CN102443634A - Fbp1基因的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药生物技术领域，具体是一个新抑癌基因FBP1基因在制备肿瘤诊断、预防和治疗药物中的应用。该抑癌基因在肿瘤细胞以及肿瘤组织中特异性低表达，并且具有抑制肿瘤细胞生长的作用，因此筛选低表达该抑癌基因的肿瘤，特异性恢复该抑癌基因在肿瘤细胞中的表达，为肿瘤靶向治疗提供了一种新方法。
Description
技术领域
本发明涉及医药生物技术领域，具体是一个新抑癌基因FBP1基因在制备肿瘤诊断、预防或治疗药物中的应用。
背景技术
肿瘤的发生发展是一个多因素多步骤的过程，涉及到癌基因的活化和抑癌基因的失活。通过检测这些癌基因和抑癌基因的改变，可以在分子水平上早期检测到肿瘤的发生，从而为及时的干预治疗创造机会。随着肿瘤研究的不断深入，目前肿瘤的诊断和临床治疗都已经开始在分子水平展开。通过基因芯片和蛋白质组学等技术，新的肿瘤相关分子标记正不断被开发，肿瘤早期诊断的水平日益提高。同时，在肿瘤分子诊断的基础上，开展针对肿瘤细胞的特异性治疗，可以避免对正常细胞的毒副作用，增加治疗剂量，提高治疗效果。
由于抑癌基因一般在肿瘤细胞中异常失活，因此恢复抑癌基因的功能一直以来被认为是抑制肿瘤进展的有效方法。而且，抑癌基因本身在正常组织中表达并发挥预防肿瘤发生的重要作用，因此，促进抑癌基因的表达一般对正常细胞没有明显毒副作用，是一种相对安全的肿瘤特异性治疗方法。目前，已经有以恢复抑癌基因表达为目的的肿瘤治疗手段应用于肿瘤的临床治疗，例如p53腺病毒等。
随着肿瘤分子生物学的发展，越来越多的抑癌基因被发现和鉴定，不仅拓展了我们对肿瘤发生的认识，也为肿瘤诊治手段的开发提供了更多的方向。果糖-1,6-二磷酸作为糖酵解途径中重要的反应中间体受到果糖-6-磷酸酶和果糖-1,6-二磷酸酶（Fructose-1,6-bisphos-phatase,FBP）的双重调控。已有研究表明，肿瘤细胞中果糖-6-磷酸酶水平发生上调，但FBP基因在肿瘤细胞中是否也发生变化以及其对肿瘤发生、发展的作用，至今还不清楚。在哺乳动物细胞中存在两种FBP基因的同工酶，其中FBP2基因只存在于肌肉中，而FBP1基因分布更为广泛。FBP1基因（Genbank No. NM_000507），与肿瘤发生的关系尚未清楚，有待进一步研究。
发明内容
本发明旨在提供一种新的抑癌基因在制备肿瘤诊断、预防或治疗药物中的应用。
为实现本发明的发明目的，发明人提供如下技术方案：
FBP1基因在制备肿瘤诊断、预防或治疗药物中的应用。
发明人研究发现，FBP1基因是一种新的抑癌基因，该抑癌基因在肿瘤细胞以及肿瘤组织中特异性低表达，并且具有抑制肿瘤细胞生长的作用，因此，在筛选FBP1基因低表达的肿瘤细胞的基础上，特异性恢复该抑癌基因在肿瘤细胞中的表达，有望成为肿瘤靶向治疗的一种新方法和手段。
作为优选，根据本发明所述的FBP1基因在制备肿瘤诊断、预防或治疗药物中的应用，其中，所述的肿瘤诊断药物中至少包括一对特异扩增FBP1基因的引物，所述的引物由上游引物和下游引物组成，其中，所述的上游引物（hFBP1-F）具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；下游引物（hFBP1-R）具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
作为优选，根据本发明所述的FBP1基因在制备肿瘤诊断、预防或治疗药物中的应用，其中，所述的肿瘤诊断药物以FBP1基因为基础的检测手段，所述的检测手段包括RT-PCT和实时定量PCR。
作为优选，根据本发明所述的FBP1基因在制备肿瘤诊断、预防或治疗药物中的应用，其中，所述的肿瘤预防或治疗药物以FBP1基因为靶点。
作为优选，根据本发明所述的FBP1基因在制备肿瘤诊断、预防或治疗药物中的应用，其中，所述的肿瘤包括但不限于胃癌肿瘤。
作为优选，根据本发明所述的FBP1基因在制备肿瘤诊断、预防或治疗药物中的应用，其中，所述的药物为药剂学上可接受的任何一种剂型，包括粉剂、注射液、胶囊、片剂或口服液等。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明提供了一种新抑癌基因在制备肿瘤诊断、预防或治疗药物中的应用，以FBP1基因为基础的诊断药物可方便快捷的在分子水平上实现肿瘤的检测，同时，以FBP1基因为靶点和核心的药物可望成为肿瘤靶向治疗的一种新手段。
附图说明
图1是FBP1基因在胃癌细胞中的表达分析（RT-PCR法）。FBP1基因在大部分胃癌细胞中的表达降低。
图2是FBP1基因在胃癌组织中的表达分析（RT-PCR法）。相对于正常对照组织，肿瘤组织中的FBP1基因表达明显下调。胃癌（Tumor）与正常胃粘膜组织（Normal），22对，p < 0.01。
图3是FBP1基因表达载体的构建示意图。
图4是RT-PCR法检测FBP1基因表达载体转染前后的基因表达情况。
图5是应用集落形成实验来分析FBP1基因的抑癌功能。发现转染FBP1基因表达载体以恢复FBP1基因在肿瘤细胞中表达后，肿瘤细胞的集落形成能力受到明显抑制（p < 0.01）。对照组是空载体（pcDNA3.1）；数据来自3次不同的实验（均值±标准差的形式）。
图6是应用细胞生长曲线实验来分析FBP1基因的抑癌功能。数据来自3次不同的实验（均值±标准差的形式）。发现转染FBP1基因表达载体以恢复FBP1基因在肿瘤细胞中表达后，肿瘤细胞的生长受到明显抑制（p < 0.01）。
具体实施方式
下面结合实施例和说明书附图，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。若无特别指明，实施例采用的方法为本领域通用技术。
本发明所述的新抑癌基因FBP1基因在开发肿瘤诊断、预防和治疗手段中的应用，可参考常规的药物配置方法和试剂开发。药物剂型和生物制剂为医学上认可的任何一种剂型，例如为粉剂、注射液、胶囊、片剂或口服液。
实施例中未注明具体条件的实验方法，是按照常规条件，例如Sambrook等作者的分子克隆实验室手册（New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989）中所述的条件，或按照制造厂商说明书建议的条件。
试验试剂：Highfidelity PFU DNA聚合酶，Trizol试剂，小牛血清（FBS），磷酸盐缓冲液(PBS), RPMI-1640培养基，青霉素-链霉素(P/S)和0.25%(W/V) 胰蛋白酶/1 mM EDTA（Trypsin-EDTA）购于Invitrogen (USA)。GoTaq聚合酶从Promega（USA）购得。肿瘤细胞系（AGS, Kato III, MKN28, MKN45, NCI-N87, SNU1和SNU16）分别从日本的Riken BioResource Center细胞库和美国的ATCC购买。逆转录反应（RT）使用High Capacity cDNA Reverse Transcription试剂盒（美国Applied Biosystem公司）。
实施例1 RT-PCR实验检测FBP1基因在肿瘤细胞中的表达
1.细胞培养
所有细胞均采用RPMI-1640培养基，其中含100 U/ml青霉素，100 μg/ml链霉素和10%FBS，于37℃ 5% CO2培养箱中进行培养。
2.总RNA抽提试剂盒
细胞的总RNA是用Invitrogen公司的Trizol试剂按照生产厂商提供的方法分离提取。该试剂是基于酸性酚一步抽提法生产的。用于抽提RNA所用的器皿和水均要进行无RNA酶处理，以保证实验中无RNA酶的环境。
3.总RNA的抽提
培养细胞至对数生长期，吸干培养液后，直接加入1ml Trizol，室温下静置5分钟，收集细胞到1.5ml离心管中。加入氯仿后，4oC离心分层；将上层水相转入新鲜1.5ml离心管，加入1ml异丙醇，4oC离心沉淀RNA；用1.5ml75%乙醇洗涤沉淀2次；用无RNA酶的去离子水溶解沉淀。抽提的RNA质量鉴定：紫外分光光度计测定260/280比值（确认比值均在1.7-2.0）。并在MOPS甲醛变性胶中观察有无降解。作为对照的正常胃组织的总RNA从Clontech公司购买。
4.cDNA的合成
逆转录反应（RT）使用美国Applied Biosystem公司的High Capacity cDNA Reverse Transcription试剂盒，每个反应使用2微克总RNA。加入2×RT buffer10微升和总RNA10微升，反应总体积为20微升。使用ABI PCR仪进行逆转录反应，具体运行参数如下：25oC 10分钟；37oC 120分钟；85oC 5分钟；冷却至4oC。-20oC保存备用。
5.PCR
细胞FBP1的表达水平通过常规PCR法来检测，使用美国Promega公司的GoTaq聚合酶。反应总体积为20微升：采用1微升cDNA模板，加入2×PCR buffer10微升，高纯去离子水9微升。反应参数如下：95oC预变性2分钟；35个循环设置如下，95oC变性30秒；55oC退火30秒，72oC延伸30秒；最后72oC延伸10分钟。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物（结果见图1）。
PCR使用所有引物均在Invitrogen公司合成。具体序列如下：
Human FBP1的RT-PCR引物：
hFBP1-F（上游引物）：ACAGCAGTCAAAGCCATCTC（SEQ ID NO.1）；
hFBP1-R（下游引物）：GGTTCCACTATGATGGCGTG（SEQ ID NO.2），
Human GAPDH的RT-PCR引物：
hGAPDH-F：GGAGTCAACGGATTTGGT（SEQ ID NO.3）；
hGAPDH-R：GTGATGGGATTTCCATTGAT（SEQ ID NO.4）。
6.结果分析
FBP1基因在肿瘤细胞中的表达明显下降（见图1）。
实施例2 实时定量PCR实验检测FBP1基因在肿瘤组织中的表达
1.组织分离
所有标本均经病理确认。手术切除标本一经离体，迅速切取肿瘤病灶及癌旁组织，放入液氮中保存。
2.总RNA抽提
将匀浆器等在200oC干烤4小时，去除RNA酶，冷却；将组织从液氮中迅速取出，碾成粉末；用刮匙将组织放入预先加入TRIzol试剂的匀浆器中，匀浆数分钟；将匀浆后的液体转入无RNA酶的离心管中，加入氯仿后，4oC离心分层；将上层水相转入一无RNA酶的离心管中，加异丙醇，4oC离心沉淀RNA；用75%乙醇洗涤沉淀2次；风干后无RNA酶的去离子水溶解沉淀。抽提的RNA质量鉴定：紫外分光光度计测定260/280nm比值，比值均在1.7-20。通过MOPS甲醛变性胶观察有无RNA降解。
3.cDNA合成均参照实施例1。
4.实时定量PCR
采用定量实时RT-PCR来比较分析组织中FBP1的mRNA水平，用GAPDH作为对照。聚合酶链反应（PCR）使用美国Applied Biosystem公司的定量RT-PCR试剂盒（Power Sybr green）。反应总体积为20微升：采用1微升cDNA模板，加入2×PCR buffer10微升，高纯去离子水9微升。反应参数如下：95oC预热2分钟；40个循环设置如下，95oC，30秒；60oC，1分钟；最后进行溶解曲线分析（结果见图2）。
5.结果分析
FBP1基因在胃癌肿瘤组织中的表达明显下降（见图2）。
实施例3 FBP1 cDNA的克隆和表达载体的构建
1.克隆专用cDNA的合成
逆转录反应（RT）使用美国Invitrogen公司的SuperScipt III First Synthesis System for RT-PCR试剂盒，每个反应使用2微克总RNA。反应总体积为20微升：10×RT buffer 2微升，总RNA 5微升，OligodT20引物1微升，10mM dNTP1微升， 25mM MgCl2 4微升，0.1M DTT 1微升，RNaseOUT 1微升，SuperScript III逆转录酶 1微升，高纯去离子水4微升。使用ABI PCR仪进行逆转录反应，具体运行参数如下：25oC 10分钟；37oC 120分钟；85oC 5分钟；冷却至4oC。-20oC保存备用。50oC 50分钟，85oC 5分钟，冷却至4oC后加入RNaseH，37oC孵育20分钟。-20oC保存备用。
2. FBP1 cDNA的克隆
全长FBP1基因的开放阅读框采用RT-PCR的方法从正常胃组织的总RNA中扩增获得，其中聚合酶连反应（PCR）使用美国Invitrogen公司的highfidelity PFU DNA聚合酶。反应总体积为50微升：5×PCR缓冲液 10微升，10mMdNTP 1微升，引物各1微升，PFU酶0.4微升，cDNA模板5微升，高纯去离子水32.6微升。PCR反应参数如下：96oC预变性4分钟；反应37个循环：95oC变性30秒；58oC退火30秒；72oC延伸1分钟。
运用TOPO技术，连接到TOPO PCR Blunt载体（美国Invitrogen公司）。具体步骤如下：取新鲜PCR产物2微升，加入TOPO 载体1微升，试剂盒中氯化钠溶液1微升，高纯无离子水2微升。室温下孵育10分钟后。
开始细菌转化：将TOPO反应产物加入冰浴融化的感受态细菌中，冰浴孵育半小时，42oC热休克90秒，加入试剂盒中SOB培养液1毫升，37oC低速培养1小时，再将细菌培养液接种在含青霉素培养LB板中继续常规培养过夜。第二天，挑取克隆培养，经测序选择正确克隆。
3. FBP1的克隆引物
FBP1-cF:GCCACCATGGATTACAAGGATGACGATGACAAGGATTGTTACAGAACTTC（SEQ ID NO.5）
FBP1-cR: GTTAGAGTTTTGTTGACATGATGA（SEQ ID NO.6）
4. FBP1表达载体的构建 （图3）
抽提正确克隆的质粒，用EcoR I 酶切后，经1%琼脂糖电泳分离回收目的片段，连入线性化的pcDNA3.1。连接反应如下：载体1微升，回收插入子5微升，连接酶缓冲液2微升，T4 DNA连接酶1微升（Roche Applied Science公司产品）。16oC连接过夜。过夜连接产物参照步骤2中的细菌转化程序进行转化和细菌接种。挑取克隆培养，经酶切和测序双鉴定后，保存正确克隆，使用Qiagen公司的质粒抽提试剂盒抽提质粒，用于基因转染。
5.结果分析
经RT-PCR法测定FBP1在表达载体转染后肿瘤细胞中明显表达，证实FBP1的哺乳动物表达载体构建成功（见图4）。
实施例4 集落形成法分析FBP1基因的抑癌功能
1.操作过程
利用克隆形成实验（Colony Fomation Assay）来检测FBP1基因对肿瘤癌细胞生长的作用。100000个细胞接种于12孔细胞培养板培养过夜，使用德国Roche Applied Science公司的FUGENE 6试剂转染FBP1质粒，并使用空的pcDNA3.1载体作为对照。转染48小时后，转染的细胞均分成分成三组重新接种，并使用含有400微克每毫升G418的RPMI-1640完全培养基培养10-15天，形成的克隆先用甲醇固定，然后用龙胆紫染色，大于等于50个细胞的克隆被统计用于分析。
2.结果分析
在AGS和MKN28细胞中，当外源转入FBP1基因后，肿瘤细胞形成克隆的能力被明显抑制（见图5）。
实施例5 细胞生长曲线法分析FBP1的功能
1.操作过程
利用细胞生长曲线实验来检测FBP1基因对肿瘤细胞生长的作用。基因转染同实施例4。转染细胞用含有400微克每毫升G418的RPMI-1640完全培养基培养筛选，获得的稳定细胞株在12孔细胞培养板中培养并连续4-5天使用台酚蓝染色进行活细胞计数，所得结果如图6所示，稳定表达FBP1基因的细胞株的增殖能力显著低于对照的空载体细胞株。
2.结果分析
当外源转入FBP1基因后，肿瘤细胞的生长能力被明显抑制（见图6）。
结论：
FBP1基因在肿瘤细胞和肿瘤组织中表达下降；通过克隆FBP1 cDNA，构建FBP1基因的哺乳动物表达载体，发现恢复FBP1基因在肿瘤细胞中的表达，可以抑制肿瘤细胞的生长。以上结果表明：FBP1基因是一个新的抑癌基因。检测FBP1基因的表达可以用于肿瘤的诊断。而恢复FBP1基因的抑癌功能可以达到治疗肿瘤的目的。因此，FBP1基因在肿瘤的诊断、预防以及治疗中均有一定的应用价值。
尽管发明人已经对本发明的技术方案做了较为详细的阐述和列举，应当理解，对于本领域一个熟练的技术人员来说，对上述实施例作出修改和/或变通或者采用等同的替代方案是显然的，都不能脱离本发明精神的实质，本发明中出现的术语用于对本发明技术方案的阐述和理解，并不能构成对本发明的限制。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江大学
<120> FBP1基因的应用
<130> HCW003
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acagcagtca aagccatctc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggttccacta tgatggcgtg 20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggagtcaacg gatttggt 18
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gtgatgggat ttccattgat 20
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gccaccatgg attacaagga tgacgatgac aaggattgtt acagaacttc 50
Claims (6)
1.FBP1基因在制备肿瘤诊断、预防或治疗药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的FBP1基因在制备肿瘤诊断、预防或治疗药物中的应用，其特征在于，所述的肿瘤诊断药物中至少包括一对特异扩增FBP1基因的引物，所述的引物由上游引物和下游引物组成，其中，所述的上游引物具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；下游引物具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的FBP1基因在制备肿瘤诊断、预防或治疗药物中的应用，其特征在于，所述的肿瘤诊断药物以FBP1基因为基础的检测手段，所述的检测手段包括RT-PCT和实时定量PCR。
4.根据权利要求1所述的FBP1基因在制备肿瘤诊断、预防或治疗药物中的应用，其特征在于，所述的肿瘤预防或治疗药物以FBP1基因为靶点。
5.根据权利要求1所述的FBP1基因在制备肿瘤诊断、预防或治疗药物中的应用，其特征在于，所述的肿瘤包括胃癌肿瘤。
6.根据权利要求1-5之一所述的FBP1基因在制备肿瘤诊断、预防或治疗药物中的应用，其特征在于，所述的药物为药剂学上可接受的任何一种剂型，包括粉剂、注射液、胶囊、片剂或口服液。
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2011
- 2011-11-17 CN CN2011103652747A patent/CN102443634A/zh active Pending
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