CN102438702A - 抗mst1r抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本公开提供重组抗原结合区以及包含这种对MST1R特异的抗原结合区的抗体和功能性片段，MST1R在多种病症或疾病例如癌症中起着主要作用。因此，这些抗体可用来治疗这些和其他病症或疾病。本公开的抗体也可用于诊断领域，以及用于进一步研究MST1R在与肿瘤有关病症进展中的作用。本公开也提供编码前述抗体的核酸序列、包含核酸序列的载体、药物组合物和带使用说明书的试剂盒。

Description

抗MST1R抗体及其用途
背景
MST1R(巨噬细胞刺激1受体；人MST1R示于GenBank登录号：NM_002447.2中)也被描述为RON或CDw136，是一种在上皮起源的细胞上发现的c-Met相关的酪氨酸激酶。1400个氨基酸的单链前体被切割成二硫键连接的异二聚体，其由细胞外40kDaα-链和包含细胞内酪氨酸激酶结构域的150kDa β-链组成。和c-Met相似，MST1R诱导侵袭性细胞生长、迁移、细胞解离和基质侵入。[Wang，等，Carcinogenesis 24，1291-1300，2003；Lee，等，Clin Cancer Res 11，2222-2228，2005]。两种酪氨酸激酶均在多种恶性肿瘤例如乳腺癌、肺癌或前列腺癌上过量表达[O’Toole，等，Cancer Res 66，9162-9170，2006]。巨噬细胞刺激蛋白MSP是到目前为止MST1R已知的唯一配体。MSP结合引发MST1R酪氨酸激酶结构域的自磷酸化。因此活化的MST1R转导多种不同途径级联。[Wang，等，Carcinogenesis 24，1291-1300，2003；O’Toole，等，Cancer Res 66，9162-9170，2006]。通过mRNA剪接产生生物活性的截短MST1R变体已经有报道。[Wang，等，Carcinogenesis 24，1291-1300，2003]。例如，在一些结直肠癌样品中发现MST1RΔ160变体，并在裸鼠中发现其过量表达而无配体介导的肿瘤形成[Zhou等，Oncogene 22，186-197，2003]。抗MST1R抗体(例如IMC-41A10)阻断配体-受体相互作用，是受体以及下游的信号转导、细胞迁移和肿瘤发生的有力抑制剂[O’Toole，等，Cancer Res66，9162-9170，2006]。
总之，阻断MST1R活性的抗体是人癌症中相关的潜在治疗药。
概述
本发明一个目的是提供针对MST1R的人抗体和人源化抗体。
本发明另一个目的是提供对于人给药安全的抗体。
本发明又一个目的是提供通过使用本发明的一种或多种抗体治疗与MST1R上调相关的疾病和/或病症的方法。这些和其他目的在本文得到更全面的描述。
在一个实施方案中，一种分离的抗体或含有抗原结合区的功能性片段对MST1R特异。
这种抗体或其功能性片段可包含抗原结合区，所述抗原结合区包含具有SEQ ID NO：1或4氨基酸序列的H-CDR3(重链CDR3)区；所述抗原结合区还可包含具有SEQ ID NO：2或5氨基酸序列的H-CDR2(重链CDR2)区；且所述抗原结合区也可包含具有SEQ IDNO：3或6氨基酸序列的H-CDR1(重链CDR1)区。这种抗体或其功能性片段可包含抗原结合区，所述抗原结合区包含具有SEQ ID NO：7、8、9、10、11或12氨基酸序列的L-CDR3(轻链CDR3)区；所述抗原结合区还可包含具有SEQ ID NO：13或15氨基酸序列的L-CDR1(轻链CDR1)区；且所述抗原结合区也可包含具有SEQ ID NO：14或16氨基酸序列的L-CDR2(轻链CDR2)区。
本文描述的抗体(及其功能性片段)可包含对MST1R表位特异的抗原结合区，所述表位包含具有SEQ ID NO：17氨基酸序列的氨基酸的一个或多个氨基酸残基。对于某些抗体，表位可为线性的，而对于其他抗体，其可为构象的(即不连续的)。具有这些性质中一个或多个的抗体或其功能性片段可包含抗原结合区，所述抗原结合区包含具有SEQ ID NO：1或4氨基酸序列的H-CDR3区；所述抗原结合区还可包含具有SEQ ID NO：2或5氨基酸序列的H-CDR2区；且所述抗原结合区也可包含具有SEQ ID NO：3或6氨基酸序列的H-CDR1区。本发明的这种MST1R特异性抗体可包含抗原结合区，所述抗原结合区包含具有SEQ ID NO：7、8、9、10、11或12氨基酸序列的L-CDR3区；所述抗原结合区还可包含SEQ ID NO：13或15所示的L-CDR1区；且所述抗原结合区也可包含具有SEQ ID NO：14或16氨基酸序列的L-CDR2区。
本文所公开序列的肽变体亦为本公开的各种实施方案所包括。因此，实施方案包括抗MST1R抗体，所述抗体具有这样的重链氨基酸序列：其在CDR区中与具有SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6氨基酸序列的CDR区具有至少60％的序列同一性；和/或在CDR区中与具有SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6氨基酸序列的CDR区具有至少80％的序列同源性。还包括具有这样的轻链氨基酸序列的抗MST1R抗体：其在CDR区中与具有SEQ ID NO：7、8、9、10、11、12、13、14、15或16氨基酸序列的CDR区具有至少60％的序列同一性；和/或在CDR区中与具有SEQ ID NO：7、8、9、10、11、12、13、14、15或16氨基酸序列的CDR区具有至少80％的序列同源性。
本文公开的抗体可以是IgG(例如IgG1)，而抗体片段可以是例如Fab或scFv。因此本发明的抗体片段可以是或可包含以本文所述一种或多种方式作用的抗原结合区。
另一个实施方案还涉及分离的核酸序列，各核酸序列编码对MST1R表位特异的人抗体或其功能性片段的抗原结合区。这种核酸序列可编码抗体的可变重链，并包含选自SEQ ID NO：18或20的序列或在高度严格条件下与SEQ ID NO：18或20的互补链杂交的核酸序列。所述核酸可编码分离抗体或其功能性片段的可变轻链，并可包含选自SEQ ID NO：22、24、26、28、30和32的序列，或在高度严格条件下与选自SEQ ID NO：22、24、26、28、30和32的互补链杂交的核酸序列。
本文描述的核酸适合于重组体生产。因此，包含本文公开的核酸序列的载体和宿主细胞也是另外的实施方案。
本文描述的组合物可用于治疗或预防应用。因此，这些实施方案包括一种药物组合物，其包含本发明的抗体(或功能性抗体片段)及其药学上可接受的载体或赋形剂。在一个相关的方面，另一个实施方案包括用于治疗与不希望有的MST1R或MST1R表达细胞存在有关的病症或疾病的方法。这种方法包括将有效量的包含本文所述或预期的本发明抗体的药物组合物给予有需要的受试者的步骤。
其他的实施方案还涉及分离的线性或构象形式的MST1R表位及其在分离抗体或其功能性片段中的用途，所述抗体或抗体片段包含对所述表位特异的抗原结合区。在这点上，构象表位可包含SEQ IDNO：17中的一个或多个氨基酸残基。MST1R表位可用于例如分离抗体或其功能性片段(各所述抗体或抗体片段包含对这种表位特异的抗原结合区)，包括将所述MST1R表位与抗体文库相接触和分离抗体或其功能性片段的步骤。
在另一个实施方案中，本公开提供一种分离的MST1R表位，其本质上由SEQ ID NO：17的氨基酸序列组成。如本文所用，这种表位基本上由所述的氨基酸序列加附加特征组成(“consist essentiallyof”)，条件是附加特征实质上不影响表位的基本特性和新的特性。
本公开还涉及一种试剂盒，其具有：(i)一种分离的包含具有SEQ ID NO：17中氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基的MST1R表位；(ii)抗体文库；和(iii)使用抗体文库分离一个或多个特异结合该表位的该文库成员的操作指南。
(详述)
本公开基于发现新的抗体，其对MST1R特异或对MST1R具有高亲和力，并可对受试者产生治疗益处。本文公开的抗体(可为人抗体或人源化抗体)可用于很多环境，这在本文中得到更全面的描述。
“人”抗体或功能性人抗体片段在本文中定义为非嵌合(例如非“人源化”)且非来自(全部或部分)非人物种的抗体或功能性抗体片段。人抗体或功能性抗体片段可源自于人，或可以是合成人抗体。“合成人抗体”在本文中定义为具有全部或部分地在计算机芯片上从合成序列得到的序列的抗体，该合成序列基于对已知人抗体序列的分析。人抗体序列或其片段的计算机设计可例如通过分析人抗体或抗体片段序列的数据库并利用由此所得数据设计多肽序列来实现。人抗体或功能性抗体片段的另一个实例是由从人来源的抗体序列文库(即这种文库基于取自人天然来源的抗体)中分离的核酸编码的人抗体或功能性抗体片段。
“人源化抗体”或功能性人源化抗体片段在本文中定义为：(i)其源自非人来源(例如带有异种免疫系统的转基因小鼠)，所述抗体基于人种系序列；或(ii)其是嵌合的，其中可变域源自非人来源，恒定域源自人来源；或(iii)其为互补性决定区(CDR)嫁接的，其中可变域的CDR来自非人来源，而可变域的一个或多个框架为人来源且恒定域(如果存在)为人来源。
如本文所用，抗体“特异性结合”、“特异性识别”抗原(本文，MST1R)“对抗原特异”，条件是这种抗体能够将这种抗原与一种或多种参照抗原区分开，因为结合特性不是绝对性质，而是相对性质。在其最通常的形式中(和在未提及规定的参照时)，“特异性结合”是指抗体区分目标抗原和非相关抗原的能力，其例如通过下述方法之一测定。这些方法包括但不限于蛋白质印迹、ELISA试验、RIA试验、ECL试验、IRMA试验和肽扫描。例如可进行标准ELISA测定。评分可通过标准显色进行(例如带辣根过氧化物的第二抗体和带过氧化氢的四甲基联苯胺)。在特定孔中的反应通过例如450nm的光密度评分。通常背景(＝阴性反应)可为0.1OD；通常阳性反应可为1OD。这意味着阳性/阴性差异可多于10倍。通常，测定结合特异性的进行不是通过使用单一参照抗原，而是通过使用一组约3-5种非相关抗原，例如奶粉、BSA、转铁蛋白等。
然而，“特异性结合”也可指抗体区分靶抗原和一种或多种用作参考点的密切相关抗原的能力，例如区分靶MST1R和靶脑信号蛋白。此外，“特异性结合”可涉及抗体区分其靶抗原不同部分的能力，例如MST1R的不同结构域或区，例如靶MST1R N端或C端区的表位，或者靶MST1R的一个或多个关键氨基酸残基或氨基酸残基段。
同样，本文所用“免疫球蛋白”(Ig)在本文中定义为属于IgG、IgM、IgE、IgA或IgD类(或其任何亚类)的蛋白质，并包括所有常规已知抗体及其功能性片段。抗体/免疫球蛋白的“功能性片段”在本文中定义为保留抗原结合区的抗体/免疫球蛋白片段(例如IgG的可变区)。抗体的“抗原结合区”通常存在于抗体的一个或多个高变区中，例如CDR-1区、CDR-2区和/或CDR-3区；然而，可变“框架”区在抗原结合中也可起重要作用，例如通过提供CDR支架。在各种实施方案中，“抗原结合区”至少包含可变轻链(VL)的4-103位氨基酸残基和可变重链(VH)的5-109位氨基酸残基，VL的3-107位氨基酸残基和VH的4-111位氨基酸残基是完整的VL链和VH链(VL的1-109位和VH的1-113位氨基酸编号参照WO97/08320)。用于本文所述实施方案的免疫球蛋白的例示性类别为IgG。本发明的“功能性片段”包括F(ab’)2片段、Fab片段和scFv的结构域。可对F(ab’)2或Fab进行工程改造，以将发生在CH1和CL结构域之间的分子间二硫键相互作用最小化或完全移除。
本文描述的抗体可源自基于氨基酸序列的重组抗体文库，所述氨基酸序列是经计算机设计且由合成产生的核酸编码。抗体序列的计算机设计例如通过分析人序列的数据库和使用由此获得的数据设计多肽序列而实现。用于设计和获得计算机产生序列的方法参见例如Knappik等，J.Mol.Biol.296：57-86，2000；Krebs等，J.Immunol.Methods.254：67-84，2001；和授予Knappik等的美国专利第6,300,064号，上述文献通过引用以其整体结合到本文中。
(本文描述的抗体)
贯穿本公开，提到以下代表性的抗体：“抗体第…号”、或“LACS”或“MOR”X。MOR X代表这样的抗体：其具有对应于SEQ ID NO：18或20(DNA)/SEQ ID NO：19或21(蛋白质)的可变重区以及选自SEQ ID NO：22、24、26、28、30和32(DNA)/SEQ IDNO：23、25、27、29、31和33(蛋白质)的可变轻区。
在一个实例中，本公开提供一种抗体，其具有对应于SEQ IDNO：18(DNA)/SEQ ID NO：19(蛋白质)的可变重区和对应于SEQ IDNO：22(DNA)/SEQ ID NO：23(蛋白质)的可变轻链。
在一个实例中，本公开提供一种抗体，其具有对应于SEQ IDNO：20(DNA)/SEQ ID NO：21(蛋白质)的可变重区和对应于SEQ IDNO：24(DNA)/SEQ ID NO：25(蛋白质)的可变轻链。
在一个实例中，本公开提供一种抗体，其具有对应于SEQ IDNO：18(DNA)/SEQ ID NO：19(蛋白质)的可变重区和对应于SEQ IDNO：26(DNA)/SEQ ID NO：27(蛋白质)的可变轻链。
在一个实例中，本公开提供一种抗体，其具有对应于SEQ IDNO：18(DNA)/SEQ ID NO：19(蛋白质)的可变重区和对应于SEQ IDNO：28(DNA)/SEQ ID NO：29(蛋白质)的可变轻链。
在一个实例中，本公开提供一种抗体，其具有对应于SEQ IDNO：18(DNA)/SEQ ID NO：19(蛋白质)的可变重区和对应于SEQ IDNO：30(DNA)/SEQ ID NO：31(蛋白质)的可变轻链。
在一个实例中，本公开提供一种抗体，其具有对应于SEQ IDNO：18(DNA)/SEQ ID NO：19(蛋白质)的可变重区和对应于SEQ IDNO：32(DNA)/SEQ ID NO：33(蛋白质)的可变轻链。
在另一个方面，本公开提供以下抗体。
在一个实例中，本公开提供一种包含抗原结合区的抗体，该抗原结合区包含具有SEQ ID NO：1或4氨基酸序列的H-CDR3(重链CDR3)区；该抗原结合区还可包含具有SEQ ID NO：2或5氨基酸序列的H-CDR2(重链CDR2)区；且该抗原结合区也可包含具有SEQID NO：3或6氨基酸序列的H-CDR1(重链CDR1)区。其中这样的抗体可包含抗原结合区，该抗原结合区包含具有SEQ ID NO：7、8、9、10、11或12氨基酸序列的L-CDR3(轻链CDR3)区；该抗原结合区还可包含具有SEQ ID NO：13或15氨基酸序列的L-CDR1(轻链CDR1)区；且该抗原结合区也可包含具有SEQ ID NO：14或16氨基酸序列的L-CDR2(轻链CDR2)区。
本公开也提供一种抗体，其包含以下抗原结合区：(i)具有SEQID NO：1氨基酸序列的H-CDR3区、具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的H-CDR2区和具有SEQ ID NO：3氨基酸序列的H-CDR1区，(ii)具有SEQ ID NO：4氨基酸序列的H-CDR3区、具有SEQ ID NO：5氨基酸序列的H-CDR2区和具有SEQ ID NO：6氨基酸序列的H-CDR1区。
一个实施方案也提供一种包含选自以下的抗原结合区的抗体：(i)具有SEQ ID NO：7氨基酸序列的L-CDR3区、具有SEQ ID NO：13氨基酸序列的L-CDR1区和具有SEQ ID NO：14氨基酸序列的L-CDR2区，(ii)具有SEQ ID NO：8氨基酸序列的L-CDR3区、具有SEQ ID NO：15氨基酸序列的L-CDR1区和具有SEQ ID NO：16氨基酸序列的L-CDR2区，(iii)具有SEQ ID NO：9氨基酸序列的L-CDR3区、具有SEQ ID NO：13氨基酸序列的L-CDR1区和具有SEQ IDNO：14氨基酸序列的L-CDR2区，(iv)具有SEQ ID NO：10氨基酸序列的L-CDR3区、具有SEQ ID NO：13氨基酸序列的L-CDR1区和具有SEQ ID NO：14氨基酸序列的L-CDR2区，(v)具有SEQ ID NO：11氨基酸序列的L-CDR3区、具有SEQ ID NO：13氨基酸序列的L-CDR1区和具有SEQ ID NO：14氨基酸序列的L-CDR2区，或(vi)具有SEQ ID NO：12氨基酸序列的L-CDR3区、具有SEQ ID NO：13氨基酸序列的L-CDR1区和具有SEQ ID NO：14氨基酸序列的L-CDR2区。
另一个实施方案提供一种包含选自以下的抗原结合区的抗体：(i)具有SEQ ID NO：1氨基酸序列的H-CDR3区、具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的H-CDR2区、具有SEQ ID NO：3氨基酸序列的H-CDR1区、具有SEQ ID NO：7氨基酸序列的L-CDR3区、具有SEQ ID NO：13氨基酸序列的L-CDR1区和具有SEQ ID NO：14氨基酸序列的L-CDR2区，(ii)具有SEQ ID NO：4氨基酸序列的H-CDR3区、具有SEQ ID NO：5氨基酸序列的H-CDR2区、具有SEQ ID NO：6氨基酸序列的H-CDR1区、具有SEQ ID NO：8氨基酸序列的L-CDR3区、具有SEQ ID NO：15氨基酸序列的L-CDR1区和具有SEQ ID NO：16氨基酸序列的L-CDR2区，(iii)具有SEQ ID NO：1氨基酸序列的H-CDR3区、具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的H-CDR2区、具有SEQID NO：3氨基酸序列的H-CDR1区、具有SEQ ID NO：9氨基酸序列的L-CDR3区、具有SEQ ID NO：13氨基酸序列的L-CDR1区和具有SEQ ID NO：14氨基酸序列的L-CDR2区，(iv)具有SEQ ID NO：1氨基酸序列的H-CDR3区、具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的H-CDR2区、具有SEQ ID NO：3氨基酸序列的H-CDR1区、具有SEQ ID NO：10氨基酸序列的L-CDR3区、具有SEQ ID NO：13氨基酸序列的L-CDR1区和具有SEQ ID NO：14氨基酸序列的L-CDR2区，(v)具有SEQ ID NO：1氨基酸序列的H-CDR3区、具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的H-CDR2区、具有SEQ ID NO：3氨基酸序列的H-CDR1区、具有SEQ ID NO：11氨基酸序列的L-CDR3区、具有SEQ ID NO：13氨基酸序列的L-CDR1区和具有SEQ ID NO：14氨基酸序列的L-CDR2区，以及(vi)具有SEQ ID NO：1氨基酸序列的H-CDR3区、具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的H-CDR2区、具有SEQ ID NO：3氨基酸序列的H-CDR1区、具有SEQ ID NO：12氨基酸序列的L-CDR3区、具有SEQ ID NO：13氨基酸序列的L-CDR1区和具有SEQ IDNO：14氨基酸序列的L-CDR2区。
在另一个方面，本公开提供以下抗体。
一个实施方案也提供一种抗体，其包含：(i)具有SEQ ID NO：49或51氨基酸序列的重链；和(ii)具有选自SEQ ID NO：53、55、57、59、61和63的氨基酸序列的轻链。
又一个实施方案提供一种抗体，其选自：(i)具有SEQ ID NO：49氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO：53氨基酸序列的轻链(称为“MOR07919”)，(ii)具有SEQ ID NO：51氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO：55氨基酸序列的轻链(称为“MOR07692”)，(iii)具有SEQ ID NO：51氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO：57氨基酸序列的轻链(称为“MOR07923”)，(iv)具有SEQ ID NO：51氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO：59氨基酸序列的轻链(称为“MOR07924”)，(v)具有SEQ ID NO：51氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO：61氨基酸序列的轻链(称为“MOR07925”)，(vi)具有SEQ ID NO：51氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO：63氨基酸序列的轻链(称为“MOR07926”)。
在一个方面，本公开提供具有可特异性结合靶MST1R的一个或多个区或对靶MST1R的一个或多个区具有高亲和力的抗原结合区的抗体，所述靶MST1R具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列。如果亲和力测量结果是至少100nM(Fab片段的单价亲和力)的KD，则说抗体对抗原具有“高亲和力”。本文描述的抗体或抗原结合区可例如以约小于100nM、小于约60nM或小于约30nM的亲和力结合MST1R。另外的实施方案包括以小于约10nM或小于约3nM的亲和力结合MST1R的抗体。特别地，分离的人抗体或人源化抗体或者其功能性片段包含对具有SEQ ID NO：17氨基酸序列的MST1R部分肽特异的抗原结合区，其中所述抗体或其功能性片段针对所述MST1R部分肽的亲和力为小于约10nM、小于约5nM、小于约1nM、小于约0.5nM或小于约0.1nM的KD，所述KD通过表面等离振子共振测定。同时，针对所述MST1R部分肽的亲和力为小于约10nM、小于约5nM、小于约1nM、小于约0.5nM或小于约0.1nM的KD，所述KD通过溶液平衡滴定测定。例如，本文描述的抗体针对MST1R的亲和力可为约0.98nM或0.02nM(Fab片段的单价亲和力)。
表1提供本文公开的代表性抗体的亲和力概要，所述亲和力通过表面等离振子共振(Biacore)和溶液平衡滴定(SET)测定。
表1：抗体亲和力
参照表1，MOR X抗体的亲和力通过表面等离振子共振(Biacore)在固定的重组人MST1R上测定。Biacore研究在直接固定的抗原上进行。MOR X的Fab形式在固定MST1R蛋白上表现的单价亲和力在约0.02nM和0.98nM之间，其中Fab MOR07925显示最高亲和力，紧接着是Fab MOR07923和Fab MOR07926。此外，在SET研究中，MOR X的Fab形式表现的亲和力在约0.01nM和0.27nM之间，其中Fab MOR07925显示最高亲和力，紧接着是Fab MOR07923和Fab MOR07924。
本文描述的抗体的另一个特征是它们对MST1R N末端区内的区域的特异性。例如，本文公开的MOR X可特异性结合MST1R N末端区。
本文描述的抗体结合的表位的类型可以是线性的(例如一条连续的氨基酸序列)或构象的(例如多条氨基酸序列)。为了测定特定抗体的表位是线性的还是构象的，本领域技术人员可分析抗体与涵盖MST1R不同结构域的重叠肽(例如具有11个氨基酸重叠的13聚体肽)的结合。ELISA分析利用具有SEQ ID NO：17氨基酸序列的重组MST1R部分肽进行。由于MOR X不适用于免疫印迹分析以便检测相同重组MST1R蛋白质的变性形式，因此MOR X必须具有SEQ IDNO：17氨基酸残基内的构象表位。
本文公开的抗体与人和至少一种其他物种发生物种交叉反应，所述其他物种可以是例如猴或小鼠。为了在多种物种中用相同的抗体进行体内研究，与至少猕猴发生交叉反应的抗体例如可提供比已知抗靶MST1R抗体更大的灵活性和益处。
在一个实施方案中，描述的抗体不仅能够结合MST1R，而且能够抑制MST1R的活化。受体的抑制导致阻抑受体内在的激酶活性和下调信号转导。这种下调可例如通过限制配体结合MST1R、改变MST1R的构象或使MST1R内化而发生。更具体而言，本文公开的抗体可借助抗体-效应子功能通过MST1R介导其治疗效果。
又一个实施方案涉及通过本文描述的抗体抑制MST1R的依赖配体的MST1R磷酸化活性。在MSP-依赖的MST1R信号转导测定系统(例如“Elk1荧光素酶测定”)中，公开的抗体IC50值为至少100ng/ml、至少50ng/ml、至少20ng/ml、至少10ng/ml或至少5ng/ml。
本文描述的另一种抗体也抑制不依赖配体的MST1R活化。
本文公开的又一种抗体也抑制响应于MST1R配体MSP的ERK磷酸化。
本文描述的再一种抗体也阻抑表达MST1R的肿瘤细胞的MSP促进的增殖。
(肽变体)
贯穿本公开描述的抗体不限于本文提供的特定多肽序列。当然也包括这些多肽的变体。参照本公开和常规可用技术和文献，本领域技术人员能够制备、测试和利用本文公开的抗体的功能性变体，同时理解具有阻抑依赖和不依赖配体的MST1R的活化之一/二者的能力的这些变体落在本发明的范围内。
变体包括例如与本文公开的肽序列相比具有至少一个改变的互补性决定区(CDR)(高变)和/或框架(FR)(可变)域/位置的抗体。为了更好的阐述该概念，下面简述抗体的结构。
抗体由两条肽链组成，每条肽链包含一个(轻链)或三个(重链)恒定域和一个可变区(VL，VH)，后者在所有情况下由四个FR区和三个间插的CDR组成。抗原结合位点由一个或多个CDR形成，但是FR区为CDR提供结构框架并因此在抗原结合中起重要作用。通过改变CDR或FR区中的一个或多个氨基酸残基，本领域技术人员常规可产生突变的或多样化的抗体序列，可针对抗原筛选这些抗体序列以例如得到新的或改进的性质。
图1(VH)和图2(VL)描绘出本文公开的特定抗体的CDR区和FR区(根据Kabat定义)，并相互比较和与相应的HuCAL“主导基因”序列(如美国专利第6,300,064号所述)比较给定位置的氨基酸：
本领域技术人员可利用图1和图2中的数据来设计本文公开的实施方案范围内的肽变体。在一个实施方案中，通过改变一个或多个CDR区中的氨基酸构建变体；变体也可有一个或多个改变的框架区。参照新抗体的相互比较，可改变的候选残基包括MOR X的可变轻链残基和可变重链残基。也可在框架区中作出改变。例如，可改变肽FR域，其中相比种系序列残基中存在差异。
参照新抗体与相应的共有序列或“主导基因”序列的比较，可改变的候选残基包括MOR X的可变轻链残基(例如VLλ3残基)和MOR X的可变重链残基(例如VH3残基)。本领域技术人员可通过将本文公开的氨基酸序列与这种抗体相同类的已知序列进行比较来作出相同的分析，例如使用Knappik等(J.Mol.Biol.296，57-86，2000)和授予Knappik等的美国专利第6,300,064号中描述的步骤。
此外，可通过使用一个MOR X作为优化起点、通过使MOR X序列中一个或多个氨基酸残基(优选一个或多个CDR中的氨基酸残基)多样化和通过针对具有改进性质的变体筛选所得抗体变体的集合来获得变体。VL CDR-3、VH CDR-3、VL CDR-1和/或VH CDR-2中的一个或多个氨基酸残基的多样化可通过使用三核苷酸诱变(TRIM)技术合成DNA分子的集合来完成(
Figure BPA00001446698500141
B.，Ge，L.，Plückthun，A.，Schneider，K.C.，Wellnhofer，G.，和Moroney S.E.(1994)“Trinucleotidephosphoramidites：ideal reagents for the synthesis of mixedoligonucleotides for random mutagenesis.”Nucl.Acids Res.22，5600.)。
(保守氨基酸变体)
可制备保留本文描述的抗体肽序列的总体分子结构的多肽变体。鉴于单个氨基酸的性质，一些合理的置换将为本领域技术人员所识别。可例如基于所涉及残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性的相似性作出氨基酸置换，即“保守置换”。
例如，(a)非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；(b)极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；(c)带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；和(d)带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。置换通常在(a)-(d)组内部作出。此外，甘氨酸和脯氨酸可基于它们破坏α螺旋的能力而相互置换。类似地，某些氨基酸如丙氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸和赖氨酸更常见于α螺旋中，而缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和苏氨酸更常见于β折叠片中。甘氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺和脯氨酸常见于转角中。一些优选的置换可在以下组中作出：(i)S和T；(ii)P和G；和(iii)A、V、L和I。鉴于已知的遗传密码以及重组DNA技术和合成DNA技术，本领域技术人员可容易地构建编码保守氨基酸变体的DNA。
如本文所用，两条多肽之间的“序列同一性”指两条序列间相同的氨基酸百分比。“序列同源性”是指相同或代表保守氨基酸置换的氨基酸百分比。本发明的多肽序列在CDR区中的序列同一性为至少60％、至少70％或80％、至少90％或至少95％。此外，包括的抗体在CDR区中的序列同源性为至少80％、至少90％或至少95％。
(DNA分子)
本公开也涉及编码本文描述的抗体的DNA分子。这些序列包括但不限于图3A、3B和4A-4F中所示的那些DNA分子。
本公开的DNA分子不限于本文公开的序列，而且包括其变体。可参照它们在杂交中的物理性质描述不同实施方案中的DNA变体。本领域技术人员将认识到，DNA可用来利用核苷酸杂交技术鉴定其互补序列和(由于DNA是双链的)其等价物或同源物。也将认识到，杂交可伴随小于100％的互补性发生。然而，鉴于条件的适当选择，杂交技术可用来基于它们与特定探针的结构相关程度区分DNA序列。对于与这样的条件有关的指导，参见Sambrook等，1989(Sambrook，J.，E.F.Fritsch和T.Maniatis(1989)Molecular Cloning：Alaboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，USA)和Ausubel等，1995(Ausubel，F.M.，R.Brent，R.E.Kingston，D.D.Moore，J.G.Sedman，J.A.Smith和K.Struhl.主编.(1995).Current Protocols in Molecular Biology.New York：John Wileyand Sons)。
两条多核苷酸序列之间的结构相似性可表示为条件“严格性”的函数：在该条件下，两条序列将相互杂交。本文所用术语“严格性”是指条件不利于杂交的程度。严格条件强烈不利于杂交，在这种条件下仅结构上最相关的分子将相互杂交。相反，不严格条件利于表现出较低结构相关程度的分子杂交。因此，杂交严格性与两条核酸序列的结构关系直接相关。以下关系可用于将杂交和相关程度关联(其中Tm是核酸双链体的解链温度)：
a.Tm＝69.3+0.41(G+C)％
b.双链体DNA的Tm随错配碱基对数每增加1％而降低1℃。
c.(Tm)μ2-(Tm)μ1＝18.5log10μ2/μl
其中μ1和μ2是两种溶液的离子强度。
杂交严格性是包括总DNA浓度、离子强度、温度、探针大小和破坏氢键形成的试剂的存在情况在内的多种因素的函数。促进杂交的因素包括高DNA浓度、高离子强度、低温、较长探针大小和不存在破坏氢键形成的试剂。杂交通常在两个阶段中进行：“结合”阶段和“洗涤”阶段。
首先，在结合阶段中，探针在有利于杂交的条件下与靶标结合。在该阶段通常通过改变温度控制严格性。对于高度严格性，除非使用短(＜20nt)寡核苷酸探针，温度一般在65℃-70℃。代表性杂交溶液包含6X SSC、0.5％SDS、5X Denhardt杂交溶液和100μg非特异性载体DNA。参见Ausubel等，第2.9节，附录27(1994)。当然，许多不同但功能等价的缓冲条件是已知的。当相关程度较低时，可选择较低的温度。低严格性结合温度是在约25℃-40℃之间。中等严格性是在至少约40℃到小于约65℃之间。高度严格性为至少约65℃。
其次，过量的探针通过洗涤除去。通常在这个阶段施用更严格的条件。因此，该“洗涤”阶段在通过杂交测定相关程度中是最重要的。洗涤溶液通常包含较低的盐浓度。一种例示性中等严格溶液包含2X SSC和0.1％SDS。高度严格洗涤溶液包含小于约0.2X SSC的当量(在离子强度中)，其中优选的严格溶液包含约0.1X SCC。不同严格性相关的温度与上文对“结合”所述一样。在洗涤过程中，洗涤溶液通常还更换多次。例如，典型的高度严格洗涤条件包括在55℃洗涤30分钟2次和在60℃洗涤15分钟3次。
因此，本公开包括在高度严格结合和洗涤条件下与图3A、3B和4A-4F所示分子杂交的核酸分子，其中这样的核酸分子编码具有本文所述性质的抗体或其功能性片段。包括的分子(从mRNA角度看)是与本文描述的DNA分子之一具有至少75％或80％(优选至少85％、更优选至少90％和最优选至少95％)的同源性或序列同一性的分子。在本公开变体的一个具体实例中，SEQ ID NO：18或20中核酸位置7可从C置换成G，因此将密码子从CAA变成GAA。
(功能等价变体)
本发明范围内的又一类DNA变体可参照它们编码的产物(图3C、3D和4G-4L中列出的肽)描述。这些功能等价基因通过它们由于遗传密码的简并性而编码图3C、3D和4G-4L中相同的肽序列的事实表征。图3C的氨基酸序列也如SEQ ID NO：19所示。图3D的氨基酸序列也如SEQ ID NO：21所示。图4G的氨基酸序列也如SEQID NO：23所示。图4H的氨基酸序列也如SEQ ID NO：25所示。图4I的氨基酸序列也如SEQ ID NO：27所示。图4J的氨基酸序列也如SEQ ID NO：29所示。图4K的氨基酸序列也如SEQ ID NO：31所示。图4L的氨基酸序列也如SEQ ID NO：33所示。
应当认识到，本文提供的DNA分子变体可以若干不同方式构建。例如，它们可构建为完全合成DNA。有效合成20-约150个核苷酸的寡核苷酸的方法广泛可用。参见Ausubel等，第2.11节，附录21(1993)。重叠寡核苷酸可以首先由Khorana等，J.Mol.Biol.72：209 217(1971)报道的方式合成和装配；亦参见Ausubel等，同上，第8.2节。合成DNA优选设计为具有在基因的5’端和3’端工程改造的合宜限制位点，以助于克隆到合适的载体中。
如示，产生变体的方法是用本文公开的DNA之一开始，然后进行位点定向诱变。参见Ausubel等，同上，第8章，附录37(1997)。在一个典型的方法中，将靶DNA克隆到单链DNA噬菌体载体中。分离单链DNA，并与包含所需核苷酸改变的寡核苷酸杂交。合成互补链，并将双链噬菌体导入宿主中。一些所得后代包含所需突变体，这可通过DNA测序证实。此外，增加噬菌体后代是所需突变体概率的多种方法是可用的。这些方法是本领域技术人员所熟知的，产生这种突变体的试剂盒在商业上是可获得的。
(重组DNA构建体和表达)
本公开还提供包含一个或多个本文所述核苷酸序列的重组DNA构建体。这些重组构建体用于与载体例如质粒、噬菌粒、噬菌体或病毒载体连接，编码任何公开抗体的DNA分子被插入到所述载体中。
编码基因可通过Sambrook等，1989和Ausubel等，1989中描述的技术产生。备选地，DNA序列可使用例如合成器化学合成。例如参见Oligonucleotide Synthesis(1984，Gait，主编，IRL Press，Oxford)中描述的技术，通过引用以其整体结合到本文中。本公开的重组构建体包含能够表达编码DNA的RNA和/或蛋白质产物的表达载体。载体可进一步包含调节序列，其包括与开放阅读框(ORF)有效连接的启动子。载体可进一步包含选择性标记序列。特定起始信号和细菌分泌信号对于插入靶基因编码序列的有效翻译也可能是需要的。
本公开进一步提供包含至少一种本文所述DNA的宿主细胞。宿主细胞本质上可以是表达载体可用的任何细胞。它可为例如高级真核宿主细胞(如哺乳动物细胞)、低级真核宿主细胞(如酵母细胞)，且可为原核细胞(如细菌细胞)。将重组构建体导入宿主细胞可通过磷酸钙转染、脂质转染、DEAE、葡聚糖介导转染、电穿孔或噬菌体感染实现。
(细菌表达)
用于细菌用途的有用表达载体通过以可操作的阅读状态将编码所需蛋白质的结构DNA序列连同合适的翻译起始和终止信号与功能性启动子一起插入来构建。载体包含一个或多个表型选择性标记和复制起点，以确保维持载体和需要时在宿主内提供扩增。用于转化合适的原核宿主包括大肠杆菌、枯草杆菌、鼠伤寒沙门氏菌以及假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属内的各种物种。
细菌载体可例如基于噬菌体、质粒或噬菌粒。这些载体包含选择性标记和来源于市售质粒的细菌复制起点，市售质粒通常包含熟知的克隆载体pBR322(ATCC登录号37017)的元件。在转化合适的宿主菌株和宿主菌株生长到适当的细胞密度后，所选启动子通过合适的方法(例如温度变动或化学诱导)去阻抑/诱导，并培养细胞另外一段时间。细胞通常通过离心收获、通过物理或化学方法裂解，并保留所得粗提取物以进一步纯化。
在细菌系统中，可取决于被表达蛋白质的预期用途而有利地选择大量表达载体。例如当为了产生抗体或筛选肽文库生产大量的这样的蛋白时，指导易于纯化的融合蛋白产物高水平表达的载体可能是合乎需要的。
(治疗方法)
治疗方法包括将治疗有效量的本公开预期的抗体给予需要治疗的受试者。“治疗有效”量在本文中定义为足以排除受试者治疗区域中的MST1R阳性细胞的抗体量-作为单剂量或根据多剂量方案，单独或与其他试剂联合使用，其导致有害状态的减轻，但该量是毒理学上可耐受的。受试者可以是人或者非人动物(例如兔、大鼠、小鼠、猴或其他低级灵长类动物)。
本公开的抗体可与已知药物共同给予，且在一些情况下抗体自身可被修饰。例如抗体可与免疫毒素缀合或可为放射性标记抗体，以潜在进一步增加功效。
本文描述的抗体能够在多种情形下作为治疗或诊断工具，在所述情形中，MST1R不合乎需要地表达或存在。特别适合使用本公开的抗体治疗的疾病和病症是表达MST1R的恶性肿瘤和增生，例如乳腺、肺、结肠、膀胱、皮肤、胰腺、神经胶质瘤、淋巴瘤、前列腺、甲状腺、卵巢、胃(gastric)、肝、胃(stomach)等。
为了治疗任何前述病症，用于本公开用途的药物组合物可以常规方式使用一种或多种生理学上可接受的载体或赋形剂配制。本文描述的任何抗体可通过任何合适的方法给予，其可视待治疗病症的类型而不同。可能的给药途径包括胃肠外(例如肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下)、肺内和鼻内，以及在需要时用于局部免疫阻抑治疗的病灶内给药。此外，任何公开抗体可通过脉冲输注(pulseinfusion)以例如减少的抗体剂量给予。给药可通过注射给予，例如静脉内或皮下注射，部分地取决于给予是短暂的还是慢性的。给予的量取决于多种因素，例如临床症状、个体的体重、是否给予其他药物。本领域技术人员将认识到给药途径视待治疗病症或疾病而不同，并应理解哪个途径基于各个体的具体因素对于个体最合适。
根据本发明，确定新多肽的治疗有效量主要取决于特定患者特征、给药途径和待治疗病症的性质。一般性指导可参见例如International Conference on Harmonisation的出版物和Remington’sPharmaceutical Sciences，第27和28章，第484-528页(第18版，Alfonso R.Gennaro，ED.，Easton，PA.：Mack Pub.Co.，1990)。更具体而言，确定治疗有效量取决于诸如药物的毒性和功效等因素。毒性可使用本领域公知和前述参考文献中存在的方法测定。功效可利用相同指导连同下文实施例中描述的方法测定。
(诊断方法)
MST1R在某些恶性肿瘤的癌细胞上高表达；因此，可使用本公开的抗MST1R抗体，以便反映或可视化患者中可能MST1R的位点或部位。在这点上，抗体可通过使用放射性同位素、亲和标记(例如生物素、抗生物素蛋白等)、荧光标记、顺磁性原子等可检测地标记。用于完成这种标记的步骤是本领域熟知的。抗体在诊断成像中的临床应用的综述见于Grossman，H.B.，Urol.Clin.North Amer.13：465-474(1986))，Unger，E.C.等，Invest.Radiol.20：693-700(1985))和Khaw，B.A.等，Science 209：295-297(1980))。
这种可检测地标记的抗体的集中检测可指示例如MST1R。在一个实施方案中，该检查通过取出组织或血液样品并在可检测地标记的抗体存在下孵育该样品完成。在一个实施方案中，该技术通过使用磁成像、荧光自显影等以非侵入方式完成。这样的诊断试验可用于监测疾病治疗的结果，其中MST1R阳性细胞是否存在是相关指标。
(治疗及诊断组合物)
本公开的抗体可根据已知方法配制，以制备药学上有用的组合物，其中本文描述的抗体(包括其任何功能性片段)与药学上可接受的载体赋形剂混合成混合物。合适的赋形剂及其配制例如参见REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES(第18版，Alfonso R.Gennaro，ED.，Easton，PA.：Mack Pub.Co.，1990)。为了形成适合有效给药的药学上可接受的组合物，这种组合物将包含有效量的本公开的一种或多种抗体，连同合适量的载体赋形剂。
可合适地配制制剂，以得到活性化合物的控释。控释制剂可通过使用聚合物复合或吸附抗MST1R抗体来实现。受控递送可通过选择合适的高分子(例如聚酯、聚氨基酸、聚乙烯、吡咯烷酮、乙烯醋酸乙烯酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素或鱼精蛋白、硫酸酯)和高分子的浓度以及掺入方法进行，以便控制释放。另一个通过控释制剂控制作用的持续时间的可行方法是将抗MST1R抗体掺入到聚合物材料的颗粒中，聚合物材料例如聚酯、聚氨基酸、水凝胶、聚(乳酸)或乙烯醋酸乙烯酯共聚物。备选地，代替将这些药物掺入到聚合物颗粒中，可能的是将这些材料包封在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(分别例如羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中，或包封在胶体药物递送系统(例如脂质体、清蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)中，或包封在粗乳状液中。这样的技术公开于Remington’s Pharmaceutical Sciences(1980)。
可配制化合物，以通过注射(例如通过推注或连续输注)胃肠外给予。用于注射的制剂可与添加的防腐剂呈单位剂型，例如在安剖中或在多剂量容器中。组合物可采取诸如在含油赋形剂或含水赋形剂中的混悬剂、溶液剂或乳剂等形式，且可包含配制剂，例如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。备选地，活性成分可为粉剂形式，用于在使用前利用合适的溶媒(例如无菌无热原水)溶解。
在需要时，组合物可存在于包装或分配装置中，其可包含一个或多个含活性成分的单位剂型。包装例如可包含金属或塑料箔，例如泡罩包装。包装或分配装置可附有给药说明书。而且，包装或分配装置和组合物可存在于用于商业流通的试剂盒中。
本发明的不同实施方案可参照以下指导性实施例进一步理解，实施例旨在阐述和因此不限制本发明公开的范围。
附图简述
图1提供不同新抗体可变重区的氨基酸序列，且其描绘了CDR区和框架(FR)区。将VH3序列(SEQ ID NO：80)与MOR07692、MOR07923、MOR07924、MOR07925、MOR07926可变重区序列(SEQ ID NO：19)比对，并将VH5序列(SEQ ID NO：81)与MOR07919可变重区序列(SEQ ID NO：21)比对。
图2：图2A和图2B提供不同新抗体可变轻区的氨基酸序列，且其描绘了CDR区和框架(FR)区。将VLκ3序列(VLκ3；SEQ ID NO：82)与MOR07692(SEQ ID NO：23)、MOR07923(SEQ ID NO：27)、MOR07924(SEQ ID NO：29)、MOR07925(SEQ ID NO：31)、MOR07926(SEQ ID NO：33)可变轻区序列比对，并将VLλ3序列(VL13；SEQ ID NO：83)与MOR07919可变轻区序列(SEQ ID NO：25)比对。
图3：图3A(MOR07692、MOR07923、MOR07924、MOR07925、MOR07926；SEQ ID NO：18)和图3B(MOR07919；SEQ ID NO：20)提供不同新抗体可变重区的核酸序列。图3C(MOR07692、MOR07923、MOR07924、MOR07925、MOR07926；SEQ ID NO：19)和图3D(MOR07919；SEQ ID NO：21)提供不同新抗体可变重区的氨基酸序列。CDR区H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3从N端到C端用粗体和下划线指出。
图4：图4A(MOR07692；SEQ ID NO：22)、图4B(MOR07919；SEQ ID NO：24)、图4C(MOR07923；SEQ ID NO：26)、图4D(MOR07924；SEQ ID NO：28)、图4E(MOR07925；SEQID NO：30)和图4F(MOR07926；SEQ ID NO：32)提供不同新抗体可变轻区的核酸序列。图4G(MOR07692；SEQ ID NO：23)、图4H(MOR07919；SEQ ID NO：25)、图4I(MOR07923；SEQ ID NO：27)、图4J(MOR07924；SEQ ID NO：29)、图4K(MOR07925；SEQID NO：31)和图4L(MOR07926；SEQ ID NO：33)提供不同新抗体可变轻区的氨基酸序列。CDR区L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3从N端到C端用粗体和下划线指出。
图5提供不同的基于共有序列的人类组合抗体文库(HuCAL
Figure BPA00001446698500231
)抗体主导基因序列的可变重区的氨基酸序列。CDR区H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3从N端到C端用下划线指出。上一行是MOR07919(SEQ ID NO：21)，而下一行是MOR07692/7923/7924/7925/7926(SEQ ID NO：19)。
图6提供不同的基于共有序列的HuCAL抗体主导基因序列的可变轻区的氨基酸序列。CDR区L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3从N端到C端用下划线指出。两套排列从上到下分别如下：MOR07919(SEQ ID NO：25)；MOR07692(SEQ ID NO：23)；MOR07923(SEQ IDNO：27)；MOR07924(SEQ ID NO：29)；MOR07925(SEQ ID NO：31)；MOR07926(SEQ ID NO：33)。
图7：图7A和图7B提供从pMORPH
Figure BPA00001446698500241
2_h_IgG1f表达的不同新抗体重链(分别是图7A：MOR07919；图7B：MOR07692、MOR07923、MOR07924、MOR07925和MOR07926)的核酸和氨基酸序列。CDR区为粗体加下划线。VH前导区和重链恒定区的氨基酸序列分别以斜体或者斜体加粗指出。限制位点和测序引物的引导位点在序列的上面或下面指出。图7A的核酸序列通过SEQ ID NO：64表示，而氨基酸序列是SEQ ID NO：65。图7B的核酸序列通过SEQID NO：66表示，而氨基酸序列是SEQ ID NO：67。
图8提供从pMORPH
Figure BPA00001446698500242
2_h_Ig_λ2表达的新抗体λ轻链(MOR07919)的核酸序列(SEQ ID NO：68)和氨基酸序列(SEQ ID NO：69)。CDR区为粗体加下划线。VL前导区和λ轻链恒定区的氨基酸序列分别以斜体或者斜体加粗指出。限制位点和测序引物的引导位点在序列的上面或下面指出。
图9：图9A-图9E提供从pMORPH
Figure BPA00001446698500243
2_h_Ig_κ表达的不同新抗体κ轻链的核酸和氨基酸序列。CDR区为粗体加下划线。VL前导区和κ轻链恒定区的氨基酸序列分别以斜体或者斜体加粗指出。限制位点和测序引物的引导位点(priming site)在序列的上面或下面指出。图9A的核酸序列通过SEQ ID NO：70表示，而氨基酸序列是SEQID NO：71(MOR07692)。图9B的核酸序列通过SEQ ID NO：72表示，而氨基酸序列是SEQ ID NO：73(MOR07923)。图9C的核酸序列通过SEQ ID NO：74表示，而氨基酸序列是SEQ ID NO：75(MOR07924)。图9D的核酸序列通过SEQ ID NO：76表示，而氨基酸序列是SEQ ID NO：77(MOR07925)。图9E的核酸序列通过SEQID NO：78表示，而氨基酸序列是SEQ ID NO：79(MOR07926)。
图10提供证明分离抗体(MorphoSys IgG1-2μg/ml)与MST1R直向同源物的交叉反应性的FACS分析。
图11显示与PBS对照相比，MOR07692、MOR07919、MOR07923、MOR07924、MOR07925和MOR07926与人MST1R的25-571部分的结合活性。使用n＝3的t检验分析，p值如下：MOR07692：4.56E-07；MOR07919：1.43E-05；MOR07923：2.10E-05；MOR07924：1.42E-06；MOR07925：9.74E-07；以及MOR07926：1.53E-06。
图12显示不存在配体时抑制性ElK1反式报道基因活性。使用t检验分析和5μg/ml的抗体浓度，p值如下：MOR07692：5.39E-06；MOR07919：3.19E-04；和MOR07925：3.78E-05。
图13显示与hIgG对照相比，在不同时间点(分钟)、在带有570nm参照的450nm吸光度下，通过MOR07692对200ng/ml MSP诱导磷酸化的抑制。在5分钟时间点时，p值是5.43E-05，而在15分钟时间点时，p值是4.76E-06。
图14是蛋白质印迹，其阐明在1μg/ml交联抗体存在或不存在下相比无抗体和hIgG对照，通过1μg/ml MOR07692对100ng/mlMSP诱导的ERK磷酸化的抑制。
图15显示存在或不存在100ng/ml MSP时特定抗体或者无抗体的对照对MSP诱导的细胞增殖(％)的抑制活性。对于不同抗体，p值如下：MOR07692：0.0001；MOR07919：0.2037；MOR07923：0.0106；MOR07924：0.0203；MOR07925：0.0042；和MOR07926：0.0044。
图16显示通过所示抗MST1R抗体对MSP诱导迁移的抑制。
图17显示所示抗MST1R抗体诱导内化的潜能。
实施例
(细胞培养和瞬时转染)
将人胚肾(HEK)293FreeStyleTM细胞在Freestyle 293 Medium(Invitrogen)中培养。293α是通过将整联蛋白αv和整联蛋白β3表达载体转染到HEK293细胞中得到的稳定转染子。将HEK293和293α细胞在含10％FCS的DMEM中繁殖。将PC3和T47D在含10％FCS的RPMI中培养。为了淘选、筛选和功能测定，使用293fectin(Invitrogen)将质粒DNA转染HEK 293FreeStyleTM细胞。根据供应商说明书使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)将质粒DNA转染293T和293α细胞。
(流式细胞术(“FACS”))
在圆底96孔培养板(Corning)，将细胞(5×105细胞/孔)与所示浓度的Fab或IgG抗体在50μl FACS缓冲液(PBS，5％FCS)中于4℃孵育60分钟。将细胞洗涤两次，然后与异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的检测抗体在4℃孵育30分钟。将细胞再次洗涤，重悬在0.3ml FACS缓冲液中，然后在Cytomics FC500(Beckman Coulter，Inc.)中通过流式细胞术分析。数据通过FlowJo软件(Tomy digital biology Co.，Ltd.)分析。多克隆山羊抗hMSP R IgG(R&D systems)或抗FLAG M2抗体(Sigma)用作阳性对照，MOR03207(抗溶菌酶)抗体用作阴性对照。
(表面等离振子共振)
动力学常数kon和koff是使用BIAcore 3000仪器(Biacore)对与共价固定的MST1R-Fc融合蛋白(R&D systems)结合的各Fab的系列稀释物测定。对于共价抗原固定，使用标准EDC-NHS胺偶联化学。对于MST1R-Fc融合蛋白的直接偶联，在10mM醋酸缓冲液，pH 4.5中对CM5传感器芯片(Biacore)包被约600-700RU。对于参照流动细胞，使用各自量的HSA(人血清清蛋白)。动力学测量在20μl/分钟流速的PBS(136mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.76mMKH2PO4 pH 7.4)中使用15.6-500nM的Fab浓度完成。各浓度的注射时间是1分钟，之后是3分钟的解离期。使用5μl 10mM HCl再生。所有传感图使用BIA评价软件3.2(Biacore)全局拟合。
(溶液平衡滴定(SET))
溶液中的亲和力测定基本上按照文献(Friguet，B.，Chaffotte，A.F.，Djavadi-Ohaniance，L.，和Goldberg，M.E.(1985)J Immunol Methods 77，305-319.)所述进行。为了提高SET方法的灵敏度和准确性，将方法从经典ELISA修改成基于ECL的技术(Haenel，C.，Satzger，M.，Ducata，D.D.，Ostendorp，R.，和Brocks，B.(2005)Anal Biochem 339，182-184)。
实施例1
(从HuCAL文库产生抗体)
为了产生针对MST1R的治疗抗体，使用MorphoSys HuCALGOLD噬菌体展示文库进行选择。HuCAL GOLD
Figure BPA00001446698500271
是基于HuCAL
Figure BPA00001446698500272
概念的Fab文库(Knappik等(J.Mol.Biol.，296，57-86，.2000)；Krebs等，J.Immunol.Methods，254，67-84，2001；Rothe等，J.Mol.Biol.，376(4)：1182-200，2008)，其中将所有六个CDR多样化，且其使用CysDisplayTM技术将Fab片段与噬菌体表面连接(WO 01/05950)。
(A.噬菌粒拯救、噬菌体扩增和纯化)
将HuCAL GOLD
Figure BPA00001446698500273
噬菌粒文库在包含34μg/ml氯霉素和1％葡萄糖的2x YT培养基(2x YT-CG)中扩增。在0.5的OD600nm(在37℃不振荡30分钟；在37℃以250rpm振荡30分钟)时辅助噬菌体感染(VCSM13)后，将细胞旋下(4120g；5分钟；4℃)，重悬到2x YT/34μg/ml氯霉素/50μg/ml卡那霉素/0.25mM IPTG中并在22℃培养过夜。将噬菌体从上清液中通过PEG沉淀，重悬到PBS/20％甘油中并贮存在-80℃。在两轮淘选之间的噬菌体扩增如下进行：用洗脱的噬菌体感染对数中期的TG1细胞，并接种到补充有1％葡萄糖和34μg/ml氯霉素的LB琼脂(LB-CG)上。在30℃孵育过夜后，刮下菌落并用于接种2xYT-CG直到OD600nm达到0.5，加入VCSM13辅助噬菌体用于上文所述感染。
Figure BPA00001446698500274
为了选择，将HuCAL GOLD
Figure BPA00001446698500275
抗体-噬菌体分成六个包含不同组合的VH主导基因的库(库1：VH1/3/5κ，库2：VH1/3/5λ，库3：VH2/4/6κ，库4：VH2/4/6λ，库5：VH1-6κ，库6：VH1-6λ)。这些库分别接受在MST1R表达载体转染的HEK 293FreeStyleTM细胞上的3轮全细胞淘选，随后pH洗脱和在MST1R阴性HEK 293FreeStyleTM细胞上的后吸附步骤，以排除不相关的抗体-噬菌体。最后，将残留抗体噬菌体用于感染大肠杆菌TG1细胞，然后将TG1细胞接种到琼脂板上并在30℃孵育过夜。第二天，将细菌菌落从平板上刮下，按照上文所述拯救和扩增噬菌体。第二轮和第三轮选择按照第一轮进行。除了标准淘选外，应用LCDR3-RapMAT
Figure BPA00001446698500281
技术以潜在鉴定具有较高亲和力的克隆。RapMAT代表分子内亲和力成熟方法，用于快速选择高亲和力抗体。该技术基于HuCAL GOLD
Figure BPA00001446698500283
Fab文库的标准设计。对于RapMAT
Figure BPA00001446698500284
方法，用λ和κ文库各自的库进行两轮标准淘选。所选第二轮Fab库通过与LCDR3文库盒交换LCDR3多样化。所得Fab文库在严格条件下接受两轮进一步的淘选。
(C.可溶性Fab片段的亚克隆和表达)
将编码所选HuCAL GOLD
Figure BPA00001446698500285
噬菌粒插入的Fab亚克隆到表达载体pMORPH
Figure BPA00001446698500286
x9_Fab_FS(Rauchenberger等，J.Biol.Chem.278(40)：38194-205，2003)中，以利于快速表达可溶性Fab。为此目的，将编码所选克隆插入(ompA-VLCL和phoA-Fd)的Fab用XbaI和EcoRI从质粒DNA上切下，并克隆到用XbaI/EcoR切割的载体pMORPH
Figure BPA00001446698500287
x9_FS中。在该载体中表达的Fab携带两个用于检测和纯化的C端标签(FLAGTM和Strep-tag
Figure BPA00001446698500288
II)。
Figure BPA00001446698500289
由pMORPHx9_Fab_FS编码的Fab片段在大肠杆菌TG-1细胞中的表达在摇瓶培养物中使用750ml补充有34μg/ml氯霉素的2xYT培养基进行。在30℃振荡培养物直到OD600nm达到0.5。通过加入0.75mM的IPTG在30℃诱导表达20小时。通过离心收获细胞，并使用30-35ml BBS制备周质部分。借助Strep-tag
Figure BPA000014466985002811
II使用Step-Tactin琼脂糖凝胶柱纯化Fab。样品的纯度通过变性、还原状态的SDS-PAGE和通过天然状态下的大小排阻层析(SEC)与校正标准品一起分析。蛋白浓度通过UV-分光光度法测定(Krebs等，J.Immunol.Methods 254，67-84，2001)。
实施例2
(HuCAL
Figure BPA00001446698500291
IgG1的克隆、表达及纯化)
为了表达全长IgG1，将重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)片段从Fab表达载体亚克隆到pMORPH
Figure BPA00001446698500292
2_hIg载体中。限制酶MfeI和BlpI用于VH片段的亚克隆。限制酶EcoRV和BsiWI或HpaI分别用于VLκ或VLλ片段的亚克隆。消化后，将VH和VL片段从制备的琼脂凝胶中分离，并连接到各自的IgG表达载体中(VH片段连接到pMORPH
Figure BPA00001446698500293
2_h_IgG1f中；Vκ片段连接到pMORPH
Figure BPA00001446698500294
2_h_Igκ中；Vλ片段连接到pMORPH
Figure BPA00001446698500295
2_h_Igλ2中)。所得IgG表达质粒通过限制性分析和测序表征。全长人IgG的瞬时表达在HKB11细胞中进行，利用IgG重链和轻链表达载体转染HKB11细胞。将IgG从细胞培养物上清液中通过借助Protein A Sepharose柱的亲和层析纯化。进一步的下游处理包括通过纯化IgG的凝胶过滤和无菌过滤进行缓冲液交换。质量控制揭示通过还原性SDS-PAGE测定的纯度＞90％，且通过分析性大小排阻层析测定单体IgG＞90％。
实施例3
(HuCAL
Figure BPA00001446698500296
Fab克隆和HuCAL
Figure BPA00001446698500297
IgG1的ELISA筛选)
用在PBS中稀释的0.5μg/ml重组MST1R-Fc融合蛋白包被384孔MaxiSorpTM微量滴定板的孔。将板在4℃孵育过夜。第二天，用PBST(0.05％Tween20在PBS中)洗涤孔3次，然后用MPBST(5％奶粉在PBST中)室温下在微量滴定板摇床上封闭30分钟。在加入第一抗体前用PBST洗涤孔3次，即预封闭HuCAL
Figure BPA00001446698500298
Fab克隆的BEL提取物或者纯化的HuCAL
Figure BPA00001446698500299
抗体和对照抗体。将板在室温下在微量滴定板摇床上孵育2小时，然后用PBST洗涤3次。为了检测HuCAL
Figure BPA00001446698500301
抗体，加入山羊抗人IgG碱性磷酸酶(Dianova，用PBST中0.5％奶粉以1∶5000稀释)，并将板在室温下在微量滴定板摇床上孵育1小时。随后用TBST(0.05％Tween20在TBS中)洗涤板5次。加入Attophos(AttoPhos Substrate Set，Roche)(在TBS中以1∶10稀释)，并在TECAN微量滴定板读数器(发射：535nm，激发：430nm)上测量荧光。
实施例4
(通过FACS进行交叉反应性分析)
MST1R直向同源物表达细胞的FACS分析：构建包含N端Flag标签(pFLAG-myc-CMV-19，Sigma)的人MST1R(cDNA核苷酸序列如GenBank登录号：NM_002447.2所示)、猕猴MST1R以及小鼠MST1R(cDNA核苷酸序列如GenBank登录号：NM_009074.1所示)表达载体。使用猕猴胃cDNA作为模板以及分别具有SEQ ID NO：34和35核苷酸序列的正向和反向引物，通过PCR扩增编码猕猴MST1R的cDNA。通过PCR产物的测序分析，将猕猴MST1R ORF核苷酸序列鉴定为SEQ ID NO：36所示。相应的氨基酸序列示于SEQ ID NO：37。接着使用具有SEQ ID NO：38和39(人)、40和41(猕猴)以及42和43(小鼠)核苷酸序列的各自的正向和反向引物，在合适的克隆位点扩增排除了信号肽区域的人、猕猴和小鼠MST1RORF cDNA，然后克隆到pFLAG-myc-CMV-19中。扩增的人MST1R片段编码对应于GenBank登录号：NP_002438.2(SEQ ID NO：45)的氨基酸。小鼠MST1R片段编码对应于GenBank登录号：NP_033100.1(SEQ ID NO：47)的氨基酸，除了以下位置的氨基酸差异：688(Leu变成Pro)、713(Ile变成Val)、714(Ala变成Gly)和719(Ala变成Val)。将这些表达载体转染到HEK293T细胞中。对于FACS分析，用2μg/ml第一抗体孵育细胞，接着如上所述用FITC标记的第二抗体孵育。图10中抗Flag抗体证实每种(人、猕猴和小鼠MST1R)蛋白的表达。MOR07692、MOR07923、MOR07924、MOR07925和MOR07926显示与人和猴MST1R结合。另一方面，除了人和猴MST1R之外，MOR07919还表现出与小鼠MST1R结合。
这些抗体的核苷酸序列由DNA序列分析仪确定。MOR07692、MOR07923、MOR07924、MOR07925和MOR07926的可变重链的核苷酸序列确定为如图3A和SEQ ID NO：18所示。MOR07919的可变重链的核苷酸序列显示在图3B和SEQ ID NO：20中。MOR07692、MOR07923、MOR07924、MOR07925和MOR07926的可变重链的氨基酸序列确定为如图3C和SEQ ID NO：19所示。MOR07919的可变重链的氨基酸序列显示在图3D和SEQ ID NO：21中。
MOR07692的可变轻链的核苷酸序列显示在图4A和SEQ IDNO：22中。MOR07692的可变轻链的氨基酸序列显示在图4G和SEQ ID NO：23中。MOR07919的可变轻链的核苷酸序列显示在图4B和SEQ ID NO：24中。MOR07919的可变轻链的氨基酸序列显示在图4H和SEQ ID NO：25中。MOR07923的可变轻链的核苷酸序列显示在图4C和SEQ ID NO：26中。MOR07923的可变轻链的氨基酸序列显示在图4I和SEQ ID NO：27中。MOR07924的可变轻链的核苷酸序列显示在图4D和SEQ ID NO：28中。MOR07924的可变轻链的氨基酸序列显示在图4J和SEQ ID NO：29中。MOR07925的可变轻链的核苷酸序列显示在图4E和SEQ ID NO：30中。MOR07925的可变轻链的氨基酸序列显示在图4K和SEQ ID NO：31中。MOR07926的可变轻链的核苷酸序列显示在图4F和SEQ ID NO：32中。MOR07926的可变轻链的氨基酸序列显示在图4L和SEQ ID NO：33中。
MOR07692、MOR07923、MOR07924、MOR07925和MOR07926的可变重链CDR3(H-CDR3)的氨基酸序列显示在SEQ IDNO：1中。MOR07919的可变重链CDR3(H-CDR3)的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：4中。
MOR07692、MOR07923、MOR07924、MOR07925和MOR07926的可变重链CDR2(H-CDR2)的氨基酸序列显示在SEQ IDNO：2中。MOR07919的可变重链CDR2(H-CDR2)的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：5中。
MOR07692、MOR07923、MOR07924、MOR07925和MOR07926的可变重链CDR1(H-CDR1)的氨基酸序列显示在SEQ IDNO：3中。MOR07919的可变重链CDR1(H-CDR1)的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：6中。
MOR07692的可变轻链CDR3(L-CDR3)的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：7中。MOR07919的可变轻链CDR3(L-CDR3)的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：8中。MOR07923的可变轻链CDR3(L-CDR3)的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：9中。MOR07924的可变轻链CDR3(L-CDR3)的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：10中。MOR07925的可变轻链CDR3(L-CDR3)的氨基酸序列显示在SEQ IDNO：11中。MOR07926的可变轻链CDR3(L-CDR3)的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：12中。
MOR07692、MOR07923、MOR07924、MOR07925和MOR07926的可变轻链CDR2(L-CDR2)的氨基酸序列显示在SEQ IDNO：14中。MOR07919的可变轻链CDR2(L-CDR2)的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：16中。
MOR07692、MOR07923、MOR07924、MOR07925和MOR07926的可变轻链CDR1(L-CDR1)的氨基酸序列显示在SEQ IDNO：13中。MOR07919的可变轻链CDR1(L-CDR1)的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：15中。
MOR07692的重链的核苷酸序列显示在SEQ ID NO：50中。MOR07692的重链的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：51中。MOR07692的轻链的核苷酸序列显示在SEQ ID NO：54中。MOR07692的轻链的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：55中。
MOR07923的重链的核苷酸序列显示在SEQ ID NO：50中。MOR07923的重链的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：51中。MOR07923的轻链的核苷酸序列显示在SEQ ID NO：56中。MOR07923的轻链的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：57中。
MOR07924的重链的核苷酸序列显示在SEQ ID NO：50中。MOR07924的重链的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：51中。MOR07924的轻链的核苷酸序列显示在SEQ ID NO：58中。MOR07924的轻链的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：59中。
MOR07925的重链的核苷酸序列显示在SEQ ID NO：50中。MOR07925的重链的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：51中。MOR07925的轻链的核苷酸序列显示在SEQ ID NO：60中。MOR07925的轻链的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：61中。
MOR07926的重链的核苷酸序列显示在SEQ ID NO：50中。MOR07926的重链的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：51中。MOR07926的轻链的核苷酸序列显示在SEQ ID NO：62中。MOR07926的轻链的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：63中。
MOR07919的重链的核苷酸序列显示在SEQ ID NO：48中。MOR07919的重链的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：49中。MOR07919的轻链的核苷酸序列显示在SEQ ID NO：52中。MOR07919的轻链的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：53中。
实施例5
(通过ELISA进行结合活性分析)
用在PBS中稀释的1μg/ml重组MST1R-Fc融合蛋白(含人MST1R的25-571氨基酸序列，R&D)包被96孔MaxiSorpTM微量滴定板的孔。将板在4℃孵育过夜。第二天，将孔用PBS-FCS缓冲液(5％FCS在PBS中)洗涤1次，然后用PBS-FCS缓冲液在室温封闭1小时。在除去PBS-FCS缓冲液后，向MST1R-Fc包被的孔中加入4μg/ml第一抗体，并在室温孵育1小时。在用PBS-FCS缓冲液洗涤1次后，加入第二抗体，并使其在室温孵育1小时。在用PBS-FCS缓冲液洗涤3次后，加入HRP底物(0.4mg/ml邻苯二胺二盐酸盐和0.006％过氧化氢在底物缓冲液(50mM无水柠檬酸三钠、100mM磷酸氢二钠，pH4.5)中)。黄色显现后，再加入1M HCl停止反应。在EnVision微量滴定板读数器中测量490nm吸光度。在图11中，所有获得的抗体(MOR07692、MOR07919、MOR07923、MOR07924、MOR07925和MOR07926)显示与人MST1R的25-571部分结合。各抗体可适用于非还原和非变性MST1R的免疫沉淀，但不适用于蛋白质印迹来检测还原和变性的MST1R(数据未显示)。结果显示，这些抗体识别SEQ ID NO：17中的氨基酸残基内的天然构象。
实施例6
(生物学测定)
(A.Elk1荧光素酶报道基因测定)
抗体的功能通过Elk1荧光素酶报道基因测定来测试。测定原理基于用若干载体共转染293α细胞。MST1R被整合到细胞膜中，当它过量表达或者用MSP刺激时，MST1R变成活化的(磷酸化的)以转导信号至ERK(胞外信号调节激酶)。为了测试抗体的功能，Elk1荧光素酶报道基因测定如下建立：首先我们构建pFR-Luc2CP载体。为了构建pFR-Luc2CP，将pFR-Luc载体(Stratagene)用HindIII消化，用T4DNA聚合酶处理以得到平端，并用BamHI消化以获得含5xGAL4结合元件和TATA框的约140bp片段。将pGL4.12[luc2CP](Promega)用EcoICRI/BglII消化，去磷酸化，并与上述片段连接以产生pFR-Luc2CP。然后，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染步骤将pcDNA-DEST40 MST1R、pcDNA-DEST40、pFA2-Elk1(Stratagene)、pFR-Luc2CP和pGL4.74[hRluc/TK](Promega)瞬时共转染293α细胞，并接种到96孔细胞培养板上。转染后第二天，将细胞与抗体预孵育1小时，然后将配体(人MSP)加入孔中。在6小时孵育后，制备细胞裂解物，并使用双荧光素酶报道基因测定系统(Promega)测量萤火虫荧光素酶活性(特定信号)和Renilla荧光素酶活性(用于标准化的信号)。计算萤火虫/Renilla比以标准化各孔的数据。表2显示在100ng/ml MSP配体存在下的IC50值。MOR07692、MOR07919、MOR07923、MOR07924、MOR07925和MOR07926显示低4-100ng/ml范围内的IC50值。如图12所示，MST1R通过其自身的过量表达诱导不依赖配体的MST1R活化。MOR07925、MOR07919和MOR07692也阻抑该类型的MST1R活化。
表2：Elk1荧光素酶报道基因测定的IC50值
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(B.用于检测MST1R磷酸化的ELISA)
用配体和/或抗体处理后的MST1R磷酸化状态的改变通过ELISA系统测定。PC3细胞(1x 106)在6cm直径盘中过夜孵育后，用PBS洗涤细胞并用0.1％BSA-RPMI培养基孵育。过夜孵育后，用1μg/ml MOR07692抗体在37℃处理细胞1小时，然后用200ng/ml的重组MSP(R&D systems)刺激0分钟-15分钟。制备细胞裂解物，并根据供应商说明书通过Human Phospho-MSP R/Ron ELISA系统(R&Dsystems)测量MST1R的磷酸化形式。MOR07692显示完全抑制通过加入MSP配体促进的MST1R磷酸化，如图13所示。
(C.活化ERK的蛋白质印迹)
用配体和/或抗体处理后ERK的磷酸化状态的改变通过蛋白质印迹测定。PC细胞(2x 105)在12孔板上过夜培养后，用PBS洗涤细胞，并用0.1％BSA-RPMI培养基孵育。过夜孵育后，用1μg/mlMOR07692抗体与或不与1μg/ml针对人IgG-Fc(Cappel)的山羊亲和纯化抗体在37℃处理细胞1小时。孵育后，加入100ng/ml的重组MSP(R&D systems)，并进一步孵育30分钟。然后，用含completemini(Roche)和磷酸酶抑制剂(Nakarai tesque)的RIPA缓冲液裂解细胞。通过离心除去细胞碎片以获得裂解物，并使用BCA蛋白质测定(PIERCE)来测定蛋白质浓度。将裂解物在含β-巯基乙醇的缓冲液中重悬，并在99℃变性5分钟。在5-20％凝胶上通过SDS-PAGE分离蛋白质(10μg/泳道)。将蛋白质印迹到PVDF膜(BioRad)上。将膜用Blockace(Yukijirushi)在室温封闭1小时，并与针对ERK的多克隆抗体或磷酸化ERK抗体在4℃孵育过夜。洗涤后，将膜与第二抗兔辣根过氧化物酶缀合抗体(Amersham)孵育。使用ECL加底物(GEHealthcare)在X射线胶片上将免疫反应性条带可视化。图14代表响应于配体MSP的ERK磷酸化。当存在和不存在针对人IgG-Fc的交联抗体时，通过加入MOR07692几乎完全抑制了增加。
(D.细胞增殖测定)
将重悬在含2％活性炭/葡聚糖处理的FCS(Hyclone)RPMI培养基中的T-47D细胞(5000细胞/孔)接种到96孔板。将细胞与1μg/ml抗体在37℃孵育1小时，然后用100ng/ml重组MSP刺激。在5天孵育后，根据供应商说明书通过CellTiter-Glo发光细胞生存力测定试剂盒(Promega)测量细胞ATP。如图15所示，MOR07692、MOR07923、MOR07924、MOR07925和MOR07926明显阻抑MSP促进的T-47D细胞增殖。MOR07919具有比其他抗体弱的抑制活性。
(E.迁移测定)
将重悬在含10％FCS的RPMI培养基中的BxPC-3细胞(5x104细胞/孔)接种到96孔OrisTM Cell Migration Assay板(PlatypusTechnologies，LLC.)上。在过夜培养后，从试验孔中移去塞子，并将培养基替换成2％活性炭/葡聚糖处理的FCS(Hyclone)。将细胞与10μg/ml抗体在37℃孵育1小时，然后用300ng/ml重组MSP刺激。在24小时孵育后，使用明视野显微镜(Nikon)观察迁移的细胞，然后通过Image J软件分析它们的图像以计算无细胞区域。如图16所示，MOR07919、MOR07692和MOR07925明显阻抑MSP促进的BxPC-3细胞迁移。MOR07692和MOR07925具有比MOR07919强的抑制活性。
(F.内化测定)
为了评估抗体内化的能力，使用Hum-ZAP第二缀合物(由ADVANCED TARGETING SYSTEMS提供的亲和纯化山羊抗人IgG-肥皂草毒蛋白)作为第二抗体，以引起蛋白合成抑制并最终在内化到细胞中后引起细胞死亡。将重悬在含10％FCS的RPMI培养基中的PC3细胞(2000细胞/孔)接种到96孔平亮底(clear bottom)白色培养板中。第二天，将细胞与抗体在4℃预孵育1小时。除去含抗体的培养基后，向孔中加入0.5μg/ml Hum-ZAP第二缀合物。将板在4℃孵育1小时，然后在37℃孵育3天。根据供应商说明书通过CellTiter-Glo发光细胞生存力测定试剂盒(Promega)测量细胞ATP作为细胞生存力读出。如图17所示，通过用MOR07692、MOR07919、MOR07923、MOR07924、MOR07925和MOR07926处理极大地降低了PC3细胞的生存力，表明这些抗体内化的潜能。
本文引用的所有专利、专利申请、公开的PCT申请和文章、书籍、参考文献、参考手册以及摘要的内容通过引用以其整体结合到本文中，以便更充分地描述本发明所属领域的状况。
由于可在上述主题中作出多种改变而不偏离本发明的范围和精神，意图是，包含在上述说明书或者在所附权利要求中定义的所有主题应当理解为描述和阐述本发明。根据上述教导，本发明的许多改变和变化是可能的。
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Claims (63)

1.一种分离人抗体或人源化抗体或者其功能性片段，包含对具有SEQ ID NO：17氨基酸序列的MST1R部分肽特异的抗原结合区，其中所述抗体或其功能性片段抑制依赖和/或不依赖配体的MST1R磷酸化。
2.一种分离人抗体或人源化抗体或者其功能性片段，包含对具有SEQ ID NO：17氨基酸序列的MST1R部分肽特异的抗原结合区，其中所述抗体或其功能性片段抑制依赖和不依赖配体的MST1R磷酸化。
3.一种分离人抗体或人源化抗体或者其功能性片段，包含对具有SEQ ID NO：17氨基酸序列的MST1R部分肽特异的抗原结合区，其中所述抗体或其功能性片段除了抑制ERK和/或Akt的磷酸化之外，还抑制依赖和/或不依赖配体的MST1R磷酸化。
4.一种分离人抗体或人源化抗体或者其功能性片段，包含对具有SEQ ID NO：17氨基酸序列的MST1R部分肽特异的抗原结合区，其中所述抗体或其功能性片段除了抑制ERK和/或Akt的磷酸化之外，还抑制依赖和不依赖配体的MST1R磷酸化。
5.一种分离人抗体或人源化抗体或者其功能性片段，包含对具有SEQ ID NO：17氨基酸序列的MST1R部分肽特异的抗原结合区，其中所述抗体或其功能性片段针对所述MST1R部分肽的亲和力为小于约10nM、小于约5nM、小于约1nM、小于约0.5nM或小于约0.1nM的KD，所述KD通过表面等离振子共振测定。
6.一种分离人抗体或人源化抗体或者其功能性片段，包含对具有SEQ ID NO：17氨基酸序列的MST1R部分肽特异的抗原结合区，其中所述抗体或其功能性片段针对所述MST1R部分肽的亲和力为小于约10nM、小于约5nM、小于约1nM、小于约0.5nM或小于约0.1nM的KD，所述KD通过溶液平衡滴定测定。
7.一种分离人抗体或人源化抗体或者其功能性片段，包含对具有SEQ ID NO：17氨基酸序列的MST1R部分肽特异的抗原结合区，其中所述抗体或其功能性片段阻抑表达MST1R的肿瘤细胞的MSP促进的细胞增殖。
8.一种分离人抗体或人源化抗体或者其功能性片段，包含对具有SEQ ID NO：17氨基酸序列的MST1R部分肽特异的抗原结合区，其中所述抗体或其功能性片段阻抑表达MST1R的肿瘤细胞的MSP促进的细胞迁移。
9.一种分离人抗体或人源化抗体或者其功能性片段，包含对具有SEQ ID NO：17氨基酸序列的MST1R部分肽特异的抗原结合区，其中所述抗体或其功能性片段使MST1R内化。
10.一种分离人抗体或人源化抗体或者其功能性片段，包含对具有SEQ ID NO：17氨基酸序列的MST1R部分肽特异的抗原结合区，其中所述抗体或其功能性片段与人和至少一种其他物种有交叉反应性。
11.权利要求10的分离人抗体或人源化抗体或者其功能性片段，其中所述其他物种是小鼠或猴。
12.权利要求1-11中任一项的抗体或其功能性片段的分离抗原结合区。
13.权利要求12的分离抗原结合区，其包含具有SEQ ID NO：1或4氨基酸序列的H-CDR3区。
14.权利要求13的分离抗原结合区，还包含具有SEQ ID NO：2或5氨基酸序列的H-CDR2区。
15.权利要求14的分离抗原结合区，还包含具有SEQ ID NO：3或6氨基酸序列的H-CDR1区。
16.权利要求15的分离抗原结合区，其中：(i)具有SEQ ID NO：1氨基酸序列的H-CDR3区、具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的H-CDR2区和具有SEQ ID NO：3氨基酸序列的H-CDR1区；或(ii)具有SEQ ID NO：4氨基酸序列的H-CDR3区、具有SEQ ID NO：5氨基酸序列的H-CDR2区和具有SEQ ID NO：6氨基酸序列的H-CDR1区。
17.权利要求12的分离抗原结合区，包含具有SEQ ID NO：19或21氨基酸序列的可变重链。
18.权利要求12的分离抗原结合区，包含具有选自SEQ ID NO：7、8、9、10、11和12的氨基酸序列的L-CDR3区。
19.权利要求18的分离抗原结合区，包含具有SEQ ID NO：13或15氨基酸序列的L-CDR1区。
20.权利要求19的分离抗原结合区，包含具有SEQ ID NO：14或16氨基酸序列的L-CDR2区。
21.权利要求20的分离抗原结合区，其中抗原结合区是：(i)具有SEQ ID NO：7氨基酸序列的L-CDR3区、具有SEQ ID NO：13氨基酸序列的L-CDR1区和具有SEQ ID NO：14氨基酸序列的L-CDR2区；(ii)具有SEQ ID NO：8氨基酸序列的L-CDR3区、具有SEQ IDNO：15氨基酸序列的L-CDR1区和具有SEQ ID NO：16氨基酸序列的L-CDR2区；(iii)具有SEQ ID NO：9氨基酸序列的L-CDR3区、具有SEQ ID NO：13氨基酸序列的L-CDR1区和具有SEQ ID NO：14氨基酸序列的L-CDR2区；(iv)具有SEQ ID NO：10氨基酸序列的L-CDR3区、具有SEQ ID NO：13氨基酸序列的L-CDR1区和具有SEQID NO：14氨基酸序列的L-CDR2区；(v)具有SEQ ID NO：11氨基酸序列的L-CDR3区、具有SEQ ID NO：13氨基酸序列的L-CDR1区和具有SEQ ID NO：14氨基酸序列的L-CDR2区；或(vi)具有SEQ IDNO：12氨基酸序列的L-CDR3区、具有SEQ ID NO：13氨基酸序列的L-CDR1区和具有SEQ ID NO：14氨基酸序列的L-CDR2区。
22.权利要求12的分离抗原结合区，包含具有选自SEQ ID NO：23、25、27、29、31和33的氨基酸序列的可变轻链。
23.权利要求12的分离抗原结合区，包含以下重链氨基酸序列：(i)SEQ ID NO：49或51；或(ii)在CDR区中与SEQ ID NO：49或51的CDR区具有至少80％序列同一性的序列。
24.权利要求12的分离抗原结合区，包含以下轻链氨基酸序列：(i)SEQ ID NO：53、55、57、59、61或63；或(ii)在CDR区中与SEQ ID NO：53、55、57、59、61或63的CDR区具有至少80％序列同一性的序列。
25.权利要求1-11中任一项的分离抗体，其中所述分离抗体是IgG。
26.权利要求25的分离抗体，其中所述分离抗体是IgG1。
27.权利要求1-13中任一项的分离抗体或其功能性片段，其中所述分离抗体或其功能性片段包含SEQ ID NO：19或21的可变重链。
28.权利要求1-11中任一项的分离抗体或其功能性片段，其中所述分离抗体或其功能性片段包含具有SEQ ID NO：23、25、27、29、31或33氨基酸序列的可变轻链。
29.权利要求1-11中任一项的抗体或其功能性片段，包含具有SEQ ID NO：1或4氨基酸序列的H-CDR3区。
30.权利要求29的抗体或其功能性片段，包含具有SEQ ID NO：2或5氨基酸序列的H-CDR2区。
31.权利要求30的抗体或其功能性片段，包含具有SEQ ID NO：3或6氨基酸序列的H-CDR1区。
32.权利要求1-11中任一项的分离抗体或其功能性片段，其中所述抗原结合区包含SEQ ID NO：7、8、9、10、11或12的L-CDR3区。
33.权利要求32的分离抗体或其功能性片段，其中所述抗原结合区包含SEQ ID NO：13或15的L-CDR1区。
34.权利要求33的分离抗体或其功能性片段，其中所述抗原结合区还包含SEQ ID NO：14或16的L-CDR2区。
35.权利要求1-11中任一项的分离抗体或其功能性片段，包含选自以下的重链氨基酸序列：(i)SEQ ID NO：49和51；和(ii)在CDR区中与SEQ ID NO：49和51的CDR区具有至少80％序列同一性的序列。
36.权利要求1-11中任一项的分离抗体或其功能性片段，包含选自以下的轻链氨基酸序列：(i)SEQ ID NO：53、55、57、59、61和63；和(ii)在CDR区中与SEQ ID NO：53、55、57、59、61和63的CDR区具有至少80％序列同一性的序列。
37.一种抗体，包含：具有SEQ ID NO：49氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO：53氨基酸序列的轻链。
38.一种抗体，包含：具有SEQ ID NO：51氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO：55氨基酸序列的轻链。
39.一种抗体，包含：具有SEQ ID NO：51氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO：57氨基酸序列的轻链。
40.一种抗体，包含：具有SEQ ID NO：51氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO：59氨基酸序列的轻链。
41.一种抗体，包含：具有SEQ ID NO：51氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO：61氨基酸序列的轻链。
42.一种抗体，包含：具有SEQ ID NO：51氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO：63氨基酸序列的轻链。
43.权利要求1-11中任一项的分离功能性片段，所述分离功能性片段是Fab或scFv抗体片段。
44.一种分离抗体或其功能性片段的可变重链，其由以下序列编码：(i)包含SEQ ID NO：18或20的核酸序列，或(ii)在高度严格条件下与SEQ ID NO：18或20的互补链杂交的核酸序列，其中所述抗体或其功能性片段对MST1R表位特异。
45.一种分离抗体或其功能性片段的可变轻链，其由以下序列编码：(i)包含选自SEQ ID NO：22、24、26、28、30和32的核酸序列，或(ii)在高度严格条件下与选自SEQ ID NO：22、24、26、28、30和32的互补链杂交的核酸序列，其中所述抗体或其功能性片段对MST1R表位特异。
46.一种分离核酸序列，其编码对具有SEQ ID NO：17氨基酸序列的MST1R部分肽特异的人抗体或其功能性片段的抗原结合区。
47.一种编码分离抗体或其功能性片段的可变重链的核酸序列，包含：(i)SEQ ID NO：18或20的序列，或(ii)在高度严格条件下与SEQ ID NO：18或20的互补链杂交的核酸序列，其中所述抗体或其功能性片段对具有SEQ ID NO：17氨基酸序列的MST1R部分肽特异。
48.一种编码分离抗体或其功能性片段的可变轻链的核酸序列，包含：(i)选自SEQ ID NO：22、24、26、28、30和32的序列，或(ii)在高度严格条件下与选自SEQ ID NO：22、24、26、28、30和32的互补链杂交的核酸序列，其中所述抗体或其功能性片段对具有SEQID NO：17氨基酸序列的MST1R部分肽特异。
49.一种载体，包含权利要求46-48中任一项的核酸序列。
50.一种分离细胞，包含权利要求49的载体。
51.权利要求50的分离细胞，其中所述细胞是细菌细胞。
52.权利要求50的分离细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
53.一种药物组合物，包含权利要求1-11或25-45中任一项的抗体或其功能性片段及其药学上可接受的载体或赋形剂。
54.一种用于治疗与不希望有的MST1R存在有关的病症或疾病的方法，包括将有效量的权利要求53的药物组合物给予有需要的受试者。
55.权利要求54的方法，其中所述病症或疾病由MST1R磷酸化引起。
56.权利要求55的方法，其中所述病症或疾病是恶性肿瘤和/或增生。
57.权利要求56的方法，其中所述病症或疾病是：乳腺癌、肺癌、结肠癌、膀胱癌、皮肤癌、胰腺癌、神经胶质瘤、淋巴瘤、前列腺癌、甲状腺癌、卵巢癌、胃癌、肝癌或胃癌。
58.一种用于靶向受试者或细胞样品中MST1R+细胞的方法，包括将所述MST1R+细胞与权利要求1-11或25-45中任一项的抗体或其功能性片段接触的步骤。
59.权利要求1-11或25-45中任一项的人抗体，其中所述人抗体是合成人抗体。
60.权利要求17或22-24中任一项的分离抗原结合区，其中所述序列同一性为至少80％。
61.权利要求35-42中任一项的分离抗体或其功能性片段，其中所述序列同一性为至少80％。
62.一种通过使用权利要求49的载体生产抗体的方法。
63.一种通过培养权利要求50-52中任一项的分离细胞生产抗体的方法。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2841457T3 (da) * 2012-04-27 2019-07-22 Daiichi Sankyo Co Ltd Antistof imod ROBO4
IL288784B2 (en) 2015-09-24 2023-10-01 Daiichi Sankyo Co Ltd Antibodies against GARP, nucleotides encoding them, and vectors, cells and preparations containing them, methods for their preparation and uses thereof
WO2018038684A1 (en) * 2016-08-26 2018-03-01 Agency For Science, Technology And Research Macrophage stimulating protein receptor (or ron - recepteur d' origine nantais) antibodies and uses thereof
JP2022544393A (ja) 2019-08-12 2022-10-18 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド マクロファージ刺激１受容体（ｍｓｔ１ｒ）バリアント及びその使用
US20220372125A1 (en) * 2019-10-02 2022-11-24 Aslan Pharmaceuticals Pte. Ltd. Antigen Specific Binding Domains and Antibody Molecules

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006020258A2 (en) * 2004-07-17 2006-02-23 Imclone Systems Incorporated Novel tetravalent bispecific antibody

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0859841B1 (en) 1995-08-18 2002-06-19 MorphoSys AG Protein/(poly)peptide libraries
EP1990409A3 (en) 1999-07-20 2011-05-18 MorphoSys AG Bacteriophage
WO2005120557A2 (en) * 2004-05-13 2005-12-22 Imclone Systems Incorporated Inhibition of macrophage-stimulating protein receptor (ron)
RU2007101294A (ru) * 2004-06-15 2008-07-20 Нестек С.А. (Ch) Аэрированные забеливатели и способы
CL2008003449A1 (es) * 2007-11-21 2010-02-19 Imclone Llc Anticuerpo o fragmentos del mismo contra el receptor de proteína estimulante de macrófagos/ron; composición farmacéutica que lo comprende; uso para inhibir angiogénesis, crecimiento tumoral, proliferación, migración e invasión de células tumorales, activación de ron o fosforilación de mapk y/o akt; y uso para tratar cáncer.
WO2009094148A2 (en) * 2008-01-22 2009-07-30 Biogen Idec Ma Inc. Ron antibodies and uses thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006020258A2 (en) * 2004-07-17 2006-02-23 Imclone Systems Incorporated Novel tetravalent bispecific antibody

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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JENNIFER M.O’TOOLE ET AL.: "Therapeutic Implications of a Human Neutralizing Antibody Therapeutic Implications of a Human Neutralizing Antibody Kinase (RON), a c-MET Family Member.", 《CANCER RES.》 *

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