CN102462698A - 鹿茸提取方法及由该方法获得的鹿茸提取物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及鹿茸提取方法及由该方法获得的鹿茸提取物。本发明的鹿茸提取方法包括用超高压处理鹿茸。本发明的鹿茸提取技术具有提取时间短、能耗低、有效成分提取率高以及可避免热效应引起的有效成分结构改变等优点。本发明还涉及包含用本发明方法获得的鹿茸提取物的组合物，以及所述提取物和组合物在制备药物或保健食品中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及鹿茸的提取方法和由该方法获得的鹿茸提取物。
背景技术
鹿茸为梅花鹿或马鹿的尚未骨化的幼角，每年周期性地生长、骨化与脱落。鹿茸是我国传统名贵中药，它的治疗作用在历代本草中都有记载。现代药物化学分析表明，鹿茸中含有多种生理活性成分，具有抗衰老、抗氧化、提高机体免疫力、促进伤口愈合等多种功效。鹿茸组织中的蛋白质、多肽类物质占总重量的50％以上。近年来从鹿茸中分离得到多种对于机体生长、发育及调控具有重要功能的生长因子，如胰岛素样生长因子IGF-1等。
鹿茸的提取加工工艺对鹿茸中生理活性成分的保留有很大的影响。虽然对鹿茸的研究历史悠久，但传统的加工技术以反复水煮、烘烤和风干为主，活性物质的提取率低，并且对蛋白质等成分的破坏显著影响了鹿茸的功效。随着技术的发展，目前对鹿茸的纯化提取加工工艺主要集中在醇提、水提、有机溶剂提取、超声提取、CO2超临界萃取和缓冲液提取。表1和表2分别是非专利文献和专利文献中鹿茸提取工艺的汇总。
表1非专利文献中鹿茸提取工艺的汇总
表2专利文献中鹿茸提取工艺的汇总
在传统的鹿茸加工过程中，鹿茸要经过煮炸、烘干等步骤，由于要经过长时间高温煮炸，一方面，很多水溶性成分损失掉，另一方面，蛋白质、多肽等热敏性成分的活性破坏殆尽。
水提方法不能把非水溶性成分提取出来，选择性较差，提取率低。醇提方法虽然提取率高选择性较好，但乙醇成本高，不但污染环境，而且易燃易爆，生产中存在安全隐患。采用乙醇、乙醚等有机溶剂提取制备，不仅大大破坏了鹿茸的有效成份，而且其产品纯度不高并有部分乙醇、乙醚有机溶剂残留。
因此传统的加工工艺不能充分利用鹿茸中的活性成分，从而大大降低了鹿茸的应用价值，造成资源浪费。
一些专利申请介绍了从鹿茸中提取生长因子的研究(例如中国专利申请公开号CN1603344A)，但是这些方法在提取鹿茸多肽时，又忽视了对蛋白质以外的活性成分的利用。
此外，目前的专利和非专利文献中，对于相应鹿茸产品的活性没有详细的报道，缺乏实验数据。并且，大多数文献中对于鹿茸提取物的收率没有提供具体的数据，无法判断其提取方法的好坏。
因此，本领域仍然需要一种对鹿茸进行提取加工的方法，该方法能够提取鹿茸中包括大分子蛋白质以及生长因子、其他小分子肽等活性物质在内的多种活性成分，提取率高，并且对鹿茸有效成分的活性破坏小。
发明内容
本发明的目的之一是针对已有鹿茸产品制备方法存在的技术上的不足，设计提供一种鹿茸提取工艺。
根据一个方面，本发明提供一种鹿茸提取方法，该方法包括以下步骤：对鹿茸施加范围为100-1000Mpa的超高压，以获得鹿茸提取物。所述超高压可以为100-1000Mpa，优选100-800Mpa，更优选100-500Mpa，甚至更优选200-300Mpa。
超高压处理的持续时间可在合适的范围内变化，例如可以为大于0分钟且小于或等于15分钟，优选1-10分钟。
进行超高压处理时，鹿茸最好处于流体介质中，所述介质可选自水性溶剂、有机溶剂和合适地混合两种或两种以上的溶剂得到的混合溶剂。流体介质与鲜鹿茸的体积∶重量(v/w)比值可在1-30范围内，优选5-20。也可使用干鹿茸，流体介质与干鹿茸的体积∶重量(v/w)比值可在1-25范围内，优选3-15。
本发明的鹿茸提取方法还可在进行超高压提取后将获得的提取液过滤去除残渣，收集滤液并冷冻干燥以获得鹿茸提取物冻干粉，冷冻干燥的温度可以为-20℃至-80℃。
根据另一个方面，本发明提供通过本发明方法获得的鹿茸提取物。基于鹿茸提取物的重量，根据本发明的鹿茸提取物中IGF-1的含量范围在400-8000ng/g。根据本发明的鹿茸提取物的形式可以为提取液、提取液的浓缩液、提取液的冻干粉、或提取液的其他干燥产品。
本发明的另一个方面提供一种组合物，其包含根据本发明的鹿茸提取物。本发明还涉及根据本发明的鹿茸提取物或包含该提取物的组合物在制备药物或保健食品中的用途。
根据本发明的鹿茸超高压提取技术有多种优点，包括提取时间短、能耗低、有效成分提取率高以及可避免热效应引起的有效成分结构改变、损失和生理活性降低。此外，超高压提取在密闭环境中进行，没有溶剂挥发，不会造成环境污染。通过本发明的方法获得的鹿茸提取物中IGF-1含量高，并且在实验模型中能够显著提高超氧化物歧化酶活力、线粒体膜电位和细胞增殖能力，因此在抗衰老以及预防和治疗疾病方面都有广阔的应用前景。
附图说明
图1显示β-半乳糖苷酶染色结果。(A)空白对照组，(B)模型对照组，(C)阳性对照组，(D)本发明鹿茸提取物试样RX4，(E))本发明鹿茸提取物试样RX5。由图1可见，与空白组相比较，模型组染色较深，被染色的细胞数目比较多，差异显著，说明造模成功。阳性对照组与空白组相比较，染色的深浅以及被染色的细胞数目和空白组无明显差异，说明阳性对照药品具有很好的抗衰老活性。试验组(D和E)染色的深浅以及被染色的细胞数目与阳性对照组相比无明显差异，说明本发明提取物也具有优异的抗衰老活性。
具体实施方式
根据一个方面，本发明提供一种鹿茸提取方法，该方法包括以下步骤：对鹿茸施加范围为100-1000Mpa的超高压，以获得鹿茸提取物。
本申请说明书中的超高压是指压力大于100Mpa，例如100-1000Mpa，优选100-800Mpa，更优选100-500Mpa，甚至更优选150-400Mpa，最优选200-300Mpa。例如可选自100Mpa、150Mpa、200Mpa、250Mpa、300Mpa、350Mpa、400Mpa、450Mpa、500Mpa、600Mpa、650Mpa、700Mpa、750Mpa、800Mpa、850Mpa、900Mpa、950Mpa、1000Mpa，或其组合，例如可在一个时间段内使用某一超高压值，而在另一时间段内使用一不同的超高压值。
根据本发明，还可考虑使用合适的高压，即压力大于常压(即约0.1Mpa)但小于100Mpa。
超高压处理的持续时间，即保压时间，可在合适的范围内变化，例如可以为大于0分钟且小于或等于15分钟，优选1-10分钟，更优选2-8分钟，最优选3-7分钟，例如可选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10分钟。
本发明方法中可使用任何合适的超高压设备。
本发明方法中所用的鹿茸最好是鲜鹿茸，即采摘几小时内未经过冷冻的鹿茸，也可以是采摘后经冷冻的鹿茸，只要鹿茸仍然保持新鲜无腐烂即可。在超高压提取前可经洗净、切块。还可以是已经过热处理的干鹿茸。
进行超高压处理时，鹿茸最好处于流体介质中，所述流体介质可以是液体，例如可选自水性溶剂、有机溶剂和混合溶剂。水性溶剂可选自水和水性缓冲液，水性缓冲液例如在鹿茸提取工艺中使用的那些，诸如磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、Tris-HCL缓冲液等等。有机溶剂可使用鹿茸提取工艺中使用的那些，例如可选自醇例如乙醇、甲醇、正丁醇等，醚例如乙醚、石油醚等，氯仿，丙酮等等。
实际上，本领域中用于提取鹿茸的试剂都考虑用于本发明方法中，例如在醇提、缓冲液提取、有机溶剂提取工艺中所用的提取试剂。还考虑本发明方法可以和其他鹿茸提取工艺例如热处理、超声提取或超临界CO2提取工艺组合使用，例如本发明方法可以和其他鹿茸提取工艺同时组合进行或顺序组合进行。
如果使用鲜鹿茸，根据本发明所用的流体介质与鹿茸的体积∶重量(v/w)比值可在1-30范围内，优选该比值为3-25，更优选5-20，最优选7-15，例如该比值可选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30。如果使用经冷冻或经热处理的干鹿茸，则流体介质的相对体积可适当减少，例如液体介质与干鹿茸的体积∶重量(v/w)比值可在1-25范围内，优选3-15，例如选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25。
本发明的方法可在常温进行，或可以根据具体的需要改变温度。
在某些实施方式中，进行超高压提取后，获得的提取物可过滤去除残渣，然后收集滤液并冷冻干燥以获得鹿茸提取物冻干粉。冷冻干燥的温度可在-20℃至-80℃范围内，优选-30℃至-70℃，更优选-40℃至-60℃，例如冷冻干燥的温度可选自-20℃、-25℃、-35℃、-40℃、-45℃、-50℃、-55℃、-60℃、-65℃、-70℃、-75℃、-80℃。
在某些实施方式中，可根据需要包括去除溶剂的步骤。
根据本发明获得的鹿茸提取物可以为提取液的形式，提取液可经浓缩得到浓缩液。根据本发明获得的鹿茸提取物还可以是提取液的冻干粉，或是提取液的其他干燥产品。
在一些实施方式中，本发明提供一种鹿茸提取方法，包括以下步骤：对鹿茸施加100-500Mpa的超高压，保压时间大于0分钟且小于或等于15分钟。在某些实施方式中，获得的提取液过滤去除残渣，收集透明澄清的液体，-20℃至-80℃冷冻干燥。
在一些实施方式中，本发明提供一种鹿茸提取方法，包括以下步骤：将鹿茸加入水中，施加100-500Mpa的超高压，保压时间大于0分钟且小于或等于15分钟。在某些实施方式中，获得的提取液过滤去除残渣，收集透明澄清的液体，-20℃至-80℃冷冻干燥。在某些实施方式中，加水前将鹿茸切片。在另一些实施方式中，水的用量(体积)为鹿茸材料量(重量)的1-30倍。
在一些实施方式中，本发明提供一种鹿茸提取方法，包括以下步骤：将鹿茸加入乙醇中，施加100-500Mpa的超高压，保压时间大于0分钟且小于或等于15分钟。在某些实施方式中，获得的提取液过滤去除残渣，收集透明澄清的液体，-20℃至-80℃冷冻干燥。在某些实施方式中，加乙醇前将鹿茸切片。在另一些实施方式中，乙醇的用量(体积)为鹿茸材料量(重量)的1-30倍。
在一些具体的实施方式中，将鲜鹿茸切片，加水或乙醇，用量(体积，例如ml)为鹿茸材料量(重量，例如g)的1-30倍，施加100-500Mpa的超高压，保压时间为1-10分钟。进行超高压提取后，提取液过滤去除残渣，收集透明澄清的液体，在-30℃至-60℃例如-45℃冷冻干燥机上进行干燥。
在一个具体实施方式中，将鲜鹿茸切片，加水或乙醇，用量(体积，例如ml)为鹿茸材料量(重量，例如g)的10-20倍例如10倍、15倍或20倍，提取压力为200-300Mpa例如200Mpa、250Mpa或300Mpa，保压时间为1-10分钟例如5分钟。在优选实施方式中，提取液过滤去除残渣，收集透明澄清的液体，在-30℃至-60℃例如-45℃冷冻干燥机上进行干燥。
在一个具体实施方式中，25g鲜鹿茸洗净、切块后，加250ml水，200Mpa超高压提取，保压5分钟，提取液过滤去除残渣，收集透明澄清的液体，在-45℃冷冻干燥机上进行干燥，获得鹿茸提取物冻干粉。
在一个具体实施方式中，25g鲜鹿茸洗净、切块后，加250ml水，300Mpa超高压提取，保压5分钟，提取液过滤去除残渣，收集透明澄清的液体，在-45℃冷冻干燥机上进行干燥，获得鹿茸提取物冻干粉。
在一个具体实施方式中，25g鲜鹿茸洗净、切块后，加500ml水，400Mpa超高压提取，保压5分钟，提取液过滤去除残渣，收集透明澄清的液体，在-45℃冷冻干燥机上进行干燥，获得鹿茸提取物冻干粉。
在一个具体实施方式中，25g鲜鹿茸洗净、切块后，加250ml水，500Mpa超高压提取，保压5分钟，提取液过滤去除残渣，收集透明澄清的液体，在-45℃冷冻干燥机上进行干燥，获得鹿茸提取物冻干粉。
本发明另一方面提供通过本发明方法获得的鹿茸提取物。基于鹿茸提取物的重量，根据本发明的鹿茸提取物中IGF-1的含量范围在400-8000ng/g，例如400-6000ng/g、400-5000ng/g、500-6000ng/g、500-5000ng/g、1000-6000ng/g、1000-5000ng/g、1000-4500ng/g、1200-6000ng/g、1200-5000ng/g、1200-4500ng/g、1500-6000ng/g、1500-5000ng/g或1500-4500ng/g。
本发明另一方面提供一种组合物，其包含根据本发明的鹿茸提取物。在某些方面，本发明的组合物是营养组合物或药物组合物。所述营养组合物除含有本发明的鹿茸提取物外，还可含有食品工业中通常使用的粘合剂、色素、调味剂、添加剂等等。所述药物组合物除含有本发明的鹿茸提取物外，还含有药学上可接受的载体或佐剂，例如矫味剂、粘合剂、稳定剂、崩解剂、抗氧化剂等。
本发明还涉及根据本发明的鹿茸提取物或包含该提取物的组合物在制备药物、保健食品或营养补充剂中的用途。所述药物可用于治疗或预防本领域所知可用鹿茸治疗或改善的任何疾病或病况，例如用于延缓或防止与衰老相关的各种状况、改善伤口愈合、增加骨生长速度、治疗或预防各种癌症等等。
本发明的鹿茸提取物或包含这种提取物的组合物在各种衰老实验模型及相关的分子生物学模型中显示出抗衰老活性。β-半乳糖苷酶(β-gal)是一种很好的可用于体外衰老研究的生物学标志，对于检测细胞老化进程具有重要的生物学及临床意义。根据本发明的鹿茸提取物在β-半乳糖苷酶染色实验中显示出显著的抗衰老活性。实验还表明，本发明的鹿茸提取物能够提高SOD活力，增加细胞增殖能力，减少细胞在G1期的阻滞和线粒体膜电位的降低。不限制于任何具体的理论，考虑本发明鹿茸提取物能减轻细胞的过氧化损伤，减少脂质过氧化物的形成，同时能够增加细胞内抗氧化酶的活性，通过自由基代谢和保护线粒体发挥其抗衰老作用。
实施例
除非有特别说明，以下实施例中的百分数指重量百分数。
D-半乳糖购自国药集团；鲜鹿茸胰岛素样生长因子(IGF-1，鲜鹿茸提取物形式)购自海宁市紫金港生物科技有限公司，在以下各实施例中用作阳性药；超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒购自南京建成生物工程研究所；细胞衰老特异性β-半乳糖苷酶原位染色试剂盒购自美国Genmed公司；人胰岛素样生长因子1(IGF-1)ELISA试剂盒购自上海史瑞可生物科技有限公司；PI(Propidium Iodine，碘化丙啶)、RNase A、Rhoda mine 123均为Sigma公司产品；细胞试验中使用的细胞系为人二倍体成纤维WI38细胞，购于上海细胞库；使用的超高压设备购自天津市华泰森淼生物工程技术有限公司，型号为HPP.L3-600/0.6实用型超高压实验机。
鹿茸提取物冻干粉、D-半乳糖、鲜鹿茸胰岛素样生长因子(IGF-1)在进行生物学活性试验前用磷酸缓冲液(0.1M，pH7.4)配制。作为阳性药的鲜鹿茸提取物产品中鲜鹿茸胰岛素样生长因子(IGF-1)的标示含量为4300ng/g。
提取实施例
实施例125g鲜鹿茸洗净、切块后，加500ml水，200Mpa超高压提取，保压5分钟，提取液过滤去除残渣，收集透明澄清的液体，在-45℃冷冻干燥机上进行干燥，获得鹿茸提取物冻干粉RX1。
实施例225g鲜鹿茸洗净、切块后，加500ml水，300Mpa超高压提取，保压5分钟，提取液过滤去除残渣，收集透明澄清的液体，在-45℃冷冻干燥机上进行干燥，获得鹿茸提取物冻干粉RX2。
实施例325g鲜鹿茸洗净、切块后，加500ml水，400Mpa超高压提取，保压5分钟，提取液过滤去除残渣，收集透明澄清的液体，在-45℃冷冻干燥机上进行干燥，获得鹿茸提取物冻干粉RX3。
实施例425g鲜鹿茸洗净、切块后，加250ml水，200Mpa超高压提取，保压5分钟，提取液过滤去除残渣，收集透明澄清的液体，在-45℃冷冻干燥机上进行干燥，获得鹿茸提取物冻干粉RX4。
实施例525g鲜鹿茸洗净、切块后，加250ml水，300Mpa超高压提取，保压5分钟，提取液过滤去除残渣，收集透明澄清的液体，在-45℃冷冻干燥机上进行干燥，获得鹿茸提取物冻干粉RX5。
实施例625g鲜鹿茸洗净、切块后，加250ml水，400Mpa超高压提取，保压5分钟，提取液过滤去除残渣，收集透明澄清的液体，在-45℃冷冻干燥机上进行干燥，获得鹿茸提取物冻干粉RX6。
实施例725g鲜鹿茸洗净、切块后，加500ml水，300Mpa超高压提取，保压10分钟，提取液过滤去除残渣，收集透明澄清的液体，在-45℃冷冻干燥机上进行干燥，获得鹿茸提取物冻干粉RX7。
实施例825g鲜鹿茸洗净、切块后，加250ml水，300Mpa超高压提取，保压10分钟，提取液过滤去除残渣，收集透明澄清的液体，在-45℃冷冻干燥机上进行干燥，获得鹿茸提取物冻干粉RX8。
实施例925g鲜鹿茸洗净、切块后，加500ml 60％乙醇，300Mpa超高压提取，保压5分钟，提取液过滤去除残渣，收集透明澄清的液体，在-45℃冷冻干燥机上进行干燥，获得鹿茸提取物冻干粉RX9。
实施例1025g鲜鹿茸洗净、切块后，加250ml 60％乙醇，300Mpa超高压提取，保压5分钟，提取液过滤去除残渣，收集透明澄清的液体，在-45℃冷冻干燥机上进行干燥，获得鹿茸提取物冻干粉RX10。
生物学活性实施例
实施例11抗衰老活性测定
1、鹿茸提取物中IGF-1含量的测定
胰岛素样生长因子(IGF-1)是一种单链碱性多肽，能促进细胞的增殖和分化，具有增加人体细胞的活力、消除皱纹、延缓衰老、强化免疫系统、增进和恢复记忆等功效。不仅能有效预防各种生理衰老，而且能广泛克服由衰老引发的各种现象及病症。
试验方法酶联接免疫吸附剂测定法(Elisa)，具体操作按Elisa试剂盒(人胰岛素样生长因子1(IGF-1)ELISA试剂盒，上海史瑞可生物科技有限公司)说明书进行。
试验结果RX3、RX4、RX5、RX6中IGF-1的含量分别为4208、4582、4079、4450ng/g，和阳性药(鲜鹿茸胰岛素样生长因子(IGF-1)，鲜鹿茸提取物形式，海宁市紫金港生物科技有限公司)4439ng/g比较几乎无差异，甚至高于阳性药。试验结果总结于表3。
表3鹿茸提取物中的IGF-1含量
2、对细胞增殖能力的影响
细胞的增殖能力是评价细胞衰老的重要生物学指标。随体外培养群体倍增次数的增加，细胞的增殖能力逐渐丧失，当细胞不能再进行有丝分裂，其生长到达极限则成为衰老细胞。细胞的增殖能力是评价细胞衰老过程的重要生物学指标。
试验方法
1)对数生长期细胞，用0.25％胰酶消化制成单细胞悬液，用含10％血清的RPMI 1640培养基，调节细胞浓度为4×104个/ml，在96孔细胞培养板中每孔加入200μl细胞悬液。每组均设5个复孔。在37℃、5％CO2培养箱中培养。
2)24h后，空白组：加50μl PBS缓冲液。模型组：加25μl终浓度为8g/L的D-半乳糖和25μl PBS缓冲液。给药组：加25μl终浓度为8g/L的D-半乳糖和25μl供试样品，浓度10μg/ml。阳性对照组：加25μl终浓度为8g/L的D-半乳糖和25μl的IGF-1终浓度为1nM的阳性药。
3)72h后小心吸弃上清，倒扣在吸水纸上拍干。每孔加入100μl MTT(四甲基偶氮唑盐，0.5mg/ml，用PBS缓冲液配置)，继续在5％CO2培养箱中培养4h；
4)小心吸弃上清，倒扣在吸水纸上拍干。每孔各加入200μL的二甲基亚砜(DMSO)，振荡600s。酶标仪570nm处测定OD值(吸光值)。按以下公式计算细胞存活率。
5)统计学处理：所有数据采用均数±标准差
表示，使用SPSS15.0统计软件包，采用方差分析确定差异的显著性，(p＜0.05为有差异，p＜0.01为显著性差异，p＞0.05为无差异)。
试验结果实验结果表明，D-半乳糖能使细胞的增殖能力降低，(p＜0.01)，而加入一定量的RX4、RX5鹿茸提取物之后，显著提高细胞的存活率，与模型组相比，差异显著，(p＜0.01)。结果总结于下表4。
表4细胞增殖能力测定结果
与空白组相比较，ap＜0.01；与模型组相比较：b p＜0.01，cp＜0.05
值得注意的是，本实施例中RX4、RX5这两个提取物不仅IGF-1含量很高，而且显著提高了细胞的增殖能力，说明其具有优异的抗衰老活性。因此在以下实施例中选用RX4、RX5两个提取物进行进一步的实验。
实施例12β-半乳糖苷酶染色实验
试验方法：
1)取对数生长期细胞，用0.25％胰酶消化制成单细胞悬液，用含10％血清的RPMI 1640培养基，调节细胞浓度为4×104个/ml，在96孔细胞培养板中每孔加入200μl细胞悬液。每组均设5个复孔。在37℃、5％CO2培养箱中培养。
2)24h后，空白组：加50μl PBS(磷酸盐缓冲溶液，0.1M，pH7.4)缓冲液。模型组：加25μl终浓度为8g/L的D-半乳糖和25μl PBS缓冲液。给药组：加25μl终浓度为8g/L的D-半乳糖和25μl供试样品，浓度10μg/ml。阳性对照组：加25μl终浓度为8g/L的D-半乳糖和25μl的IGF-1终浓度为1nM的阳性药。
3)72h后小心吸弃上清，倒扣在吸水纸上拍干。染色按试剂盒(细胞衰老特异性β-半乳糖苷酶原位染色试剂盒，美国Genmed公司)说明书进行。
试验结果
由图1可见，与空白组(A)相比较，模型组(B)染色较深，被染色的细胞数目比较多，差异显著，说明造模成功。阳性对照组(C)与空白组相比较，染色的深浅以及被染色的细胞数目和空白组相差不大，无明显差异，说明阳性对照药品具有很好的抗衰老活性。鹿茸提取物给药后(D，RX4；E，RX5)，染色的深浅以及被染色的细胞数目与阳性对照组相比较无明显差异。说明此提取物也具有很好的抗衰老活性。
实施例13对SOD活力的影响
超氧化物歧化酶(SOD)是生物体内重要的抗氧化酶，能够清除机体产生的自由基，保护细胞。在机体的氧化与抗氧化平衡中起着至关重要的作用。
试验方法：
1)细胞铺板给药同实施例11。
2)给药72h后，用0.25％胰酶消化制成单细胞悬液，用超声机进行破碎。
3)离心，取上清，备用。
4)SOD活力测定按试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)说明书进行
试验结果：
模型对照组与空白对照组相比，SOD含量明显降低，差异显著(p＜0.01)，说明衰老模型造模成功；而RX4、RX5组与模型组相比较，有显著性差异(p＜0.01)，说明这两个提取物具有很好的抗衰老活性。结果见下表5。
表5SOD活力测定结果
与空白组相比较，ap＜0.01；与模型组相比较：bp＜0.01.
实施例14对线粒体膜电位的影响
研究证明，细胞衰老时，线粒体功能发生退行性改变，线粒体膜电位降低。线粒体膜电位降低，一方面使线粒体能量产生障碍。另一方面，引起线粒体膜通透性孔道开放增强，线粒体内的凋亡因子释放增加，启动凋亡程序。从而加速了细胞的衰老死亡过程。
试验方法：
1)细胞铺板给药同实施例11。给药72h后，用0.25％胰酶消化制成单细胞悬液，离心去上清，用PBS洗三遍。
2)加入终浓度为1mM的Rhoda mine 123，室温孵育30min。
3)离心收集细胞，PBS洗一遍。加PBS重悬，用300目的尼龙膜过滤后即可利用流式细胞仪进行分析。
试验结果：模型组的膜电位与空白组相比，由189下降到59.7，差异显著(p＜0.01)，说明造模成功。结果总结于下表6。相对于模型组，RX4和RX5组明显减少了线粒体膜电位的降低，差异显著。
表6线粒体膜电位测定结果
与空白组相比较，ap＜0.01；与模型组相比较：bp＜0.01.
实施例15对细胞周期的影响
衰老是细胞脱离细胞周期，并不可逆地丧失增殖能力后进入的一种相对稳定的状态，是正常细胞的必然归宿。细胞周期的变化也可反映出细胞的增殖能力。
试验方法：
1)细胞铺板给药同实施例1。给药72h后，用0.25％胰酶消化制成单细胞悬液，离心去上清，用PBS洗三遍。
2)加入预冷的70％酒精，4℃固定过夜。
3)离心收集细胞，PBS洗一遍，将细胞重悬于含100ug/ml RNase A和50ug/ml PI的PBS中，室温孵育30min。
4)将经PI染色和RNase A消化后的细胞悬液用300目的尼龙膜过滤后即可利用流式细胞仪进行细胞周期分析。
试验结果：空白对照组中，仅有10％的静止细胞(G1期)，这表明细胞具有强大的自我更新能力。而模型组细胞中，大量的细胞停滞在G1期，表明细胞分裂缓慢，增殖能力丧失，细胞进入衰老状态。RX4、RX5组G1期细胞与模型组相比较，明显减少，差异性显著，说明细胞依然具有良好的自我增殖能力，本发明的鹿茸提取物具有明显的抗衰老活性。结果总结于表7。
表7细胞周期测定结果
与空白组相比较，ap＜0.01；与模型组相比较：bp＜0.01。
本发明上述实施方式的描述仅出于阐释和说明的目的，并非以任何方式限制本发明。很明显，本领域技术人员根据本发明上下文的教导可进行多种改动和变化。这些改动和变化均落在权利要求所限定的本发明精神和范围内。
Claims (17)
1.鹿茸提取方法，该方法包括以下步骤：对鹿茸施加范围为100-1000Mpa的超高压，以获得鹿茸提取物。
2.权利要求1的方法，其中所述超高压范围为100-500Mpa。
3.权利要求2的方法，其中所述超高压范围为200-400Mpa。
4.前述任一权利要求的方法，其中保压时间为大于0分钟且小于或等于15分钟。
5.权利要求4的方法，其中保压时间为1-10分钟。
6.前述任一权利要求的方法，其中鹿茸处于流体介质中，所述介质选自水性溶剂、有机溶剂和混合溶剂。
7.权利要求6的方法，其中水性溶剂选自水、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液和Tris-HCL缓冲液，有机溶剂选自乙醇、甲醇、正丁醇、乙醚、石油醚、氯仿和丙酮。
8.权利要求6或7的方法，其中流体介质与鹿茸的体积∶重量比值是1-30。
9.权利要求8的方法，其中流体介质与鹿茸的体积∶重量比值是7-15。
10.前述任一权利要求的方法，还包括以下步骤：在进行超高压提取后，获得的提取液过滤去除残渣，收集滤液并冷冻干燥，获得鹿茸提取物冻干粉。
11.权利要求10的方法，其中所述冷冻干燥的温度为-20℃至-80℃。
12.前述任一权利要求的方法，其中所述介质是水或乙醇，介质与鹿茸的体积∶重量比值是10，提取压力范围是200-300Mpa，保压时间为3-10分钟，超高压提取后，提取液过滤去除残渣，收集滤液并在-45°冷冻干燥机上干燥以获得鹿茸提取物冻干粉。
13.通过前述任一权利要求的方法获得的鹿茸提取物。
14.权利要求13的鹿茸提取物，其中基于鹿茸提取物的重量，IGF-1的含量范围在400-8000ng/g。
15.权利要求13或14的鹿茸提取物，其中该提取物的形式为提取液、提取液的浓缩液、提取液的冻干粉、或提取液的其他干燥产品。
16.组合物，其包含权利要求13-15中任一项的鹿茸提取物。
17.权利要求13-15中任一项的鹿茸提取物或权利要求16的组合物在制备药物或保健食品中的用途。
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