CN101528943A - 制备核酸样品的方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供制备核酸样品的方法。本发明的方法具体可用于制备基本代表完整转录本的样品。该方法特别适合用于基于微阵列的表达分析。

Description

制备核酸样品的方法和试剂盒

对相关申请的参考

优先权要求

本申请要求2003年8月13日提交的U.S.临时申请序列号60/495,232的优先权，和2004年2月9日提交的U.S.临时申请序列号60/542,933的优先权，上述二者的教导在此引作参考。所有引用的专利申请在此为所有目的以其全文引作参考。

发明背景

核酸样品制备方法已经大大地改变了使用分子生物学和重组DNA技术的实验室研究，并还影响诊断、法医、核酸分析和基因表达监测等领域。对于扩增基本完整的转录本方法还存在需求。

发明概述

在本发明的一个方面，提供制备代表RNA转录本的样品的方法。所述方法特别适于制备用来检测转录本特征，例如外显子和可变剪接的样品。所述方法适于这样的转录本特征的定量、半定量或定性检测。所述方法可用于监测包括所有类型变体的大量转录本，例如可变剪接的转录本。所述方法特别适于基于微阵列的众多，例如超过1000，5000，10,000，50,000条不同的靶转录本或转录本特征的平行分析。此处使用的术语“靶转录本”或“靶核酸”指转录本或其它目的核酸。

在优选的实施方案中，制备核酸样品的方法包括：将引物混合物与多种RNA转录本或来自RNA转录本的核酸杂交，并合成互补于RNA转录本的第一链cDNAs和互补于第一链cDNAs的第二链cDNAs，其中引物混合物包括具有启动子区域和随机序列引物区域的寡核苷酸；和从启动子区域起始转录RNA以产生核酸样品。引物区域可以是随机六聚体。启动子通常是原核启动子，例如噬菌体启动子，优选T7、T3或SP6启动子。

所述方法可用于研究真核生物mRNA或其它的RNAs。总RNA样品或富集poly(A)+的样品全部适合用于该方法。

在特别优选的方法中，得到的cRNA能被用作模板合成第二cDNAs。第二cDNA合成可以使用随机引物，例如随机六聚体进行。

虽然本发明方法具有广泛的应用并且不局限于任何具体的检测方法，它们特别适于检测大量，例如超过1000，5000，10,000，50,000条不同的转录本特征。例如，第二cDNAs可以被片段化/标记然后与核酸杂交用于检测。标记步骤可以在例如cDNA合成过程中进行。寡核苷酸探针特别适于检测具体的转录本特征，例如转录本中具体的外显子和/或剪接点。通常，至少5,000，10,000，50,000，100,000或500,000条寡核苷酸探针的集合可以被用于检测。核酸探针可以固定在珠子集合或单个片基上。

在本发明的另一个方面，提供用于制备核酸样品的试剂盒。示例性的试剂盒包括包含寡核苷酸混合物组分和寡核苷酸混合物使用说明的容器，其中寡核苷酸混合物组分中的寡核苷酸包括随机引物区域和启动子区域。一个示例性的寡核苷酸混合物具有序列：(SEQ ID NO：01)

5’GAATTGTAATACGACTCACTATAGGGNNNNNN 3’

(NNNNNN代表随机六聚体区域)

所述试剂盒可还可以包括含有反转录酶的容器和含有RNA聚合酶的容器。所述试剂盒可以具有随机引物混合物(例如随机六聚体混合物)，加上寡核苷酸混合物与随机引物和启动子区域。附加组分可以包括标记和片段化试剂，核苷酸，等等。

在优选实施方案中，试剂盒包括为检测代表靶RNA转录本序列设计的至少1000，5000，10,000或50,000条不同核酸探针的集合。核酸探针可以固定在片基上。它们通常设计为至少5000条不同外显子和/或至少500个剪接点。

本发明的方法和试剂盒在生物学研究、诊断，毒理学、药物开发及其他区域具有广泛的应用。

附图简述

附图被引入申请文件并成为申请文件的一部分以示例本发明的实施方案，连同说明书用来解释本发明的原理：

图1是使用包含随机六聚体(RH)区域和T7启动子区域的寡核苷酸引物的优选实施方案(小样本WTA或sWTA)的示意图。这个方法有两个cDNA合成步骤。CDNA可以在5’或3’末端标记或内部标记。

图2是比较两个方案的示意图，一个方案具有用于制备cRNA样品的一个cDNA合成步骤，另一个方案具有用于制备cDNA样品的两个cDNA合成步骤。cRNAs可以被片段化/标记用于杂交。

图3是显示制备cDNA样品(WTA)的随机六聚体cDNA方案的示意图。任选的，还可以合成第二链cDNA。

图4比较sWTA和WTA的性能。

图5显示RP-T7-CDNA扩增(sWTA)方案适用于示例的跨全长转录本检测。

发明详述

在本发明的一个方面，提供分析RNA转录的方法和组合物。提供制备来源于转录本样品的核酸样品的方法和组合物。在优选实施方案中，核酸样品代表转录本样品中的转录本群体。因此，这些优选方法特别适于制备用来询问转录本特征/结构例如外显子结构和转录本中的剪接的核酸样品。本发明的方法通常具有在跨越靶的任何地方而不仅仅在3’或5’末端制备转录本的更好的能力。优选的方法通常包括使用转录本作为模板和随机寡核苷酸作为引物合成核酸(例如通过反转录反应)。合成的核酸然后还被进一步加工以获得核酸样品。该方法对基于微阵列的实验特别有用。然而，该样品制备方法可以还用于其它的检测方法。

在本发明的另一个方面，包含一种或者多种引物(其可以包含随机区域和固定内容区域，例如T7启动子)的分析试剂盒，任选包含反转录酶、RNA聚合酶、标记试剂和/或片段化试剂。

I.概论

本发明有许多优选实施方案，并依赖于许多专利，专利申请和其他的参考文献以获得本领域人员公知的细节。因此，当专利，专利申请和其他的参考文献在下文被引用或重复时，应当理解其以全文为所有目的和所述的命题引作参考。

如在本申请中应用的，单数形式“一个”，“一种”包括复数形式，除非上下文明确指明相反的意思。例如，术语“一种试剂”包括多种试剂，包含其混合物。

个体不限于人，而是还包括其他生物，包括但不限于哺乳动物，植物，细菌，或来自上述生物的细胞。

整个发明公开中，本发明的不同方面可以表示为范围的形式。应当理解以范围形式描述只是为了方便和简洁，不应当认为是对发明范围的僵化的限制。因此，范围的说明应当视为具体公开所有可能的子范围以及该范围内单独的数值。例如，对从1到6的范围的描述应当视为具体公开子范围例如1到3，1到4，1到5，2到4，2到6，3到6等，以及该范围内单独的数值，例如1，2，3，4，5，和6。无论范围有多宽，这同样适用。

除非有另外的说明，本发明的实践可以采用本领域技术人员公知的有机化学、聚合物技术、分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、生物化学和免疫学领域的常规技术和描述。这样的常规技术包括聚合物阵列合成、杂交、连接和使用标记物检测杂交。合适的技术具体的示例可以参考下文的实施例。然而，其他等同的常规方法当然也可以使用。这样的常规技术和描述可以在标准实验室手册，例如GenomeAnalysis：A Laboratory Manual Series(基因组分析：实验室手册系列)(Vols.I-IV)，Using Antibodies：A Laboratory Manual(使用抗体：实验室手册)，Cells：A Laboratory Manual(细胞：实验室手册)，PCR Primer：ALaboratory Manual(PCR引物：实验室手册)，和Molecular Cloning：ALaboratory Manual(分子克隆：实验室手册)(全部来自Cold SpringHarbor Laboratory Press)，Stryer，L.(1995)Biochemistry(生物化学)(第4版)Freeman，New York，Gait，“Oligonucleotide Synthesis：A PracticalApproach(寡核苷酸合成：实用方法)”1984，IRL Press，London，Nelsonand Cox(2000)，Lehninger，Principles of Biochemistry(生物化学原理)第3版，W.H.Freeman Pub.，New York，NY and Berg等(2002)Biochemistry，第5版，W.H.Freeman Pub.，New York，NY中找到，所有这些在此以其全文为所有目的引作参考。

本发明可以采用固体片基，包括一些优选的实施方案中的阵列。适用于聚合物(包括蛋白质)阵列合成的方法和技术已经描述于美国专利序列号09/536,841；WO 00/58516；U.S.专利号5,143,854；5,242,974；5,252,743；5,324,633；5,384,261；5,405,783；5,424,186；5,451,683；5,482,867；5,491,074；5,527,681；5,550,215；5,571,639；5,578,832；5,593,839；5,599,695；5,624,711；5,631,734；5,795,716；5,831,070；5,837,832；5,856,101；5,858,659；5,936,324；5,968,740；5,974,164；5,981,185；5,981,956；6,025,601；6,033,860；6,040,193；6,090,555；6,136,269；6,269,846；和6,428,752；PCT申请号PCT/US99/00730(国际公布号WO 99/36760)；和PCT/US01/04285中；其在此以其全文为所有目的引作参考。

以具体的实施方案描述合成技术的专利包括U.S.专利5,412,087；6,147,205；6,262,216；6,310,189；5,889,165；和5,959,098。核酸阵列描述于许多上述专利，但相同的技术也适用于多肽阵列。

本发明有用的核酸阵列包括那些从Affymetrix(Santa Clara，CA)以商标名购得的阵列。阵列的例子显示于网站affymetrix.com。

本发明还预期连接到固体片基的聚合物的许多应用。这些应用包括基因表达监测，图谱，文库筛选，基因分型和诊断。基因表达监测和制作图谱方法可以显示于美国专利5,800,992；6,013,449；6,020,135；6,033,860；6,040,138；6,177,248；和6,309,822。基因分型及其应用显示于美国序列号60/319,253；10/013,598；和U.S.专利5,856,092；6,300,063；5,858,659；6,284,460；6,361,947；6,368,799；和6,333,179。其他的应用还体现在美国专利5,871,928；5,902,723；6,045,996；5,541,061；和6,197,506中。

本发明还预期某些优选实施方案中的样品制备方法。在基因分型之前或同时，基因组样品可以通过多种机制扩增，其中一些采用PCR。参见例如PCR Technology：Principles and Applications for DNAAmplification(PCR技术：DNA扩增原理和应用)(Ed.H.A.Erlich，Freeman Press，NY，NY，1992)；PCR Protocols：A Guide to Methods andApplications(PCR操作：方法和应用指南)(Eds.Innis等，AcademicPress，San Diego，CA，1990)；Mattila等，Nucleic Acids Res.19，4967(1991)；Eckert等，PCR Methods and Applications(PCR方法和应用)1，17(1991)；PCR(McPherson等编，IRL Press，Oxford)；和U.S.专利4,683,202；4,683,195；4,800,159；4,965,188；和5,333,675，以其全文为所有目的引作参考。这些样品可以在阵列上扩增。参见，例如，U.S.专利6,300,070和U.S.专利申请序列号09/513,300，其在此引为参考。

其他合适的扩增方法包括连接酶链式反应(LCR)(例如，Wu和Wallace，Genomics 4，560(1989)，Landegren等，Science 241，1077(1988)和Barringer等，Gene 89：117(1990))，转录扩增(Kwoh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，1173(1989)和WO88/10315)，自动维持序列复制(Guatelli等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，87，1874(1990)和WO90/06995)，选择性扩增靶多核苷酸序列(U.S.专利6,410,276)，共有序列引发的聚合酶链式反应(CP-PCR)(U.S.专利4,437,975)，任意引物聚合酶链式反应(AP-PCR)(U.S.专利5,413,909；5,861,245)和基于核酸的序列扩增(NABSA)。(参见U.S.专利5,409,818；5,554,517；和6,063,603，在此各自引为参考)。其他可用的扩增方法描述于U.S.专利5,242,794；5,494,810；4,988,617；和U.S.序列号09/854,317，各自在此引为参考。

在Dong等，Genome Research 11，1418(2001)，U.S.专利6,361,947，6,391,592和U.S.专利申请序列号09/916,135；09/920,491；09/910,292；和10/013,598中描述另外的样品制备的方法和降低核酸样品复杂性的方法。

进行多核苷酸杂交分析的方法是本领域发展完善的技术。杂交分析方法和条件根据应用的情况而不同，并根据已知的通用结合方法包括那些参考如下的方法选择：Maniatis等Molecular Cloning：ALaboratory Manual(分子克隆：实验室手册)(第2版Cold Spring Harbor，N.Y，1989)；Berger and Kimmel Methods in Enzymology(酶学方法)，Vol.152，Guide to Molecular Cloning Techniques(分子克隆技术指南)(Academic Press，Inc.，San Diego，CA，1987)；Young和Davism，P.N.A.S，80：1194(1983)。进行重复的和可控制的杂交反应的方法和设备描述于U.S.专利5,871,928；5,874,219；6,045,996；和6,386,749；6,391,623，在此各自引为参考。

本发明的某些优选实施方案中还预期配体之间杂交信号的检测。参见U.S.专利号5,143,854；5,578,832；5,631,734；5,834,758；5,936,324；5,981,956；6,025,601；6,141,096；6,185,030；6,201,639；6,218,803；和6,225,625，U.S.专利申请序列号60/364,731；和PCT申请PCT/US99/06097(公开为WO99/47964)，各自在此以其全文为所有目的引作参考。

用于信号检测及处理强度数据的方法和设备描述于U.S.专利5,143,854；5,547,839；5,578,832；5,631,734；5,800,992；5,834,758；5,856,092；5,902,723；5,936,324；5,981,956；6,025,601；6,090,555；6,141,096；6,185,030；6,201,639；6,218,803；和6,225,625；U.S.专利申请序列号60/364,731；和PCT申请PCT/US99/06097(公开为WO99/47964)，各自在此以其全文引为多功能参考。

本发明的实践还采用常规生物学方法，软件和系统。本发明的计算机软件产品一般包括计算机可读介质，其具有计算机可执行的指令以执行本发明方法的逻辑步骤。合适的计算机可读介质包括软盘，CD-ROM/DVD/DVD-ROM，硬盘驱动器，闪存，ROM/RAM，磁带等。计算机可执行的指令可以用合适的计算机语言或数种语言的组合写成。基本的计算机生物学方法描述于，例如Setubal和Meidanis等，Introduction to Computational Biology Methods(计算生物学方法介绍)(PWS Publishing Company，Boston，1997)；Salzberg，Searles，Kasif，(编)，Computational Methods in Molecular Biology(分子生物学计算机方法)，(Elsevier，Amsterdam，1998)；Rashidi和Buehler，BioinformaticsBasics：Application in Biological Science and Medicine(生物信息学基础：在生物科学和医学中的应用)(CRC Press，London，2000)和Ouelette和Bzevanis Bioinformatics：A Practical Guide for Analysis of Gene andProteins(生物信息学：基因和蛋白质分析实用指南)(Wiley & Sons，Inc.，第2版，2001)。参见U.S.专利6,420,108。

本发明为各种目的还利用不同计算机程序产品和软件，例如，探针设计，数据管理、分析和设备操作。参见U.S.专利5,593,839；5,795,716；5,733,729；5,974,164；6,066,454；6,090,555；6,185,561；6,188,783；6,223,127；6,229,911；和6,308,170。

本发明还利用美国专利5,545,531和5,874,219中描述的阵列和处理的数个实施方案。这些专利在此以其全文引作多功能参考。

另外，本发明具有优选实施方案，其包括在网络例如互联网上提供遗传信息的方法，如U.S.专利申请序列号10/063,559；60/349,546；60/376,003；60/394,574；60/403,381所示。

II.定义

“阵列”指有意产生的分子集合，其通过合成或生物合成而制备。阵列中的分子可以是彼此相同或不同的。阵列可以具有不同的形式，例如，可溶性分子的文库；连接到树脂珠的化合物的文库；硅芯片，或其他固体支持物。

阵列板或板具有多个阵列的物体，其中各阵列与其他的阵列通过对阻止液体通过的物理屏障分离并形成称作孔的区域或空间。

核酸文库或阵列是有意产生的核酸集合，其通过合成或生物合成制备，并以各种不同的形式筛选生物活性(例如，可溶分子的文库；和连接到树脂珠的寡聚物的文库，硅片，或者其他的固体支持物)。另外，术语“阵列”包括通过将基本上任何长度的核酸(例如，从1到大约1000核苷酸单体长度)点样在片基上而制备的那些核酸文库。此处使用的术语“核酸”指任何长度的核苷酸的多聚体形式，或者是美国专利6,156,501描述的包括嘌呤和嘧啶碱基的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸或肽核酸(PNAs)，或者是其他的天然的，化学或生物化学修饰的，非天然的或衍生的核苷酸碱基。多核苷酸的骨架包含通常可以在RNA或DNA中找到的糖和磷酸基，或修饰的或取代的糖基或磷酸基。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。核苷酸的序列可以被非核苷酸成分中断。因此术语核苷，核苷酸、脱氧核苷和脱氧核苷酸通常包括例如此处描述的类似物。这些类似物是那些与天然存在的核苷或核苷酸具有相同结构特征的分子，使得掺入到核酸或寡核苷酸序列后，它们允许与天然存在的核酸序列在溶液中杂交。通常这些类似物从天然存在的核苷和核苷酸通过替换和/或修饰碱基，核糖或磷酸二酯部分而衍生得到。可以定制改变以使杂交物的形成稳定或不稳定或增强与所需的互补核酸序列杂交的特异性。

生物聚合物或生物学聚合物：用来表示生物的或化学部分的重复单元。代表性的生物聚合物包括，但不限于，核酸，寡核苷酸，氨基酸，蛋白质，肽，激素，寡糖，脂质，糖脂，脂多糖，磷脂，上述物质的合成类似物，包括但不限于反向的核苷酸，肽核酸，Meta-DNA，和上述的组合。“生物聚合物合成”旨在包括生物聚合物的无机和有机的合成生产。

与生物聚合物相关的是“生物单体”，其用来表示生物聚合物的单个单元，或不是生物聚合物的部分的单个单元。因此，例如，核苷酸是寡核苷酸生物聚合物内的生物单体，氨基酸是蛋白或肽生物聚合物的生物单体；例如亲和素，生物素，抗体，抗体片段等也是生物单体。

起始生物单体：或“起始子生物单体”表示通过反应性亲核试剂共价连接到聚合物表面的第一个生物单体，或与连接到聚合物的接头或间隔臂连接的第一个生物单体，该接头或间隔臂通过反应性亲核试剂连接到聚合物。

互补：指核苷酸或核酸之间的杂交或碱基配对，例如在双链DNA分子的两条链之间或在寡核苷酸引物与待测序或扩增的单链核酸上的引物结合位点之间。互补的核苷酸通常是A和T(或A和U)，或C和G。当一条链的核苷酸，具有合适的核苷酸插入或缺失以最优化排列并比较，与另一条链的核苷酸至少约80％配对，通常至少约90％到95％配对，更优选至少约98到100％配对时，两个单链RNA或DNA分子称为是基本互补的。或者，当RNA或DNA链在选择性杂交条件下与其互补物杂交时，存在实质的互补性。通常选择性杂交发生在至少14到25个核苷酸的范围内至少约65％互补性，优选至少约75％，更优选至少约90％互补性。参见M.Kanehisa Nucleic Acids Res.12：203(1984)，此处引为参考。

组合合成策略：组合合成策略是通过顺序添加试剂而平行合成相异的聚合物序列的有序策略，其可以通过反应物矩阵和转换矩阵(Switch matrix)来表示，其积是产物矩阵。反应物矩阵是l列m行待添加的构建模块的矩阵。转换矩阵是二元数字的全体或子集，优选有序的，在l和m之间以列形式排列。“二元策略”是其中至少两个连续的步骤曝光片基上目的区域的一部分，通常是一半。在二元合成策略中，形成所有可以从有序反应物组集合中形成的可能的化合物。在最优选的实施方案中，二元合成指还影响在先的添加步骤的合成策略。例如其中用于遮蔽策略的转换矩阵将以前曝光过的区域分成两半，曝光大约一半以前曝光的区域并保护剩余的一半(同时也保护大约一半以前保护的区域和曝光大约一半以前保护的区域)。应该认识到二元轮次可以被非二元轮次间隔开，以及只有一部分片基接受二元方案。组合的“遮蔽”策略是使用光或其他空间选择性去保护剂或激活剂除去材料的保护基团以添加其他物质如氨基酸等的合成。

有效量指足够诱导想要的结果的量。

激发能量指用于使可检测的标记物赋予能量以检测的能量，例如曝光荧光标记物。该项应用的装置包括相干光和非相干光，例如激光，UV光，发光二极管，和白炽光源，或具有可激发标记物的激发带波长或能够提供可检测的发射，反射或漫射曝光的任何其他的光或其他的电磁能源。

基因组是生物染色体中的全部遗传物质。来源于具体的生物染色体的遗传物质的DNA是基因组DNA。基因组文库是克隆的集合，制自一组随机产生的重叠的DNA片段，代表生物整个基因组。

杂交条件通常包括盐浓度低于约1M，更经常是低于约500mM，和优选低于约200mM。杂交温度可以低至5℃，但通常大于22℃，更通常大于约30℃，更优选大于约37℃。越长的片段需要越高的杂交温度以特异性地杂交。而其他因素可能影响杂交的严紧程度，包括碱基组成和互补链的长度，存在有机溶剂和碱基错配的程度，参数的组合是比单独任何一个参数的绝对量度更重要。

杂交，例如等位基因特异性的探针杂交，通常在严紧条件下完成。例如，盐浓度仅仅大约1摩尔(M)和温度至少25℃的条件，例如，750mMNaCl，50mM磷酸钠，5mM EDTA，pH 7.4(5×SSPE)和温度从约25到约30℃的条件。

杂交通常在严紧条件下完成，例如在盐浓度仅仅1摩尔(M)和温度至少25℃的条件。例如，5×SSPE的条件(750mM NaCl，50mM磷酸钠，5mM EDTA，pH 7.4)和温度25-30℃的条件是适合等位基因特异性探针杂交的条件。关于严紧条件，参考，例如Sambrook，Fritsche andManiatis.“Molecular Cloning：A laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)”第2版Cold Spring Harbor Press(1989)，其在此以全文引作上述多功能的参考。

术语“杂交”指其中两个单链多核苷酸非共价结合形成稳定的双链多核苷酸的过程；三链杂交理论上也是可能的。得到的(通常)双链多核苷酸是“杂交物”。形成稳定的杂交物的多核苷酸群体的比例此处称为“杂交程度”。

“杂交探针”是能够以碱基特异性的方式结合至核酸互补链的寡核苷酸。这样的探针包括肽核酸，如Nielsen等，Science 254，1497-1500(1991)的描述，和其他核酸类似物和核酸模拟物。参见美国专利6,156,501。

“特异性杂交到”：指分子在严格的条件下当某个具体的核苷酸序列存在于复杂混合物(例如整个细胞的)DNA或RNA中时，基本上或只结合、双链化或杂交到该序列。

分离的核酸指以优势种类存在的目标种类发明(即，以摩尔计，它在组合物中比任何其他的单个种类更丰富)。优选地，分离的核酸包括在所有出现的大分子种类中的至少大约50，80或90％(以摩尔计)。最优选，该目标种类被纯化到基本均一(不能通过常规的检测方法在组合物中检测到污染的种类)。

标记物，例如荧光标记物，光散射标记物或放射性标记物。荧光标记物尤其包括商业获得的荧光素亚磷酰胺例如Fluoreprime(Pharmacia)，Fluoredite(Millipore)和FAM(ABI)。参见美国专利6,287,778。

配体：指被特定的受体识别的分子。被受体结合或与受体反应的因子被称作“配体”，该术语定义只针对其相应的受体才有意义。术语“配体”不暗示任何具体的分子大小或其他的结构或组成的特性，只表示该物质能够结合受体或与受体相互作用。同时，配体可以或者作为受体结合的天然配体，或者作为担当激动剂或者拮抗剂的功能类似物。本发明研究的配体的例子包括而不局限于，细胞膜受体激动剂和拮抗剂，毒素和毒液，病毒表位，激素(例如阿片剂，类固醇等)，激素受体，肽，酶，酶底物，底物类似物，过渡状态类似物，辅助因子，药物，蛋白，和抗体。

连锁不平衡或等位基因相关指具体的等位基因或遗传标志与在附近染色体位置上的特定等位基因，或遗传标记优先相关的频率比群体中任何具体的等位基因频率所预计的更高。例如，如果位点X具有等位基因a和b，其以相同频率出现，和连锁的位点Y具有等位基因c和d，其以相同频率出现，人们预期ac组合发生的频率为0.25。如果ac更经常地发生，则等位基因a和c处于连锁不平衡。连锁不平衡可能由某些等位基因组合的自然选择引起，或因为等位基因被引入到群体中时间太短还没有与连锁的等位基因达到平衡。

微孔板是标准形式(96,384和1536孔)的不连续孔的阵列，用于平行检查多个样品的物理，化学或生物学性质。

混合群体或复杂群体指包含所需的和非所需的核酸的任何样品。作为非限制性的例子，核酸的复杂群体可以是总基因组DNA，总基因组RNA或其组合。此外，核酸的复杂群体可以富集给定的群体但包括其他不合需要的群体。例如，核酸的复杂群体可以是已经富集所需的信使RNA(mRNA)序列但还包括一些非所需的核糖体RNA序列(rRNA)的样品。

单体：指可以连接到一起形成寡聚物或聚合物的一组分子的任何成员。对本发明有用的该组单体包括，而不局限于例如用于(多)肽合成的L-氨基酸，D-氨基酸，或合成的氨基酸。此处使用的“单体”指合成寡聚体的基本组的任何成员。例如，L-氨基酸的二聚体形成合成多肽的400个“单体”的基本组。不同单体的基本组可以在合成聚合物的连续步骤中使用。术语“单体”也指能够结合不同的化学亚基形成比单独的任何亚基更大的化合物的化学亚基。

mRNA或mRNA转录本：如此处使用的，其包括但不限于前mRNA转录本，转录加工中间体，准备翻译的成熟mRNA和基因的转录本，或来源于mRNA转录本的核酸。转录加工可以包括剪接、编辑和降解。此处使用的来源于mRNA转录本的核酸指以mRNA转录本或其子序列最终作为模板而为其合成的核酸。因此，从mRNA反向转录的cDNA，从cDNA转录的RNA，从cDNA扩增的DNA，从扩增的DNA转录的RNA等等全部来源于mRNA转录本，检测这样的衍生产品指示样品中原始的转录本存在和/或在样品中的丰度。因此，mRNA衍生的样品包括，但不局限于基因的mRNA转录本，从mRNA反向转录的cDNA，从cDNA转录的cRNA，从基因扩增的DNA，从扩增的DNA转录的RNA等等。

核酸文库或阵列是有意产生的核酸集合，其通过或者合成或生物合成制备并以各种不同的形式筛选生物活性(例如，可溶分子的文库；和连接到树脂珠的寡聚物的文库，硅片，或者其他的固体支持物)。另外，术语“阵列”包括通过将基本上任何长度的核酸(例如，从1到大约1000核苷酸单体长度)点样在片基上而制备的那些核酸文库。此处使用的术语“核酸”指任何长度核苷酸的多聚体形式，或是包含嘌呤和嘧啶碱基的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸或肽核酸(PNAs)，或是其他天然的，化学或生物化学修饰的，非天然的或衍生的核苷酸碱基。多核苷酸的骨架能够包含通常在RNA或DNA中发现的糖和磷酸基，或修饰的或取代的糖基或磷酸基。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。核苷酸的序列可以被非核苷酸成分中断。因此术语核苷，核苷酸、脱氧核苷和脱氧核苷酸通常包括例如此处描述的类似物。这些类似物是具有一些和天然存在的核苷或核苷酸相同结构特征的分子，使得当掺入到核酸或寡核苷酸序列后，它们允许与天然存在的核酸序列在溶液中杂交。一般这些类似物从天然存在的核苷和核苷酸通过替换和/或修饰碱基，核糖或磷酸二酯部分而衍生得到。可以定制改变以使杂交物的形成稳定或不稳定或增强与所需的互补核酸序列杂交的特异性。

本发明的核酸可以包括嘧啶和嘌呤碱基，分别优选胞嘧啶，胸腺嘧啶，和尿嘧啶，及腺嘌呤和鸟嘌呤的任何聚合物或寡聚物。参见AlbertL.Lehninger，Principles of Biochemistry(生物化学原理)，793-800页(Worth Pub.1982)。实际上，本发明预期任何脱氧核糖核苷酸，核糖核苷酸或肽核酸组分，和其任何的化学变体，例如这些碱基甲基化的，羟甲基化的或糖基化的形式等。组合物中的聚合物或寡聚物可以是异源或同源的，并且可以分离自天然存在的来源或可以人工或合成生产。另外，核酸可以是DNA或RNA，或其混合物，并可以以单链的或双链的形式方式永久地或暂时存在，包括同源双链体，异源双链体，和杂交物状态。

“寡核苷酸”或“多核苷酸”指长度范围至少2，优选至少8，更优选至少20个核苷酸的核酸或特异性杂交到多核苷酸的化合物。本发明的多核苷酸包括脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)序列，其可以从天然来源，重组生产或人工合成的来源和其模拟物分离到。本发明的多核苷酸的另一个例子可以是肽核酸(PNA)。本发明还包括其中具有非传统的碱基配对，例如Hoogsteen碱基配对的情况，这已经在某些tRNA分子中鉴定到并假定存在于三螺旋中。本申请中“多核苷酸”和“寡核苷酸”是可互换地使用的。

探针：探针是被具体的靶识别的表面固定的分子。本发明研究的探针的例子包括而不局限于，细胞膜受体的激动剂和拮抗剂，毒素和毒液，病毒表位，激素(例如阿片样肽，类固醇等)，激素受体，肽，酶，酶底物，辅因子，药物，凝集素，糖，寡核苷酸，核酸，寡糖，蛋白，和单克隆抗体。

引物指在合适的条件下能够作为模板指导的DNA合成起始点的单链寡核苷酸，所述条件例如缓冲液和温度，存在四种不同的核苷三磷酸和聚合因子，例如DNA或RNA聚合酶或反转录酶。引物的长度，在任何给定的例子中，取决于例如引物打算的用途，并且范围通常从15到20，25，30个核苷酸。短的引物分子通常要求较低的温度以与模板形成足够稳定的杂交复合物。引物不必反映模板的确切序列但必须充分地互补以与这样的模板杂交。引物位点是模板上引物杂交的区域。引物对是一组引物，包括与待扩增的序列5’末端杂交的5’上游引物和与待扩增的序列3’端的互补物杂交的3’下游引物。

多态性指在群体内发生两个或更多遗传决定的替代序列或等位基因。多态性标记或位点是出现差异的位点。优选的标记具有至少两个等位基因，各自在选定的群体中的发生频率大于1％，更优选大于10％或20％。多态性可以包含一个或多个碱基变化，插入，重复，或缺失。多态性位点可以小至一个碱基对。多态性标记包括限制片段长度多态性，可变数量串联重复(VNTR’s)，高变区，微卫星，二核苷酸重复，三核苷酸重复，四核苷酸重复，简单顺序重复，和插入元件比如Alu。第一个鉴定的等位基因形式被任意指定作为参考形式而其他等位基因形式被指定为备择的或变体等位基因。选定的群体中最经常出现的等位基因形式有时被认为是野生型。对等位基因形式而言，二倍体生物可以是纯合的或杂合的。双等位基因多态性具有两种形式。三等位基因的多态性具有三种形式。单核苷酸多态性(SNPs)也包括在多态性中。

读出器或读板机是用于鉴定阵列上杂交事件，例如阵列上的核酸探针和荧光标记的靶之间杂交的装置。读出器是本领域公知的，并可以从Affymetrix，Santa Clara CA和其他公司购买到。通常，它们使用激发能量(例如激光)以曝光杂交到探针的荧光标记的靶核酸。然后，使用装置例如CCD，PMT，光电二极管或相似的装置以记录收集到的发射而检测重新发射的曝光(以与激发能量不同的波长)。参见美国专利6,225,625。

“受体”指与给定的配体有亲和力的分子。受体可以是天然存在的或人造的分子。此外，它们可以未改变的状态或作为与其他种类的聚集体而使用。受体可以共价地或非共价地，直接地或通过特异性的结合物质连接到结合成分。可以用于本发明的受体的例子包括，但不局限于，抗体，细胞膜受体，单克隆抗体和与特异抗原决定簇(比如病毒，细胞或其他材料上的抗原决定簇)反应的抗血清，药物，多核苷酸，核酸，肽，辅因子，凝集素，糖，多糖，细胞，细胞膜，和细胞器。本领域内受体有时称作抗配体。作为此处使用的术语受体，意思没有差别。当两个大分子通过分子识别形成复合物时形成“配体受体对”。本发明研究的受体的其他例子包括但不局限于U.S.专利号5,143,854显示那些分子，其在此以全文引为参考。

“固相支持物”，“支持物”，和“片基(substrate)”是可互换使用的，指具有刚性或半刚性表面的材料或一组材料。在许多实施方案中，该固相支持体的至少一个表面将是基本上平坦的，尽管在一些实施方案中物理上分开不同化合物的合成区域是合乎需要的，例如用孔，突起区域，针点(pin)，蚀刻沟等等。根据其他的实施方案，该固相支持体将采取珠，树脂，凝胶，微球体，或其他几何构型的形式。参见美国专利号5,744,305作为示例性的片基。

靶：指与给定的探针有亲和力的分子。靶可以是天然存在的或人工的分子。此外，它们可以未改变的状态或作为与其他种类的聚集体而使用。靶或者直接地或通过特异性的结合物质共价地或非共价地连接到结合成分。可以用于本发明的靶的例子包括，但不局限于，抗体，细胞膜受体，单克隆抗体和与特异抗原决定簇(比如在病毒，细胞或其他材料上的抗原决定簇)反应的抗血清，药物，寡核苷酸物，核酸，肽，辅因子，凝集素，糖，多糖，细胞，细胞膜，和细胞器。本领域内靶有时指抗-探针。作为此处使用的术语靶，意思没有差别。当两个大分子通过分子的识别组合形成复合物时形成“探针靶对”。

WGSA(全基因组取样分析)基因分型技术：允许在复杂DNA中不使用位点特异性的引物而同时对数以千计的SNPs进行基因分型的技术。在该技术中，例如基因组DNA，用目的限制性内切酶消化，适配子(adaptors)被连接到消化的片段。对应与适配子序列的单个引物被用于扩增所需大小，例如500-2000bp的片段。加工过的靶然后杂交到含有包含SNP的片段/探针的核酸阵列。WGSA公开于，例如US临时申请序列号60/319,685，60/453,930，60/454,090和60/456,206，60/470,475，U.S.专利申请09/766,212，10/316,517，10/316,629，10/463,991，10/321,741，10/442,021和10/264,945，其各自在此以全文引作多功能参考。

下文详细参考本发明示例的实施方案。当本发明连同示例的实施方案一起描述时，应当理解其不是要将本发明限制于这些实施方案。相反，本发明意图覆盖可以包含在本发明的精神和范围内的替代形式，修饰和等同物。

3.用于全转录本分析的样品制备方法

在本发明的一个方面，提供适于制备核酸样品的方法，所述样品代表至少70％，80％，90％转录本的外显子，或全转录本。在优选实施方案中，该方法用来从转录本的至少70％，80％，90％或所有的外显子制备核酸，用于与核酸探针阵列，例如包含靶向外显子和任选外显子之间连接的探针的高密度寡核苷酸阵列杂交。本发明的方法还特别适合用于例如那些在U S.专利申请序列号10/815,333中描述的瓦状阵列(tiling arrays)，其在此引为参考。在优选的实施方案中，阵列具有靶向至少500，1000，10,000转录本的至少50％，70％，80％，90％或全部外显子的探针。

在优选实施方案中，RNA转录本样品(图1所示)被用作反转录反应的模板以合成cDNA。合成cDNAs的方法是本领域公知的。然而在优选实施方案中，可以使用具有随机区域和固定内容区域的寡核苷酸引物。一个示例性的引物是随机六聚体，和可以用于体外转录反应的T7启动子：

(SEQ ID NO：01)

5’GAATTGTAATACGACTCACTATAGGGNNNNNN 3’

(NNNNNN代表随机六聚体区域)

随机区域适于用引物随机引发转录本序列使得到的cDNA更能代表转录本的不同区域。在优选实施方案中，引物的随机区域长度可以是5，6，7，8，9个碱基。所述固定内容区域通常用于提供随后的反应所需的功能。例如，T7启动子对体外转录反应是有用的。本领域技术人员将理解T7以外的启动子，例如T3和SP6也通常被用于体外转录并适于用作固定内容区域。用于不同的体外转录启动子的聚合酶是市场上可买到的，例如从Ambion公司(Austin，TX，USA)。

如图1所示，得到的cDNA(通常双链)可以用作体外转录反应的模板以合成cRNA。cRNA靶可以被标记/片段化用于杂交和检测(参见图2)。然而，在特别优选的实施方案中，cRNAs用作使用例如随机引物的另一cDNA合成反应的模板。得到的cDNA可以被标记和片段化用于杂交和检测。这个方法通常提高检测灵敏度。

图2比较所述两个方法。本领域技术人员将理解本发明不限于任何具体的标记或片段化方法。可以使用许多合适的标记和片段化方法。适合用于增强杂交的其他DNA片段化方法描述于，例如U.S.临时申请序列号60/589,648，60/545,417，60/512,569，60/506,697，全部在此引作参考。

以下是作为非限制性的例子以说明优选实施方案的详细规程。这个示例性规程用来在一些大规模的实验中以优良的结果检测转录特征，例如外显子，可变剪接等等(数据未显示)。表1是示例的试剂和材料的列表。

表1.试剂和材料

试剂名称	销售商	产品编号
			DEPC化的水，4L	Ambion	9920
无DNA的总RNA
			随机引物-T7(RP-T7)，
5’GAATTGTAATACGACTCACTATAGGGNNNNNN 3’SEQ ID NO：1
			包括Superscript II，200U/μL，40,000U5X第一链缓冲液和0.1M DTT	Invitrogen	18064-071
dNTP混合物，10mM，100μL	Invitrogen	18427-013
			Superase In，20U/μL，2,500U	Ambion	26964
Klenow片段(3’-＞5’外切)，5U/μL，1000U	NEB	M0212L
			氯化镁，25mM(来自PCR试剂盒)	ABI
随机引物，3μg/μL，300μg	Invitrogen	48190-011
			RNaseH，2U/μL，120U	Invitrogen	18021-071
DNA聚合物I的大片段，3-9U/μL，500U	Invitrogen	18012-039
			DNase I，1U/μL，5,000μL	Promega	M6101
One-Phor-All plus缓冲液，10X	Amersham	27-0901-02
			MEGAscriptT7试剂盒	Ambion	1334
RNeasy微量试剂盒	Qiagen	74104
			QIAquick PCR纯化试剂盒(50)	Qiagen	28104
包含重组末端转移酶5X缓冲液和25mM CoCl2	RocheDiagnostics	3 333 574
			DLR-1a，5mM	Affymetrix	900430

cRNA扩增

步骤1.第一链cDNA合成

1.在0.2μL PCR管中充分混合总RNA样品和RP-T7引物：

总RNA(10ng-100ng)                 1μL

RP-T7引物，2pmol/ng               1μL

水                                3μL

总体积                            5μL

2.在热循环仪中65℃温育5分钟，然后在4℃保持2分钟，并离心收集样品。

3.如下制备RT预混物1：

DEPC化的水                        0.5μL

5×第一链缓冲液                   2μL

DTT，0.1M                         1μL

dNTP混合物，10mM                  0.5μL

Superase In，20U/μL              0.5μL

Suuperscript II，200U/μL         0.5μL

总体积                            5μL

4.将5μL RT预混物1加入到变性的RNA和引物混合物中，使终体积为10μL。

5.充分混合，离心，并在25℃温育10分钟，在37℃温育1小时，然后在4℃保持不超过10分钟。

步骤2.第二链cDNA合成

1.如下制备SS预混物1：

DEPC化的水                        4.575μL

氯化镁，25mM                      2.8μL

Klenow片段(外切)，5U/μL          2.5μL

RNase H，2U/μL                   0.125μL

总体积                            10μL

2.向各第一链反应加入10μL SS预混物1使终体积为20μL。

3.充分混合并离心，然后在37℃温育50分钟。

4.在70℃灭活Klenow片段(外切)10分钟，然后在4℃保持不超过10分钟进行下一步骤。

步骤3.使用Ambion MEGAscript T7试剂盒，IVT用于cRNA扩增

1.根据以下顺序在室温下将下列试剂加入到第二链合成反应中：

ATP，75mM                5μL

CTP，75mM                5μL

GTP，75mM                5μL

UTP，75mM                5μL

10×反应缓冲液           5μL

10×酶混合物             5μL

总体积                   50μL

2.加入各试剂后充分混合并短暂离心。在37℃温育16小时。

步骤4.用RNeasy柱处理(Clean-up)cRNA

1.向上述cRNA产物中加入50μL无RNase的水。

2.根据随附RNeasy微量试剂盒的Qiagen RNA处理手册的RNeasy Mini规程纯化cRNA。

3.在cRNA纯化的最后步骤，用50μL无RNase的水洗脱产物。

4.取出2μL cRNA并加到78μL水以在260nm测量吸收值而确定cRNA收率。

5.在进行下一步骤前，使用快速真空使体积减少到7μL。

将cRNA转化为双链cDNA并标记

步骤5.将cRNA转化为第一链cDNA

1.将cRNA和随机引物混合物在0.2□L PCR管中充分混合：

cRNA，可变                    7μL

随机引物，3μg/μL            1μL

总体积                        8μL

2.短暂离心并在70℃温育5分钟，和在25℃温育5分钟。

3.如下准备RT预混物2：

5×第一链缓冲液                   4μL

DTT，0.1M                         2μL

dNTP混合物，10mM                  1μL

Superase In，20U/μL              1μL

Superscript II，200U/μL          4μL

总体积                            12μL

4.向变性的和引物混合物添加12μL RT预混物2使终体积为20μL。

5.充分混合并短暂离心，然后在25℃温育5分钟，随后在37℃温育1小时，然后在4℃保持不超过10分钟。

步骤6.第二链cDNA合成

1.如下制备SS预混物2：

DEPC化的水                        9.9μL

氯化镁，25mM                      5.6μL

大片段，8.4U/μL                  4μL

RNase H，2U/μL                   0.5μL

总体积                            20μL

2.向各第一链反应中加入20μL SS预混物2使终体积为40μL。

5.充分混合并离心，然后在37℃温育40分钟，然后在4℃保持不超过10分钟以进行下一步骤或在-20℃冷冻。

步骤7.双链cDNA处理

1.根据QIAquick PCR纯化试剂盒的说明处理双链DNA。

2.在双链cDNA纯化的最后步骤，用37μL EB缓冲液洗脱产物。

3.取出2μL cDNA洗脱物并加到78μL水以在260nm测量吸收值而确定cDNA收率。

步骤8.双链cDNA片段化

1.使用1×One-Phor-All缓冲液plus将1U/μL DNAse I稀释为0.2U/μL。

2.制备如下混合物：

10×One-Phor-All

缓冲液plus                 3.6μL

ds cDNA                    30μL

DNAse I(0.2U/μL)          3μL

总体积                     36.6μL

3.短暂离心并在37℃温育10分钟和在95℃灭活DNase I 10分钟，然后保持在4℃。

4.取1μL片段化的cDNA用RNA nano试剂盒在Agilent 2100Bioanalyzer上根据试剂盒的说明检验大小。所需的片段大小应该在50到200bp范围。如果需要，另外使用DNase I以获得所需的大小。

步骤9.片段化的cDNA的标记：

1.如下制备标记混合物：

5xTdT反应缓冲液                     14μL

CoCl₂，25mM                         14μL

DLR-1a，5mM                         1μL

末端转移酶，重组(400U/μL)          4.4μL

总体积                              33.4μL

2.将33.4μL标记混合物加到35.6μL片段化的cDNA中使终体积为69μL。

3.混合并短暂离心。在37℃温育60分钟，并在4℃保持。

步骤10.杂交

1.如下制备杂交混合物：

2xMES杂交缓冲液                    100μL

对照Oligo B2，3mM                  3μL

20×RNA对照                        10μL

BSA，乙酰化的，50mg/μL            2μL

鲱鱼精子DNA，10mg/μL              2μL

DMSO，100％                        14μL

总体积                             131μL

2.向69μL标记反应物加入131μL杂交化合物，使终体积为200μL，充分混合并在热循环仪中在99℃变性10分钟，并在50℃保持5分钟。

3.在50℃将200μL标记的cDNA杂交到预润湿的

探针阵列(cDNA检测阵列)持续16小时。

4.根据

表达分析技术手册(Affymetrix，Santa Clara，CA，USA)的描述进行洗涤和扫描步骤，手册的内容在此引作参考。

图2显示用于全转录本分析的另一个规程。该WTA规程基于随机引物cDNA合成。详细的规程在此提供作为非限制性的例子：

cDNA靶制备

试剂和材料

●随机引物，3μg/μL，Invitrogen Life Technologies，P/N48190-011

●SuperScript II反转录酶，Invitrogen Life Technologies，P/N18064-071

●SUPERase.In^TM，Ambion，P/N 2696

●NaOH，1N溶液，VWR Scientific Products，P/N MK469360

●HCl，1N溶液，VWR Scientific Products，P/N MK638860

●QIAquick PCR纯化试剂盒，QIAGEN，P/N 28104

●10×One-Phor-All缓冲液，Amersham Pharmacia Biotech，P/N27-0901-02

●脱氧核糖核酸酶I(DNase I)，Amersham Phaimacia Biotech，P/N27-0514-01

●EDTA，0.5M pH 8.0，Invitrogen Life Technologies，P/N15575-020

●末端转移酶(包括缓冲液和CoCl₂)，400U/μL，重组的，RocheApplied Science，P/N 3 333 574

●DLR-1a，5mM，Affymetrix，P/N 900430

cDNA合成

下列规程的起始材料是5μg总RNA。在热循环仪中进行温育。

步骤1：cDNA合成

1.制备下列混合物用于引物退火：

将随机引物从3μg/μL稀释到750ng/μL(1∶4稀释)。

RNA/引物退火混合物

组分                  体积          终浓度

总RNA                 5μg

随机引物(750ng/μL)   1μL          25ng/μL

无核酸酶的水          直至30μL

总体积                30μL

2.将RNA/引物混合物在以下温度温育：

●70℃10分钟

●25℃10分钟

●冷却到4℃

3.制备用于cDNA合成的反应混合物。短暂离心反应管以在底部收集样品，并根据下表将cDNA合成混合物加到RNA/引物退火混合物。

cDNA合成组分

组分                   体积      终浓度

RNA/引物退火混合物     30μL

5×第一链缓冲液        12μL     1×

100mM DTT                   6μL       10mM

10mM dNTP                   3μL       0.5mM

Superase●In(20U/μL)       1.5μL     0.5U/μL

SuperScript II(200U/μL)    7.5μL     25U/μL

总体积                      60μL

4.将反应在以下温度温育：

●25℃10分钟

●37℃60分钟

●42℃60分钟

●在70℃灭活SuperScript II 10分钟

●冷却到4℃

步骤2：除去RNA

1.添加20μL 1N NaOH并在65℃温育30分钟。

2.添加20μL 1N HCl以中和。

步骤3：cDNA合成产物的纯化和定量

1.使用QIAquick柱处理cDNA合成产物(详细的规程，参见供应商提供的QIAquick PCR纯化试剂盒规程)。

用40μL EB缓冲液(QIAquick试剂盒提供)洗脱产物。

2.从上述洗脱液中取出2μL并通过260nm吸收值对纯化的cDNA进行定量(1.0 A₂₆₀单位＝33μg/mL单链DNA)。

cDNA片段化

1.制备下列反应混合物：

片段化反应混合物

组分                      体积              终浓度

10×One-Phor-All缓冲液    4.5μL            1×

cDNA模板                  全部(大约38μL)   1.5～5μg

DNAse(参见下面注解)       XμL              0.6U/μg cDNA

无核酸酶的水              直至45μL

总体积                    45μL

2.将反应在37℃温育10分钟。

3.将DNase I在98℃灭活10分钟。

4.片段化的cDNA被直接用于末端标记反应。

或者，上述材料可以在-20℃保存备用。

末端标记

使用Roche重组末端转移酶以DLR-1a(Affymetrix，Santa Clara，CA，USA)标记片段化产物的3′末端。

1.制备如下反应混合物：

末端标记反应

组分                     体积         终浓度

5×TdT反应缓冲液         14μL        1×

25mM CoCl₂               14μL        5mM

rTDT(400U/μL)           4.375μL     5.8U/pmol

cDNA模板(1.5-5μg)       37μL

DLR-1a，5mM              1μL         0.07mM

总体积                   ～70μL

2.将反应在37℃温育60分钟。

3.通过添加2μL 0.5M EDTA(pH 8.0)而终止反应。

4.靶准备杂交到探针阵列上。或者，其可以储存在-20℃备用。

靶杂交

试剂和材料

●2X MES杂交缓冲液(制备参见

表达分析技术手册)

●乙酰化牛血清白蛋白(BSA)溶液，50mg/mL，Invitrogen LifeTechnologies，P/N 15561-020

●鲑鱼精子DNA，10mg/mL，Promega Corporation，P/N D1811

●基因芯片真核杂交对照试剂盒，Affymetrix，P/N900299

●对照Oligo B2，3nM，Affymetrix，P/N 900301(可以单独定购)

●100％ DMSO，Sigma，P/N D-4818

靶杂交

1.对各靶而言混合下列物质，放大体积用于杂交到多探针阵列

单个Midi探针阵列的杂交鸡尾酒

组分                   体积       终浓度

2×MES杂交缓冲液       100μL     1×

对照Oligo B2           3.3μL     50pM

20×Spike对照          10μL      1×

HS DNA(10mg/mL)        2μL       0.1mg/mL

Ace-BSA，(50mg/mL)     2μL       0.5mg/mL

100％DMSO              14μL      7％

片段化的cDNA           70μL

总体积                 ～200μL

2.在使用前立即将探针阵列平衡到室温。

3.将杂交鸡尾酒加热到99℃5分钟，并在50℃保持。

4.同时，通过填充1×杂交缓冲液而使探针湿润。将探针阵列在50℃旋转孵育10分钟。

5.以最大速度离心杂交鸡尾酒以除去任何不溶的物质。

6.从探针阵列除去缓冲液并填充杂交鸡尾酒。

7.将探针阵列放置在50℃烤箱的旋转式杂交盒(rotisserie box)中，60rpm旋转，并杂交16小时。

探针阵列洗涤和染色

试剂和材料

●2XMES染色缓冲液(参见GeneChip表达分析技术手册以制备)

●乙酰化的牛血清白蛋白(BSA)溶液，50mg/mL，Invitrogen LifeTechnologies，P/N 15561-020

●R-藻红蛋白链亲和素，Molecular Probes，P/N S-866

●山羊IgG，试剂级，Sigma-Aldrich，P/N 15256

●抗链亲和素抗体(山羊)，生物素化，Vector Laboratories，P/NBA-O500

染色试剂的制备

用于第一和第三染色的SAPE溶液混合物

组分                      体积        终浓度

2×MES杂交缓冲液          600.0μL    1×

50mg/mL BSA               48.0μL     2mg/mL

1mg/mL藻红蛋白链亲和素    12.0μL     10μg/mL

DI H₂O                    540.0μL

总体积                    1200.0μL

用于第二染色的抗体溶液混合物

组分                        体积        终浓度

2×MES杂交缓冲液            300.0μL    1×

50mg/mL BSA                 24.0μL     2mg/mL

10mg/mL常山羊IgG            6.0μL      0.1mg/mL

0.5mg/mL生物素抗链亲和素    6.0μL      5μg/mL

DI H₂O                      264.0μL

总体积                      600.0μL

探针阵列的洗涤和染色

根据

表达分析技术手册所述的说明对真核生物靶进行洗涤和染色。

图4显示随机六聚体cDNA规程(WTA)和sWTA(随机/T7引物，cDNA样品)之间探针强度的比较。sWTA规程与WTA规程具有良好的关联(R＝0.961±0.004)。实验中检测一致性(detection call concordance)为大约90％，其中两个规程被用来检测转录。

图5显示WTA规程和sWTA规程用于以探针检测典型转录本的比较，所述探针设计成询问跨越转录本长度。由此可见，两个规程可以产生代表全长转录本的核酸样品。

在本发明的一个方面，提供用于制备代表RNA转录本的核酸样品的方法。所述方法特别适于制备被用来检测转录本特征例如外显子和可变剪接的样品。所述方法适于定量，半定量或定性检测这样的转录本特征。所述方法可用于监测包括所有类型变体的大量转录本，例如可变剪接转录本。所述方法特别适于众多，例如超过1000，5000，10,000，50,000不同的靶转录本或转录本特征的基于微阵列的平行分析。此处使用的术语“靶转录本”或“靶核酸”指转录本或其它目的核酸。

在优选实施方案中，制备核酸样品的方法包括将引物混合物与多个RNA转录本或来源于RNA转录本的核酸杂交，并合成互补于RNA转录本的第一链cDNAs和互补于第一链cDNAs的第二链cDNAs，其中引物混合物包含具有启动子区域和随机序列引物区域的寡核苷酸；并从启动子区域启动RNA转录以产生核酸样品。所述引物区域可以是随机六聚体。启动子通常是原核的启动子，例如噬菌体启动子，优选T7，T3或SP 6启动子。

所述方法可用于分析真核生物mRNA或其它的RNAs。总RNA样品或富集poly(A)+的样品全部适合用于该方法。

在特别优选的方法中，得到的cRNA能被用作模板合成第二cDNAs。可以使用随机引物例如随机六聚体进行第二cDNA合成。

虽然本发明方法具有广泛的应用并且不局限于任何具体的检测方法，它们特别适于检测大量，例如超过1000，5000，10,000，50,000不同的转录本特征。例如，第二cDNAs可以被片段化/标记然后与核酸杂交用于检测。寡核苷酸探针特别适于检测具体的转录本特征，例如转录本中具体的外显子和/或剪接点。通常，至少5,000，10,000，50,000，100,000或500,000寡核苷酸探针的集合可以被用于检测。核酸探针可以固定在珠子的集合或单个片基上。

在本发明的另一个方面，提供用于制备核酸样品的试剂盒。示例性的试剂盒包括包含寡核苷酸混合物组分的容器和寡核苷酸混合物使用说明书，其中寡核苷酸混合物组分中的寡核苷酸包括随机引物区域和启动子区域。一个示例性的寡核苷酸混合物具有序列：

(SEQ ID NO.：01)

5’GAATTGTAATACGACTCACTATAGGGNNNNNN 3’

(NNNNNN代表随机六聚体区域)

所述试剂盒可以包括含有反转录酶的容器和含有RNA聚合酶的容器。除了具有随机引物和启动子区域的寡核苷酸混合物之外，所述试剂盒也可以具有随机引物混合物(例如随机六聚体混合物)。附加组分可以包括标记和片段化试剂，核苷酸等等。

在优选实施方案中，试剂盒包括设计成检测代表靶RNA转录本序列的至少1000，5000，10,000或50,000不同核酸探针的集合。核酸探针可以固定在片基上。它们通常设计为至少5000条不同外显子和/或至少500个剪接点。

本发明的方法和试剂盒在生物学研究、诊断、毒理学、药物开发及其他领域具有广泛的应用。在示例性实施方案中，在用候选药物处理的样品中监测单个外显子的转录和剪接点结构。可以分析转录特征例如可变剪接对药物处理的反应以评价候选药物。本发明的方法和试剂盒特别适于这样的应用，因为得到的核酸更代表全转录本，而不是限于转录本的3’或5’区域。

在另一个示例性应用中，该方法和试剂盒可用于加工组织样品以获得核酸样品。分析样品的可变剪接转录本。公知的是可变剪接通常参与某些疾病的发病机制。通过分析组织样品中的可变剪接事件，可以获得诊断信息。

应该理解上述说明书目的在于示例而不是限制性的。参考上述说明，对本领域技术人员而言本发明的许多变化是显而易见的。所有引用的参考，包括专利和非专利文献，此处以其全文引入作为多功能参考。

Claims (45)

1.一种制备核酸样品的方法，包括：

将引物混合物与多种RNA转录本或来自RNA转录本的核酸杂交，并合成互补于RNA转录本的第一链cDNAs和互补于第一链cDNAs的第二链cDNAs；其中引物混合物包括具有启动子区域和随机序列引物区域的寡核苷酸；和

从启动子区域起始转录RNA以产生核酸样品。

2.权利要求1的方法，其中随机序列引物区域是随机六聚体。

3.权利要求2的方法，其中启动子区域包括原核启动子。

4.权利要求2的方法，其中启动子区域包括噬菌体启动子。

5.权利要求4的方法，其中启动子区域包括T7启动子。

6.权利要求4的方法，其中启动子区域包括T3启动子。

7.权利要求4的方法，其中启动子区域包括SP6启动子。

8.权利要求1的方法，其中RNA转录本是真核mRNA。

9.一种制备核酸样品的方法，包括：

将引物混合物与多种RNA转录本或来自RNA转录本的核酸杂交，并合成并合成互补于RNA转录本的第一链cDNAs和互补于第一链cDNAs的第二链cDNAs以产生第一cDNAs；其中引物混合物包括具有启动子区域和随机序列引物区域的寡核苷酸；

从启动子区域起始转录RNA以产生cRNAs；

将随机引物混合物与cRNAs杂交；和

从随机引物合成第二cDNAs。

10.权利要求9的方法，其中随机序列引物区域是随机六聚体。

11.权利要求10的方法，其中启动子区域包括原核启动子。

12.权利要求10的方法，其中启动子区域包括噬菌体启动子。

13.权利要求12的方法，其中启动子区域包括T7启动子。

14.权利要求12的方法，其中启动子区域包括T3启动子。

15.权利要求12的方法，其中启动子区域包括SP6启动子。

16.权利要求9的方法，其中RNA转录本是真核mRNA。

17.权利要求9的方法，其中随机引物是随机六聚体。

18.分析多种转录本的方法，包括：

将引物混合物与多种RNA转录本或来自RNA转录本的核酸杂交，并合成并合成互补于RNA转录本的第一链cDNAs和互补于第一链cDNAs的第二链cDNAs以产生第一cDNAs；其中引物混合物包括具有启动子区域和随机序列引物区域的寡核苷酸；

从启动子区域起始转录RNA以产生cRNAs；

将随机引物混合物与cRNAs杂交；

从随机引物合成第二cDNAs；

使第二cDNAs片段化以产生片段化的cDNAs；

将片段化的cDNAs与多个核酸探针杂交以检测代表靶转录本的核酸。

19.权利要求18的方法，其中随机序列引物区域是随机六聚体。

20.权利要求18的方法，其中启动子区域包括原核启动子。

21.权利要求21的方法，其中启动子区域包括噬菌体启动子。

22.权利要求21的方法，其中启动子区域包括T7启动子。

23.权利要求21的方法，其中启动子区域包括T3启动子。

24.权利要求21的方法，其中启动子区域包括SP6启动子。

25.权利要求18的方法，其中RNA转录本是真核mRNA。

26.权利要求18的方法，其中随机引物是随机六聚体。

27.权利要求18的方法，其中多个核酸探针是被固定的。

28.权利要求27的方法，其中多个核酸探针包括至少50,000条探针。

29.权利要求28的方法，其中多个核酸探针被固定在珠子的集合上，其中各珠子含有独特的探针或探针混合物。

30.权利要求28的方法，其中多个核酸探针被固定在片基上。

31.权利要求28的方法，其中核酸探针是寡核苷酸探针。

32.权利要求31的方法，还包括在杂交前标记第二cDNA片段。

33.权利要求32的方法，还包括在片段化前标记第二cDNAs。

34.权利要求32的方法，其中靶转录本包括至少5000条不同的外显子。

35.权利要求32的方法，其中靶转录本包括至少500条剪接点。

36.制备核酸样品的试剂盒，包括：包含寡核苷酸混合物组分的容器和使用寡核苷酸混合物的说明书，其中寡核苷酸混合物组分中的寡核苷酸包括随机引物区域和启动子区域。

37.权利要求36的试剂盒，还包括包含反转录酶的容器和包含RNA聚合酶的容器。

38.权利要求37的试剂盒，还包括随机引物混合物。

39.权利要求38的试剂盒，其中随机引物混合物是随机六聚体混合物。

40.权利要求39的试剂盒，还包括标记试剂。

41.权利要求40的试剂盒，还包括设计用于检测代表靶RNA转录本的核酸探针的集合。

42.权利要求42的试剂盒，其中核酸探针的集合被固定在片基上。

43.权利要求42的试剂盒，其中核酸探针是寡核苷酸探针。

44.权利要求43的试剂盒，其中寡核苷酸探针靶向至少5000条不同的外显子。

45.权利要求43的试剂，其中寡核苷酸探针靶向至少500条剪接点。

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