CN102432659B - 一种23-乙酰泽泻醇b单体的分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种植物化合物单体的制备方法，属于中药活性成分的分离纯化技术领域。本发明是以泽泻（泽泻科泽泻属植物泽泻Alismaorientalis(Sam.)Juzep）的块茎为原料，通过醇提取、采用乙酸乙酯萃取、硅胶柱层析进行富集及加入乙酸乙酯后的冷却结晶得到23-乙酰泽泻醇B单体。本发明通过最适宜的工艺及参数条件，使产品中23-乙酰泽泻醇B的含量达到98%以上；整个工艺过程操作简便、工艺稳定、成本低，适合大量生产，且分离效率高、产品纯度高，即可实现大量23-乙酰泽泻醇B单体的高纯度分离制备。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物化合物单体的制备方法，具体涉及从泽泻中提取分离23-乙酰泽泻醇B单体的方法，属于中药活性成分的分离纯化技术领域。
背景技术
23-乙酰泽泻醇B又叫泽泻醇B单乙酸酯，23-O-Acetylalisol B，Alisol B 23-acetate，Alisol B 23-monoacetate，Alisol B monoacetate，分子式为C32H50O5，分子量为514.74，结构式如下：
23-乙酰泽泻醇B来源于泽泻科泽泻属植物泽泻Alisma orientalis (Sam.) Juzep的干燥块茎，是泽泻药材中的主要活性成分，具有抗高血脂、抗肝毒、抑制血管收缩功能。通过研究23-乙酰泽泻醇B逆转因P-糖蛋白在肿瘤细胞上过度表达产生的多药耐药性的活性，发现对23-乙酰泽泻醇B能够恢复多药耐药细胞株对抗癌素的敏感性，是一种潜在的MDR 逆转剂，可用于研制新型抗肿瘤药物。目前文献报道主要集中在提取方法、检测方法及药理研究上。
发明内容
本发明的目的就在于提供一种简便的快速分离制备高含量23-乙酰泽泻醇B的方法，为新药研发提供支持。该方法操作简便，分离效率高，工艺稳定，成本低廉，可实现大量23-乙酰泽泻醇B单体的高纯度分离制备，得到的23-乙酰泽泻醇B单体纯度高，可达到99%以上。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种23-乙酰泽泻醇B单体的分离纯化方法，其特征在于：以泽泻科植物泽泻的块茎为原料，通过提取、萃取、富集和结晶得到23-乙酰泽泻醇B单体，具体包括下述主要步骤：
A、提取
将干燥的泽泻块茎粉碎成粗粉，加入质量百分比浓度均为75%～95%的甲醇或乙醇溶液，其加入量按照药材重量:乙醇溶液体积=1Kg:(5～10)L计算，60～80℃提取3～4次，每次1～2小时，提取液过滤，合并过滤液，浓缩回收乙醇，得浓浸膏待进行下一步水解处理；
B、萃取
将步骤A所得的浓浸膏加水稀释至相对密度为0.8～0.9g/mL（60℃），然后加入等体积的乙酸乙酯萃取3～5次，分取上层溶液，45～60℃减压浓缩至干，所得固体物进行下一步富集处理；
C、富集
将步骤B所得固体物用甲醇或乙醇溶解完全，加入固体物3～5倍质量的硅胶拌样，经40～60℃干燥后，进行以二氯甲烷-甲醇混合液为洗脱剂的硅胶柱层析，其中硅胶为200～300目，其用量为固体物质量的20～50倍，流出液按200ml/瓶收集，进行以环己烷-乙酸乙酯1:1体积比为展开剂，5%质量体积比硅钨酸乙醇溶液为显色剂的TLC操作，完全收集经105℃加热后显示为紫红色斑点的流份，并于40～60℃的水浴减压干燥，得粉末状固体，进行进一步纯化；
所述拌样硅胶的类型优选60～80目或80～100目。
所述洗脱剂中甲醇的体积分数为5%～15%。
D、结晶
按照粉末状固体物:乙酸乙酯溶液=1g:( 6～8)ml计算，于步骤C得到的粉末状固体物中加入乙酸乙酯溶液，加热使溶解完全，过滤除去不溶性杂质，将滤液冷却结晶；根据晶体纯度情况，重结晶2～3次，直到纯度≥99%，即可得到23-乙酰泽泻醇B单体产品。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明通过萃取使23-乙酰泽泻醇B 从提取浓缩水溶液中转移至乙酸乙酯溶液中，起到提高目标物浓度的作用，同时由于乙酸乙酯易于浓缩，从而起到减少能耗的作用。经硅胶富集后通过结晶处理用最适宜的工艺及参数条件，使产品中23-乙酰泽泻醇B的含量达到99%以上；整个工艺过程操作简便、工艺稳定、成本低廉，适合工业化生产，且分离效率高、产品纯度高，即可实现大量23-乙酰泽泻醇B单体的高纯度分离制备。
附图说明
图1是本发明实施例1所得23-乙酰泽泻醇B单体产品的HPLC图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。
但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。
下述各实施例中，终产品23-乙酰泽泻醇B单体的纯度复检均采用反相分析型液相色谱（RP-HPLC）法，色谱条件如下：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈：水（73:27）为流动相；柱温30℃；流速1.0ml/min；检测波长为208 nm。
实施例1
一种23-乙酰泽泻醇B单体的分离纯化方法，以泽泻（泽泻科泽泻属植物泽泻Alisma orientalis (Sam.) Juzep）的干燥块茎为原料，通过提取、萃取、富集和结晶得到23-乙酰泽泻醇B单体，具体包括下述主要步骤：
A、提取
将干燥的泽泻药材150kg粉碎成粗粉，装入体积2m3的提取罐中，加入质量百分比浓度为75%的甲醇溶液1.05x103L，70℃提取3次，每次1.5小时，提取液过滤，合并过滤液，浓缩回收乙醇，得浓浸膏待进行下一步水解处理；
B、萃取
将步骤A所得的浓浸膏加水稀释至相对密度为0.85g/mL（约60℃测定），共得溶液0.3 x103L，加入等体积的乙酸乙酯萃取4次，使23-乙酰泽泻醇B转移至乙酸乙酯溶液中，分取上层溶液，45℃减压浓缩至干，所得固体物进行下一步富集处理；
C、富集
将步骤B所得固体物用甲醇溶解完全，加入固体物4倍质量的60～80目硅胶拌样，经50℃干燥后，进行以二氯甲烷-甲醇95:5混合液为洗脱剂的硅胶柱层析，其中200～300目新硅胶用量为固体物质量的30倍，流出液按每200ml/瓶收集，进行以环己烷-乙酸乙酯1:1为展开剂5%硅钨酸乙醇溶液为显色剂的TLC操作，完全收集经105℃加热后显示为紫红色斑点的流份，并将该部分液体用于50℃的水浴减压干燥，得粉末状固体140g，进行进一步纯化；
D、结晶
于步骤C得到的粉末状固体物中加入980ml乙酸乙酯溶液，加热使溶解完全，过滤除去不溶性杂质，将滤液冷却结晶12小时；过滤，得晶体100g；将100g晶体用700ml乙酸乙酯溶液加热复溶，自然冷却结晶12小时再过滤，得23-乙酰泽泻醇B的无色方晶86g。经HPLC检测，产品纯度为99.15%。
整个生产流程历时仅7天，能大大缩短生产周期，节约生产成本。
实施例2
一种23-乙酰泽泻醇B单体的分离纯化方法，以泽泻（泽泻科泽泻属植物泽泻Alisma orientalis (Sam.) Juzep）的干燥块茎为原料，通过提取、萃取、富集和结晶得到23-乙酰泽泻醇B单体，具体包括下述主要步骤：
A、提取
将干燥的泽泻药材500kg粉碎成粗粉，装入体积6m3的提取罐中，加入质量百分比浓度为95%的甲醇溶液5 x103L，80℃提取4次，每次2小时，提取液过滤，合并过滤液，浓缩回收乙醇，得浓浸膏0.5 x103L待进行下一步水解处理；
B、萃取
将步骤A所得的浓浸膏加水稀释至相对密度为0.8g/mL（约60℃测定），共得溶液1 x103L，加入等体积的乙酸乙酯萃取5次，使23-乙酰泽泻醇B转移至乙酸乙酯溶液中，分取上层溶液，50℃减压浓缩至干，所得固体物进行下一步富集处理；
C、富集
将步骤B所得固体物用乙醇溶解完全，加入固体物5倍质量的60～80目硅胶拌样，经60℃干燥后，进行以二氯甲烷-甲醇9：1混合液为洗脱剂的硅胶柱层析，其中200～300目新硅胶用量为固体物质量的50倍，流出液按每200ml/瓶收集，进行以环己烷-乙酸乙酯1:1为展开剂5%硅钨酸乙醇溶液为显色剂的TLC操作，完全收集经105℃加热后显示为紫红色斑点的流份，并将该部分液体用于60℃的水浴减压干燥，得粉末状固体482g，进行进一步纯化；
D、结晶
于步骤C得到的粉末状固体物中加入3856ml乙酸乙酯溶液，加热使溶解完全，过滤除去不溶性杂质，将滤液冷却结晶12小时；过滤，得晶体386g；将386g晶体用3088ml乙酸乙酯溶液加热复溶，自然冷却结晶12小时再过滤，得23-乙酰泽泻醇B的无色方晶86g。经HPLC检测，产品纯度为99.30%。
整个生产流程历时仅9天，能大大缩短生产周期，节约生产成本。
实施例3
一种23-乙酰泽泻醇B单体的分离纯化方法，以泽泻（泽泻科泽泻属植物泽泻Alisma orientalis (Sam.) Juzep）的干燥块茎为原料，通过提取、萃取、富集和结晶得到23-乙酰泽泻醇B单体，具体包括下述主要步骤：
A、提取
将干燥的泽泻药材50kg粉碎成粗粉，装入体积0.5 x103L的提取罐中，加入质量百分比浓度为85%的乙醇溶液0.25 x103L，70℃提取3次，每次1小时，提取液过滤，合并过滤液，浓缩回收乙醇，得浓浸膏待进行下一步水解处理；
B、萃取
将步骤A所得的浓浸膏加水稀释至相对密度为0.9g/mL（约60℃测定），共得溶液0.1 x103L加入等体积的乙酸乙酯萃取3次，使23-乙酰泽泻醇B转移至乙酸乙酯溶液中，分取上层溶液，40℃减压浓缩至干，所得固体物进行下一步富集处理；
C、富集
将步骤B所得固体物用甲醇溶解完全，加入固体物3倍质量的80～100目硅胶拌样，经40℃干燥后，进行以二氯甲烷-甲醇85:15混合液为洗脱剂的硅胶柱层析，其中200～300目新硅胶用量为固体物质量的20倍，流出液每200ml/瓶收集，进行以环己烷-乙酸乙酯1:1为展开剂5%硅钨酸乙醇溶液为显色剂的TLC操作，完全收集经105℃加热后显示为紫红色斑点的流份，并将该部分液体用于40℃的水浴减压干燥，得粉末状固体95g，进行进一步纯化；
D、结晶
于步骤C得到的粉末状固体物中加入570ml乙酸乙酯溶液，加热使溶解完全，过滤除去不溶性杂质，将滤液冷却结晶12小时；过滤，得晶体75g；将75g晶体用450ml乙酸乙酯溶液加热复溶，自然冷却结晶12小时再过滤，得23-乙酰泽泻醇B的无色方晶86g。经HPLC检测，产品纯度为99.41%。
整个生产流程历时仅4天，能大大缩短生产周期，节约生产成本。
Claims (1)
1.一种23-乙酰泽泻醇B单体的分离纯化方法，其特征在于：以泽泻科植物泽泻的块茎为原料，通过提取、萃取、富集和结晶得到23-乙酰泽泻醇B单体，具体包括下述主要步骤：
A、提取
将干燥的泽泻块茎粉碎成粗粉，加入质量百分比浓度均为75%～95%的乙醇溶液，其加入量按照药材重量:乙醇溶液体积=1Kg:(5～10)L计算，60～80℃提取3～4次，每次1～2小时，提取液过滤，合并过滤液，浓缩回收乙醇，得浓浸膏待进行下一步萃取处理；
B、萃取
将步骤A所得的浓浸膏加水稀释至60℃时相对密度为0.8～0.9g/mL，然后加入等体积的乙酸乙酯萃取3～5次，分取上层溶液，45～60℃减压浓缩至干，所得固体物进行下一步富集处理；
C、富集
将步骤B所得固体物用甲醇或乙醇溶解完全，加入固体物3～5倍质量的硅胶拌样，经40～60℃干燥后，进行以二氯甲烷-甲醇混合液为洗脱剂的硅胶柱层析，其中硅胶为200～300目，其用量为固体物质量的20～50倍，流出液按200ml/瓶收集，进行以环己烷-乙酸乙酯1:1体积比为展开剂，5%质量体积比硅钨酸乙醇溶液为显色剂的TLC操作，完全收集经105℃加热后显示为紫红色斑点的流份，并于40～60℃的水浴减压干燥，得粉末状固体，进行进一步纯化；
D、结晶
按照粉末状固体物:乙酸乙酯=1g:( 6～8)ml计算，于步骤C得到的粉末状固体物中加入乙酸乙酯，加热使溶解完全，过滤除去不溶性杂质，将滤液冷却结晶；根据晶体纯度情况，重结晶2～3次，直到纯度≥99%，即可得到23-乙酰泽泻醇B单体产品；
步骤C所述拌样硅胶的类型选自60～80目或80～100目；
步骤C所述洗脱剂中甲醇的体积分数为5%～15%。
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