CN103319617A - 利用超声波协同酶法提取紫薯多糖的方法及应用 - Google Patents

Abstract

利用超声波协同酶法提取紫薯多糖的方法及应用，该方法采用超声波协同淀粉酶辅助提取紫薯多糖，其制备方法为：紫薯粉经脱除脂肪和色素后配制成悬浮液，先用超声波辅助提取，提取结束后加入淀粉酶进行酶解，然后利用离心方法收集上清液，上清液经浓缩后加入乙醇，静置后离心，沉淀经冷冻干燥后得到粉末状紫薯多糖，该多糖不仅具有较强的抗氧化活性，而且具有较强的抑制胃癌细胞SGC7901活性。本发明具有多糖提取率高、操作方便、生产成本低，适用于工业化生产，所得产品符合功能食品要求。

Description

利用超声波协同酶法提取紫薯多糖的方法及应用

技术领域

本发明涉及食品生物化学领域，可作为功能性添加剂用于食品、化妆品和药物，具体涉及一种利用超声波协同酶法提取紫薯多糖的方法及其应用。

背景技术

多糖是由10个以上的单糖通过糖苷键连接而成的一种高分子化合物，普遍存在于高等植物、藻类、菌类及动物体内，是自然界含量最丰富的生物聚合物。近年来研究发现，多糖及其缀合物参与了细胞中的各种生命活动，具有多种生理功能，如调节免疫、抗癌、抗氧化、抗疲劳、降血糖、抗凝血、降血脂等，而且对机体具有高效低毒的特点。现已有多种多糖药物成功应用于临床，如香菇多糖和人参多糖等。另外，多糖被作为乳化剂、酸性饮料稳定剂及抗氧化剂等用于改善食品的食用品质、加工特性和感官特性。因此，目前多糖是食品和医药研究领域的热点领域之一。

紫薯，又称黑红薯、紫心甘薯、紫肉甘薯或紫番薯，是因为含有丰富的花青素而薯皮呈紫黑色、肉质紫红色至深紫色的甘薯新品种。最初由日本引进到了国内，并进行了改良，为我国主要栽培种植的农作物之一。紫薯富含多种生物活性物质，常食用紫薯可明显增强人体免疫能力，具有防癌抗癌、养颜等功效，现已有大量关于紫薯加工方面的专利报道，如：中国专利CN102204704A（申请公布号）中公开了一种紫薯汁的制备方法，经该方法制成的紫薯汁，具备紫薯天然的成分和功效；中国专利CN102206426A（申请公布号）中公开了一种综合利用紫薯中紫薯色素及组分的方法，经该方法制备的紫薯色素纯度最高可达20％左右（w/w，g/g）；迄今为止，尚未检索到关于提取紫薯多糖方面的中国专利，仅有少量文献报道了紫薯多糖制备工艺，江雪等（江雪,吕晓玲,李津,王星明.紫甘薯多糖对辐射的防护作用[J].食品与生物技术学报，2010,29(5):665-669）和叶小利等（叶小利,李学刚,李坤培.紫色甘薯多糖对荷瘤小鼠抗肿瘤活性的影响[J].西南师范大学学报(自然科学版),2005,30(2):333-336）仅仅研究了紫薯多糖的生物活性（抗辐射损伤能力和抗肿瘤活性），而对紫薯多糖的提取工艺未进行优化；李翔（李翔.紫甘薯多糖的分离纯化及生物活性研究[D].江西农业大学，2011）和姚惠伶等（姚惠伶，蒋林彬.超声波提取紫薯多糖的工艺优化.安徽农业科学[J]，2011，39(14):8357-8358）利用超声波辅助提取紫薯多糖，在最优提取工艺条件下，紫薯多糖的提取率分别为5.52％和3.63％，贾琳璐（贾琳璐.紫色甘薯非淀粉多糖的提取、纯化及性质研究[D].河南工业大学，2011）采用微波辅助提取紫薯多糖，在最优工艺条件下多糖的提取率为5.75％。紫薯淀粉的干扰使紫薯多糖的提取偏低，现有研究方法中未考虑去除紫薯淀粉。本专利采用超声波协同酶法提取紫薯多糖，利用超声波促使紫薯多糖溶出，而酶法则使淀粉快速水解，以利于紫薯多糖的醇析。本专利所述的方法尚未见报道。

发明内容

解决的技术问题：本发明的目的是提供一种利用超声波协同酶法提取紫薯多糖的方法及其在制备抑制肿瘤药物中的应用。

技术方案：利用超声波协同酶法提取紫薯多糖的方法，紫薯粉经脱除脂肪和色素后配制成悬浮液，用超声波辅助提取紫薯多糖，超声波辅助提取结束后加入淀粉酶酶解，酶解结束后离心，收集上清液，上清液经浓缩后加入乙醇，静置后离心，收集沉淀，冷冻干燥，即得到粉末状紫薯多糖产品。

所述紫薯粉脱除脂肪和色素的步骤为：紫薯粉用95％（v/v，mL/mL）乙醇配制成10％－30％（w/v，g/mL）悬浮液，在50℃－80℃下浸提4－6h进行脱脂和脱色处理，50℃－70℃烘干，即为脱脂脱色紫薯粉。

脱脂脱色后紫薯多糖的提取步骤为：将脱脂脱色紫薯粉用蒸馏水配制成3％－5％（w/v，g/mL）溶液，搅拌均匀后在55℃－75℃下用25kHz超声波辅助提取30－50min，超声波功率为180－250W，超声波辅助提取结束后加入淀粉酶，加酶量为100－500U/g，在50℃－60℃酶解2－4h，酶解结束后离心分离得到上清液，将上清液浓缩至多糖含量5％（w/v，g/mL），加入95％（v/v，mL/mL）乙醇，保持混合液中乙醇浓度为85％－95％（v/v，mL/mL），静置1h后离心，收集沉淀后冷冻干燥，即得到粉末状紫薯多糖产品。

选用的淀粉酶为α-淀粉酶。

上述方法提取获得的紫薯多糖在制备抑制肿瘤药物中的应用。

采用清除DPPH自由基能力和螯合亚铁离子能力评价紫薯多糖的抗氧化活性，采用MTT法评价紫薯多糖抗胃癌细胞SGC7901活性，具体方法如下：

1）清除DPPH自由基能力的测定（Amarowicz R,Naczk M,Shahidi F.Antioxidant activityof various fractions of non-tanin phenolics of canola hulls[J].J Agric Food Chem,2000,48:2755-2759）

在2mL样品中加入2mL浓度为0.04g/L的DPPH无水乙醇溶液，混匀后室温反应20min，3500r/min离心10min，取上清液，在517nm测其吸光值；另取2mL样品，加入2mL无水乙醇，混匀后室温反应20min，3500r/min离心10min，取上清液，在517nm测其吸光值；以2mL0.04g/L DPPH无水乙醇溶液和2mL无水乙醇混合液做为参比，在517nm测其吸光值，计算公式如下：

K=[1－(A_i－A_j)/A₀]×100

式中K—DPPH自由基清除率，%；A₀—2mL0.04g/L的DPPH无水乙醇溶液加2mL无水乙醇的吸光值；A_i—2mL0.04g/L的DPPH无水乙醇溶液加2mL样品的吸光值；A_j—2mL无水乙醇加2mL样品的吸光值。

2）螯合Fe²⁺能力测定（Lee Y L,Yen M T,Mau J L.Antioxidant properties of various extractsfrom Hypsizigus marmoreus[J].Food Chemistry,2007,104:1-9）

取1mL样品溶液，加入3.7mL双蒸水，然后加入0.1mL2mmol/L的FeCl₂溶液，混匀后加入0.2mL5mmol/L的Ferrozine溶液，混匀后静置10min。在562nm下测定吸光值。按照下式计算Fe²⁺的螯合率：

螯合率=（1－A"/A"₀）×100％

式中A"—样品参与反应的吸光值；A"₀—空白吸光值。

3）MTT比色法测定（Zhang D,Wu H,Xia Z,Wang C,Cai J,Huang Z,Du L,Sun P,Xie J.Partial characterization,antioxidant and antitumor activities of three sulfated polysaccharidespurified from Bullacta exarata[J].Journal of Functional Foods,2012,4(4):784-792）

取对数生长期的肿瘤细胞，每孔100μL，接种于96孔塑料培养板内，静止培养12h后，对照组不加多糖，样品组每孔内分别加入100μL不同浓度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL）的多糖样品，每个浓度设3个平行孔，然后将培养板移入CO₂培养箱中，在37℃，5%（v/v，cm³/cm³）CO₂以及饱和湿度条件下培养48h，弃上清液，每孔内分别加入20μL5mg/mL MTT溶液。37℃继续孵育4h后，终止培养，吸取弃除上清液后，每孔加入150μL DMSO，轻轻振荡10min，使MTT还原产物完全溶解，用酶标仪在570nm处测定对照组和样品组各孔吸光值，以每组3个孔的平均值作为各组的平均吸光值，根据下式计算肿瘤细胞抑制率：

抑制率＝（1－B/B₀）×100％

式中B—加多糖样品组的吸光值；B₀—空白吸光值。

有益效果：

1）首次利用超声波协同酶法提取紫薯多糖，提高了紫薯多糖的提取率。

2）紫薯货架期短，易腐败变质，开发紫薯多糖为紫薯资源的有效利用提供新途径，且紫薯原料来源广泛。

3）本发明所得到的紫薯多糖的提取率为8.5％－11.1％（w/w,g/g），均高于目前文献报道的紫薯多糖提取率，清除DPPH自由基的IC₅₀是0.15-0.33mg/mL，螯合Fe²⁺能力的IC₅₀为0.5-1.1mg/mL，48h抑制胃癌细胞SGC7901的IC₅₀为0.4-0.9mg/mL。

附图说明

图1超声波协同酶法提取紫薯多糖的工艺流程图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

紫薯粉用95％（v/v，mL/mL）乙醇配制成10％（w/v，g/mL）悬浮液，在50℃下浸提6h进行脱脂和脱色处理，然后在50℃烘干，将烘干的脱脂脱色紫薯粉用蒸馏水配制成3％（w/v，g/mL）溶液，搅拌均匀后在55℃下用25kHz超声波辅助提取50min，超声波功率为180W，超声波辅助提取结束后加入α-淀粉酶，加酶量为100U/g，在50℃酶解4h，酶解结束后离心分离得到上清液，将上清液浓缩至多糖含量5％（w/v，g/mL），加入95％（v/v，mL/mL）乙醇，保持混合液中乙醇浓度为85％（v/v，mL/mL），静置1h后离心，收集沉淀后冷冻干燥，即得到粉末状紫薯多糖产品。该方法紫薯多糖的提取率为8.5％（w/w,g/g），清除DPPH自由基的IC₅₀是0.23mg/mL，螯合Fe²⁺能力的IC₅₀为0.6mg/mL，48h抑制胃癌细胞SGC7901的IC₅₀为0.6mg/mL。

实施例2

紫薯粉用95％（v/v，mL/mL）乙醇配制成20％（w/v，g/mL）悬浮液，在65℃下浸提5h进行脱脂和脱色处理，然后在60℃烘干，将烘干的脱脂脱色紫薯粉用蒸馏水配制成4％（w/v，g/mL）溶液，搅拌均匀后在65℃下用25kHz超声波辅助提取40min，超声波功率为210W，超声波辅助提取结束后加入α-淀粉酶，加酶量为300/g，在55℃酶解3h，酶解结束后离心分离得到上清液，将上清液浓缩至多糖含量5％（w/v，g/mL），加入95％（v/v，mL/mL）乙醇，保持混合液中乙醇浓度为90％（v/v，mL/mL），静置1h后离心，收集沉淀后冷冻干燥，即得到粉末状紫薯多糖产品。该方法紫薯多糖的提取率为11.1％（w/w,g/g），清除DPPH自由基的IC₅₀是0.15mg/mL，螯合Fe²⁺能力的IC₅₀为0.5mg/mL，48h抑制胃癌细胞SGC7901的IC₅₀为0.4mg/mL。

实施例3

紫薯粉用95％（v/v，mL/mL）乙醇配制成30％（w/v，g/mL）悬浮液，在80℃下浸提4h进行脱脂和脱色处理，然后在70℃烘干，将烘干的脱脂脱色紫薯粉用蒸馏水配制成5％（w/v，g/mL）溶液，搅拌均匀后在75℃下用25kHz超声波辅助提取30min，超声波功率为250W，超声波辅助提取结束后加入α-淀粉酶，加酶量为500U/g，在60℃酶解2h，酶解结束后离心分离得到上清液，将上清液浓缩至多糖含量5％（w/v，g/mL），加入95％（v/v，mL/mL）乙醇，保持混合液中乙醇浓度为95％（v/v，mL/mL），静置1h后离心，收集沉淀后冷冻干燥，即得到粉末状紫薯多糖产品。该方法紫薯多糖的提取率为9.2％（w/w,g/g），清除DPPH自由基的IC₅₀是0.33mg/mL，螯合Fe²⁺能力的IC₅₀为1.1mg/mL，48h抑制胃癌细胞SGC7901的IC₅₀为0.9mg/mL。

Claims (5)

1.利用超声波协同酶法提取紫薯多糖的方法，其特征为：紫薯粉经脱除脂肪和色素后配制成悬浮液，用超声波辅助提取紫薯多糖，超声波辅助提取结束后加入淀粉酶酶解，酶解结束后离心，收集上清液，上清液经浓缩后加入乙醇，静置后离心，收集沉淀，冷冻干燥，即得到粉末状紫薯多糖产品。

2.根据权利要求1所述的利用超声波协同酶法提取紫薯多糖的方法，其特征在于所述紫薯粉脱除脂肪和色素的步骤为：紫薯粉用体积浓度95％乙醇配制成10％－30％（w/v，g/mL）悬浮液，在50℃－80℃下浸提4－6h进行脱脂和脱色处理，50℃－70℃烘干，即为脱脂脱色紫薯粉。

3.根据权利要求2所述的利用超声波协同酶法提取紫薯多糖的方法，其特征在于紫薯多糖的提取步骤为：将脱脂脱色紫薯粉用蒸馏水配制成3％－5％（w/v，g/mL）溶液，搅拌均匀后在55℃－75℃下用25kHz超声波辅助提取30－50min，超声波功率为180－250W，超声波辅助提取结束后加入淀粉酶，加酶量为100－500U/g，在50℃－60℃酶解2－4h，酶解结束后离心分离得到上清液，将上清液浓缩至多糖含量5％（w/v，g/mL），加入体积浓度95％乙醇，保持混合液中乙醇体积浓度为85％－95％，静置1h后离心，收集沉淀后冷冻干燥，即得到粉末状紫薯多糖产品。

4.根据权利要求1或3所述的利用超声波协同酶法提取紫薯多糖的方法，其特征在于：选用的淀粉酶为α-淀粉酶。

5.权利要求1所述方法提取获得的紫薯多糖在制备抑制肿瘤药物中的应用。