CN102465121A - 单链cDNA合成、微阵列用样品制备及核酸检测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明单链cDNA合成、微阵列用样品制备及核酸检测的方法。本发明为了提供无关于作为模板使用的RNA的量而可得大致一定量的扩增产物的核酸扩增法，以从活体样品提取的RNA作为模板，使用有寡dT及启动子序列的引物，在合成单链cDNA的反应中，以终浓度500pM～500nM使用该引物。
Description
【技术领域】
本发明涉及单链cDNA的合成方法、及从由该合成方法得到的单链cDNA，制备提供给使用微阵列的核酸的检测的样品的方法。另外，本发明涉及从该样品通过微阵列检测检测对象的核酸的方法。
【背景技术】
近年，作为用于检测检测对象的核酸的工具，微阵列受到关注。微阵列也称为DNA芯片，是作为探针的核酸片段在塑料或玻璃等的基板上高密度配置的微阵列。通过使此微阵列的探针和样品中的核酸(DNA、RNA、cDNA或cRNA)杂交，可同时一并解析待测样品中含的多数的基因。
如此，微阵列在基因的表达解析、变异解析等中非常有用。将微阵列应用到临床检查的尝试也开始。
在使用微阵列的核酸的检测中，样品中的要检测的核酸是微量时，核酸的检测精度降低。因此，从升高由微阵列的核酸的检测精度的观点，已知扩增样品中的核酸，制备微阵列用样品(参照国际公开第01/038572号、美国专利公开No.2002/127592、及，特开2007-300829号公报)。
以往、由微阵列解析基因表达时，首先从活体样品提取RNA，将其作为模板合成单链cDNA。从此单链cDNA合成双链cDNA，再从此双链cDNA通过体外转录(in vitro transcription：IVT)反应扩增cRNA而得微阵列用样品。此微阵列用样品中含的cRNA，对于供给到微阵列而言浓度过高的情况多。因此，将样品供给到微阵列之前，定量cRNA而稀释成适宜的浓度。
如此，使用由以往的核酸扩增得到的样品通过微阵列检测检测对象的核酸时，有必要进行样品中含的核酸浓度的定量，和样品的稀释的烦琐的操作。
在由微阵列的核酸的检测中，一般地存在如下(1)～(4)的步骤：(1)从活体样品的核酸的提取、(2)提取的核酸的扩增、(3)核酸的扩增产物和微阵列的探针的杂交、及，(4)微阵列的测定。现在，使上述的(3)及(4)的步骤自动化的装置已有市售。但是，尚未开发出使全步骤自动化的装置。这是由于，在从(2)到(3)的步骤中，必要测定样品中的核酸的浓度，应其测定结果判断适宜地稀释，而将此浓度测定及稀释的作业自动化是困难的。
本发明以提供无需定量及稀释，在微阵列用样品的制备中使用的，合成单链cDNA的方法作为目的。本发明另外，以提供使用该单链cDNA的合成方法的微阵列用样品的制备方法、及使用微阵列的核酸的检测方法作为目的。
【发明概述】
本发明的范围仅由随附的权利要求确定，且不以任何程度受此发明概述中的说明的影响。
本发明人发现，通过在单链cDNA的合成反应中，以极其低的浓度使用引物来得到单链cDNA，从此单链cDNA合成cRNA，而无论以何量的RNA作为模板使用，均可得到大致一定量的cRNA，从而完成本发明。
即，本发明是：
(1)单链cDNA的合成方法，其包括：
以从活体样品提取的RNA作为模板，使用有寡dT及启动子序列的引物合成单链cDNA的反应；其中
在合成单链cDNA的反应中，以终浓度500pM～500nM使用上述引物。
(2)(1)所述的合成方法，其中
上述活体样品是血液、淋巴液、尿、组织或细胞。
(3)(1)所述的合成方法，其中
在合成单链cDNA的反应中，作为反应溶液中含的模板使用的RNA的浓度是0.005～0.5μg/μL。
(4)微阵列用样品的制备方法，其包括：
从活体样品提取RNA的步骤；
使用含提取的RNA、以及，具有寡dT及启动子序列的引物的反应溶液，合成单链cDNA的步骤；及
以合成的cDNA作为模板合成检测用核酸，制备微阵列用样品的步骤；其中
在合成单链cDNA的步骤中，上述反应溶液中的上述引物的终浓度是500pM～500nM。
(5)(4)所述的制备方法，其中
上述活体样品是血液、淋巴液、尿、组织或细胞。
(6)(4)所述的制备方法，其中
在合成单链cDNA的步骤中，作为模板使用的RNA的浓度是0.005～0.5μg/μL。
(7)(4)所述的制备方法，其中
在制备微阵列用样品的步骤中，检测用核酸是cRNA。
(8)由微阵列的核酸的检测方法，其包括：
从活体样品提取RNA的步骤；
使用含提取的RNA、以及，具有寡dT及启动子序列的引物的反应溶液，合成单链cDNA的步骤；
以合成的cDNA作为模板合成检测用核酸，制备微阵列用样品的步骤；
使制备的微阵列用样品与微阵列接触，使微阵列用样品中含的检测用核酸和配置于微阵列的探针杂交的步骤；
测定由上述检测用核酸和上述探针的杂交发生的信号的步骤；及
基于测定结果，从上述微阵列用样品检测检测对象的核酸的步骤；其中
在合成单链cDNA的步骤中，合成单链cDNA的反应溶液中的上述引物的终浓度是500pM～500nM。
(9)(8)所述的检测方法，其中
上述活体样品是血液、淋巴液、尿、组织或细胞。
(10)(8)所述的检测方法，其中
在合成单链cDNA的步骤中，作为模板使用的RNA的浓度是0.005～0.5μg/μL。
(11)(8)所述的检测方法，其中
在制备微阵列用样品的步骤中，检测用核酸是cRNA。
根据上述的(1)的构成，由于无论以何量的RNA作为模板使用，均得到大致一定量的单链cDNA，可省略将RNA从活体样品提取之后的定量及稀释步骤。
在本发明的微阵列用样品的制备方法中，由于使用通过上述的(1)的合成方法得到的单链cDNA，得到的样品中的检测用核酸是大致一定量。从而，根据上述的(4)的构成，可省略样品的制备后的核酸的定量及稀释步骤。
将这样的样品中含的目标核酸通过微阵列检测的本发明的核酸的检测方法不要求核酸的定量及稀释步骤。从而，上述的(8)的构成可在使从微阵列用样品的制备至微阵列测定自动化的系统中适宜地使用。
【附图说明】
图1是示T7-寡dT引物的终浓度和cRNA收量的关系的坐标图。
图2是示作为模板使用的RNA量和cRNA收量的关系的坐标图。
图3是示将从不同量的RNA合成的cRNA用微阵列检测之时的相关关系的坐标图。
图4是示NTP混合物的终浓度和cRNA收量的关系的坐标图。
图5是示在使用不同的浓度的NTP混合物的反应系统中，IVT反应时间和cRNA收量的关系的坐标图。
【发明详述】
以下将参照附图描述本发明的优选的实施方式。
【1.单链cDNA的合成方法】
接下来对本实施方式中涉及的单链cDNA的合成方法(以下，也简单成为“合成方法”)进行说明。
本发明的合成方法中以从活体样品提取的RNA作为模板使用。活体样品只要是从该处可提取RNA的活体来源的样品，就不特别限定，可举例如从活体采集的血液(含全血、血浆、血清)、淋巴液、尿、细胞、组织等。
在本发明的合成方法中作为模板使用的RNA只要是可从上述的活体样品通过所述技术中公知的方法提取的RNA级分即可，优选是mRNA。再有，在真核生物中，mRNA在其3’末端有称之为聚(A)尾的聚腺苷酸(聚A)序列。
从活体样品提取RNA的方法不特别限定，可通过将例如苯酚、硫代氰酸胍等的变性剂添加到活体样品中，从该样品使mRNA游离到溶液中来进行。根据需要纯化从活体样品提取的RNA也可。作为RNA的纯化方法，可举例如，使用苯酚/氯仿的方法、通过密度梯度离心的方法、使用寡dT柱的方法等。在RNA的纯化及提取中，使用市售的RNA提取-纯化试剂盒也可。活体样品是血液时，为了除去球蛋白的mRNA等，使用GLOBINclear-Human kit(Ambion社)等也可。
在本发明的合成反应中，作为模板使用的RNA的量不特别限定，举一例，则在20μl的反应系统的情况中，通常是0.1～10μg、优选是1.0～10μg。即，作为RNA浓度，是0.005～0.5μg/μL、优选是0.05～0.5μg/μL。
本发明的合成方法中使用的引物在5’末端侧有启动子序列，在3’末端侧有寡dT序列。寡dT序列的T的数只要是该引物经寡dT序列退火到mRNA的聚A序列，可合成单链cDNA的程度就不特别限定，通常15～40、优选是40。
上述的启动子序列只要是RNA聚合酶识别，且可进行IVT反应的序列就不特别限定，可举例如T7启动子、T3启动子、Sp6启动子等。再有，本发明的合成方法中使用的引物只要在后述的本发明的待测样品的制备方法中，不抑制利用该启动子序列的从双链cDNA的cRNA的合成反应，则也可含其他序列。
上述的引物自体可通过所述技术中公知的方法合成。使用有市售的寡dT及启动子序列的引物也可。
在本发明的合成方法中，如上述，将具有寡dT及启动子序列的引物以在反应溶液中的终浓度500pM～500nM使用。这样的引物浓度相比在所述技术中的一般浓度(通常5μM)极低。如此，通过以极其低的浓度使用引物，在逆转录反应中引物枯渴而单链cDNA的合成停止。其结果，无论作为模板使用的RNA是何量，可得大致一定量的单链cDNA。再有，本说明书中所谓“大致一定量的单链cDNA”，也包括可将得到的单链cDNA的其全部或一部分不稀释而在以下的双链cDNA的合成反应中使用的量(浓度)。
本发明的合成反应中使用所述技术中公知的逆转录酶。作为那样的逆转录酶，可举例如，AMV(禽成髓细胞瘤病毒)逆转录酶、M-MLV(莫洛尼鼠白血病病毒)逆转录酶等。
本发明的合成反应，除了使上述的引物的终浓度成为500pM～500nM以外，可如同所述技术中惯用的RNA的逆转录反应进行。另外，根据需要，纯化合成的单链cDNA也可。在此纯化中，可使用乙醇沉淀等的所述技术中公知的方法、及，市售的核酸纯化试剂盒等。
【2.待测样品的制备方法】
接下来说明供给到使用本实施方式中涉及的，微阵列的核酸的检测的微阵列用样品的制备方法(以下，也简称为“制备方法”)。
本发明的制备方法，通过以可通过上述的合成方法得到的单链cDNA作为模板，合成检测用核酸来进行。检测用核酸可根据使用的微阵列适宜选择，通例使用cDNA及cRNA等。在合成检测用核酸的步骤中，可利用所述技术中公知的方法。
其中，作为制备方法之一例，对检测用核酸是cRNA的情况进行说明。首先，以可通过上述的合成方法得到的单链cDNA作为模板，使用DNA聚合酶合成双链cDNA。由于通过上述的本发明的合成方法得到的单链cDNA是大致一定量，无在此双链cDNA的合成步骤之前定量单链cDNA而稀释的必要。
在上述的双链cDNA的合成步骤中，可利用所述技术中公知的方法、例如，切口平移法等。在切口平移法中，向由例如RNase H，与单链cDNA形成杂交体的模板RNA引入切口，然后，可通过大肠杆菌(E.coli)来源的DNA连接酶及DNA聚合酶I将该模板RNA置换为DNA链，合成双链cDNA。另外，使用市售的cDNA合成试剂盒也可。根据需要，纯化合成的双链cDNA也可。在此纯化中，可使用乙醇沉淀等的所述技术中公知的方法、及，市售的核酸纯化试剂盒等。
接下来，通过以如上述一样得到的双链cDNA作为模板，使用对应于上述的引物的启动子序列的RNA聚合酶合成cRNA，得到微阵列用样品。在如此得到的该样品中，含大致一定量的cRNA。本说明书中所谓“大致一定量的cRNA”也包括，可将含cRNA的该样品的其全部或一部分不经稀释而在以下的由微阵列的核酸的检测中使用的量(浓度)。
其中，对应于启动子序列的RNA聚合酶是指，可识别上述的引物的启动子序列而进行IVT反应的酶。例如，引物的启动子序列是T7启动子时，使用T7RNA聚合酶。在此步骤中从双链cDNA的cRNA的合成反应可通过所述技术中公知的方法进行。另外，使用市售的cRNA合成试剂盒也可。根据需要，纯化合成的cRNA也可。在此纯化中，可使用乙醇沉淀等的所述技术中公知的方法、及，市售的核酸纯化试剂盒等。
通过本发明的制备方法得到的微阵列用样品由于供给到微阵列测定，为了使样品中的cRNA和探针的杂交容易，优选将cRNA片段化。cRNA的片段化可通过所述技术中公知的方法进行，可举例如，在金属离子存在下加热的方法、使用核糖核酶等的酶的方法等。
后述的由微阵列的核酸的检测方法中，通过荧光物质或染料的检测测定微阵列用样品中的cRNA和探针的杂交体的形成时，该cRNA优选用标记物质标记。从而，本发明的制备方法优选再包括标记合成的cRNA的步骤。这样的标记物质只要是所述技术中通常使用的物质，就不特别限定，可举例如Cy3、Cy5、Alexa Fluor(商标)、异硫氰酸荧光素(FITC)等的荧光物质、生物素等的半抗原、放射性物质等。将cRNA用标记物质标记的方法在所述技术中公知。例如，在合成上述的cRNA的步骤中，通过以生物素化核糖核苷酸作为底物，向反应液中混合，可得用生物素标记的cRNA。
【3.使用微阵列的核酸的检测方法】
接下来对本实施方式中涉及的，由微阵列的核酸的检测方法(以下，也简称为“检测方法”)进行说明。
在本发明的检测方法中，首先，使可通过上述的微阵列用样品的制备方法得到的样品与微阵列接触，使样品中的检测用核酸与配置于微阵列的探针杂交。
其中“杂交”是指，例如在检测用核酸是cRNA时，在严格的条件下与探针和微阵列用样品中的cRNA形成杂交体时候。严格的条件，使配置于微阵列的探针和样品中的cRNA杂交时使本领域技术人员在一般地使用的条件，则不特别限定。
可在本发明的检测方法中使用的微阵列只要是核酸探针配置在基板上的微阵列就不特别限定，优选是DNA微阵列(DNA芯片)。那样的微阵列可通过购入GeneChip(注册商标)(Affymetrix社)等的市售的微阵列来得到，另外通过所述技术中公知的方法制备的也可。
上述的微阵列用样品和微阵列的接触可通过直接添加上述的通过本发明的制备方法得到的样品来进行。即，在本发明的检测方法中，在此接触之前，不需要用于稀释成适宜于微阵列测定的浓度的微阵列用样品中的核酸的定量。再有，接触根据微阵列的种类而不同，在约10～70℃进行2～20小时即可。另外，接触使用Affymetrix社的杂交Oven 640等进行也可。
再者，使与微阵列用样品的接触后的微阵列经历染色及清洗的步骤也可。在以下步骤中，信号的测定基于荧光强度或发色强度时，通过此染色步骤使检测用核酸和探针的杂交体的检测变得可能。例如，将样品中的检测用核酸用生物素标记时，可在微阵列上，向此生物素结合用适宜的荧光物质等预先标记的亲和素或链霉亲和素。由此，可染色杂交体。作为那样的荧光物质，可举例如FITC、Alexa Fluor(商标)、绿色荧光蛋白质(GFP)、荧光素、藻红蛋白等。由于藻红蛋白-链霉亲和素的缀合物有市售，使用其是简便的。
向生物素结合亲和素或链霉亲和素之后，通过使对亲和素或链霉亲和素的标记抗体与微阵列接触来染色杂交体也可。
微阵列的染色及清洗可使用Affymetrix社的Fluidic Station 450等的装置进行。
在本发明的检测方法中，接下来，测定由样品中的检测用核酸与探针的杂交发生的信号。
上述的信号随着微阵列的种类而不同，是例如，通过检测用核酸和探针的杂交而发生的电信号(电流量的变化)也可。如上述一样检测用核酸被标记时，是从标记物质发生的荧光、发色等的信号(荧光强度、发色强度等)也可。在它们的信号之中，优选由上述的标记物质发生的信号，更优选荧光信号。
信号的测定可通过通常的微阵列测定装置中具备的扫描仪进行。作为扫描仪，可举例如GeneChip(注册商标)Scanner 30007G(Affymetrix社)等。
在本发明的检测方法中，基于上述的信号测定的结果，从微阵列用样品检测检测对象的核酸。本说明书中所谓“检测”是指，检测微阵列用样品中的检测对象的核酸的存在与否。微阵列用样品中存在检测对象的核酸时，测定该样品中的该核酸的量也包括在本发明的检测方法的范围内。
从基于信号测定的结果的微阵列用样品的检测对象的核酸的检测可通过所述技术中公知的方法来进行。例如，可通过将从微阵列得到的信号测定值使用GeneChip(注册商标)Operating Softwae(Affymetrix社)、ArrayAssist(Stratagene社)等的软件解析，检测微阵列用样品中的检测对象的核酸的存在与否或存在量。
接下来，通过实施例详细地说明本发明，本发明不限定于这些的实施例。
【实施例】
【试验例1：单链cDNA的合成反应中的引物终浓度的检查】
(1)从活体样品的RNA的提取
从K562细胞，根据以下的顺序使用RNeasy mini kit(QIAGEN社)提取总RNA。再有，使用的试剂及柱全部含在RNeasy mini kit中。
向K562细胞(1×106细胞)加RLT缓冲液693μl和2-巯基乙醇7μl而混合。再者，加100％乙醇500μl，通过移液器吸吐混合。将混合液施加到柱上，以10,000×g、于25℃离心15秒钟之后，除去滤液。向此柱施加350μl的RW1，以10,000×g、于25℃离心15秒钟之后，除去滤液。向此柱施加DNase溶液10μl和RDD缓冲液70μl的混合液，于室温静置20分钟。再者，将350μl的RW1施加到柱，以10,000×g、于25℃离心15秒钟之后，除去滤液。向此柱施加RPE缓冲液500μl，以10,000×g、于25℃离心15秒钟之后，除去滤液。再者，向柱施加RPE缓冲液500μl，以10,000×g、于25℃离心5分钟之后，将柱移到新的收集管。向柱的中心施加30μl无RNase水，于室温静置1分钟，以14,000rpm、于25℃离心1分钟。再者，向柱的中心施加30μl无RNase水，于室温静置1分钟，以14,000rpm、于25℃离心1分钟而得到总RNA溶液。
(2)生物素标记cRNA的制备
以得到的总RNA作为模板，将T7-寡dT引物以5pM、500pM、5nM、50nM、500nM及5μM的各终浓度使用而合成单链cDNA，从该单链cDNA制备生物素标记cRNA。具体而言，根据以下的顺序，使用GeneChip One-Cycle Target 标记及Control Reagents(Affymetrix社制)制备生物素标记cRNA。
(2-1)单链cDNA的合成
向PCR用的管放入以下的试剂，于70℃温育10分钟、接下来于4℃温育2分钟。再有，T7-寡dT引物的序列如SEQ ID NO：1所示。
| 总RNA(1μg) | 3μl |
| 无RNase水 | 5μl |
| 20倍稀释的Poly-A RNA Control | 2μl |
| T7-寡dT引物 | 2μl |
| 合计 | 12μl |
其中，再添加以下的试剂而叩敲。
| 5×第一链反应混剂 | 4μl |
| DTT 0.1M | 2μl |
| dNTP 10mM | 1μl |
| 合计 | 7μl |
于42℃温育2分钟，加1μl Super Script II于42℃温育1小时、接下来于4℃温育2分钟以上来合成单链cDNA。
(2-2)双链cDNA的合成
向合成的单链cDNA添加以下的试剂而叩敲。
| 无RNase水 | 91μl |
| 5×第二链反应混剂 | 30μl |
| dNTP 10mM | 3μl |
| 大肠杆菌(E.coli)DNA连接酶 | 1μl |
| 大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I | 4μl |
| RNaseH | 1μl |
| 合计 | 130μl |
将混合物于16℃温育2小时，加2μl T4DNA聚合酶I，于16℃温育5分钟。其后，加10μl0.5M EDTA来合成双链cDNA。
(2-3)cDNA的清洗
将合成的双链cDNA移到1.5mL管，加600μl的cDNA结合缓冲液，通过涡旋混和。将500μl放入cDNA Cleanup Spin Column，以10000rpm离心1分钟，除去滤液。将残留的cDNA也加载到柱，同样离心。将柱移到新的2mL管中，将750μl的cDNA洗涤缓冲液加载到柱上离心，除去滤液。再者，将此柱以14000rpm离心5分钟。将柱移到新的1.5mL管中，将14μl的cDNA洗脱缓冲液加载到柱上，放置1分钟之后，以14000rpm离心1分钟，清洗cDNA。
(2-4)IVT标记
从得到的cDNA，根据以下的顺序，通过体外转录(IVT)合成生物素标记cRNA。
向PCR用管中放入以下的各试剂，轻混合，于37℃温育16小时，得到cRNA。再有，使用的各试剂含在One-Cycle Target标记及Control Reagents试剂盒中。
| 从步骤(2-3)的cDNA | 12μl |
| 无RNase水 | 8μl |
| 10×IVT标记缓冲液 | 4μl |
| IVT标记NTP Mix | 12μl |
| IVT标记酶Mix | 4μl |
| 合计 | 40μl |
(2-5)cRNA的清洗
将得到的cRNA移到1.5mL管中，加60μl的无RNase水，通过涡旋混合。加350μl的IVT CRNA结合缓冲液，通过涡旋混合，加250μl的100％EtOH而用移液器吸吐混合。加载到cRNA CleanupSpin Column，以1000rpm离心15秒钟，将柱移到新管中。将500μl的IVT cRNA洗涤缓冲液放入柱中，以10000rpm离心15秒钟，除去滤液。放入500μl80％EtOH，以10000rpm离心15秒钟，除去滤液。以14000rpm离心5分钟而使柱干燥之后，将柱移到新管中，将无RNase水11μl加载到柱而放置1分钟，以14000rpm离心1分钟。再者，将10μl无RNase水加载到柱中放置1分钟，以14000rpm离心1分钟。将得到的滤液稀释200倍而测定吸光度，测定cRNA的量。将各引物浓度和cRNA收量的关系示于图1。
为了通过调节T7-寡dT引物的终浓度来使cRNA收量一定，必需发现该引物浓度变成限速的条件、即对于mRNA量T7-寡dT引物少的状态。再者，在该条件下得到的cRNA量必须是对于由微阵列的核酸的检测充分的量。
由图1知，适当的T7-寡dT引物的终浓度是500pM～500nM。在往后的试验中，将引物的终浓度设定在5nM。
【试验例2：模板RNA量和cRNA收量的关系的检查】
以如同上述的试验例1(1)得到的RNA 2.5、5.0或10μg作为模板，以终浓度5nM或5μM使用T7-寡dT引物，如同试验例1(2-1)合成单链cDNA。然后，从得到的单链cDNA，如同试验例1(2-2)～(2-5)合成生物素标记cRNA，测定其量。结果示于以下的表1。另外，将以2.5μg的RNA作为模板时的cRNA收量作为1时，cRNA的收量的比示于图2。
(表1)
如表1及图2所示，在引物浓度是5μM的反应系统中，得到的cRNA量与作为模板使用的RNA的量成比例地增加。对此，在引物浓度是5nM的反应系统中，无论以任何的量的RNA作为模板，均可得大致一定量的cRNA。
从而示，通过本发明的单链cDNA的合成方法及待测样品的制备方法，可不依赖于模板RNA量而，合成大致一定量的cRNA。
【试验例3：模板RNA量和微阵列的测定结果的关系的检查】
以如同上述的试验例1(1)得到的RNA 1.0或10μg作为模板，以终浓度5nM使用T7-寡dT引物，如同试验例1(2-1)合成单链cDNA。然后，从得到的单链cDNA，如同试验例1(2-2)～(2-5)合成生物素标记cRNA，测定其量。将得到的cRNA，和以下的试剂放入管中，混合，于94℃温育35分钟而将cRNA片段化之后，于4℃保存。再有，使用的试剂含在One-Cycle Target标记及Control Reagents试剂盒中。
| cRNA | 10μl |
| 5×片段化缓冲液 | 8μl |
| 无RNase水 | 22μl |
| 合计 | 40μl |
使用得到的片段化的生物素标记cRNA，通过在GeneChip(注册商标)上的杂交，进行基因的表达量的测定。使用的核酸芯片是HumanGenome U133Plus 2.0Array。另外，杂交的条件如下。
<杂交溶液>
| 片段化的cRNA | 15μg |
| Control Oligo B2 | 5μl |
| 20×Eukaryotic Hyb control | 15μl |
| 2×杂交Mix | 150μl |
| DMSO | 30μl |
| 无核酶水 | 至合计300μl |
<杂交温度条件>
99℃、5分钟→45℃、5分钟→14000rpm、5分钟
芯片的染色及清洗是，使用Fluidic Station 450(Affymetrix社)装置，将形成杂交体的靶cRNA用链霉亲和素-藻红蛋白缀合物染色的GeneChip杂交洗涤及Stain kit(Affymetrix社)的试剂盒根据使用说明书使用而进行。
扫描使用GeneChip Scanner 3000(Affymetrix)进行。
使用作为DNA微阵列解析软件的GeneChip Operating Software(GCOS；Affymetrix社)，将扫描的画像数据变换为CEL文件，用ArrayAssist(Stratagene社)软件标准化，算出在各模板RNA量中测定结果间的相关系数。标准化的算法使用MAS5.0。结果示于表2及图3。再有，在表2中，“SF”示标准化时乘以的系数，“％P”示用DNA芯片中搭载的探针检测的基因之中显著表达的基因的比例，“％A”示用DNA芯片中搭载的探针检测的基因之中不表达的基因的比例，“GAPDH3/5比”示相对于GAPDH基因的序列，检测3′侧的探针的信号值和检测5′侧的探针的信号值的比(使用的RNA分解，则示高的值。基准是3以内)。
(表2)
| 总RNA量(μg) | cRNA收量(μg) | SF | 背景平均 | 噪声平均 | ％P | ％A | GAPDH3/5比 |
| 1.0 | 27.87 | 2.71 | 45.21 | 2.52 | 40.91 | 57.89 | 1.17 |
| 10 | 38.18 | 1.99 | 52.36 | 2.88 | 44.41 | 54.45 | 0.95 |
模板RNA量1.0μg及10μg的数据间的相关系数是R2＝0.989，非常高。从而提示，在本发明的核酸的检测方法中，无关于作为模板使用的RNA量，可将检测对象的核酸通过微阵列以同程度检测。
【比较例：在IVT反应中的NTP混合物的浓度和cRNA收量的关系的检查】
在本发明的单链cDNA的合成方法及待测样品的制备方法中，通过调节使用的引物浓度，解决了得到一定量的cRNA的课题。另一方面，本发明人，在引物浓度以外，对于成为RNA合成的底物的NTP混合物，也检查了与cRNA收量的关系。即，为了研究是否可能使IVT反应中使用的NTP混合物在得到某一定量的生成物(cRNA)的时间点枯渴而结束合成反应，而进行实验。
以如同上述的试验例1(1)得到的RNA0.25μg作为模板，以终浓度5μM使用T7-寡dT引物，如同试验例1(2-1)合成单链cDNA。然后，从得到的单链cDNA，除了使IVT标记NTP Mix成为23.0μM～3.0mM的终浓度以外，如同试验例1(2-2)～(2-5)合成了生物素标记cRNA，测定其量。各NTP混合物浓度和cRNA收量的关系示于图4。
知在NTP混合物的浓度和cRNA收量之间有比例关系。从而提示，NTP混合物不是饱和状态。这被认为是因为NTP混合物的浓度变成反应速度的限速(反应速度依赖于NTP mix浓度)。
为了确认这方面，研究了使用终浓度3.0mM及1.5mM的NTP混合物时的反应时间(2小时、4小时、6小时、16小时)和cRNA收量的关系。结果示于图5。
由图5知，反应速度依赖于NTP混合物的浓度而变化。从而，即便使NTP混合物的浓度变低，反应速度也降低，所以认为反应中无NTP混合物枯渴。从而考虑，通过调节NTP混合物的浓度来得到一定量的cRNA的方法是不可能的。
Claims (11)
1.单链cDNA的合成方法，其包括：以从活体样品提取的RNA作为模板，使用有寡dT及启动子序列的引物合成单链cDNA的反应；其中
在合成单链cDNA的反应中，以终浓度500pM～500nM使用上述引物。
2.权利要求1所述的合成方法，其中上述活体样品是血液、淋巴液、尿、组织或细胞。
3.权利要求1所述的合成方法，其中
在合成单链cDNA的反应中，作为反应溶液中含的模板使用的RNA的浓度是0.005～0.5μg/μL。
4.微阵列用样品的制备方法，其包括：
从活体样品提取RNA的步骤；
使用含提取的RNA、以及，具有寡dT及启动子序列的引物的反应溶液，合成单链cDNA的步骤；及
以合成的cDNA作为模板合成检测用核酸，制备微阵列用样品的步骤；其中
在合成单链cDNA的步骤中，上述反应溶液中的上述引物的终浓度是500pM～500nM。
5.权利要求4所述的制备方法，其中
上述活体样品是血液、淋巴液、尿、组织或细胞。
6.权利要求4所述的制备方法，其中
在合成单链cDNA的步骤中，作为模板使用的RNA的浓度是0.005～0.5μg/μL。
7.权利要求4所述的制备方法，其中
在制备微阵列用样品的步骤中，检测用核酸是cRNA。
8.由微阵列的核酸的检测方法，其包括：
从活体样品提取RNA的步骤；
使用含提取的RNA、以及，具有寡dT及启动子序列的引物的反应溶液，合成单链cDNA的步骤；
以合成的cDNA作为模板合成检测用核酸，制备微阵列用样品的步骤；
使制备的微阵列用样品与微阵列接触，使微阵列用样品中含的检测用核酸和配置于微阵列的探针杂交的步骤；
测定由上述检测用核酸和上述探针的杂交发生的信号的步骤；及
基于测定结果，从上述微阵列用样品检测检测对象的核酸的步骤；其中
在合成单链cDNA的步骤中，合成单链cDNA的反应溶液中的上述引物的终浓度是500pM～500nM。
9.权利要求8所述的检测方法，其中
上述活体样品是血液、淋巴液、尿、组织或细胞。
10.权利要求8所述的检测方法，其中
在合成单链cDNA的步骤中，作为模板使用的RNA的浓度是0.005～0.5μg/μL。
11.权利要求8所述的检测方法，其中
在制备微阵列用样品的步骤中，检测用核酸是cRNA。
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