CN102470173B

CN102470173B - 金属纳米粒子、其制备和应用

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Publication number: CN102470173B
Application number: CN201080031148.1A
Authority: CN
Inventors: 劳伦特·莱维; 阿格尼丝·波迪艾尔; 劳伦斯·保罗; 劳伦斯·马格奥勒拉
Original assignee: Nanobiotix SA
Current assignee: Nanobiotix SA
Priority date: 2009-07-10
Filing date: 2010-07-09
Publication date: 2015-04-22
Anticipated expiration: 2030-07-09
Also published as: MX347606B; BR112012000530B1; SI2451481T1; EP2451481B1; JP5739883B2; KR20120052979A; PL3178494T3; NZ597564A; BR112012000530A2; US10391174B2; CA2765290A1; PT3178494T; ZA201200902B; IL217287A; LT2451481T; WO2011003999A1; JP2012532847A; ES2616628T3; BR122019025997B1; KR101670757B1

Abstract

本发明涉及可活化的纳米粒子，其可在健康领域、特别是人类健康中用于扰乱、改变或破坏靶细胞、组织或器官。更具体来说，它涉及当暴露于电离辐射时能够产生显著有效的疗效的纳米粒子。本发明的纳米粒子是金属纳米粒子，其具有约80至105nm之间的尺寸作为最大尺寸，并且所述金属优选具有至少25的原子序数(Z)。本发明还涉及包含前面限定的纳米粒子群的药物组合物以及它们的应用。

Description

金属纳米粒子、其制备和应用

发明领域

本发明涉及可活化纳米粒子，其可用于健康领域、特别是人类健康中，用于扰乱、改变或破坏靶细胞、组织或器官。更具体来说，它涉及当暴露于电离辐射例如X-射线、γ-射线、放射性同位素和/或电子束时能够产生惊人有效的疗效的纳米粒子。本发明的纳米粒子是金属纳米粒子，其具有约80至约105nm之间的尺寸作为最大尺寸，并且所述金属优选具有至少25的原子序数(Z)。本发明还涉及包含前面限定的纳米粒子群的药物组合物以及它们的应用。

背景技术

各种形式的辐射例如X-射线、γ-射线、UV-射线、激光、微波、电子束以及例如中子和质子的粒子束，已被用于治疗癌症相关问题。一些所述辐射与辐射敏感分子组合，已用于这样的应用中。事实上，电磁和电离辐射能够特别是打断细胞的DNA分子，从而杀死细胞和/或阻止所述细胞生长和分裂。这种效应主要是由于在能够引起自由基生成的电离后发射的特别是电子和/或高能光子所产生的间接损伤。

术语“电离辐射”是指能够使原子或分子电离的高能粒子或波。电离能力取决于个体粒子或波的能量而不是它们的数量。在最常见情况下，如果个体粒子或波的能量不足，大量涌来的粒子或波将不会引起电离。典型的电离辐射是辐射，其能量高于2KeV。

通过金纳米粒子(GNP)的辐射敏化已被认为是用于改进放疗的有希望的方法。

US 6,955,639(Hainfeld等)描述了使用金属、特别是金的纳米粒子增强X-射线辐射效果的方法，出于生物分布的原因，金属核心的尺寸(直径)优选在0.8至20nm、更优选在0.8至3nm的范围内。

Herold等(Int.J.Rad.Biol.76(2000)1357)指出，小尺寸(～2nm)的金纳米粒子将在整个肿瘤块中更均匀地扩散。

Chithrani等(Nano Lett.6(2006)662；Nano Lett.7(2007)1542)显示了直径50nm的GNP在Hela细胞中优先穿透和积累。

Chang等(Cancer Sci.99(2008)1479)显示，在带有黑素瘤肿瘤的小鼠模型中，直径13nm的GNP与来自6MeV电子束的单剂25Gy相结合，引起了与对照组中相比更显著的肿瘤体积减小。

Zhang等(Biomed Microdevices(2009)，11：925-933)提供了计算机数据(Monte carlo模拟模型)，证实了金纳米粒子能够增强辐射的有效剂量，但是没有研究纳米粒子尺寸对这种剂量增强的影响。该文献在放疗的情形中提到了直径为1.9nm的Hainfeld纳米粒子(参见930页右栏)，但是没有提供可以帮助在生物系统、特别是人类中准确定量剂量增强系数的结果(参见Montenegro等，J.Phys.Chem.A.2009，113，12364-12369：“用于生物医学纳米诊断治疗学中的Auger过程的Monte carlo模拟和原子计算”(Monte Carlo Simulations and AtomicCalculations for Auger Processes in Biomedical Nanotheranostics))。

在本文中，本发明人提供了高效纳米粒子，与现有技术中描述的纳米粒子相比，当所述纳米粒子被暴露于电离辐射时，其惊人地能够在体外、离体和体内实现靶细胞的更有效的扰乱、改变或破坏，正如在本文中所证实的。

本发明的纳米粒子是金属纳米粒子，其有利的最大尺寸是在约80nm至约105nm之间的尺寸，所述纳米粒子由优选原子序数(Z)至少25的金属制成。本文描述的纳米粒子的有利性质不能从与本发明相矛盾的现有技术推测出来，所述现有技术建议使用小尺寸的金纳米粒子来提高剂量增强系数[具体参见Brun等(Colloids and Surfaces B：interfaces，72(2009)128-134：“控制金纳米粒子X-射线放射敏化的参数”(Parameters governing gold nanoparticle X-rayradiosensitization))，他揭示了金纳米粒子浓度的影响]。特别是在Brun等的图4(B)上显示的结果，揭示了对于给定金浓度来说，当金纳米粒子的尺寸减小时剂量增强系数增加(金含量随着金纳米粒子的半径按照系数3变化)。

对于给定的金属浓度和给定的电离辐射吸收能力来说，本文描述的金属纳米粒子、典型的金属纳米粒子尺寸优选在约80nm至约105nm之间，当与较小尺寸的纳米粒子相比、特别是与尺寸为60nm或更小的纳米粒子相比时，造成了疗效(产生靶细胞损伤的能力)的增加。

对于给定的金属浓度和在细胞水平上等效的X-射线衰减来说，本文描述的金属纳米粒子表现出更强的杀死细胞和/或阻止它们分裂的能力。

本文中描述的纳米粒子所显示的另一个特点，是它们当暴露于电离辐射时，在与靶细胞接触时产生治疗效果的能力。换句话说，在辐射下观察到的疗效不需要纳米粒子的细胞摄入。在本文中第一次描述了这样的性质。

事实上，到目前为止，在本技术领域中一直相信，靶细胞摄入对于纳米粒子能够在辐射下产生有效的细胞致死性损伤来说是必需的(参见例如Kong等(Small 4(2008)1537))。

因此，本发明与所有现有技术的成见相反，所述成见引导专业技术人员主要出于生物相容性、生物分布和细胞摄入的原因而在医学应用中使用直径约为1至20nm、至多为60nm的纳米粒子，其中特别并且长期感兴趣的是50nm的纳米粒子(参见Chithrani等(2006)和Chang等(2008))。

本发明的纳米粒子还有利地允许减少给药于对象的金属的量，并在完全放射治疗性治疗方案的情况下将纳米粒子给药步骤的数量降至最低，从而有利于对象对它们的耐受。

发明概述

现在，本发明人发现，使用由原子序数(Z)优选为至少25的金属制成的纳米粒子，有可能以惊人增加的效率扰乱、改变或破坏身体浅表或深处的靶细胞、组织或器官，特别是在本文中定义为良性细胞或组织的异常细胞或组织，或患病细胞或组织例如恶变前或恶性细胞(癌细胞)或组织(肿瘤)，其中所述纳米粒子的最大尺寸在约80nm至约105nm之间。

本发明的优点是提供了本身无害，但是在适当条件下能够安全地用于功能性扰乱、改变或破坏动物、优选为哺乳动物、更优选为人类中的靶细胞。纳米粒子的所需治疗效果事实上严格依赖于它们的电离，所述电离由本身在质量和量方面受到有利控制、并由本技术领域的人员以靶向、即局域化的方式使用的电离辐射源产生。

本发明事实上描述了当细胞暴露于电离辐射例如特别是X-射线、伽马射线(γ-射线)、放射性同位素、离子束和/或电子束时，能够在体外、离体或体内引起所述细胞的扰乱、改变或破坏的纳米粒子。

本文描述的纳米粒子能够直接与进入的辐射相互作用并产生惊人高效的治疗效果，而且不需要纳米粒子被靶细胞内化。

本发明的纳米粒子可以用在下文中进一步描述的优选有利于纳米粒子在生理流体中的稳定性的生物相容性涂层包覆。

在适当和优选的情况下，通过使用例如能够特异性靶向生物组织或细胞的表面组分，本发明的纳米粒子可以靶向方式使用。然而，它们不需要靶向性分子来集中到靶细胞或组织中。

增强渗透和滞留(“EPR”)效应事实上造成了通过静脉内途径(一种可能的给药途径)注射后的给定时间之后，纳米粒子在肿瘤块中的被动积累。确实观察到了肿瘤血管与正常毛细血管有相当大差异，并且它们的血管“渗漏性”促进了纳米粒子在正常组织中不常见的选择性外渗。缺乏有效的肿瘤淋巴引流阻止了穿入的纳米粒子的清除并促进它们的积累。因此，本发明的纳米粒子在静脉内给药后成功地靶向原发以及转移肿瘤。

本发明的纳米粒子还可以有利地通过肿瘤内或动脉内途径给药。

因此，本发明的目的是使用本发明的纳米粒子或这种纳米粒子的群来改变或破坏靶细胞、组织或器官。

本文公开的具体实施方案涉及金属纳米粒子群在制备旨在当靶哺乳动物细胞暴露于电离辐射时扰乱、改变或破坏所述细胞的药物组合物中的应用，其中所述纳米粒子由原子序数(Z)为至少25的金属制成，并且所述纳米粒子群的平均最大尺寸在约80至105nm之间，并且还涉及相应的治疗方法。

在本文中特别公开了用于治疗癌症的本发明的产品，特别是纳米粒子和金属纳米粒子群。

另一个实施方案是基于药物组合物，特别是正如从整篇描述中可以明显看出的，旨在当哺乳动物中的靶细胞暴露于电离辐射时扰乱、改变或破坏所述细胞的药物组合物，所述药物组合物包含本文中限定的金属纳米粒子群以及可药用载体或赋形剂，其中所述纳米粒子由原子序数(Z)为至少25的金属制成，并且所述纳米粒子群的平均最大尺寸在约80至105nm之间。

另一个实施方案涉及使用本发明的纳米粒子、金属纳米粒子群或组合物，预防或治疗动物的癌症或减轻癌症的症状，其中将所述动物暴露于辐射、特别是本文中所限定的电离辐射。

本公开特别涵盖了通过向对象给药本发明的金属纳米粒子、金属纳米粒子群或包含这种纳米粒子群的组合物，并将所述对象暴露于辐射、特别是电离辐射，以预防或治疗对象的癌症或减轻癌症症状的方法，所述对象是动物，特别是哺乳动物，优选为人类。

另一方面，本公开提供了试剂盒，其包含本文中描述的产品、即纳米粒子和组合物中的任一种或多种，以及提供了产品使用说明的标注。

附图简述

图1A和1B：

图1A显示了表1中描述的金纳米粒子的透射电子显微镜(TEM)图像(参见实施例1)。

图1B显示了表1中描述的金纳米粒子(GNP)的尺寸分布。

图2A和2B：通过电子衍射确定的所制备的金纳米粒子的晶体结构。

图2A显示了参比纳米粒子(具有立方面心(Cubic Face Center)结构的金纳米粒子用作参比以建立透射电子显微镜的相机常数(Lλ))和实施例1的金纳米粒子(GNP)的电子衍射图案。

图2B报告了金纳米粒子(来自实施例1)的指数化，电子衍射图案显示了金纳米粒子的立方面心(CFC)结构。

电子衍射图案的指数化由下列步骤组成：

1)从参比的电子衍射图案建立相机常数，

2)测量来自实施例1的金纳米粒子的电子衍射图案的环直径(D1，D2，...，Dn)，

3)使用表达式d_hkl＝L*λ/(Dn/2)计算d_hkl，

4)使用现有的结构数据基础对每个环进行指数化。

图3A和3B：

图3A显示了使用200KVp X-射线能量束辐照的HT29结肠癌细胞，在细胞水平下不存在(阴性对照)或存在12μM、20μM和130μM金的情况下，粒度为15nm的金纳米粒子(来自实施例1的金-15)的产克隆存活测定。辐射剂量从0(无辐射)至4Gy变化。

HT29的阴性对照：正方形点

HT29与12μM的金-15纳米粒子：交叉点

HT29与20μM的金-15纳米粒子：三角形点

HT29与130μM的金-15纳米粒子：圆形点

图3B显示了使用200KVp X-射线能量束辐照的HT29结肠癌细胞，在细胞水平下不存在(阴性对照)或存在17μM、52μM和119μM金的情况下，粒度为80nm的金纳米粒子(来自实施例1的金-80)的产克隆存活测定。辐射剂量从0(无辐射)至4Gy变化。

HT29的阴性对照：正方形点

HT29与17μM的金-80纳米粒子：交叉点

HT29与52μM的金-80纳米粒子：三角形点

HT29与119μM的金-80纳米粒子：圆形点

图4A和4B：对于细胞水平下相同的金浓度、在本文中也称为每个靶细胞的金浓度来说，金纳米粒子尺寸对剂量增强系数(DEF)的影响。

图4A

细胞水平下的金(Au)浓度以μM表示。

金浓度低于20μM([Au]＜20μM)：交叉点

金浓度在20μM至83μM之间(20μM≤[Au]≤83μM)：菱形点

金浓度在95μM至148μM之间(95μM≤[Au]≤148μM)：正方形点

金浓度为400μM([Au]＝400μM)：三角形点

图4B

每个靶细胞的金(Au)浓度表示如下：

细胞∶Au＝1∶X(X用nmole表示)

细胞∶Au≤1∶15×10^-5：交叉点

1∶20*10^-5≤细胞∶Au≤1∶45×10^-5：菱形点

1∶60*10^-5≤细胞∶Au≤1∶110×10^-5：正方形点

细胞∶Au＝1∶182×10^-5：三角形点

图5A和5B：

图5A显示了金纳米粒子尺寸≥80nm的阈值效应。细胞水平下的金浓度在20μM至83μM之间。

相应的每个靶细胞的金浓度在20×10^-5nmole至45×10^-5nmole之间。

建立了两条线性趋势曲线，在它们相应的斜率值之间存在显著差异：尺寸在15nm至60nm之间的金纳米粒子显示出斜率为0.0033的线性趋势曲线。尺寸在80nm至105nm之间的金纳米粒子显示出斜率为0.0384的线性趋势曲线。所述两条曲线显示出的斜率比约为10。当认为DEF由金属纳米粒子尺寸引起时，当所述尺寸约为80nm或以上时观察到阈值效应。

图5B显示了金纳米粒子尺寸≥80nm的阈值效应。细胞水平下的金浓度在95μM至148μM之间。

相应的每个靶细胞的金浓度在60×10^-5nmole至110×10^-5nmole之间。

建立了两条线性趋势曲线，在它们相应的斜率值之间存在显著差异：尺寸在15nm至60nm之间的金纳米粒子显示出斜率为0.0025的线性趋势曲线。尺寸在80nm至105nm之间的金纳米粒子显示出斜率为0.0865的线性趋势曲线。所述两条曲线显示出的斜率比约为30。当认为DEF由金属纳米粒子尺寸引起时，当所述尺寸约为80nm或以上时观察到阈值效应。

图6A和6B：

图6A显示了对于实施例1的表1中描述的每种金纳米粒子来说，X-射线衰减随金浓度的变化。

对于金-15来说，HU值随[Au](g/L)的变化：菱形点

对于金-30来说，HU值随[Au](g/L)的变化：正方形点

对于金-60来说，HU值随[Au](g/L)的变化：三角形点

对于金-80来说，HU值随[Au](g/L)的变化：交叉点

对于金-105来说，HU值随[Au](g/L)的变化：+点

图6B显示了金纳米粒子尺寸对X-射线衰减的影响。从图6A获得每种金纳米粒子尺寸的斜率，并报告为随金纳米粒子尺寸的变化。

图7A和7B：

图7A显示了与金纳米粒子(来自实施例1的金-60)温育不到5分钟的HT29细胞在4Gy辐射(SF4)下的存活分数。

图7B显示了与金纳米粒子(来自实施例1的金-60)温育约12小时的HT29细胞在4Gy辐射(SF4)下的存活分数。

发明详述

本发明人意外发现，由金属、优选原子序数(Z)至少25的金属制成、并且具有约80至105nm之间的尺寸作为最大尺寸的纳米粒子，能够显著增强旨在扰乱、改变或破坏动物中的异常细胞、组织或器官的局部辐射的治疗效果。

使用本发明的金属纳米粒子，第一次能够观察到放疗效能的强烈增强(参见例如图4A、4B、5A和5B)。

在本发明的精神中，术语“纳米粒子”是指尺寸在纳米范围内的产品，特别是合成产品。

在本发明的情形中，术语尺寸是指纳米粒子的金属核心的最大尺寸。典型地，最大尺寸是圆形或球形纳米粒子的直径或卵形或椭圆形纳米粒子的最长长度。

纳米粒子的形状可以是例如圆、扁平、细长、球、卵圆或椭圆等。形状可以由生产方法决定或控制，并由本技术领域的专业人员根据所需应用进行调整。

由于粒子的形状能够影响其“生物相容性”，因此优选具有十分均匀形状的粒子。因此，出于药物动力学原因，基本上球形、圆形或卵形的纳米粒子是优选的。球形或圆形是特别优选的。

正如实验部分所证实的，本发明的纳米粒子有利的最大尺寸在约70nm至约130nm之间，有利地在约75或80nm至约105nm之间，优选在约75nm至约95nm之间或约80nm至约90或95nm之间。

本发明人第一次出人意料地证实，在本发明的情形中，纳米粒子穿透到靶细胞、例如肿瘤细胞中，对于扰乱、破坏或改变所述细胞来说不是必需的。事实上，在其中纳米粒子被靶细胞合并或与所述细胞相接触、特别是外部接触这两种条件下，本发明人观察到了对靶细胞的等同效应。

在本文中，本发明人描述了本文公开的金属纳米粒子或这种金属纳米粒子的群在制备旨在当哺乳动物靶细胞暴露于电离辐射时扰动、扰乱、改变或破坏所述细胞的药物组合物中的应用。在所述群中，纳米粒子由金属制成，所述金属优选具有至少25的原子序数(Z)。有利地，群中纳米粒子的平均最大尺寸在约70nm至约130nm之间，有利地在约75或80nm至约105nm之间，优选在约75nm至约95nm之间或约80nm至约90或95nm之间。

正如前面提到的，在由按照本技术领域的方法(如下面进一步描述的)获得的纳米粒子构成的典型的纳米粒子群中，群中纳米粒子的平均最大尺寸在约80nm至约105nm之间，群中纳米粒子的最大尺寸在约60nm至155nm之间，典型在60、65、70、75或80至105、110、130、140、150或155nm之间。

换句话说，群的95％(2σ)由最大尺寸在约60nm至约155nm之间的纳米粒子构成，或群的68％(1σ)由最大尺寸在约70nm至约130nm之间的纳米粒子构成。

本发明的金属纳米粒子由金属制成，所述金属优选具有至少25、有利地至少40或50、更优选至少60或70的原子序数。

这样的金属可以选自金(Au-Z＝79)、银(Ag-Z＝47)、铂(Pt-Z＝78)、钯(Pd-Z＝46)、锡(Sn-Z＝50)、钽(Ta-Z＝73)、镱(Yb-Z＝70)、锆(Zr-Z＝40)、铪(Hf-Z＝72)、铽(Tb-Z＝65)、铥(Tm-Z＝69)、铈(Ce-Z＝58)、镝(Dy-Z＝66)、铒(Er-Z＝68)、铕(Eu-Z＝63)、钬(Ho-Z＝67)、铁(Fe-Z＝26)、镧(La-Z＝57)、钕(Nd-Z＝60)、镨(Pr-Z＝59)及其混合物。

金属优选选自金(Au)、银(Ag)、铂(Pt)、钯(Pd)、锡(Sn)、锆(Zr)和铁(Fe)。

原子序数(也称为质子数)是原子的核中存在的质子数量。它在传统上用符号Z表示。原子序数独一无二地指定化学元素。在中性电荷的原子中，原子序数等于电子数。

Z参与纳米粒子的输入辐射吸收能力。

在本发明的优选实施方案中，金属纳米粒子由金制成。

在本发明中，在特定纳米粒子或特定纳米粒子群中也可能存在前面指出的金属的混合物。

为了限制纳米粒子与周围环境的相互作用，具有低比表面积(SSA)的纳米粒子是更加优选的。

比表面积(SSA)是固体的材料性质，其度量了每单位质量的总表面积(m²/g)。SSA表现为影响纳米粒子生物系统界面的重要因素；已经报道，在相等的质量-剂量基础上，当在动物中给药时，超细粒子与细粒子相比引起更多副作用，例如炎症(参见例如Nel等(NatureMaterials 8(2009)543)。

正如下面所解释的，对于SSA来说，最大尺寸在约80至105nm之间的金属纳米粒子是特别有利的。

出于本发明的目的，纳米粒子的比表面积在例如约1m²/g至50m²/g之间。比表面积优选在2m²/g至20m²/g之间。

球形纳米粒子的比表面积可以使用下列等式估算(SSA＝3000/(d×r))，d是金属纳米粒子的密度，r是纳米粒子的半径。

因此，对于密度为19.32的金纳米粒子来说，粒度为15、30、60、80和100nm的球形金纳米粒子将产生分别为20.7、10.3、5.2、3.9和3.1m²/g的比表面积。

对于密度为7.87的铁纳米粒子来说，粒度为15、30、60、80和100nm的球形铁纳米粒子将产生分别为50.8、25.4、12.7、9.5和7.6m²/g的比表面积。

在本文中，本发明人公开了本发明的纳米粒子的令人吃惊的效能主要是由于它们的尺寸。尺寸为至少80nm的纳米粒子与尺寸更小的纳米粒子、特别是60nm或更小的纳米粒子相比，当暴露于电离辐射时确实能够对靶细胞产生更多损伤。因此，本发明人在此强调了纳米粒子尺寸对电离辐射下的细胞扰乱的重大和直接影响，当本文中描述的尺寸达到并优选超过80nm阈值时，所述尺寸有利于对哺乳动物中治疗性应用(参见实验部分)。在本文中鉴定的尺寸范围内，纳米粒子尺寸越大，它们产生细胞损伤的能力越有效。

这种机制的可能解释可能是由于纳米粒子以更好或不同的方式递送所捕获的能量(电离辐射)的能力。

在实施例2和3中，为了区分金纳米粒子尺寸的影响与金浓度对纳米粒子在辐射下诱导的治疗效果的影响，本发明人使用金纳米粒子尺寸作为唯一可调节参数执行所有体外测定法。本发明人所获得的实验结果揭示了纳米粒子尺寸(对于恒定的金属浓度来说)对治疗效能(杀死细胞和/或阻止细胞分裂的能力)的放大的惊人影响。

为了在电离辐射下产生有效治疗效果，使用纳米粒子尺寸≥80nm的金属纳米粒子需要每个靶细胞的金属浓度，比当使用纳米粒子尺寸约为60nm或以下的金属纳米粒子时所需的每个靶细胞的金属浓度低约2至7倍之间，特别是4至7倍或2至5倍之间(对于GNP来说参见实施例2和3)。

因此，得益于本发明，现在有可能显著并有利地减少给药到患者的金属量，同时具有相似的治疗效能并伴有有害副作用的降低。

本发明还允许显著减少放疗治疗情形中、特别典型的是如到目前为止在临床上执行的多分次辐射方案过程中给药步骤的数量。事实上，本专利申请中描述的纳米粒子大得足以有利于它们滞留在肿瘤组织中。在文献中已观察到较大金属纳米粒子尺寸显著降低靶组织清除率(CHANG等，Cancer Sci.99(2008)1479；Hainfeld等，Phys.Med.Biol49(2004)N309)。

对于在体外执行的应用来说，所需的电离辐射剂量优选为约0.05戈瑞至约16戈瑞之间、优选为约0.05戈瑞至约6戈瑞之间的剂量。

对于特别是局部、离体或在体内执行的应用来说，剂量在大于约0.05戈瑞至小于约16或30戈瑞之间。

根据目前的实践，在人类中总电离辐射在约1.5戈瑞至最高约85戈瑞的范围内。根据目前的实践，还可以在人类中提供约40戈瑞的附加增强辐射。

投送的辐射的总剂量可以按照不同安排提供，例如单剂、分次剂、超分次剂等。

正如在实验部分中所证实的，当与使用较小尺寸的辐射过的纳米粒子所获得的效果相比时，本文描述的辐射过的纳米粒子提供了明显的治疗效果提高。

有利地，本发明的纳米粒子是生物相容的，也就是说，它们可以安全地给药于动物体、典型为哺乳动物、特别是人类，以提供它们的治疗效果。可以例如通过构成粒子的金属的性质和/或通过任选的涂层来确保所述生物相容性。

无论给药途径如何，本发明的优选纳米粒子包覆有生物相容性涂层。当本发明的纳米粒子通过静脉内(IV)途径给药于对象时，这样的生物相容性涂层对于在前面描述的EPR效应的情形中优化纳米粒子的生物分布来说，是特别有利的。为了避免粒子表面与任何识别要素(巨噬细胞、调理素等)的相互作用，纳米粒子的完全生物相容性涂层是优选的，特别是在IV的情形中。“完全涂层”意指存在非常高密度的生物相容性分子，能够在粒子表面上产生至少完整的单层。所述涂层造成纳米粒子所谓的“隐身效果”。

生物相容性涂层尤其允许或有利于(取决于所选的制造纳米粒子的金属)纳米粒子在生物相容悬液中的稳定性，所述悬液例如生理流体(血液、血浆、血清等)、药物给药所需的任何等渗介质或生理介质，例如包含葡萄糖(5％)和/或NaCl(0.9％)的介质。

这样的生物相容性涂层通过用表面处理剂处理纳米粒子来获得。

可以通过生物相容悬液中的金属纳米粒子的动态光散射，或通过在将生物相容悬液中的金属纳米粒子在0.22μm滤膜上过滤之前和/或之后对金属元素进行ICP-MS定量，来证实稳定性。

有利的是，所述涂层在体内保护粒子的完整性，确保或提高其生物相容性，并促进其任选的功能化(例如用间隔分子、生物相容聚合物、靶向剂、蛋白质等)。事实上，本发明的特定纳米粒子还包含能够特异性靶向生物组织或细胞的表面组分。这样的表面组分优选为允许纳米粒子与靶细胞上存在的识别成分相互作用的靶向剂。一旦在纳米粒子在肿瘤中积累之后，这样的靶向剂就可以发挥作用。由于靶向剂的构象将负责其与靶的相互作用，因此所述靶向剂的密度应该被仔细控制。靶向剂的高密度确实能够扰乱它的构象，结果扰乱它被靶细胞的识别(参见例如J A Reddy等，Gene therapy 9(2002)1542；Ketan B.Ghaghada等，Journal of Controlled Release 104(2005)113)。此外，高的靶向剂密度可能有利于纳米粒子在血管中循环期间被网状内皮系统(RES)清除。

生物相容性涂层可以由任何无定形或晶体结构构成。

一般来说，涂层可以是不可生物降解的或可生物降解的。两种选项都可用于本发明的目的。

不可生物降解的涂层的实例是选自下列的一种或多种材料或表面处理剂：二氧化硅、氧化铝、糖(例如琼脂糖)、磷酸盐、硅烷、硫醇、两性离子化合物、脂类、饱和的碳聚合物(例如聚氧乙烯)和无机聚合物、网状或非网状、改性或未改性的聚合物(例如聚甲基丙烯酸酯或聚苯乙烯)及其组合。

可生物降解的涂层的实例是例如选自下列的一种或多种材料或表面处理剂：改性或未改性、天然或非天然的生物分子，以及改性或未改性、天然或非天然形状的生物分子聚合物。生物聚合物可以是磷脂、糖类、寡糖或多糖，其可以是多硫酸化的或者不是，例如葡聚糖。

上面提到的材料、化合物或表面处理剂可以单独使用或以复合或非复合、共价或非共价的组合物、混合物或集合物使用，任选与其他化合物组合。此外，还可以使用任一种上面提到的材料，所述材料是天然水溶性或脂溶性的，或被人工改性以变成水溶性或脂溶性的。

生物相容性涂层优选包含选自无机试剂、有机试剂及其混合物或其组合的化合物，或由它们制成。

适合的无机试剂可以选自氧化物、氢氧化物和羟基氧化物。无机试剂可以包含例如硅、铝、钙和/或镁。

这样的试剂可用于使纳米粒子带上正电荷或负电荷，以便调节所述纳米粒子与生物介质的相互作用。

选自例如镁和钙的无机试剂将在pH 7下在纳米粒子表面产生正电荷。

例如，硅可用于在pH 7下在纳米粒子表面产生负电荷。

适合的有机试剂可以是包含能够与本发明的纳米粒子相互作用的官能和赋予所述纳米粒子生物相容性的官能的任何试剂。

包含能够与纳米粒子相互作用的官能的试剂可以是例如羧酸根(R-COO^-)、硅烷(R-Si(OR)₃)、膦酸官能团(R-PO(OH)₂)、磷酸官能团(R-O-PO(OH)₂)或硫醇官能团(R-SH)。

包含能够赋予本发明的纳米粒子生物相容性的官能的试剂可以具有立体官能团和/或静电官能团。这样的具有立体官能团的试剂可以选自聚乙二醇(PEG)、聚氧乙烯、聚乙烯醇、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺(聚(N-异丙基丙烯酰胺))、聚脲、生物聚合物或多糖例如葡聚糖、木聚糖、纤维素、胶原蛋白和两性离子化合物例如聚磺基甜菜碱等。

具有正静电官能的试剂可以是胺类，例如氨基丙基三乙氧基硅烷、聚赖氨酸或2-氨基乙硫醇。

具有负静电官能的试剂可以选自磷酸盐(例如聚磷酸盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐等)、羧酸盐(例如柠檬酸盐或二羧酸、特别是琥珀酸盐)和硫醇(例如羧基封端的硫醇，例如巯基琥珀酸)。

涂层还可以包含允许任何目标分子与粒子表面结合的不同官能团(或接头链段)，例如能够特异性靶向生物组织或细胞的表面组分。

本发明的纳米粒子的典型实例是由金制成的纳米粒子。这样的金纳米粒子可以另外包含由硫醇化合物例如聚乙二醇-硫醇(PEG-SH)、硫代葡萄糖或羧酸盐化合物例如柠檬酸盐制成的涂层作为生物相容性涂层。

本发明的纳米粒子的另一个实例是由金制成的纳米粒子，其包含由带有选自聚乙烯、胺或羧基的至少一个官能团的硫醇试剂制成的涂层或由柠檬酸盐构成的涂层作为生物相容性涂层。

本发明的纳米粒子提供了易于制备的优点。事实上，生产金属纳米粒子的方法在本技术领域中是公知的(参见例如Brian L.Cushing等(Chem.Rev.104(2004)3893)。典型通过将金属元素在水性或非水性溶液中沉淀来获得金属纳米粒子，所述沉淀涉及金属阳离子的化学还原。生产金属纳米粒子的另一种可能方式是通过辐射辅助的还原。

本发明的另一个目的涉及生产金属纳米粒子或金属纳米粒子群、例如上文中所限定的金属纳米粒子或金属纳米粒子群的方法，所述方法包含：

-提供本文中所指定的金属元素，优选为原子序数(Z)等于或高于25的金属元素，

-通过在存在还原剂的情况下将所述金属元素在介质中沉淀，从所述金属元素制备金属纳米粒子，以及任选地

-向介质加入络合剂(络合剂在添加还原剂之前、期间或之后加入)，还原剂和络合剂任选为相同化合物，以及任选地

-使用上文中描述的表面处理剂对纳米粒子进行涂层。

在本发明中典型使用的介质可以选自水性溶液、醇性溶液等。

典型使用的还原剂可以选自柠檬酸盐、抗环血酸、2-巯基琥珀酸。

典型使用的络合剂可以选自柠檬酸盐、硫醇化合物例如2-巯基琥珀酸等。

有利地，涂层步骤由使纳米粒子与如上限定的表面处理剂相接触所构成。

在具体实施方案中，生产纳米粒子群的方法包含优选采取下列次序的下列步骤：

a)提供本文中指定的金属元素、优选为原子序数(Z)等于或高于25的金属元素作为前体，

b)在还原性化合物存在下，优选通过调整步骤a)的前体和/或还原性化合物浓度和/或温度，将所述前体在如上限定的极性介质中沉淀，

c)任选在沉淀步骤b)之前、期间或之后，在极性介质中添加络合剂，络合剂与还原剂任选为相同化合物，

d)任选清洗在步骤b)或c)结束时获得的悬液，以除去任何杂质、还原剂和/或络合剂，

e)任选浓缩在步骤d)结束时获得的悬液，以及

f)任选对纳米粒子进行涂层。

如上所述的群在给药于对象之前，可以进一步提交到制剂步骤。

在具体实例中，生产本发明的纳米粒子、所述纳米粒子由金属制成的方法，优选依序包含下列步骤：

a)在还原剂(例如柠檬酸盐)存在下，在50℃至100℃之间的介质温度下，将金的氯化物前体(例如特别是HAuCl₄或KAuCl₄)溶液在水性溶液中进行沉淀，

b)任选清洗获得的金属纳米粒子悬液以除去任何杂质，

c)任选浓缩由此获得的金属纳米粒子悬液，

d)任选通过将所述金属纳米粒子与如上限定的表面处理剂相接触，对所述金属纳米粒子进行包衣。

本发明的另一个目的是基于包含纳米粒子、例如上文中所限定的和/或可以通过本文描述的方法获得的纳米粒子的任何组合物。尽管不是强制性的，但本发明的组合物中的粒子优选具有如上所指出的相当均匀的形状。

使用本文中所描述的方法，可以获得包含高浓度金属元素(例如300g/L)的生物相容性悬液。

本发明的具体目的涉及药物组合物，其包含例如上文中所限定的纳米粒子和任选的可药用赋形剂或介质。

组合物可以采取固体、液体(粒子在悬液中)、气溶胶、凝胶、糊剂等的形式。优选的组合物采取可注射制剂的形式，优选采取液体形式。

使用的赋形剂或介质可以是用于这种应用类型的任何经典载体，例如盐水、等渗、无菌、缓冲溶液等。它们也可以包含稳定剂、甜味剂、表面活性剂等。它们可以通过使用已知的药物配制技术配制成例如安瓿、气溶胶、瓶、片剂、胶囊。

有利地，每个靶细胞待给药的金属浓度在约10^-7nmole(细胞∶[金属]＝1∶10^-7(nmole))至约5×10^-1nmole(细胞∶[金属]＝1∶5×10^-1(nmole))之间。更优选，每个靶细胞的金属浓度在约10^-6nmole(细胞∶[金属]＝1∶10^-6(nmole))至约2×10^-1nmole(细胞∶[金属]＝1∶2×10^-1(nmole))之间。

更优选，每个靶细胞的金属浓度在约10^-6nmole(细胞∶[金属]＝1∶10^-6(nmole))至约10^-3nmole(细胞∶[金属]＝1∶10^-3(nmole))之间，或在约10^-6nmole(细胞∶[金属]＝1∶10^-6(nmole))至约10^-4nmole(细胞∶[金属]＝1∶10^-4(nmole))之间。

在本文所描述的组合物中，金属的适合或所需浓度在每克靶哺乳动物细胞、例如特别是哺乳动物肿瘤细胞约1mg至约100mg金属之间，典型地在每克靶哺乳动物细胞约1mg或5mg至50mg金属之间。

一般来说，液体形式的组合物包含0.01g/L至300g/L金属之间，优选为至少1g/L、5g/L、10g/L、20g/L、40g/L、60g/L、80g/L、100g/L、150g/L、200g/L或250g/L。

金属定量理想地是通过ICP-MS进行。

上面指定的金属浓度随着患者对象、所选的给药途径、靶细胞的性质等而变，并且本技术领域的人员容易进行调整。

本发明的纳米粒子、纳米粒子群和组合物是可用于许多领域、特别是人类或兽医医学中的产品。

本发明的目的是使用本文中描述的产品改变、破坏靶细胞、组织或器官。

取决于电离辐射的能量，粒子能够扰乱细胞和/或组织，或破坏它们。

因此，本发明的具体目的是基于本发明的金属纳米粒子或纳米粒子群在制备旨在当动物中的靶细胞暴露于辐射、特别是电离辐射时改变、破坏所述靶细胞的药物组合物中的应用，以及相应的治疗方法。

药物组合物还可以包含不同于本文中所描述的纳米粒子或纳米粒子群、并且也旨在治疗癌症的其他治疗性化合物。

本发明的另一个具体目的是基于在体外、离体或体内诱导或引起靶细胞的扰乱、裂解、凋亡或破坏的方法，所述方法包含将细胞、特别是靶细胞与例如上文中所限定的一种或多种纳米粒子在足以允许纳米粒子与所述细胞相互作用的时间内进行接触，以及将细胞暴露于辐射，适合的辐射特别是电离辐射，优选为X-射线、γ-射线、放射性同位素和/或电子束，所述暴露诱导或引起了所述靶细胞的扰乱、裂解、凋亡或破坏。

靶细胞可以是任何病理细胞，也就是说参与病理机制的细胞，例如增殖性细胞例如肿瘤细胞、狭窄性细胞(成纤维细胞/平滑肌细胞)或免疫系统细胞(病理性细胞克隆)。优选的应用是基于恶性细胞或组织的治疗(例如破坏或功能性改变)。

就此而言，本发明的具体目的是基于上文中所限定的纳米粒子或这样的纳米粒子群在生产旨在与电离辐射(如前所限定)组合使用时用于治疗特别是癌症的药物组合物中的应用。

本公开还涵盖了使用组合物、纳米粒子或纳米粒子群，例如上文中所限定的，以在动物的癌细胞暴露于辐射、特别是如上所限定的电离辐射时，预防或治疗癌症或减轻癌症的症状。

本发明的另一个具体目的是基于在体外、离体或体内诱导或引起靶细胞、特别是癌细胞的扰乱、裂解或破坏的方法，所述方法包含将靶细胞与一种或多种纳米粒子、例如上文中所限定的一种或多种纳米粒子，在足以允许纳米粒子与所述细胞相互作用的时间内进行接触，以及将细胞暴露于辐射、特别是如上所限定的电离辐射，所述暴露诱导或引起了所述细胞的扰乱、裂解或破坏。

本发明的另一个目的涉及用于在对象或患者中预防或治疗病症、特别是癌症或缓解病症的症状的方法，所述方法包含在允许纳米粒子与异常细胞、特别是癌细胞相互作用(进行接触)的条件下，向患有所述病症的患者给药例如上文中所限定的纳米粒子、纳米粒子群或组合物，并随后通过将所述对象暴露于电离辐射来治疗对象，所述辐射引起患者的异常细胞的改变、扰乱或功能破坏，从而预防或治疗癌症。

经典的癌症管理系统性地蕴涵了同时进行的多种方式的治疗(例如放疗与化疗的组合)。

在放疗的情形中，本文所描述的经历电离辐射的纳米粒子，可以与不同的癌症治疗方案联合使用。这样的方案可以选自手术、放射手术、化疗、包含给药细胞抑制剂、细胞毒性剂的治疗、靶向疗法、疫苗以及旨在治疗癌症的任何其他生物或无机产品。

意外的是，本文描述的纳米粒子还可单独用于化疗的情形中，并且观察到的效能增加。

本发明可用于治疗任何类型的恶性肿瘤，例如血液肿瘤或恶性肿瘤以及实体肿瘤，特别是上皮、神经外胚层或间质来源的实体肿瘤。此外，纳米粒子可用于治疗经典使用和/或适用放疗的恶变前病变或特定良性疾病。

在治疗的情形中，本发明适用于原发肿瘤或继发性侵袭、局部区域性或远处转移肿瘤，而在预防的情形中，用于避免中枢神经系统的激发恶性牵连，例如观察到的来自黑素瘤、肺癌、肾癌、乳腺癌等的侵袭(转移)。

纳米粒子可以在整个抗癌治疗期间的任何时间使用。它们可以例如作为新辅助疗法(在癌切除术的手术干预之前)或作为辅助疗法(在手术后)给药。

纳米粒子还可用于不能通过手术移除的晚期肿瘤。

正如本文中解释的，可以在粒子给药后的任何时间，在一个或多个时候，使用任何目前可用的放疗系统来施加辐射。

本文描述的纳米粒子特别打算用于治疗经典用放疗进行治疗的癌症。这样的癌症具体来说可以选自皮肤癌，包括与AIDS相关的恶性赘生物、黑素瘤；中枢神经系统肿瘤，包括大脑、脑干、小脑、垂体、椎管、眼和眼眶；头颈部肿瘤；肺癌；乳腺癌；胃肠肿瘤例如肝和肝胆管癌、结肠、直肠和肛门癌、胃、胰腺、食管癌；男性泌尿生殖肿瘤例如前列腺、睾丸、阴茎和尿道癌；妇科肿瘤例如子宫颈、子宫内膜、卵巢、输卵管、阴道和外阴癌；肾上腺和腹膜后肿瘤；不论任何位置的骨和软组织肉瘤；淋巴瘤，骨髓瘤；白血病和儿科肿瘤例如Wilm氏肿瘤、成神经细胞瘤、中枢神经系统肿瘤、尤文氏(Ewing)肉瘤等。

粒子可以在大范围的辐射总剂量内活化。

确定了任何疾病/解剖位点/疾病阶段/患者背景/患者年龄(儿童、成人、老年患者)的量和安排(以单剂或以分次或超分次方案等计划和发送辐射)，并且它们构成了对于任何具体情况的护理标准。

可以在粒子给药后的任何时间，在一个或多个时候，使用任何目前可用的放疗系统来施加辐射。纳米粒子可以通过不同途径来给药，例如局部(特别是肿瘤内(IT))、皮下、静脉内(IV)、真皮内、动脉内、气道(吸入)、腹膜内、肌肉内和口服途径(经口)。纳米粒子还可以在腔内例如肿瘤切除术后肿瘤床的实际腔内给药。

在适合时，可以执行重复注射或给药。

术语“治疗”是指为了校正异常功能、预防疾病、改善病理体征、例如特别是降低异常组织特别是肿瘤的尺寸或生长、控制所述尺寸或生长、抑制或破坏异常细胞或组织、减缓疾病进展、稳定疾病并延迟癌症进展、减少转移肿瘤的形成、疾病的逆转或完全减退(在例如癌症的情形中)等而采取的任何行动。

正如前面指出的，适合的辐射或电离源优选为电离辐射，并且可以有利地选自X-射线、γ-射线、电子束、离子束和放射性同位素或放射性同位素发射。X-射线是特别优选的电离源。

电离辐射典型为约2KeV至约25000KeV，特别是约2KeV至约6000KeV(LINAC源)或约2KeV至约1500KeV(例如钴60源)。使用X-射线源，特别优选的电离辐射典型为约50KeV至约12000KeV，例如约50KeV至约6000KeV。

一般并且非限制性地来说，在不同情况下可以使用下述X-射线来激活纳米粒子：

-50至150keV的X-射线，其对于浅表靶组织特别有效；

-200至500keV的X-射线(正电压)，其可以穿透厚度为6cm的组织；

-1000keV至25,000keV的X-射线(兆伏)。例如用于治疗前列腺癌的纳米粒子的电离可以通过5个聚焦的能量为15,000keV的X-射线来进行。

放射性同位素还可以用作电离辐射源(被称为镭疗法或近距疗法)。具体来说，可以有利地使用碘I¹²⁵(t1/2＝60.1天)、钯Pd¹⁰³(t1/2＝17天)、铯Cs¹³⁷和铱Ir¹⁹²。

在放射免疫治疗的情形中，免疫放射性核素(或免疫放射标记的配体)也可以用作电离辐射源。用于放射免疫治疗的适合的放射性核素可以例如选自¹³¹I、¹⁸⁶Re、¹⁷⁷Lu或⁹⁰Y。

带电荷粒子例如质子束、离子束例如碳、特别是高能离子束和/或中子束，也可以用作电离辐射源。

能量在4MeV至25Mev之间的电子束也可以用作电离辐射源。

可以使用特定的单色辐射源，以便选择性地产生具有接近或对应于金属纳米粒子原子的所需X-射线吸收限的能量的X-射线。

优选，电离辐射源可以选自线性加速器(LINAC)、钴60和近距治疗源。

术语“组合”是指当与本发明的纳米粒子相接触的目标细胞、组织或器官被限定的源活化时获得了所寻求的效果。然而，粒子和射线不必同时、也不必按照相同方案施用。

本公开还提供了包含本文所述纳米粒子或组合物中的任一种或多种的试剂盒。典型地，试剂盒包含至少一种本发明的纳米粒子或纳米粒子群。一般来说，试剂盒还包含装填有本发明的药物组合物的一种或多种成分的一个或多个容器。伴随这样的容器可以提供标签贴士，提供使用本发明的纳米粒子、纳米粒子群或组合物的产品使用说明。

在下面的实施例中，本发明的其他特点和优点将变得明显，提供所述实施例是出于说明的目的，而不是为了限制。

实验部分

实施例1：具有不同尺寸的金纳米粒子的合成和物理化学表征

通过用在水性溶液中用柠檬酸钠还原氯化金来获得金纳米粒子。方案改编自G.Frens Nature Physical Science 241(1973)21。

在典型的实验中，将HAuCl₄溶液加热至沸腾。然后加入柠檬酸钠溶液。将得到的溶液继续保持沸腾5分钟的时间。

通过仔细调整柠檬酸盐与金前体的比率，将纳米粒子尺寸调节为15直至105nm(参见表1)。

然后使用超滤装置(来自于Millipore的Amicon搅拌池8400型)，使用30kDa纤维素膜，对如此制备的金纳米粒子悬液进行浓缩。

最后，将得到的悬液在层流罩下通过截留值为0.22μm的滤膜(来自Millipore的PES膜)进行过滤，并储存在4℃下。

通过ICP-MS测定金含量，并表示成以g/L计的[Au]。

使用透射电子显微术(TEM)，通过计数200个以上粒子来测定粒度(图1A)，取最长的纳米粒子尺寸进行尺寸测量。建立直方图，并报告了平均值和标准偏差(图1B)。

表1：

结论

表1中描述的金纳米粒子都按照相同的合成方法来制备，以确保相同的表面特征性质。

TEM图像显示出合成的金纳米粒子的形状都是球形和/或卵形的。

TEM电子衍射图案显示所有合成的金纳米粒子呈现CFC结构。

因此，只有金纳米粒子的尺寸变化，其具有符合现有技术的良好表征的平均粒度和尺寸多分散性。

实施例2：当在细胞水平下金浓度恒定时，金纳米粒子尺寸对体外效能的影响(产克隆存活测定法)

方案

为了调查内化到细胞中或结合于细胞的金纳米粒子(GNP)(在下文中表述为细胞水平的金浓度)增强辐射响应的，本发明人使用了如下所述的特异性产克隆存活测定法：

将HT29细胞以20 000个细胞/cm²的密度铺板。以μM范围内的各种金浓度向培养基添加GNP。在1小时至24小时之间的温育时间后，除去细胞上清液。然后将细胞用PBS简单清洗以除去所有未附着于细胞或未内化到细胞中的GNP。接下来本发明人进行了细胞胰蛋白酶处理，并使用血细胞计数器对细胞数量进行计数。

对于每种条件，本发明人取100000个细胞/mL直至220000个细胞/mL的样品，通过ICP-MS进一步分析金浓度。

细胞水平的金(Au)浓度(每单位体积的金原子数量)用μM表示。

该参数也可以根据每个靶细胞的金(Au)浓度表示如下：

细胞∶Au＝1∶X(X以nmole表示)

根据下列计算：

细胞＝1

将其他细胞铺板(根据处理条件，以300直至1000个细胞/孔的密度)以执行产克隆测定。在细胞附着于板后，它们或者不被辐射(模拟对照)，或者使用200kVp X-射线装置以2Gy和4Gy的剂量进行辐射。允许细胞生长最多12天以形成集落。然后将集落固定，用结晶紫染色并计数，以便使用下述公式估算产克隆存活分数(SF)(参见图3A和3B)：

铺板效率(PE)是没有任何辐射时形成的集落数与接种细胞数的比率：

PE＝形成的集落数×100/接种的细胞数

存活分数(SF)表示辐射后活细胞的水平，并相对于对照的PE归一化：

SF＝处理后形成的集落数/(接种的细胞数*PE)

剂量增强系数(DEF)被估算为SF(只有辐射剂量)/SF(用相同辐射剂量激活的金纳米粒子)的比率。

表2：

表2显示了对于实施例表1中合成的每种金纳米粒子来说，与HT29癌细胞温育的不同金(Au)浓度下的细胞水平金浓度(μM)[或每个靶细胞的金浓度(细胞∶Au＝1∶X(X以nmole表示))]。

表3A：

表3A报告了实施例1中描述的金纳米粒子当细胞水平的金浓度低于20μM[或相应的每个靶细胞的金浓度低于15*10^-5nmole(细胞∶Au≤1∶15*10^-5nmole)]时，4Gy辐射剂量下获得的DEF值。

表3B：

表3B报告了实施例1中描述的金纳米粒子当细胞水平的金浓度在20μM至83μM之间[或相应的每个靶细胞的金浓度在20×10^-5nmole至45×10^-5nmole之间(1∶20×10^-5nmole≤细胞∶Au≤1∶45×10^-5nmole)]时，在4Gy辐射剂量下获得的DEF值。

表3C：

表3C报告了实施例1中描述的金纳米粒子当细胞水平的金浓度在95μM至148μM之间[或相应的每个靶细胞的金浓度在60×10^-5nmole至110×10^-5nmole之间(1∶60×10^-5nmole≤细胞∶Au≤1∶110×10^-5nmole)]时，在4Gy辐射剂量下获得的DEF值。

结论

意外地，对于粒度≥80nm的金纳米粒子观察到了DEF值中的阈值(参见图5A和5B)。

实施例3：当在细胞水平下每种被测试的金纳米粒子的X-射线衰减能力恒定时，金纳米粒子尺寸对体外效能的影响

方案：X-射线衰减测量

在200μL管中制备了具有不同金浓度(以[Au]g/L表示)的金纳米粒子，并置于特别定制的聚苯乙烯架上。

使用阳极电压和电流分别为50KV和450μA的General ElectricLocus μCT系统来进行μCT。

使用90μm各向同性分辨率模式执行扫描。

将圆柱形小目标区域小心地放置在每个管中心上方的3D图像中，以测量含有金纳米粒子分散体的流体填充管的衰减值。

结论

对于15nm至105nm之间的尺寸来说，不管金纳米粒子尺寸如何，都观察到相似的X-射线衰减(参见图6A和6B)。该结果证实了对于尺寸≥80nm的纳米粒子所观察到的效能的阈值效应。对于给定的被吸收X-射线能量来说，这样的纳米粒子能够在细胞水平下产生更多损伤(参见图4A和4B)。

实施例4：金纳米粒子在细胞水平的定位(与肿瘤细胞膜物理相互作用和/或细胞摄取)对体外效能的影响。

根据处理，使用细胞数适合的HT29细胞进行铺板，以形成50至200个之间的集落。当细胞附着时，加入50μM、100μM或400μM金，温育时间小于5分钟(无温育)或为12小时。测试了粒度为60nm的金纳米粒子(来自实施例1的金-60)。细胞不进行辐射，或使用200kVpX-射线装置以2Gy和4Gy的剂量进行辐射。在辐射后，将细胞在37℃下温育10至12天。将克隆固定，用结晶紫染色并计数，以估算产克隆存活分数。

图7A显示了与金纳米粒子(实施例1的金-60)温育少于5分钟的HT29细胞在4Gy(SF4)下的存活分数，图7B显示了与金纳米粒子(实施例1的金-60)温育约12小时的HT29细胞在4Gy(SF4)下的存活分数。

表4：

DEF金-60	50μM	100μM	400μM
				4Gy，温育时间少于5分钟	0.96	1.25	1.8
4Gy，温育时间为12小时	0.88	1	1.5

表4显示了对于少于5分钟和12小时的温育时间来说，金浓度为50μM、100μM和400μM的金纳米粒子(金-60)在4Gy下的DEF。

结论

数据显示，对于400μM的金浓度来说，在辐射前与细胞温育少于5分钟的金纳米粒子和温育12小时的金纳米粒子具有同样显著的DEF值。

这些结果证实，金纳米粒子(GNP)增强了靶细胞辐射响应，而GNP不是必需被细胞内化。事实上并且正如本技术领域的人员已知的，需要两个小时才能让细胞摄取约50％的生物介质中存在的纳米粒子(参见例如Chitrani等，2006)。

当金纳米粒子与癌细胞接触时，它们有利于在辐射下引起癌细胞损伤的能力。

上述实施例1至4的实验结果凸显了如果在肿瘤位点上存在足够的金属浓度(正如对本技术领域的人员显而易见的，与肿瘤重量成正比)，金属纳米粒子在体内给药时引起增强的治疗效果的能力(正如前面证实的，不需要金属纳米粒子的细胞摄入)。

当使用粒度≥80nm的金属纳米粒子时，与使用粒度约为60nm的金属纳米粒子时相比，当金属纳米粒子暴露于电离辐射(例如通过放疗)时，每个靶细胞需要明显更少量的金属来产生有效的治疗效果。

为了在电离辐射下产生有效的治疗效果，使用纳米粒子尺寸≥80nm的金属纳米粒子所需的每个靶细胞的金属浓度，与使用纳米粒子尺寸约为60nm或以下的金属纳米粒子时所需的每个靶细胞的金属浓度相比，低约2至7倍之间，特别是4至7倍或2至5倍之间。

这样的金属纳米粒子显得对体内使用有利。

其中纳米粒子群中的平均最大尺寸在80至105nm之间的金属纳米粒子群，在所述纳米粒子暴露于电离辐射时在治疗中是特别有利的。事实上，这样的纳米粒子尤为允许提高剂量增强系数(DEF)。正如本文中描述的，在体外观察到了纳米粒子的阈值效应，最大尺寸优选≥80nm，更优选在80nm至105nm之间。这样的纳米粒子显示出减小的表面积，允许改进生物相容性并因此降低毒性。

本文描述的金属纳米粒子群还允许降低肿瘤清除率。现在，单次注射本发明的组合物允许在目前应用于临床的多分次辐射方案的情形中获得的所需治疗效果。

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-“理解纳米-生物界面处的生物物理化学相互作用”(Understanding biophysicochemical interactions at the nano-biointerface)，Andre E.Ne等，Nature Materials，2009，8，pp 543-557

-“使用金纳米粒子在小鼠中增强放疗”(The use of goldnanoparticles to enhance radiotherapy in mice)，James F Hainfeld等，Phys.Med.Biol.，2004，49，pp N309-N315

-“无机纳米粒子液相合成中的新进展”(Recent Advances in theLiquid-Phase Syntheses of Inorganic nanoparticles)，Brian L.Cushing等，Chem.Rev.，2004，104，pp 3893-3946

-“叶酸靶向的、阳离子脂质体介导的基因转移到弥散性腹膜肿瘤中”(Folate-targeted，cationic liposome-mediated gene transfer intodisseminated peritoneal tumors)，J A Reddy等，Gene therapy，2002，9，pp1542-1550

-“药物载体的叶酸靶向：数学模型”(Folate targeting of drugcarriers：A mathematical model)，Ketan B.Ghaghada等，Journal ofControlled Release，2005，104，pp 113-128

-“在多分散金悬液中用于调节粒度的受控成核作用”(ControlledNucleation for the Regulation of the Particle Size in Monodisperse GoldSuspensions)，G.Frens，Nature Physical Science，1973，241，pp 21-22.

Claims

1.金属纳米粒子群在制备旨在当选自良性细胞、恶变前细胞和恶性细胞的靶哺乳动物细胞暴露于电离辐射时扰乱、改变或破坏所述细胞的药物组合物中的应用，其中所述纳米粒子由选自金(Au)、银(Ag)、铂(Pt)、钯(Pd)、锡(Sn)、钽(Ta)、镱(Yb)、锆(Zr)、铪(Hf)、铽(Tb)、铥(Tm)、铈(Ce)、镝(Dy)、铒(Er)、铕(Eu)、钬(Ho)、铁(Fe)、镧(La)、钕(Nd)、镨(Pr)及其混合物的金属制成，所述金属的原子序数(Z)为至少25，并且所述纳米粒子群的平均最大尺寸在80至105nm之间，并且其中所述金属纳米粒子被生物相容性涂层包覆。

2.权利要求1的应用，其中所述生物相容性涂层是选自二氧化硅、氧化铝、糖、磷酸盐、硅烷、硫醇、两性离子化合物、脂类、饱和的碳聚合物和无机聚合物的不可生物降解的涂层；或选自生物聚合物、磷脂和糖类的可生物降解的涂层。

3.权利要求2的应用，其中所述糖类为寡糖。

4.权利要求2的应用，其中所述糖类为多糖。

5.权利要求1的应用，其中所述组合物包含每个靶细胞10^-6nmole至10^-3nmole之间的金属。

6.权利要求1的应用，其中所述金属纳米粒子包含能够特异性靶向生物组织或细胞的表面组分。

7.权利要求1的应用，其中所述金属纳米粒子的形状为球形或卵形。

8.权利要求1的应用，其中所述电离辐射选自X-射线、γ-射线、电子束和放射性同位素发射。

9.权利要求8的应用，其中电离辐射为50KeV至12000KeV。

10.权利要求8的应用，其中X-射线辐射为50KeV至6000KeV。

11.权利要求1的应用，其中所述恶性细胞是来自实体肿瘤的细胞。

12.权利要求1的应用，其中所述药物组合物还包含与金属纳米粒子群不同的旨在治疗癌症的其他治疗化合物。

13.权利要求1的应用，其中所述哺乳动物细胞是人类细胞。