CN102472746B - 检测氮氧化物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了对生物样品中的NOx化合物进行检测和定量的方法和试剂盒。所述方法包括使包含亚硝酸盐化合物的混合物与显色试剂反应形成有色化合物，使所述混合物与被构造用于保留所述有色化合物的保留介质接触，和检测保留在所述保留介质上的所述有色化合物。

Description

检测氮氧化物的方法
相关专利申请的交叉引用
本申请要求2009年8月4日提交的美国临时专利申请61/231,257、2010年8月2日的美国临时专利申请61/369,933的优先权，两专利申请以引用方式并入本文。
背景技术
硝酸盐化合物可存在于供水中。当其浓度水平较高时，可在成人中引起与亚硝胺有关的胃部问题，并可引起婴儿的高铁血红蛋白血症。饮用水标准通常包括硝酸盐化合物在公共饮用水中的最大容许浓度。
硝酸盐化合物还可以低水平存在于生物组织中，特别是创伤组织中。一氧化氮合酶(NOS)在组织中产生一氧化氮(NO)。NO在生物组织中的半衰期为约5秒。NO通常代谢成稳定的NO相关化合物(如硝酸盐和亚硝酸盐化合物)，这可在患者的尿液、血浆、组织、创液或其他样本中得以测定。样本中硝酸盐和亚硝酸盐化合物的水平可用作患者体内NO合成水平的指标。患者体内的NO在阈值水平以下时，不能实现正常的创伤修复，从而导致不愈合的慢性创伤或溃疡。
需要简单、灵敏的方法来测量样品中的NO相关化合物。
发明内容
本发明涉及对生物样品(如患者的尿液、血浆、组织、创液或其他样本)中的NOx化合物进行检测和任选定量的方法。在某些优选实施例中，采自某个部位的生物样品可包含有限量的即刻可捕集的流体(如创伤部位)。可通过样品采集装置来捕集生物样品。本发明的方法提供用于检测生物样品中极低量的NOx化合物。
在一个方面，本发明提供检测NOx化合物的方法。所述方法可包括提供可能含有NOx化合物的样品和4，4’-磺酰基双苯胺；形成包含样品和4，4’-磺酰基双苯胺的混合物；以及检测指示样品中存在NOx的有色沉淀。所述混合物还可包含N-(1-萘基)乙二胺和/或VCl3。
在另一方面，本发明提供检测创伤中NOx化合物的方法。所述方法可包括提供来自创伤的样品和4，4’-磺酰基双苯胺；形成包含样品和4，4’-磺酰基双苯胺的混合物；以及检测指示样品中存在NOx的有色沉淀。所述混合物还可包含N-(1-萘基)乙二胺和/或VCl3。
在另一方面，本发明提供检测NOx化合物的方法。所述方法可包括提供可能包含NOx化合物的样品、4，4’-磺酰基双苯胺和芳香族二胺；形成包含样品、4，4’-磺酰基双苯胺和芳香族二胺的混合物；和检测指示样品中存在NOx的有色沉淀。芳香族二胺可包括N-(1-萘基)乙二胺。
在另一方面，本发明提供检测创伤中NOx化合物的方法。所述方法可包括提供样品采集装置、来自创伤的样品、4，4’-磺酰基双苯胺和芳香族二胺；形成包含样品和4，4’-磺酰基双苯胺以及芳香族二胺的混合物；和检测指示样品中存在NOx的有色化合物。芳香族二胺可包括N-(1-萘基)乙二胺。
在上述任一实施例中，所述混合物还可包含强酸。在上述任一实施例中，所述有色沉淀可包括红色沉淀。
在上述任一实施例中，所述方法还可包括加热混合物的步骤。在上述任一实施例中，所述方法还可包括过滤混合物的至少一部分的步骤。在一些实施例中，过滤混合物的至少一部分可包括捕集表面积为约1.5mm2至约31mm2的过滤型保留介质中的滤液。在一些实施例中，过滤混合物的至少一部分可包括捕集表面积为约1.5mm2至约20mm2的过滤型保留介质中的滤液。在一些实施例中，过滤混合物的至少一部分可包括捕集表面积为约1.5mm2至约3.1mm2的过滤型保留介质中的滤液。
在上述任一实施例中，检测有色沉淀可包括目视检测沉淀。在上述任一实施例中，检测有色沉淀可包括定量检测有色沉淀。
在上述任一实施例中，所述方法还可包括形成包含预定量的NOx化合物和4，4’-磺酰基双苯胺的混合物。在这些实施例中，所述方法还可包括检测有色沉淀。在这些实施例中，所述方法还可包括将包含可能含有NOx化合物的样品的混合物中的有色沉淀的量与包含预定量的NOx化合物的样品中的有色沉淀的量进行比较。
在另一个方面，本发明提供试剂盒。该试剂盒可包含过滤型保留介质和选自4，4’-磺酰基双苯胺和N-(1-萘基)乙二胺的化合物。
在另一个方面，本发明提供试剂盒。该试剂盒可包含过滤型保留介质和选自4，4’-磺酰基双苯胺、N-(1-萘基)乙二胺和VCl3的两种或更多种化合物。
在上述任一实施例中，所述试剂盒还可包含强酸。在上述任一实施例中，所述试剂盒还可包括样品采集装置。在一些实施例中，所述样品采集装置可用于从创伤中获得样品。在上述任一实施例中，所述试剂盒还可包括过滤装置。
在一个方面，本发明提供检测创伤中NOx化合物的方法。所述方法可包括提供来自创伤的样品和能与亚硝酸盐化合物反应形成有色化合物的显色试剂。所述方法还可包括形成包含样品和显色试剂的第一混合物。所述方法还可包括使第一混合物的至少一部分与被构造得适于保留有色化合物的第一保留介质接触。所述方法还可包括检测保留在第一保留介质上的有色化合物。
在一些实施例中，所述方法还可包括提供能够将硝酸盐化合物还原成亚硝酸盐化合物的还原剂，其中所述第一混合物包括还原剂。
在上述方法的任一实施例中，与亚硝酸盐化合物反应形成有色化合物的显色试剂可包含生色团或显色剂。在上述方法的任一实施例中，与亚硝酸盐化合物反应形成有色化合物的显色试剂可选自4，4′-双-(二甲基氨基)二苯甲硫酮；薁；番木鳖碱吲哚(brucine indol)；对苯基偶氮苯胺；对硝基苯胺；邻氨基苯甲酸；对氨基苯乙酮；对氨苯基砜；对苯基苯胺；对氨基苯磺酸；双-(4-氨基苯基)硫醚；(4-氨基苯基)三甲基氯化铵；1-萘胺；氯-对苯二胺；间苯二酚；N，N-二甲基苯胺；对氨基苯乙酮；4-硝基-1-萘胺；对硝基苯胺；4-硝基-1-萘胺；对苯基偶氮苯胺；对苯基偶氮苯胺；对硝基苯胺；4-硝基-1-萘胺；对氨基苯乙酮；1-萘胺；1-苯胺基萘；1-萘酚；苯甲醛2-苯并噻唑腙；蒽酮；1-蒽酚；薁；二苯胺；1，2-二羟基苯；芝麻酚；N，N-二甲基-1-萘胺；甲醛；高氯酸铁(III)；和N，N-二甲基-3-羟基苯胺。
在上述任一实施例中，所述方法还可包括加热混合物的步骤。在上述方法的任一实施例中，使混合物的至少一部分与第一保留介质接触可包括使所述部分与膜滤器接触。在上述方法的任一实施例中，检测有色化合物可包括定量检测有色化合物。
在上述任一实施例中，所述方法还可包括提供第二保留介质、显色试剂和包含预定量的NOx化合物的溶液。显色试剂与亚硝酸盐化合物反应形成有色化合物。第二保留介质被构造成用于保留有色化合物。所述方法还可包括形成包含溶液和显色试剂的第二混合物，使第二混合物的至少一部分与第二保留介质接触，检测保留在第二保留介质上的有色化合物，以及将保留在第一保留介质上的有色化合物的量与保留在第二保留介质上的有色化合物的量进行比较。
在另一个方面，本发明提供试剂盒。所述试剂盒可包含被构造用于保留有色化合物的保留介质和可与亚硝酸盐化合物反应形成有色化合物的显色试剂。
在一些实施例中，所述试剂盒还可包含将硝酸盐化合物还原成亚硝酸盐化合物的试剂。在上述任一实施例中，所述试剂盒还可包括样品采集装置。在上述任一实施例中，所述试剂盒还可包括含有保留介质的过滤装置。
定义
如本文所用，“NOx”是指一氧化氮相关(NO相关)化合物。NO相关化合物包括一氧化氮及其衍生物。NO衍生物包括硝酸盐化合物和亚硝酸盐化合物。
本文中所用的“包括”、“包含”或“具有”以及它们的变化形式意在涵盖其后所列举的项目及其等同项目以及附加项目。除非另有规定或限制，否则术语“偶联”、“附接”、“连接”及其变化形式作广义使用并涵盖直接连接和间接连接两者。此外，术语“偶联”不限于物理或机械偶联。应当理解，可利用其他实施例并且在不脱离本发明的范围的情况下可以进行结构或逻辑上的改变。此外，诸如“顶部”、“底部”等术语仅用于描述其彼此关联的元件，但绝非意在描述装置的具体取向，用于表明或暗示装置的必需或要求的取向，或规定本文描述的发明在应用时应如何使用、安装、陈列或设置。
词语“优选的”和“优选地”是指在某些情况下，可以提供某些有益效果的本发明实施例。然而，在相同的情况或其他情况下，其他实施例也可以是优选的。此外，对一个或多个优选实施例的表述并不暗示其他实施例是不可用的，且并非意图将其他实施例排除在本发明范围之外。
本文所用的“一种(个)”、“所述(该)”、“至少一种(个)”以及“一种或多种(一个或多个)”可互换使用。因此，例如，包含“一个”样本收集区的制品可被解释为意指制品包括“一个或多个”样品收集区。相似地，用于检测“一种”被分析物的方法可被解释为意指该方法可涉及检测“一种或多种”被分析物。
术语“和/或”意指所列要素的一个或全部，或所列要素的任何两个或更多个的组合。
本文所用的术语“或(或者)”通常按其意义应用，包括“和/或”，除非上下文清楚表明并非如此。
还有，本文通过端点表述的数值范围包括该范围内的所有数值(比如，1-5包含1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。
本发明的上述发明内容并非意图描述本发明的每一个公开的实施例或每种实施方式。以下具体实施方式更具体地举例说明了示例性实施例。在本专利申请全文的几处，通过实例列表提供指导，可以不同组合使用这些实例。在每一种情况下，被引用的列表均仅用作一个代表性的组，不应被理解为是排他性列表。
附图说明
将参照下面列出的附图来进一步说明本发明，其中在这几个视图中类似的结构由类似的数字标注。
图1A是根据本发明用于检测硝酸盐化合物或亚硝酸盐化合物的装置的一个实施例的俯视图。
图1B是图1A装置的分解侧视图。
图2A是根据本发明用于检测硝酸盐化合物或亚硝酸盐化合物装置的的一个实施例的俯视图。
图2B是图2A装置的分解侧视图。
图3是得自反射密度计的数据图。
图4是得自分光光度计的数据图。
图5是得自反射密度计的数据图。
图6是得自分光光度计的数据图。
图7是得自反射密度计的数据图。
图8是得自分光光度计的数据图。
图9是得自反射密度计的数据图。
具体实施方式
本发明整体涉及用于检测样品中的氮氧化物(如亚硝酸盐和/或硝酸盐化合物)的制品和方法。本发明还涉及评估创伤状况的制品和方法。本发明的制品和方法提供了对样品中较低(如生理学中)水平的NOx进行测量的速测法。
在一些实施例中，本发明的方法包括在过滤片中收集可溶性有色化合物或有色沉淀，该有色化合物或有色沉淀指示有亚硝酸盐化合物或硝酸盐化合物存在。在一些实施例中，可在具有较小横截面积的过滤片中收集沉淀。在有较小横截面积的过滤片中收集沉淀，具有可允许对样品中极低水平的NOx化合物进行检测或定量的优点。
样品和样品收集：
本发明的方法可用于检测多种样品中的NOx化合物，所述多种样品包括(但不限于)水(如地表水、池塘水、井水、工业用水、饮用水)、农业样品(如废水塘、牲畜饲料、农作物、土壤)、食物产品(如蔬菜、乳制品)、和患者样品(如血液、尿液、组织、血浆、创面、创面渗出物)。
本发明的方法可联合多种样品采集装置使用。优选的样品采集装置(如吸移管、拭子、海绵、伤口敷料等)基本上不含反应性亚硝酸盐或硝酸盐化合物。合适的样品采集装置的实例描述于2009年8月4日提交的名为“SAMPLING DEVICES AND METHODS OF USE”的美国专利申请No.61/231,236，该专利以引用方式全文并入本文。
样品采集装置可处理得适于从创伤中获得样品。例如，在一些实施例中，使样品采集装置适于从创伤中获得样品的办法可包括处理所述装置以使其基本上去污、消毒、或灭菌。在一些实施例中，使样品采集装置适于从创伤中获得样品的办法可包括将样品采集装置封装在包装中，所述包装已经过处理以使其基本上去污、消毒、或灭菌。在一些实施例中，使样品采集装置适于从创伤中获得样品的办法可包括由易于吸收或吸附创面渗出物的材料构造样品采集装置。在一些实施例中，使样品采集装置适于从创伤中获得样品的办法可包括提供具有选来抵抗与创伤组织粘附的面创层的吸收材料。
用于收集样品的装置以可脱开的方式采集(如通过吸附和/或吸收)一定量的足以进行一个或多个测试工序的样品(如创面渗出物)。
检测样品中硝酸盐或亚硝酸盐化合物的方法：
本发明的方法包括检测样品中的NOx化合物。本发明的方法还包括检测创面渗出物样品中的NOx。NO通常代谢成某些稳定的产物，诸如硝酸盐和亚硝酸盐化合物，这可在患者的尿液、血浆、组织、创液或其他样本中得以测定。样本中硝酸盐化合物、亚硝酸盐化合物或其他NO相关产物的水平可用作患者体内NO合成水平的指标。
NO相关产物或氧化剂应激相关产物的“水平”通常是指样本中或样本的流体部分中相应产物的浓度(摩尔/升、微摩尔/升或其他合适的单位)。然而，还可使用其他度量单位来表示产物的水平。例如，可使用绝对量(以微克、毫克、纳摩尔、微摩尔、摩尔或其他合适的单位计)、特别是如果量是回指患者样本的恒定的量、质量或体积(如克、千克、毫升、升或其他合适的单位)。
在一个方面，本发明提供采用形成有色化合物(如与以下所示化合物I类似或相同的红色阳离子染料)的反应来检测样品中NOx化合物的方法：
化合物I
在一些实施例中，所述方法包括提供样品、保留介质和显色试剂。所述显色试剂能够与亚硝酸盐化合物反应形成有色化合物。保留介质被构造得用于保留有色化合物。所述方法还包括在允许亚硝酸盐化合物与显色试剂反应以形成有色化合物的条件下形成包含样品和显色试剂的混合物，使混合物的至少一部分与保留介质接触，以及检测保留在保留介质上的有色化合物。
样品可为可能包含硝酸盐化合物和/或亚硝酸盐化合物的任何样品。所述方法特别适合于较小体积的样品(如约2μl至约10μl)，所述样品包含较低累积浓度(如≤50μM)的硝酸盐和/或亚硝酸盐化合物。样品可为生物样品(如患者的尿液、血浆、组织、创液或其他样本)。所述方法的实施例特别适用于创伤液的样品，因为i)难以从从创伤部位即刻获得超过10微升的创伤液，和ii)生物材料的样品通常具有较低浓度(如≤50μM、≤40μM、≤30μM、≤20μM、或≤10μM)的NO3和/或NO2化合物存在于样品材料中。
保留介质可为被构造用于捕集和保留有色化合物的任何介质。例如可通过吸收、吸附和/或过滤来捕集和保留有色化合物。吸附可藉疏水性和/或库仑(离子)相互作用来加以促进。过滤过程可包括将有色化合物捕集于过滤片的表面和/或过滤片的孔内。在一些实施例中，保留介质表现出对有色化合物的各向异性的捕集和保留(例如其将有色化合物捕集和保留在介质表面上或附近的场合)。合适的保留介质的实例包括片材介质(即，大致平坦的材料片，例如塑料薄膜、膜滤器和非织造材料)和粒子。在一些实施例中，粒子可为多孔粒子。在一些实施例中，粒子可嵌入实质上不会捕集或保留有色化合物的基质(如纤维、微纤维或水凝胶)。保留介质可包含与有色化合物中的离子基团相互作用离子基团，从而将有色化合物捕集和保留在保留介质上和/或介质内。用于捕集和保留阳离子有色化合物的合适离子基团的非限定性实例包括磺酸盐基团、羧酸盐基团、磷酸盐基团、硫酸酯基团和磷酸酯基团。用于捕集和保留阴离子有色化合物的合适离子基团的非限定性实例包括各种季铵基团、膦基和锍基。
所述方法包括使用能够与亚硝酸盐化合物反应形成有色化合物的显色试剂。显色试剂可包括本领域中已知的多种显色试剂中的至少一种，包括E.Sawicki等人(1963)的名称为“Comparison of fifty-twospectrophotometric methods for the determination of nitrite(用于测定亚硝酸盐的五十二种分光光度法的比较)”(Talanta，第10卷，第641-655页；Pergamon Press Ltd.，Oxford，UK)的出版物中所描述的显色试剂，该出版物以引用方式全文并入本文中。显色试剂包含生色团和显色剂。生色团可与显色剂反应形成阴离子有色化合物。形成阳离子有色化合物的合适生色团包括例如二芳基甲烷阳离子(如4，4′-双-(二甲基氨基)二苯甲硫酮)、二芳基胺阳离子(如薁、番木鳖碱吲哚)、双偶氮染料双阳离子(如对苯基偶氮苯胺)、偶氮染料阳离子(如对硝基苯胺、邻氨基苯甲酸、对氨基苯乙酮、对氨苯基砜、对苯基苯胺、对氨基苯磺酸、双-(4-氨基苯基)硫醚、(4-氨基苯基)三甲基氯化铵和1-萘胺)、重氮阳离子(如氯-对苯二胺)和吩噁嗪双阳离子(如间苯二酚；N，N-二甲基苯胺)。形成阴离子有色化合物的合适生色团包括例如偶氮染料阴离子(如对氨基苯乙酮、4-硝基-1-萘胺、对硝基苯胺、4-硝基-1-萘胺)、三氮烯阴离子(如对苯基偶氮苯胺)和甲臜(formazan)阴离子(如对苯基偶氮苯胺、对硝基苯胺、4-硝基-1-萘胺、对氨基苯乙酮)。
显色剂包括多种本领域中已知的显色剂。通常，将某些显色剂与某些生色团配合使用，以在生色团和显色剂与NO2-反应时得到特定的有色化合物(参见Sawicki等人，1963年)。合适的显色剂包括例如1-萘胺；1-苯胺基萘；1-萘酚；苯甲醛2-苯并噻唑腙；蒽酮；1-蒽酚；薁；二苯胺；1，2-二羟基苯；芝麻酚；N，N-二甲基-1-萘胺；甲醛；高氯酸铁(III)；和N，N-二甲基-3-羟基苯胺)。
在一些实施例中，所述方法包括形成包含可能含有NOx化合物的样品、显色试剂(如4，4’-磺酰基双苯胺)、显色剂(例如，芳香族二胺如N-(1-萘基)-乙二胺)和酸(如HCl)的混合物。所述方法还包括检测指示样品中存在NOx的有色化合物(如可溶性化合物或沉淀)。
该混合物在允许亚硝酸盐化合物与显色试剂反应形成有色化合物的条件下形成。合适的条件是已知的并且由例如E.Sawicki等人描述。如反应方案I所示，所述条件包括酸(如HCl、H3PO4、H2SO4、乙酸、甲酸)以有利于有色化合物的形成。在一些实施例中，所述条件可包括提高了的温度(如约70℃)以提高有色化合物的形成速率。
在所述方法的一些实施例中，所述混合物还可包含可促使硝酸盐化合物还原成亚硝酸盐化合物的还原剂(如VCl3)。在其中将VCl3用作还原剂的实施例中，HCl为优选的酸，以i)使VCl3稳定，和ii)有利于有色化合物的形成。其他合适的还原剂包括例如活泼金属(如Cd、Al、Zn)、氨和硼氢化物。在某些可供选择的实施例中，混合物可经受促使硝酸盐化合物还原成亚硝酸盐化合物的处理(如电化学还原、光化学还原)。用于使硝酸盐化合物还原成亚硝酸盐化合物的方法描述于J.C.Fanning的论文中(“The chemical reduction of nitrate in aqueoussolution”；Coordination Chemistry Reviews，第199卷第159-179页；2000年；Elsevier，New York，NY)，其以引用方式全文并入本文中。
在一个实施例中，所述方法包括形成包含可能含有NOx化合物的样品和4，4’-磺酰基双苯胺的混合物。所述方法还包括检测指示样品中存在NOx的有色沉淀。在一些实施例中，所述混合物还可包含N-(1-萘基)-乙二胺。在一些实施例中，所述混合物还可包含VCl3。在一些实施例中，所述混合物还可包含强酸(如HCl)。
在一个实施例中，所述方法包括形成包含可能含有NOx化合物的样品、4，4’-磺酰基双苯胺和芳香族二胺的混合物。所述方法还包括检测指示样品中存在NOx的有色化合物。在一些实施例中，芳香族二胺包括N-(1-萘基)-乙二胺。在一些实施例中，所述混合物还可包含VCl3。在一些实施例中，所述混合物还可包含强酸(如HCl)。
在一个实施例中，检测NOx化合物的方法包括形成包含可能含有NOx化合物的样品、VCl3和4，4’-磺酰基双苯胺的混合物。所述方法还包括检测指示样品中存在NOx的有色化合物。
在一个实施例中，所述检测NOx化合物的方法包括形成包含可能含有NOx化合物的样品、N-(1-萘基)-乙二胺和4，4’-磺酰基双苯胺的混合物。所述方法还包括检测指示样品中存在NOx的有色化合物。
在一个实施例中，检测NOx化合物的方法包括形成包含可能含有NOx化合物的样品、VCl3和N-(1-萘基)-乙二胺的混合物。所述方法还包括检测指示样品中存在NOx的有色化合物。
不必受理论的约束，但可认为反应方案I给出了形成有色染料的示例性推测途径，以检测包含硝酸盐(或亚硝酸盐)化合物、VCl3、HCl、对二氨基二苯砜(4，4’-磺酰基双苯胺)和N-(1-萘基)-乙二胺的混合物中的NO3 -(或NO2 -)：
反应方案I
该推测途径可包括在存在VCl2和强酸(HCl)的情况下将NO3 -还原成NO2 -的过程，如反应反应Ia中所示。该推测途径还可包括在存在NO2 -和酸的情况下氧化对二氨基二苯砜的过程，如反应Ib中所示。该推测途径还可包括使两个N-(1-萘基)-乙二胺的分子偶联至氧化型对二氨基二苯砜以形成有色反应产物，如反应Ic所示。
形成包含可能含有NOx化合物的样品、VCl3、HCl、对二氨基二苯砜和/或N-(1-萘基)-乙二胺的混合物(为各组分的任何组合)可包括使混合物在提高的温度下反应。提高的温度可用来提高反应速率，前提条件是该高温不会显著降低反应的准确性、敏感性和/或可重复性。例如，可能含有NOx化合物的样品可与包含VCl3、HCl、对二氨基二苯砜和/或N-(1-萘基)-乙二胺的混合物在约70℃的温度下反应。通过在环境温度下和在升高的温度下测试包含已知量的NOx化合物的样品且对两种温度下的测量结果进行比较，有关领域的普通技术人员可容易地确定高温是否会显著降低反应的准确性、敏感性和/或可重复性。
在一个实施例中，可能含有NOx化合物的样品可在包含VCl3、HCl、对二氨基二苯砜和/或N-(1-萘基)-乙二胺的混合物(呈各组分的任何组合)中反应足以形成可检测量的有色化合物的时间段。在一些实施例中，有色化合物包括红色化合物。在一些实施例中，有色化合物包括可沉淀的有色化合物。在一个优选的实施例中，可能含有NOx化合物的样品可在包含VCl3、HCl、对二氨基二苯砜和N-(1-萘基)-乙二胺的混合物在70℃下反应约10分钟。反应可形成可溶性或可沉淀的有色化合物。所述方法还包括使混合物与被构造用于保留有色化合物的保留介质接触。在此实施例中，所述方法可用于目视检测10微升样品中至少约50皮摩尔的亚硝酸盐或硝酸盐化合物或其组合。
在上述任一实施例中，所述方法还可包括冷却反应混合物。例如，可将该反应混合物冷却至室温、。在上述任一实施例中，所述方法还可包括稀释反应混合物。例如可用水(如去离子水)稀释反应混合物。在一些实施例中，可用约830微升的去离子水稀释约170微升的反应混合物。
在一些实施例中，所述方法还可包括藉包括过滤片的保留介质过滤该混合物的全部或至少一部分或稀释该混合物。所述混合物可通过任何适于保留作为反应产物的有色化合物的过滤介质(如表面过滤片或深度过滤片)来过滤。合适的过滤型保留介质的非限定性实例包括聚砜、纤维质、玻璃膜滤器和羧化尼龙过滤片。优选地，过滤型保留介质基本上不对有色化合物的观察、检测或定量造成干扰(如模糊、稀释、漫射)。在本文中，把可溶性有色化合物或有色沉淀收集“到”一种保留介质(如过滤片介质)上，是指把沉淀收集在保留介质的表面上(如膜滤器表面)、或收集到过滤型保留介质内(如深度过滤片内部)，或两者。收集过滤片中的有色沉淀，还指(例如)收集设置在装置隔室中的过滤片(例如96孔滤板)上的沉淀。
在一些实施例中，过滤混合物的至少一部分可包括收集表面积大于31mm2的过滤型保留介质中的滤液。在一些实施例中，过滤混合物的至少一部分可包括收集表面积为约1.5mm2至约31mm2的过滤型保留介质中的滤液。在一些实施例中，过滤混合物的至少一部分可包括收集表面积为约1.5mm2至约20mm2的过滤型保留介质中的滤液。在一些实施例中，过滤混合物的至少一部分可包括收集表面积为约1.5mm2至约3.1mm2的过滤型保留介质中的滤液。
在一些实施例中，通过得自Pall Gelman(East Hills，NY)的膜滤器(I.C.E.450，聚砜膜，0.45μm，零件号66530)过滤混合物。在一些实施例中，通过直径约2mm的膜过滤混合物。
过滤型保留介质可设置在用于过滤液体样品的装置(如过滤装置)中。过滤装置可包括混合隔室，该混合隔室可用于根据本文所述的方法形成化合物和样品的混合物。在一些实施例中，混合隔室与过滤型保留介质或其他保留介质流体连通。在一些实施例中，混合隔室与过滤型保留介质或其他保留介质选择性流体连通(如经由阀门)。
包含样品的混合物可主动地通过过滤片(如通过对样品施加正压或通过对包括过滤片的装置施加负压)或该样品可被动地通过过滤片(如藉重力流或通过对过滤片的与接触样品的一侧相对的一侧施加芯吸组合物)。
图1A示出用于检测样品中NOx化合物的装置100的一个实施例的俯视图。该装置包括具有多个通孔120的上层110。上层110优选地由耐水性材料(如塑料、金属、玻璃、涂料纸)构成。在一些实施例中，上层110由塑料薄膜(如聚乙烯带)构成。在一些实施例中，可形成(例如通过注模)具有通孔120的上层110。在一些实施例中，可在形成上层110后再形成(如经由打孔器或穿孔器)通孔120。过滤型保留介质130置于上层110的下面且与通孔120的横截面积共延。过滤型保留介质130可以是具有适于保留本文所述可溶性或可沉淀的有色化合物的标称孔隙度(如0.1μm、0.2μm、0.45μm)的膜滤器(如聚砜膜滤器)。
在使用时，可将液体样品加到过滤型保留介质130的一侧，并且可通过重力使液体通过保留介质。作为一种替代选择，或作为附加的办法，可藉对包含样品的过滤型保留介质130一侧上的通孔120施加正压源(未示出)或藉对过滤型保留介质130的与包含样品的一侧相对的另一侧上的通孔120施加负压源(未示出)来促使样品穿过过滤型保留介质130。
图1B示出图1A装置100的分解横截面侧视图。装置100包括上层110和下层110’，每个层分别包含通孔120和120’。下层110’可由针对上层110所述的材料构成。上层110可由与下层110’相同的材料构成。在一些实施例中，上层110可由与下层110’不同的材料构成。将通孔120和120’对准以提供从装置100的上表面开始、从其下表面流出的液体流路。粘合剂140提供耐水性屏障，该耐水性屏障围绕与通孔120和120’对准的过滤型保留介质130。在一些实施例(未示出)中，例如可将包含通孔的各个流路分隔成例如96孔板的形式。
图2A示出用于检测样品中NOx化合物的装置200的一个实施例的俯视图。该装置包括具有多个通孔220的上层210。上层210优选地由耐水性材料(如塑料、金属、玻璃、涂料纸)构成。在一些实施例中，上层210由塑料薄膜(如聚乙烯带)构成。在一些实施例中，可形成(例如通过注模)具有通孔220的上层210。在一些实施例中，可在形成上层210后再形成(如经由打孔器或穿孔器)通孔220。过滤型保留介质230置于上层210的下面且与通孔220的横截面积共延。过滤型保留介质230可以是具有适于保留本文所述可溶性或可沉淀的有色化合物的标称孔隙度(如0.1μm、0.2μm、0.45μm)的膜滤器(如聚砜膜滤器)。
图2B示出图2A装置200的分解横截面侧视图。装置200包括包含通孔220的上层210。可由针对上层210所述的材料构造成没有通孔的下层210’。在一些实施例中，上层210可由与下层210’不同的材料构成。任选的吸收接触层250贴着过滤型保留介质230安置、位于与通孔220相对的过滤型保留介质230的另一侧。吸收贮存片255贴着接触层250，位于与过滤型保留介质230相对的接触层250的一侧。接触层250和吸收贮存片255两者提供了吸芯，以将液体样品(未示出)抽吸通过过滤型保留介质230。接触层250和吸收贮存片255可由吸收材料(如纤维素纤维、无纺布、泡沫)构成且可由相同或不同的材料构成。接触层250(如果存在)提高了液体由过滤型保留介质230到吸收贮存片255的流速。粘合剂240将上层210联结至下层210’，这有利于吸收贮存片255或接触层250(如果存在)与过滤型保留介质230之间的接触，并且粘合剂240可提供围绕过滤型保留介质230和吸收贮存片255的耐水性屏障。
用于接触层250和/或吸收贮存片255的合适材料的非限定性实例包括非织造吸收片(3M FAD吸收垫)、吸墨纸(VWR Scientific)、GF-B和TCLP(Whatman Corp.)、标称孔径为0.3至1.0μm的Sterlitech玻璃纤维膜(Sterlitech Corp.)。
在上述任一实施例中，所述方法还可包括使用至少一种包含预定量的NOx化合物(如硝酸盐)的参比混合物(如一种或多种“标准物”)。在一些实施例中，标准物可具有阈值标准(如用于存在/不存在测试)。在一些实施例中，可用多个标准物生成标准曲线以进行定量检测。在上述任一实施例中，检测样品中的NOx还可包括将在样品中检测到的NOx的量与在一种或多种包含预定量的NOx化合物的混合物中检测到的NOx的量进行比较。在一些实施例中，检测样品中的NOx还可包括将在样品中检测到的NOx的量与标准曲线进行比较。
在一些实施例中，可目视观察由过滤片保留的有色化合物(如红色阳离子染料)。在一些实施例中，可采用仪器(如反射密度计RD917，得自GretagMacbeth，Munich，DE)对由过滤片保留的可溶性或可沉淀的有色化合物进行检测或定量。反射密度计可与任何合适的过滤片一起使用以检测红色化合物。在一些实施例中，可用绿色滤光器来检测红色化合物。在上述任一实施例中，可在液体溶液或液体悬浮液中对有色化合物(如红色阳离子染料)进行检测和/或定量。
试剂盒：
本发明提供用于检测样品中NOx化合物的试剂盒。试剂盒可包含某些包装在一起以用于根据本发明方法中的组分。
在一个实施例中，试剂盒可包含保留介质(如过滤型保留介质、颗粒保留介质)和与亚硝酸盐化合物反应形成有色化合物的显色试剂。显色试剂可包括生色团和/或显色剂。试剂盒还可包含将硝酸盐化合物还原成亚硝酸盐化合物的试剂。在一些实施例中，试剂盒还可包含酸(如HCl)。
在一个实施例中，试剂盒可包含过滤型保留介质(或其他保留介质)和选自4，4’-磺酰基双苯胺、N-(1-萘基)乙二胺和VCl3的一种化合物。在一个实施例中，试剂盒可包含过滤型保留介质(或其他保留介质)和选自4，4’-磺酰基双苯胺、N-(1-萘基)乙二胺和VCl3的两种或更多种化合物。在上述任一实施例中，试剂盒还可包含强酸。在一些实施例中，所述强酸包括HCl。
在上述任一实施例中，试剂盒还可包括样品采集装置。在一些实施例中，样品采集装置适于从创伤中获得样品。在上述任一实施例中，试剂盒还可包括过滤装置。在一些实施例中，过滤装置可包括过滤型保留介质(或其他保留介质)。在一些实施例中，过滤装置还可包括与过滤型保留介质流体连通的混合室。在一些实施例中，混合室可与过滤型保留介质选择性流体连通。
实例
下面的实例进一步例示本发明的目的和优点，但这些实例中列举的具体材料及其量以及其他条件和细节不应被解释为是对本发明的不当限制。
除非另外指明，否则这些实例中的所有份数、百分数、比率等均按重量计。除另指出外，所使用的溶剂及其他试剂均得自Sigma-AldrichChemical Company(St.Louis，MO)。
实例1
用硝酸钾在水中的原溶液制备一套硝酸盐标准液。将该原溶液在水中进一步稀释至以下浓度：分别为0、5、10、15、20、25和30μM。稀释液为下述测定中使用的“样品”。
将各自0.1g的组分A和B与49.8g水混合来制备试剂1。组分A是1N HCl中的1％(w/v)的氨苯砜(4，4’-磺酰基双苯胺，Aldrich目录号A7480-7，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)溶液组成。组分B是水中的0.05％(w/v)NEDD(N-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐，Eastman目录号4835，Eastman Chemical Company，Kingsport，TN)组成。试剂2由20％HCl中的0.1％(w/v)氯化钒(VCl3)组成。
将10微升的每种样品加入微量离心管中，在该微量离心管中将其与140μl的试剂1及20μl的试剂2合并，并混合均匀。将所述管在70℃下温育10min并冷却至室温。将830μl的去离子水添加至该离心管中并且过滤所得混合物，如下所述。
把数条白色条带穿好直径为2.0mm的孔洞。层合物通过以下方式形成：将膜滤器盘(直径为1/4英寸(6.35mm)，由Pall Gelman LabI.C.E.450冲切，聚砜膜0.45mm，零件号66530)插在条带的两层之间，并使条带顶层上的孔叠合在条带底层上的孔的上方，同时使滤膜材料位于由叠合孔形成的开口中。将层合物放置在被构造用于真空过滤的96孔板上方，并使得放置在所述板孔中的样品可被抽吸通过2mm开孔中的过滤片。膜滤器将含有硝酸盐化合物的样品中的红色阳离子染料保留了下来。
使用绿色滤光片并通过反射密度计(MacBeth RD917)来测量每个孔中的颜色的强度(光密度)。样品中的硝酸盐化合物的浓度与过滤片保留的颜色的光密度之间的关系图如图3所示。从图3所示的标准曲线可看出，该化学反应具有很好的线性。
实例2
实例2中描述的检测系统用于检测各种市售吸收材料中的硝酸盐化合物水平。这些材料包括若干等级的滤纸，这些滤纸据称仅包含极低水平的硝酸盐。
制备并测试包含10μM的标准液，如实例1中所述。将吸收材料(四个等级滤纸的1cm×1cm方块和一种3M NEXCARE Soft‘nFlex#672-35急救敷料)的样品放置在管中并用0.05mL不含硝酸盐的测定缓冲液(Cayman硝酸盐/亚硝酸盐荧光测定试剂盒、目录号780051，Cayman Chemical Company)润湿，并且使其在室温下静置约30分钟。在微型离心机中以10,000rpm进行离心从吸收制品中分离所述缓冲液，并依实例1中描述的程序10微升的分离所得的缓冲液进行测试。将每种吸收材料的硝酸盐测试中的膜滤器的颜色与10mM硝酸盐标准液的膜滤器的颜色进行比较。将显示出比标准液的红色更深的色调的任何测试记录为“是”。结果显示在表1中。数据表明所测试的所有滤纸均包含内源性水平的硝酸盐化合物，该内源性水平高到足以干扰采用实例1中描述的方法对NOx的生理水平进行检测。相比之下，急救敷料所含内源性硝酸盐化合物的水平不足以干扰采用实例1中描述的方法对NOx的生理水平进行的检测。
表1.
实例3
用硝酸钾在水中的原溶液制备一组硝酸盐标准液。将所述原溶液在水中进一步稀释至以下浓度：分别为0、5、10、15、20、25和30μM。稀释液为下述测定中使用的“样品”。
将各自0.1g的组分A和组分B与49.8g水混合来制备试剂1。组分A由1N HCl中的1％(w/v)的氨苯砜(4，4’-磺酰基双苯胺，Aldrich目录号A7480-7，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)溶液组成。组分B由水中的0.05％(w/v)NEDD(N-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐，Eastman目录号4835，Eastman Chemical Company，Kingsport，TN)组成。
试剂2由20％HCl中的0.1％(w/v)氯化钒(VCl3)组成。
将10微升的每种样品加入微量离心管中，在该微量离心管中将其与140μl的试剂1和20μl的试剂2合并，并混合均匀。将所述管在70℃下温育10min并冷却至室温。将830μl的去离子水添加至该微量离心管中并过滤所得混合物，如下所述。
把数条白色条带穿好直径为2.0mm的孔洞。层合物通过以下方式形成：将膜滤器盘(直径为1/4英寸(6.35mm)，由Pall Gelman LabI.C.E.450冲切，聚砜膜0.45μm，零件号66530)插在条带的两层之间，并使条带顶层上的孔叠合在条带底层上的孔的上方，同时使滤膜材料位于由叠合孔形成的开口中。将层合物放置在被构造用于真空过滤的96孔板上方，使放置在所述板孔中的样品可被抽吸通过2mm开孔中的过滤片。膜滤器将含有硝酸盐的样品中的红色阳离子染料保留了下来。
使用绿色滤光片并通过反射密度计(MacBeth RD917)测量每个孔中的颜色的强度(光密度)。样品中硝酸盐的浓度与过滤片保留的颜色的光密度(O.D.)之间的关系图如图4所示。
实例4
通过硝酸钾和去离子水来制备硝酸盐的校准液(0、5、10、20、30和40μM的硝酸盐)。在10％HCl中制备包含0.05％w/v氯化钒(III)、0.25％w/v氨苯砜和0.05％w/v Tsuda试剂(N-(2-二乙氨基乙基)-1-萘胺草酸盐，TCI Chemicals)的混合试剂，并进行过滤。使10微升的每种校准液与10μL的上述混合试剂(在去离子水中稀释至200μL)反应并在70℃下温育10min，然后冷却至室温。添加300μl的去离子水，并且通过直径为2mm的膜滤器来过滤所得溶液，如实例3中所述。使用了三组膜滤器：孔径为450nm的未带电的(中性)聚砜膜(Supor 450，Pall)、孔径为450nm的阴离子交换聚砜膜(SB6407，Pall)和孔径为450nm的阳离子交换聚砜膜(I.C.E.450，Pall)。采用X-Rite 530(X-Rite Inc.)光密度计来测量所吸附染料的反射率，并且将扫描光谱转换成等效的吸光度曲线。表2和图5中所示的结果表明，在捕集和保留阳离子染料时，阳离子交换膜(I.C.E 450)比阴离子交换膜(SB6407)或未带电荷的膜(SUPOR 450)更有效。
表2.各种膜滤器上阳离子染料的捕集和保留。
实例5
用硝酸钾和去离子水制备硝酸盐的校准液(0、5、10、20、30和40μM的硝酸盐)。在10％HCl中制备包含0.05％w/v氯化钒(III)、0.25％w/v氨苯砜和0.05％w/v Tsuda试剂(N-(2-二乙氨基乙基)-1-萘胺草酸盐，TCI Chemicals)的混合试剂，并进行过滤。分光光度检测和整体检测技术的工序如下：
分光光度法：将40μL的每种校准液与80μL的上述混合试剂反应并在70℃下温育10min，然后冷却至室温。将100μl的每种所得染料溶液转移至96孔PS板(Nunc)上并采用BioTek Synergy 4板读取器在545nm下进行读数。
反射(整体)方法：将7μL的每种校准液与14μL的上述混合试剂(在去离子水中稀释至200μL)反应并在70℃下温育10min，然后冷却至室温。添加300μl的去离子水，并且通过直径为2mm的膜滤器过滤所得溶液，如实例3中所述。
图6和7中示出的结果表明，整体检测技术需用的样品体积比分光光度法所用的样品体积小，因而灵敏度较高。两种测定均表现出对硝酸盐浓度的线性响应。分光光度法中的相关系数(R2)为0.9999。反射方法中的相关系数为0.9983。此外，对于整体检测方法而言，其依校准线的斜率测量得到的辨别力要高出200倍以上。
实例6
该实例表明，与针对硝酸盐的常规分光光度检测测定相比，整体检测技述对生物体的基质不灵敏，从而允许在无需清理样品的情况下进行对生物样品的检测。
在10％重组人血浆(Sigma Chemicals)中用硝酸钾和去离子水制备硝酸盐的校准液(0、5、10、20、30和40μM的硝酸盐)。在10％HCl中制备包含0.05％w/v氯化钒(III)、0.25％w/v氨苯砜和0.05％w/v Tsuda试剂(N-(2-二乙氨基乙基)-1-萘胺草酸盐，TCI Chemicals)的混合试剂，并进行过滤。分光光度检测和整体检测技术的工序如下：
分光光度法：将40μL的每种校准液与80μL的混合试剂反应并在70℃下温育10min，然后冷却至室温。将100μl的每种所得染料溶液转移至96孔PS板(Nunc)上并采用BioTek Synergy 4板读取器在545nm下进行读数。
整体检测方法：将7μL的每种校准液与14μL的混合试剂(在去离子水中稀释至200μL)反应并在70℃下温育10min，然后冷却至室温。添加300μl的去离子水，并且通过直径为2mm的膜滤器来过滤所得溶液，如实例3中所述。
图8和9中显示的结果表明在分光光度法中，酸性介质中的血浆蛋白的光散射对吸光度测量有影响所述的光散射导致用于分光光度法中的校准曲线呈非线性(相关系数＝0.7982)。整体检测方法在硝酸盐浓度和吸光度之间给出线性关系(相关系数＝0.9644)。
在不脱离本发明的范围和精神的前提下，本发明的各种修改和更改对本领域的技术人员而言将是显而易见的。应当理解，本发明并非意图受本文提出的示例性实施例和实例的不当限制，并且这种实例和实施例仅以举例的方式提出，本发明的范围旨在仅受下文提出的权利要求书的限制。

Claims (6)

1.一种检测创伤中NOx化合物的方法，其包括：
提供来自创伤的样品、第一保留介质和显色试剂；
其中所述显色试剂能够与亚硝酸盐化合物反应形成有色化合物；
其中所述第一保留介质被构造用于保留所述有色化合物
在允许亚硝酸盐化合物与所述显色试剂反应形成所述有色化合物的条件下形成包含所述样品和所述显色试剂的第一混合物；
加热第一混合物；
用水成液稀释第一混合物；
使所述第一混合物的至少一部分与所述第一保留介质接触；和
检测保留在所述第一保留介质上的所述有色化合物，
其中所述第一或第二保留介质包括具有与所述有色化合物接触的离子官能团的介质；
其中在加热第一反应混合物和用水成液稀释第一混合物之后，使第一混合物的至少一部分与第一保留介质接触。
2.根据权利要求1所述的方法，该方法还包括提供还原剂，其中所述第一混合物包括所述还原剂，其中所述条件同时允许硝酸盐化合物还原成亚硝酸盐化合物且允许亚硝酸盐化合物与所述显色试剂反应形成所述有色化合物。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述显色试剂选自、4,4'-双-(二甲基氨基)二苯甲硫酮；薁；番木鳖碱吲哚；对苯基偶氮苯胺；对硝基苯胺；邻氨基苯甲酸；对氨基苯乙酮；对氨苯基砜；对苯基苯胺；氨基苯磺酸；双-(4-氨基苯基)硫醚；(4-氨基苯基)三甲基氯化铵；1-萘胺；氯-对苯二胺；间苯二酚；N,N-二甲基苯胺；4-硝基-1-萘胺；对苯基偶氮苯胺；对苯基偶氮苯胺；对硝基苯胺；4-硝基-1-萘胺；对氨基苯乙酮；1-苯胺基萘；1-萘酚；苯甲醛2-苯并噻唑腙；蒽酮；1-蒽酚；薁；二苯胺；1,2-二羟基苯；芝麻酚；N,N-二甲基-1-萘胺；甲醛；高氯酸铁(III)；和N,N-二甲基-3-羟基苯胺。
4.根据权利要求1所述的方法，该方法还包括：
形成第二混合物，其包含预定量的NOx化合物和与亚硝酸盐化合物反应形成有色化合物的显色试剂；
使所述第二混合物的至少一部分与被构造用于保留所述有色化合物的第二保留介质接触；
检测保留在所述第二保留介质上的所述有色化合物；和
将保留在所述第一保留介质上的有色化合物的量与保留在所述第二保留介质上的有色化合物的量进行比较。
5.根据权利要求1所述的方法，其中使所述混合物的至少一部分与保留介质接触包括使所述部分与膜滤器接触。
6.根据权利要求1所述的方法，其中检测所述有色化合物包括采用仪器检测所述有色化合物。
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