ES2616628T3

ES2616628T3 - Nanopartículas metálicas, preparación y usos de las mismas

Info

Publication number: ES2616628T3
Application number: ES10729917.4T
Authority: ES
Inventors: Laurent Levy; Agnès Pottier; Laurence Poul; Laurence Maggiorella
Original assignee: Nanobiotix SA
Current assignee: Nanobiotix SA
Priority date: 2009-07-10
Filing date: 2010-07-09
Publication date: 2017-06-13
Anticipated expiration: 2030-07-09
Also published as: US20120203050A1; KR20120052979A; US10391174B2; CY1118600T1; BR122019025997B8; MA33516B1; BR122019025997B1; DK2451481T3; US9700621B2; SG10201403832YA; PT3178494T; EP2451481B1; BR112012000530A8; CA2765290C; US20170296661A1; EA020942B1; MX347606B; HRP20202005T1; SG177611A1; EP2451481A1

Abstract

El uso de una población de nanopartículas de oro (Au) para preparar una composición farmacéutica para emplear en un método para modificar, alterar o destruir células humanas diana in vivo, seleccionadas del grupo que consiste en células benignas, células pre-malignas y células malignas, cuando dichas células se exponen a radiaciones ionizantes, en donde el tamaño medio más grande de una nanopartícula de la población está entre aproximadamente 80 y 105 nm, y en donde la nanopartícula de oro se recubre con un recubrimiento biocompatible.

Description

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En el contexto de la presente invención, el término tamaño se refiere al diámetro de mayor dimensión del núcleo metálico de la nanopartícula. Normalmente, el diámetro de mayor dimensión de una nanopartícula de forma circular

o esférica, o la mayor longitud de una nanopartícula es de forma ovoide u oval.

La forma de la nanopartícula puede ser por ejemplo circular, plano, alargado, esférico, ovoide u oval, y similar. La forma se puede determinar o controlar mediante el método de producción, y adaptarse por el experto en la técnica según a las aplicaciones deseadas.

Como la forma de las partículas puede influir en su “biocompatibilidad”, se prefieren las partículas que tienen una forma bastante homogénea. Por razones farmacocinéticas, se prefieren por tanto nanopartículas que sean esencialmente con forma esférica, circular u ovoide. Se prefiere particularmente la forma esférica o circular.

El tamaño más grande de las nanopartículas según la invención se comprende ventajosamente, como se demostró mediante la parte experimental, entre aproximadamente 70 nm y aproximadamente 130 nm, ventajosamente entre aproximadamente 75 ó 80 nm y aproximadamente 105 nm, preferiblemente entre aproximadamente 75 nm y aproximadamente 95 nm o entre aproximadamente 80 nm y aproximadamente 90 ó 95 nm.

Los inventores sorprendentemente demuestran por primera vez que la penetración de la nanopartícula en la célula diana, una célula tumoral por ejemplo, no requiere, en el contexto de la presente invención, modificar, destruir o alterar dicha célula. De hecho, se ha observado por los inventores un efecto equivalente en células diana en ambas condiciones, en donde las nanopartículas se han incorporado por las células diana o que están en contacto, en particular contacto externo, con dichas células.

Los inventores describen en la presente memoria la utilización de una nanopartícula metálica como se divulga en la presente memoria, o de una población de tales nanopartículas metálicas, para preparar una composición farmacéutica destinada a perturbar, modificar, alterar o destruir células diana de mamíferos cuando dichas células se exponen a radiaciones ionizantes. En dicha población, las nanopartículas se fabrican de un metal, teniendo el metal preferiblemente un número atómico (Z) de al menos 25. Ventajosamente, el tamaño medio más grande de las nanopartículas de la población está entre aproximadamente 70 nm y aproximadamente 130 nm, ventajosamente entre aproximadamente 75 ó 80 nm y aproximadamente 105 nm, preferiblemente entre aproximadamente 75 nm y aproximadamente 95 nm o entre aproximadamente 80 nm y aproximadamente 90 ó 95 nm.

En una población típica de nanopartículas, como se refiere anteriormente, constituida por nanopartículas obtenidas según un método de la técnica (como se describe además más abajo), en donde el tamaño medio más grande de una nanopartícula de la población está entre aproximadamente 80 nm y aproximadamente 105 nm, el tamaño más grande de una nanopartícula de la población se comprende entre aproximadamente 60 nm y 155 nm, normalmente entre 60, 65, 70, 75, ó 80, y, 105, 110, 130, 140, 150 ó 155 nm.

En otras palabras, el 95% (2σ) de la población se fabrica de nanopartículas cuyo tamaño más grande está entre aproximadamente 60 nm y aproximadamente 155 nm o el 68% (1σ) de la población se fabrica de nanopartículas cuyo tamaño más grande está entre aproximadamente 70 nm y aproximadamente 130 nm.

Las nanopartículas metálicas que se describen en la presente memoria se fabrican de un metal, dicho metal tiene preferiblemente un número atómico de al menos 25, ventajosamente de al menos 40 ó 50, más ventajosamente al memos 60 ó 70.

Tal metal se puede seleccionar del oro(Au – Z = 79), plata (Ag – Z = 47), platino (Pt – Z = 78), paladio (Pd – Z = 46), estaño (Sn – Z = 50), tantalio (Ta – Z = 73), iterbio (Yb – Z = 70), circonio (Zr -Z = 40), hafnio (Hf –Z = 72), terbio (Tb

– Z = 65), tulio (Tm –Z = 69), cerio (Ce –Z = 58), disprosio (Dy –Z = 66), erbio (Er –Z = 68), europio (Eu –Z = 63), holmio (Ho –Z = 67), hierro (Fe –Z = 26), lantano (La –Z = 57), neodimio (Nd –Z = 60), praseodimio (Pr –Z = 59), y mezclas de los mismos.

El metal se selecciona preferiblemente del oro (Au), plata (Ag), platino (Pt), paladio (Pd), estaño (Sn), circonio (Zr) y Hierro (Fe).

El número atómico (también conocido como el número de protones) es el número de protones que se encuentra en el núcleo de un átomo. Habitualmente se representa mediante el símbolo Z. El número atómico identifica únicamente a un elemento químico. En un átomo de carga neutral, el número atómico es igual al número de electrones.

Z participa en la capacidad de absorción de las radiaciones entrantes de las nanopartículas .

Las nanopartículas metálicas de la invención se fabrican de oro.

En la presente descripción, también es posible la mezcla de los metales como se describe anteriormente en una nanopartícula particular, o en una población particular de nanopartículas.

Se prefieren además las nanopartículas que tienen un área superficial específica pequeña (de sus siglas en inglés, SSA) para limitar sus interacciones con el entorno circundante.

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El Área Superficial Específica (SSA) es una propiedad material de los sólidos que mide el área superficial total por unidad de masa (m2/g). El SSA parece ser un factor importante que afecta en el sistema de interconexión biológico de la nanopartícula; en base a una masa-dosis igualitaria, se ha reportado que las partículas ultrafinas causan más efectos adversos, tal como inflamación, cuando se administran en un animal, que las partículas finas (véase por ejemplo Nel et Al. (Nature Materials 8 (2009) 543).

Las nanopartículas metálicas, cuyo tamaño más grande está entre aproximadamente 80 y 105 nm son particularmente ventajosas respecto al SSA como se explica abajo.

Para el propósito de la presente invención, el área superficial específica de la nanopartícula se comprende por ejemplo entre aproximadamente 1 m2/g y 50 m2/g. El área superficial específica se comprende preferentemente entre 2 m2/g y 20 m2/g.

El área superficial específica de una nanopartícula esférica se puede estimar utilizando la siguiente ecuación (SSA = 3000 / (dxr)), siendo d la densidad de la nanopartícula metálica, y r el radio de la nanopartícula.

Por lo tanto, nanopartículas de oro esféricas con un tamaño de partícula de 15, 30, 60, 80 y 100 nm desarrollarán un área superficial específica de 20,7, 10, 3, 5,2, 3,9 y 3,1 m2/g respectivamente, para una nanopartícula de oro de densidad 19,32.

Nanopartículas esféricas de hierro con un tamaño de partícula de 15, 30, 60, 80 y 100 nm desarrollarán un área superficial específica de 50,8, 25,4, 12,7, 9,5 y 7,6 m2/g respectivamente, para una nanopartícula de hierro de densidad 7,87.

Los inventores de la presente memoria divulgan que la sorprendente eficacia de las nanopartículas según la presente invención es debida principalmente a su tamaño. De hecho, cuando una nanopartícula, cuyo tamaño es de al menos 80 nm, se expone a radiaciones ionizantes, es capaz de generar más daños a las células diana que una nanopartícula de menor tamaño, en particular una nanopartícula de 60 nm o menos. Por tanto, los inventores de la presente memoria destacan la influencia fundamental y directa del tamaño de la nanopartícula sobre la alteración celular bajo radiaciones ionizantes, favoreciendo los tamaños que se describen en la presente memoria aplicaciones terapéuticas en un mamífero, cuando dicho tamaño alcanza, y preferiblemente excede, el límite de 80 nm (véase la parte experimental). En la presente memoria se identifica el intervalo de tamaños del tamaño más grande de la nanopartícula, su habilidad para generar daños celulares más eficaces.

Una posible explicación de este mecanismo podría deberse a la capacidad de la nanopartícula para repartir la energía capturada (radiación ionizante) en una forma mejor o diferente.

En el ejemplo 2 y 3, para diferenciar la influencia del tamaño de la nanopartícula de oro de la influencia de la concentración de oro en el efecto terapéutico inducido por las nanopartículas bajo radiación, los inventores realizaron todos los ensayos in vitro utilizando el tamaño de la nanopartícula de oro como único parámetro ajustable. Los resultados experimentales obtenidos por los inventores revelaron la sorprendente influencia del tamaño de la nanopartícula (para una concentración metálica constante) en la amplificación de la eficacia terapéutica (capacidad para matar células y/o prevenir que las células se dividan).

Para producir un efecto terapéutico eficaz bajo radiaciones ionizantes, la utilización de nanopartículas metálicas con un tamaño de nanopartícula ≥ 80 nm requiere de una concentración metálica por célula diana que sea entre aproximadamente 2 y 7 veces inferior, en particular entre 4 y 7 veces o entre 2 y 5 veces, a la concentración del metal por célula diana requerida cuando se utilizan nanopartículas metálicas con un tamaño de nanopartícula de aproximadamente 60 nm o menos (véanse los ejemplos 2 y 3 respecto GNPs).

Por lo tanto actualmente es posible gracias a la presente invención, administrar al paciente una cantidad de metal significativa y ventajosamente reducida con una eficacia de tratamiento similar, asociada a una reducción de los efectos secundarios perjudiciales.

La presente invención permite además una reducción significativa del número de etapas de administración en el contexto de un tratamiento radioterápico en particular, normalmente en el transcurso de un protocolo de radiación multi fraccionado como se realiza en clínica hasta el momento. De hecho, las nanopartículas que se describen en la presente solicitud de patente son lo suficientemente grandes para favorecer su retención en el tejido tumoral. En la bibliografía se ha observado una eliminación por el tejido diana sustancialmente reducida de las nanopartículas metálicas de mayor tamaño (CHANG et al. Cancer Sci. 99 (2008) 1479; Hainfeld et al., Phys. Med. Biol 49 (2004) N309).

Las dosis de radiaciones ionizantes requeridas son preferiblemente dosis comprendidas entre aproximadamente 0,05 Grays y aproximadamente 16 Grays, preferiblemente entre aproximadamente 0,05 Grays y aproximadamente 6 Grays, para aplicaciones realizadas in vitro.

Las dosis están comprendidas entre más de aproximadamente 0,05 Grays y menos de aproximadamente 16 ó 30 Grays para aplicaciones realizadas, en particularmente localmente, ex vivo o in vivo.

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Los materiales, compuestos o agentes tratantes superficiales anteriormente mencionados, se pueden utilizar en solitario o en combinaciones, mezclas o en conjunto, compuestos o no, covalentes o no, opcionalmente en combinación con otros compuestos. Por otra parte, también es posible utilizar cualquiera de los materiales anteriormente mencionados, siendo dicho material soluble en agua de forma natural o soluble en lípido o que sea modificado artificialmente para volverse soluble en agua o soluble en lípido.

El recubrimiento biocompatible comprende o se fabrica preferiblemente de un compuesto que se selecciona del grupo que consiste en un agente inorgánico, un agente orgánico, y una mezcla o combinación de los mismos. El agente inorgánico apropiado se puede seleccionar del grupo que consiste en un óxido, un hidróxido, y un oxihidróxido. El agente inorgánico puede comprender por ejemplo silicio, aluminio, calcio y/o magnesio.

Tales agentes se pueden utilizar para cargar la nanopartícula bien positivamente o negativamente para modular las interacciones de dicha nanopartícula con el medio biológico.

Un agente inorgánico que se selecciona del grupo que consiste en, por ejemplo magnesio y calcio, brindará una carga positiva a la superficie de la nanopartícula a un pH de 7.

Por ejemplo, se puede utilizar silicio para brindar una carga negativa a la superficie de la nanopartícula a un pH de 7.

Un agente orgánico apropiado puede ser cualquier agente que comprende una función capaz de interaccionar con una nanopartícula como se describe en la presente memoria y una función que confiere biocompatibilidad a dicha nanopartícula.

El agente que comprende una función capaz de interaccionar con una nanopartícula puede ser por ejemplo un carboxilato (R-COO-), un silano (R-Si(OR)3), una función fosfónica (R-PO(OH)2), una función fosfórica (R-OPO(OH)2), o una función tiol (R-SH).

El agente que comprende una función capaz de conferir biocompatibilidad a una nanopartícula como se describe en la presente memoria puede tener una función estérica y/o una función electrostática. Tal agente con una función estérica se puede seleccionar del grupo que consiste en polietilenglicol (PEG) polietilenóxido, alcohol de Polivinilo, Poliacrilato, Poliacrilamida (poli(N-isopropilacrilamida)), Policarbamida, un biopolímero o polisacárido tal como Dextrano, Xilano, celulosa, colágeno, y un compuesto zwitteriónico tal como polisulfobetaina, etc.

Un agente con una función electrostática positiva puede ser una amina tal como aminopropiltrietoxisilano, polilisina o 2-aminoetanotiol.

Un agente con una carga electrostática negativa se puede seleccionar del grupo que consiste en fosfato (por ejemplo un polifosfato, un metafosfato, un pirofosfato, etc), carboxilato (por ejemplo citrato o ácido dicarboxílico, en particular ácido succínico) y tiol (por ejemplo un carboxi terminado en tiol tal como ácido mercaptosuccínico).

El recubrimiento puede contener también diferentes grupos funcionales (o segmentos de enlace), permitiendo que cualquier molécula de interés se una a la superficie de la partícula, tal como un componente superficial que active dianas específicas de tejidos o células biológicas.

Un ejemplo típico de una nanopartícula según la invención es una nanopartícula que se fabrica de oro. Tal nanopartícula de oro puede comprender, además, como un recubrimiento biocompatible, un recubrimiento fabricado de compuestos tiol tal como polietilenglicol-tiol (PEG-SH), tioglucosa, o compuestos de carboxilato tal como citrato.

Otro ejemplo de una nanopartícula según la invención es una nanopartícula fabricada de oro que comprende, como un recubrimiento biocompatible, un recubrimiento fabricado de agentes tiol que soporta al menos un grupo funcional que se selecciona de polietileno, amina o carboxilo, o un recubrimiento que consiste en citrato.

Las presentes nanopartículas ofrecen la ventaja de ser fáciles de preparar. De hecho los métodos para producir nanopartículas metálicas son bien conocidos en la técnica (véase por ejemplo Brian L. Cushing et al. (Chem. Rev. 104 (2004) 3893). Normalmente, las nanopartículas metálicas se obtienen por precipitación de un elemento metálico en una disolución acuosa o una no-acuosa, implicando dicha precipitación la reducción química del catión metálico. Otra posible manera para producir las nanopartículas metálicas es a través de la reducción asistida por radiación.

Otro objetivo que se describe en la presente memoria se refiere a un método para producir una nanopartícula metálica o población de nanopartículas metálicas tal como las que se definen anteriormente en la presente memoria, que comprende:

-proporcionar un elemento metálico como el que se identifica en la presente memoria, preferiblemente un elemento metálico que tiene un número atómico (Z) igual o superior a 25,

-preparar la nanopartícula metálica a partir de dicho elemento metálico mediante precipitación de dicho elemento metálico en un medio, en presencia de un agente reductor, y, opcionalmente

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-añadir un agente complejante al medio (el agente complejante se añade antes de, durante o después de la adición del agente reductor), siendo el agente reductor y el agente complejante opcionalmente el mismo compuesto, y, opcionalmente,

- recubrir la nanopartícula utilizando un agente tratante superficial como se describe anteriormente.

Un medio que se utiliza normalmente en la presente invención se puede seleccionar de una disolución acuosa, una disolución alcohólica, etc.

Un agente reductor que se emplea normalmente se puede seleccionar del citrato, ácido ascórbico, ácido 2mercaptosuccínico, etc.

Un agente complejante que se emplea normalmente se puede seleccionar del citrato, tiol tal como el ácido 2mercaptosuccínico, etc.

La etapa de recubrir ventajosamente consiste en poner la nanopartícula en contacto con un agente tratante superficial como se define anteriormente.

En un aspecto particular, un método para producir una población de nanopartículas comprende las siguientes etapas, preferiblemente para:

a) proporcionar, como un precursor, un elemento metálico como se identifica en la presente memoria, preferiblemente un elemento metálico que tiene un número atómico (Z) igual o superior a 25,

b) precipitar el precursor de la etapa a) en un medio polar como se define anteriormente en presencia de un compuesto reductor, preferiblemente ajustando el precursor y/o reduciendo la concentración del compuesto y/o la temperatura,

c) añadir opcionalmente un agente complejante en el medio polar, antes de, durante o después de la etapa de precipitación b), siendo opcionalmente el agente complejante y el agente reductor el mismo compuesto,

d) lavar opcionalmente la suspensión obtenida al final de la etapa b) o c) para eliminar cualquier impureza, agente reductor y/o agente complejante,

e) concentrar opcionalmente la suspensión obtenida al final de la etapa d), y

f) recubrir opcionalmente las nanopartículas.

La población descrita anteriormente se puede someter además a una etapa de formulación antes de administrarse a un sujeto.

En un ejemplo particular, un método para producir una nanopartícula según la presente invención, estando la nanopartícula fabricada de un metal, comprende preferiblemente las siguientes etapas para:

a) precipitar una disolución del precursor de cloruro de oro (tal como, en particular, HAuCl4 o KAu Cl4) en disolución acuosa en presencia de un agente reductor (tal como citrato), estando la temperatura del medio comprendida entre 50ºC y 100ºC,

b) lavar opcionalmente la suspensión de nanopartículas metálicas obtenida para eliminar cualquier impureza,

c) concentrar opcionalmente la suspensión de nanopartículas metálicas obtenida de esta manera,

d) recubrir opcionalmente dichas nanopartículas metálicas poniéndolas en contacto con un agente tratante superficial como se define anteriormente.

Otro objetivo de la descripción se basa en cualquier composición que comprende nanopartículas, tales como se definen anteriormente en la presente memoria y/o que se pueden obtener mediante los métodos que se describen en la presente memoria. Aunque no es obligatorio, las partículas que se describen en las composiciones de la presente memoria tienen ventajosamente una forma bastante homogénea como se indica anteriormente.

Se pueden obtener suspensiones biocompatibles que comprenden una alta concentración del elemento metálico (300g/L, por ejemplo) con un método como el que describe en la presente memoria.

Un objetivo particular de la descripción se refiere a una composición farmacéutica que comprende nanopartículas, tales como se definen anteriormente en la presente memoria y, opcionalmente, un excipiente o vehículo aceptable farmacéuticamente.

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Las composiciones pueden estar en forma de un sólido, líquido (partículas en suspensión), aerosol, gel, pasta, y similares. Las composiciones preferidas están en forma de una formulación inyectable, preferiblemente en una forma líquida.

El excipiente o vehículo que se emplea puede estar en cualquier soporte clásico para este tipo de aplicación, tal como por ejemplo disoluciones salinas, isotónicas, estériles, tamponadas, y similares. Pueden comprender también estabilizadores, edulcorantes, tensioactivos, y similares. Se pueden formular por ejemplo en ampollas, aerosoles, frascos, comprimidos, cápsulas, utilizando técnicas de formulación farmacéutica conocidas.

Ventajosamente, la concentración de metal que se administra por célula diana está entre aproximadamente 10-7 nmoles (Célula: [metal] = 1: 10-7 (nmoles)) y aproximadamente 5x10-1 nmoles (Célula: [metal] = 1: 5x10-1 (nmoles)). Más preferiblemente, la concentración de metal por célula diana está entre aproximadamente 10-6 nmoles (Célula: [metal] = 1: 10-6 (nmoles)) y aproximadamente 2x10-1 nmoles (Célula: [metal] = 1: 2x10-1 (nmoles)).

Incluso más preferiblemente, la concentración de metal por célula diana está entre aproximadamente 10-6 nmoles (Célula: [metal] = 1: 10-6 (nmoles)) y aproximadamente 10-3 nmoles (Célula: [metal] = 1: 10-3 (nmoles)) o entre aproximadamente 10-6 nmoles (Célula: [metal] = 1: 10-6 (nmoles)) y aproximadamente 10-4 nmoles (Célula: [metal] =

1: 10-4 (nmoles)).

En las composiciones que se describen en la presente memoria, concentraciones apropiadas o deseables del metal se comprenden entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 100 mg de metal por gramo de células mamíferas diana, tal como, en particular, células tumorales mamíferas, normalmente entre aproximadamente 1 mg o 5 mg y 50 mg del metal por gramo de células mamíferas diana.

Generalmente, las composiciones en forma líquida comprenden entre aproximadamente 0,01 g/L y 300 g/L de metal, preferiblemente al menos 1 g/L, 5 g/L, 10 g/L, 20 g/L, 40 g/L, 60 g/L, 80 g/L, 100 g/L, 150 g/L, 200 g/L o 250 g/L.

Lo ideal es que la cuantificación del metal se realice mediante ICP-MS.

Las concentraciones de metal que se identifican anteriormente varían dependiendo del sujeto paciente, la vía de administración seleccionada, la naturaleza de las células diana, etc., y son fácilmente ajustables por el experto en la técnica.

Las nanopartículas, poblaciones de nanopartículas y composiciones que se describen en la presente memoria, son productos que se pueden emplear en muchos campos, particularmente en medicina humana o veterinaria.

Es un objetivo de la presente descripción emplear un producto como se describe en la presente memoria para alterar, destruir una célula, tejido u órgano diana.

Dependiendo de la energía de las radiaciones ionizantes, las partículas pueden activar la alteración de células y/o tejidos, o la destrucción de los mismos.

De hecho, un objetivo particular de la descripción se basa en la empleo de una nanopartícula metálica o una población de nanopartículas, como se describe en la presente memoria, para preparar una composición farmacéutica destinada a alterar, destruir células diana en un animal, cuando dichas células se exponen a radiaciones, en particular radiaciones ionizantes, y con los métodos terapéuticos correspondientes.

La composición farmacéutica puede comprender además un compuesto terapéutico adicional, distinto de una nanopartícula o de una población de nanopartículas como se describe en la presente memoria, destinado también a tratar el cáncer.

Otro objetivo particular de la descripción se basa en un método para inducir o causar la alteración, lisis, apoptosis o destrucción de células diana, in vitro, ex vivo o in vivo, que comprende la puesta en contacto de células, en particular de células diana, con una o más nanopartículas tal como se define anteriormente en la presente memoria, durante un periodo de tiempo suficiente para permitir a las nanopartículas interaccionar con dichas células y, exponiendo las células a radiaciones, siendo radiaciones apropiadas en particular las radiaciones ionizantes, preferiblemente Rayos-X, Rayos-γ, isótopos radiactivos y/o rayos de electrones, dicha exposición induce o causa la alteración, lisis, apoptosis o destrucción de dichas células diana.

Las células diana pueden ser cualquiera de las células patológicas, es decir, células implicadas en un mecanismo patológico, por ejemplo células proliferativas, tales como células tumorales, células estenosantes (células del músculo liso/fibroblasto), o células del sistema inmunológico (clones de células patológicas). Una aplicación preferida se basa en el tratamiento de (por ejemplo, la destrucción o alteración funcional) células o tejidos malignos.

A este respecto, un objetivo particular de la descripción se basa en el empleo de una nanopartícula, o una población de tales nanopartículas, como se define anteriormente en la presente memoria, para producir una composición farmacéutica destinada al tratamiento de un cáncer en particular, cuando se usa en combinación con radiaciones ionizantes (como se define anteriormente).

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La presente divulgación proporciona además kits que comprenden cualquiera de las nanopartículas o composiciones que se describen en la presente memoria. Normalmente, el kit comprende al menos una nanopartícula o población de nanopartículas como se describe en la presente memoria. Generalmente, el kit también comprende uno o más envases llenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la invención. Asociada a tal envase o envases, se observa una etiqueta que proporciona instrucciones para el uso de los productos que pueden proporcionar la utilización de las nanopartículas, población de nanopartículas o composiciones según los presentes métodos.

Otros aspectos y ventajas de la invención quedarán claros en los siguientes ejemplos, que se proporcionan con propósitos ilustrativos y no como limitación.

Sección experimental

Ejemplo 1: síntesis y caracterización físico-química de nanopartículas de oro con diferentes tamaños.

Se obtienen nanopartículas de oro mediante reducción de cloruro de oro con citrato sódico en disolución acuosa. El protocolo se adaptó a partir de G. Frens Nature Physical Science 241 (1973) 21.

En un experimento típico, la disolución de HAuCl4 se calienta hasta ebullición. Posteriormente, se añade una disolución de citrato sódico. La disolución resultante se mantiene bajo ebullición durante un periodo adicional de 5 minutos.

El tamaño de la nanopartícula se ajusta de 15 hasta 105 nm mediante modificación cuidadosa del citrato frente a la proporción del precursor de oro (cf. Tabla 1).

Después, se concentran las suspensiones de nanopartículas de oro preparadas utilizando un dispositivo de ultrafiltración (célula con agitación Amicon modelo 8400 de Millipore) con una membrana de celulosa de 30 kDa.

Las suspensiones resultantes se filtran finalmente a través de un filtro de membrana de 0,22 μm (membrana PES de Milipore) bajo campana laminar y se almacenan a 4ºC.

El contenido de oro se determina mediante ICP-MS y se expresa como [Au] g/L.

El tamaño de partícula se determina utilizando un Microscopio Electrónico de Transmisión (TEM) mediante el recuento de más de 200 partículas (Figura 1A), tomando la dimensión de la nanopartícula más grande para la medición del tamaño. Se establecen histogramas y se presentan la desviación media y estándar (Figura 1B).

Tabla 1:

Muestras: Tamaño de partícula (nm) Síntesis Citrato HAuCl4 Estructura [Au] g/L

Oro-15: 15±2 (1σ) 20 mL 30 mM 500 mL 0,25 mM CFC 17,86

Oro-30: 32±10 (1σ) 7,5 mL 40 mM 500 mL 0,25 mM CFC 16,90

Oro-60: 60±10 (1σ) 2 mL 85 mM 500 mL 0,25 mM CFC 4,98

Oro-80: 80±10 (1σ) 1,2 mL 43 mM 200 mL 0,30 mM CFC 10,67

Oro-105: 105±25 (1σ) 1,2 mL 39 mM 200 mL 0,33 mM CFC 5,06

Conclusión

Las nanopartículas de oro que se describen en la Tabla 1 se preparan según al mismo proceso de síntesis para asegurar las mismas propiedades características superficiales. Las imágenes TEM muestran que las nanopartículas de oro sintetizadas son todas de forma esférica y/o ovoide. Los patrones de difracción electrónica TEM muestran que todas las nanopartícuas de oro sintetizadas presentan una

estructura CFC. Por lo tanto, de acuerdo con la técnica anterior, el tamaño de las nanopartículas de oro sólo varía, con un tamaño de partícula medio bien caracterizado y un tamaño polidisperso.

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Ejemplo 2: Efecto del tamaño de la Nanopartícula de oro en la eficacia in vitro (ensayo de supervivencia clonogénica) cuando la concentración de oro es constante a nivel celular.

Protocolo Para investigar la intensificación de la respuesta a la radiación de las nanopartículas de oro (GNPs) que se internalizan dentro de la célula o se une a la célula (expresada abajo como concentración de oro a nivel celular), los inventores emplearon un ensayo de supervivencia clonogénica que se describe a continuación:

Las células HT29 se recubrieron a la densidad de 20.000 células/cm2. Las GNPs se añadieron al medio a varias concentraciones de oro en el intervalo de μM. Después de un tiempo de incubación de entre 1 hora y 24 horas, se eliminaron las células sobrenadantes. Después, las células se lavaron brevemente con PBS para eliminar todas las GNPs no-unidas o no-internalizadas dentro de las células. A continuación los inventores realizaron una tripsinación celular y contaron el número de células utilizando un Hemocitómetro.

Para cada condición, los inventores tomaron una muestra de 100.000 células/mL hasta 220.000 células/mL y analizaron además la concentración de oro mediante ICP-MS. La concentración de oro (Au) a nivel celular (número de átomos de oro por volumen) se expresa en μM. Este parámetro se puede expresar también en cuanto a la concentración de oro (Au) por célula diana como sigue: célula: Au = 1 : X (X expresado en nmoles) según el siguiente cálculo: Célula = 1 Concentración de oro (Au) (μM) x 1 (mL) X (expresado en nmoles) = ------------------------------------------------------

1.000 (mL) X Número de células por mL

Las otras células se recubrieron (a la densidad de 300 hasta 1.000 células/pocillos según las condiciones de los tratamientos) para realizar los ensayos clonogénicos. Una vez que las células se unieron a la placa, o bien no se irradiaron (simulación control), o se irradiaron con dosis de 2 Gy y 4 Gy utilizando un dispositivo de Rayos-X a 200 kVp. Se dejó crecer a las células hasta 12 días para formar colonias. Después, las colonias se fijaron y tiñeron con cristal violeta y se contaron para estimar la fracción superviviente clononogénica (SF) (véanse las Figuras 3A y 3B) utilizando la siguiente fórmula:

Eficacia de revestimiento (PE) es la razón del número de colonias formadas sin ninguna radiación por el número de células sembradas:

PE= nº de colonias formadas x 100 / nº de células sembradas

La fracción superviviente (SF) representa el nivel de células viables después de la radiación y se normaliza por el PE del control:

SF = nº de colonias formadas después del tratamiento / (nº de células sembradas * PE)

El Factor de Intensificación de la Dosis (DEF) se estima como la razón de SF (dosis de radiación en solitario) / SF (nanopartículas de oro activadas con la misma dosis de radiación).

Tabla 2:

MUESTRAS DE ORO: Concentración de oro (Au) a nivel celular (μM) Concentración de oro (Au) por célula diana Célula : Au = 1 : X (X expresada en nmoles)

[Au] μM: Número de Células por mL Célula:Au = 1:X (nmoles)

ORO-15

[Au] μM: Número de Células por mL Célula:Au = 1:X (nmoles)

ORO-30

ORO-60

ORO-80

ORO-105: 6 1,6x105 3,6x10-5

[Au] μM: Número de Células por mL Célula:Au = 1:X (nmoles)

ORO-15: 12 1,3x105 9,5x10-5

ORO-30: 17 1,3x105 13,1x10-5

ORO-60: 16 2,2x105 7,3x10-5

ORO-80: 17 2,0x105 8,5x10-5

ORO-105: 17 1,3x105 13,6x10-5

[Au] μM: Número de Células por mL Célula:Au = 1:X (nmoles)

ORO-15: 20 9,7x104 20,7x10-5

ORO-30: 40 1,8x105 22,6x10-5

ORO-60: 83 2,2x105 37,7x10-5

ORO-80: 52 2,1x105 24,9x10-5

ORO-105: 59 1,4x105 43,4x10-5

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Tabla 4:

DEF ORO-60: 50 μM 100 μM 400 μM

4 Gy, tiempo de incubación menor de 5 minutos: 0,96 1,25 1,8

4 Gy, tiempo de incubación de 12 horas: 0,88 1 1,5

La Tabla 4 representa el DEF de nanopartículas de oro (ORO-60) para una concentración de oro de 50 μM, 100 μm y 400 μM, a 4 Gy, durante un tiempo de incubación de menos de 5 minutos o de 12 horas.

Conclusión

Los datos muestran, para una concentración de oro de 400 μM, valores DEF significativamente similares para nanopartículas de oro incubadas menos de 5 minutos y para nanopartículas de oro incubadas 12 horas con células antes de la radiación.

Estos resultados demuestran que las nanopartículas de oro (GNPs) intensifican la respuesta de radiación de la célula diana sin ser necesario que las GNPs se internalicen por la célula. De hecho, y como es conocido por el experto en la técnica, son necesarias dos horas para permitir la absorción celular de aproximadamente el 50% de las nanopartículas presentes en el medio biológico (véase Chitrani et al., 2006, por ejemplo).

Cuando las nanopartículas están en contacto con las células cancerosas son ventajosamente capaces de inducir daños en las células cancerosas bajo radiación.

Los resultados experimentales anteriores de los ejemplos 1 a 4 destacan la capacidad de las nanopartículas metálicas para inducir un efecto terapéutico mejorado cuando se administran in vivo si la concentración metálica adecuada (proporcional al peso del tumor como es evidente para el experto en la técnica) está presente en el lugar del tumor (como se demuestra anteriormente no se requiere la absorción celular de las nanopartículas metálicas).

Se requiere una cantidad de metal significativamente menor por célula diana, cuando se emplean nanopartículas metálicas con un tamaño de partícula ≥ 80 nm comparada con la cantidad de metal requerida cuando se emplean nanopartículas metálicas con un tamaño de partícula de aproximadamente 60 nm, para producir un efecto terapéutico eficaz cuando las nanopartículas se exponen a radiaciones ionizantes (a través de radioterapia, por ejemplo).

Para producir un efecto terapéutico eficaz bajo radiaciones ionizantes, la utilización de nanopartículas metálicas con un tamaño de nanopartícula ≥ 80 nm requiere de una concentración metálica por célula diana que sea entre aproximadamente 2 y 7 veces inferior, en particular entre 4 y 7 veces o entre 2 y 5 veces, a la concentración metálica por célula diana requerida cuando se utilizan nanopartículas metálicas con un tamaño de nanopartícula de aproximadamente 60 nm o menos.

Tales nanopartículas metálicas parecen ser ventajosas para usos in vivo.

En terapia es particularmente ventajosa una población de nanopartículas metálicas en donde el tamaño medio más grande de una nanopartícula de la población está entre 80 y 105 nm, cuando dichas nanopartículas se exponen a radiaciones ionizantes. En particular, tales nanopartículas permiten de hecho, un Factor de Intensificación de la Dosis (DEF) mejorado. Se observó in vitro un efecto límite para una nanopartícula como se describe en la presente memoria cuyo tamaño más grande es preferiblemente ≥ 80 nm, e incluso más preferiblemente entre aproximadamente 80 nm y 105 nm. Tal nanopartícula muestra un área superficial reducida que permite una biocompatibilidad mejorada y en consecuencia una toxicidad reducida.

Una población de nanopartículas metálicas como se describe en la presente memoria permite además una eliminación reducida por el tumor. Una inyección única de una composición según la presente invención permite el efecto terapéutico requerido en el contexto de un protocolo de radiación multi fraccionado como se aplica actualmente en clínica.

Referencias

-‘Gold microspheres: a selective technique for producing biologically effective dose enhancement’, Herold et al., Int. J. Rad. Biol., 2000, 76, pp 1357-1364

5 -‘Increased apoptotic potential and dose-enhancing effect of gold nanoparticles in combination with singledose clinical electron beams on tumor-bearing mice’, Meng-Ya Chang et al., Cancer Sci., 2008, 99(7) pp 1479-1484

-‘Elucidating the Mechanism of Cellular Uptake and Removal of Protein-Coated Gold Nanoparticles of Different Sizes and Shapes', B. Devika Chithrani et al., Nano Lett., 2007, 7 (6), pp 1542-1550

10 -‘Determinig the Size and Shape Dependence of Gold Nanoparticle Uptake into Mammalian Cells’, B. Devika Chithrani et al., Nano Lett., 2006, 6(4), pp 662-668

-‘Enhancement of Radiation Cytotoxicity in Breast-Cancer Cells by Localized – Attachment of Gold Nanoparticles’, Tao Kong et al., Small, 2008, 4(9), pp 1537-1543

-‘Understanding biophysicochemical interactions at the nano-bio interface’, Andre E. Nel et al., Nature 15 Materials, 2009, 8, pp 543-557

-‘The use of gold nanoparticles to enhance radiotherapy in mice’, James F Hainfeld et al., Phys. Med. Biol., 2004, 49, pp N309-N315

-‘Recent Advances in the Liquid-Phase Syntheses of Inorganic Nanoparticles’ Brian L. Cushing et al., Chem. Rev., 2004, 104, pp 3893-3946

20 -‘Folate-targeted, cationic liposome-mediated gene transfer into disseminated peritoneal tumors’; J A Reddy et al., Gene therapy, 2002, 9, pp 1542-1550

-‘Folate targeting of drug carriers: A mathematical model’, Ketan B. Ghaghada et al., Journal of Controllled Release, 2005, 104, pp 113-128

-‘Controlled Nucleation for the Regulation of the Particle Size in Monodisperse Gold Suspensions’, G. Frens, 25 Nature Physical Science, 1973, 241, pp 21-22.

Claims

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