CN102414190A

CN102414190A - NF-kB的抑制剂

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Publication number: CN102414190A
Application number: CN2010800200099A
Authority: CN
Inventors: J·张; D·R·斯利斯科维克; C·E·达克
Original assignee: Profectus Biosciences Inc
Current assignee: Profectus Biosciences Inc
Priority date: 2009-03-27
Filing date: 2010-03-25
Publication date: 2012-04-11
Anticipated expiration: 2030-03-25
Also published as: CN102414190B; JP2012521998A; JP5719344B2; HRP20150777T1; CA2755910A1; EP2411376A1; US8629164B2; ES2540351T3; US20120015952A1; DK2411376T3; WO2010111460A1; TW201038561A; SI2411376T1; CA2755910C; PL2411376T3; PT2411376E; EP2411376B1; SMT201500178B

Abstract

本发明涉及式(1)或式(2)所示化合物及其药学上可接受的盐以供治疗癌症、炎症、自身免疫疾病、糖尿病和糖尿病并发症、感染、心血管疾病和缺血-再灌注损伤。

Description

NF-kB的抑制剂

发明领域

本发明涉及式(1)和(2)所示化合物及其药学上可接受的盐，

以供治疗癌症、炎症、自身免疫疾病、糖尿病和糖尿病并发症、感染、心血管疾病和缺血-再灌注损伤。

发明背景

NF-κB(活化B细胞的核因子κ-轻链增强子)是p65(RelA)、c-Rel、RelB、p50(NF-κB1)和p52(NF-κB2)的异源或同源二聚体构成的转录因子家族(Dejardin 2006)。在NF-κB的经典或标准途径中，刺激各种细胞膜受体导致IκB(抑制剂蛋白)的磷酸化、泛素化和蛋白酶体降解，从而造成p65/50异源-二聚体的核转运，进而开启转录。抑制IκBβ激酶、26S蛋白酶体或p65与DNA结合可有效阻断该经典途径。通过含蛋白NF-κB2/p100的抑制锚蛋白的蛋白水解作用以释放p52来调控其它或非经典的途径，其通常与RelB形成二聚体。此外，有“杂合(hybrid)”途径活化p52/c-Rel和p52/p65。非经典或“杂合”途径对IκBβ激酶或蛋白酶体抑制剂不敏感。通过拮抗RelB或c-Rel与DNA结合最有效地抑制这些途径。经典和非经典途径通过活化不同组的基因而与具体疾病的不同方面相关。因此，人们相信选择性抑制不同疾病状态下的经典或非经典途径或二者是缓解所强调疾病状况的最有效方法。

NF-κB活化参与各种疾病，包括癌症、AIDS、糖尿病、心血管疾病、自身免疫疾病、病毒复制、脓毒性休克、神经变性疾病、运动失调性毛细血管扩张症(AT)、关节炎、哮喘、炎性肠病和其它炎性病症、动脉粥样硬化、心脏病、哮喘、代谢疾病、1型和2型糖尿病、衰老、皮肤疾病、肾病、肠病、胰腺炎、神经病理学疾病、肺病、慢性阻塞性肺病、脓毒症和睡眠呼吸暂停。NF-κB的活化涉及人的各种疾病。

例如，革兰氏阴性细菌脂多糖(LPS)活化NF-κB可产生脓毒性休克，因为NF-κB过度活化许多细胞因子和修饰酶的转录，它们的表达延长可不利地影响关键器官，例如心脏和肝脏的功能(Arcaroli等.，2006；Niu等.，2008)。

此外，在慢性阿尔茨海默病中，淀粉样蛋白β肽导致反应活性氧中间体的产生，通过NF-κB位点间接活化基因表达(Giri等.，2005)。

骨的破坏性侵蚀或骨质溶解是炎性病症，例如类风湿性关节炎(RA)、牙周病和假体周围骨质溶解的主要并发症。RA是影响约1.0％美国成年人的自身免疫疾病，女性和男性之比是2.5到1(Lawrence等.，1998)。其标志是导致主要病态的渐进性关节破坏。牙周病非常普遍，最多影响全球90％的人口。众所周知其是成年人牙齿丧失的主要原因(Pihlstrom等.，2005)。尽管很普遍，但牙周骨侵蚀的发生机制仍不清楚，虽然看来是宿主对口腔中存在的病理性微生物的反应触发该过程。外源性植入物器件周围的慢性骨再吸收作用导致假体周围骨质溶解，直至丧失固定作用(Harris，1995)，据信其是针对磨损碎片颗粒的先天免疫反应所致，获得性免疫系统组分的贡献不大(Goldring等.，1986)。

虽然这些病症由不同原因引发，通过各种途径而进展，但这些病症的病理性过程中的重要共同因素是发炎组织中NF-κB途径的组成型活化驱动的炎性细胞因子过度产生。与例如骨质疏松症等全身性、激素调控的骨病理状况不同，这些病症中发现的骨侵蚀大多定位于发炎的组织。在许多这些疾病中发现的这些发炎组织还产生促炎细胞因子，即，TNF-α、IL-1和IL-6，这些促炎细胞因子进而参与破骨细胞分化信号转导和骨再吸收活性。因此，炎性骨质溶解是发炎组织中NF-κB驱动促炎细胞因子推动的破骨细胞募集和活化增强所致。

炎性肠病(IBD)包括涉及胃肠道的许多慢性复发性炎性疾病。IBD的两种最常见的形式是克罗恩病和溃疡性结肠炎，二者的区别在于独特的组织病理学特性和免疫应答(Atreya等.，2008；Bouma和Strober，2003)。目前的治疗疗效有限，还可能有副作用使得患者和医生渴望能控制这些疾病的慢性复发性炎症性质的新疗法。

虽然导致克罗恩病和溃疡性结肠炎的确切病因尚未知，但通常认为是粘膜免疫系统对正常肠菌群的不当和正进行的活化导致(Tilg等.，2008)。因此，驻留型巨噬细胞、树突细胞和T细胞活化并开始主要分泌NF-κB-依赖性趋化因子和细胞因子。NF-κB介导关键促炎介质的过度产生导致人IBD和结肠炎动物模型的启动和进展(Neurath等.，1998；Wirtz和Neurath，2007)。具体地说，IBD患者的巨噬细胞表现出高水平的NF-κB DNA结合活性并伴有白介素(IL)1、IL6和肿瘤坏死因子(TNFα)的产生增加(Neurath等.，1998)。此外，NF-κB在活化T辅助细胞1(Th1)和T辅助细胞2(Th2)细胞因子中起到关键作用，二者是促进和维持炎症所需(Barnes，1997)。由于NF-κB在IBD中起到的核心作用，人们付出大量努力试图开发靶向该途径的疗法。

NF-κB显示在来自乳腺、卵巢、结肠、胰腺、甲状腺、前列腺、肺、头颈、膀胱和皮肤肿瘤的许多癌症衍生细胞系中组成型表达(Calzado等.，2007)。B-细胞性淋巴瘤、霍奇金病、T-细胞性淋巴瘤、成人T细胞白血病、急性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病和急性骨髓性白血病中也观察到。虽然NF-κB作为防御性应答的一部分是正常炎症的关键介质，但慢性炎症可导致癌症、糖尿病和许多上述其它疾病。已鉴定了几种促炎基因产物在致癌过程、血管发生、侵袭和肿瘤细胞转移中介导关键作用。这些基因产物有TNF及其超家族的成员，IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18、趋化因子、MMP-9、VEGF、COX-2和5-LOX。所有这些基因的表达主要由转录因子NF-κB调控，其在大多数肿瘤中有组成型活性并由致癌物(例如香烟的烟)、肿瘤促进剂、致癌性病毒蛋白(HIV-tat、KHSV、EBV-LMP1、HTLV1-tax、HPV、HCV和HBV)、化疗剂和γ射线诱导(Aggarwal等.，2006)。这些观察结果提示抑制NF-κB的抗炎剂应该可能用于预防和治疗癌症。

流感病毒蛋白血凝素还活化NF-κB，该活化可导致细胞因子的病毒诱导和一些流感相关症状(Flory等.，2000；Pahl和Baeuerle，1995)。

动脉粥样硬化相关的低密度脂蛋白的氧化脂质活化NF-κB，然后活化其它基因，例如炎性细胞因子(Liao等.，1994)。此外，动脉粥样硬化易感小鼠在喂食致动脉粥样硬化饮食时显示NF-κB活化，因为它们对脂质过氧化产物累积、炎性基因诱导和NF-κB转录因子活化相关的动脉粥样硬化病损形成敏感(Liao等.，1994)。动脉粥样硬化的另一重要原因是凝血酶，其通过NF-κB活化而刺激血管平滑肌细胞增殖(Maruyama等.，1997)。IκB阻遏蛋白的截短形式(IκBα)显示是电离辐射超敏性的原因，在组成型水平NF-κB-活化的运动失调性毛细血管扩张症(AT)细胞中其对DNA合成调控有缺陷(Jung等.，1995)。AT细胞的IκBα中的该突变显示导致NF-κB途径组成型活化的阻遏蛋白灭活。鉴于所有这些发现，NF-κB的异常活化或表达明显与各种病理学状况相关。

人单核细胞中，HIV-1的感染和生命周期与NF-κB途径紧密相连。病毒感染导致NF-κB活化，从而产生AIDS标志性的T细胞过度刺激和最终耗尽(综述见(Argyropoulos和Mouzaki，2006)。例如，NF-κB调节作为HIV-1关键受体的CCR5的表达(Liu等.，1998)。CCR-5启动子的缺失分析证明3’-远端NF-κB/AP-1位点的丧失使得转录降低＞95％(Liu等.，1998)。这些研究提示NF-κB的组成型表达导致CCR-5受体信号急剧降低。由于靶T-细胞表面上CCR5的表达水平影响HIV-1进入动力学特性(Ketas等.，2007；Platt等.，1998；Reeves等.，2002)，下调CCR5可约束大量产生病毒库的感染细胞群扩散。还有报道说NF-κB影响CXCR4表达(Helbig等.，2003)，提示NF-κB抑制剂可能同样有效抗感染后期期间出现的X4-向性分离物。整合的DNA-前-病毒的转录需要NF-κB(Baba，2006；Iordanskiy等.，2002；Mukerjee等.，2006；Palmieri等.，2004；Rizzi等.，2004；Sui等.，2006；Williams等.，2007)。事实上，缺乏NF-κB活化导致具有潜伏病毒的细胞群产生，这是消除受感染患者的病毒的主要障碍(Williams等.，2006)。

NF-κB促进超过150种靶基因对炎性刺激物起反应而表达。这些基因包括白介素-1、-2、-6和肿瘤坏死因子受体(TNF-R)(这些受体介导凋亡并起到炎症调节剂的作用)以及编码免疫受体、细胞粘附分子和酶，例如环加氧酶-II和诱生型一氧化氮核酶(iNOS)的基因(Karin，2006；Tergaonkar，2006)。其还在病毒感染，例如HCV和HIV-1相关疾病的进展中起关键作用。

NF-κB家族的成员包括RelA/p65、RelB、c-Rel、p50/p105(NF-κB1)和p52/p100(NF-κB2)(Hayden和Ghosh，2004；Hayden等.，2006a；Hayden等.，2006b)。Rel家族成员作为同源二聚体或异源二聚体起作用，对位于NF-κB-调节基因的启动子结构域内的顺式结合元件的特异性不同(Bosisio等.，2006；Natoli等.，2005；Saccani等.，2004)。经典NF-κB-由RelA/p65和p50异源二聚体构成，是NF-κB研究得最清楚的形式(Burstein和Duckett，2003；Hayden和Ghosh，2004)和其中的参考文献)。细胞刺激前，经典NF-κB驻留在细胞质中作为与IκBα抑制蛋白结合的无活性复合物。NF-κB的诱导剂，例如细菌脂多糖、炎性细胞因子或HIV-1Vpr蛋白通过活化磷酸化IκBα的IκB-激酶复合物(IKK)而从细胞质复合物释放活性NF-κB(Greten和Karin，2004；Hacker和Karin，2006；Israel，2000；Karin，1999；Scheidereit，2006)。IκB的磷酸化为随后的泛素化和通过26S蛋白酶体降解提供了标记。游离NF-κB二聚体转运进入核，在核中刺激它们的靶基因转录。

外消旋脱羟基甲基环氧醌霉素(DHMEQ)的分子设计是依据从拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis)分离的抗生素环氧醌霉素C(Chaicharoenpong等.2002)。DHMEQ是采用五步骤从2，5-二甲氧基苯胺合成的外消旋物。利用手性柱分离对映体产生(+)和(-)对映体。(-)-对映体显示抑制NF-κB强于(+)-对映体(Umezawa等.2004)。DHMEQ显示特异性抑制NF-κB转运入核(Ariga等.2002)。具体地说，其以1∶1的化学计量比共价修饰p65和其它Rel同源蛋白中的特定半胱氨酸残基(Yammamoto等.2008)。作为NF-κB抑制剂，在各种疾病的动物模型中广泛测试了DHMEQ，证明包括治疗实体瘤、血液恶性肿瘤、关节炎、肠缺血和动脉粥样硬化在内的广谱效力(Watanabe等.2006)。因此，DHMEQ可用作癌症和炎症的治疗(Takeuchi等.2003)。

鉴于NF-κB活化在多种不同疾病，例如上述那些中起作用，现正需要有效的小分子NF-κB抑制剂。

现已发现数个系列的小分子抑制剂能直接抑制NF-κB组分，p65(RelA)、RelB和c-Rel与DNA结合。因此，这些化合物能阻断经典和非经典的NF-κB途径。双重抑制与仅影响经典途径的IκBβ激酶抑制剂不同。利用多发性骨髓瘤和类风湿性关节炎的动物模型测试了这些化合物的效力，结果如本文所述。

发明概述

本发明一方面涉及具有式(1)或式(2)所示结构的化合物或其药学上可接受的盐，

式中HET是饱和或不饱和的单环或多环碳环，其中一个或多个环碳原子被N、S、P或O替代；

各R¹独立为氢；CF₃；任选用以下取代的苯基：氰基、卤素、硝基、羟基、(C1-C6)烃基(alkyl)、(C1-C6)烃基-OH、(C1-C6)烷氧基、COR³、NR⁴R⁵或NHCO(C1-C6)烃基)；氰基；卤素；硝基；羟基；(C1-C6)烃基；(C1-C6)烃基-OH；(C1-C6)烷氧基；(C1-C6)硫代烷氧基；苯氧基；COR³；NR⁴R⁵；NHCO(C1-C6)烃基；SO₂(C1-C6)烃基；或SO₂NR⁴R⁵。

R²是H、R⁶、COR⁶、CONHR⁶、COOR⁶、CH₂OCOR⁶、P(O)(OH)₂、 P(O)(O(C1-C6)烃基)₂、P(O)(OCH2OCO(C1-C6)烃基)₂、P(O)(OH)(OCH2OCO(C1-C6)烃基)、P(O)(OH)(OC1-C6)烃基)、P(O)(OH)(C1-C6)烃基)，P(O)(OH)₂、P(O)(O(C1-C6)烃基)₂、P(O)(OCH₂OCO(C1-C6)烃基)₂、P(O)(OH)(OCH₂OCO(C1-C6)烃基)、P(O)(OH)(OC1-C6)烃基)或P(O)(OH)(C1-C6)烃基)的无机盐，或糖基(除去半缩醛形式碳水化合物的羟基得到该基团)，其中R⁶是C1-C6烃基、三氟甲基、(C3-C6)环烃基、环己基甲基或苯基，其中所述苯基被0到4个选自以下的基团取代：氟、氯、溴、羟基、三氟甲基、(C1-C4)烃基、(C1-C4)烷氧基和苯基甲基，其中所述苯基甲基在苯环上被0到4个选自以下的基团取代：氟、氯、溴、羟基、三氟甲基、(C1-C4)烃基、(C1-C4)烷氧基、2-，3-或-4-吡啶基和2-，-4-或5-嘧啶基。

R³独立为羟基、(C1-C6)烷氧基、苯氧基或-NR⁴R⁵。

R⁴和R⁵各自独立为氢、(C1-C6)烃基或(C3-C6)环烃基。

n＝0-3。

HET上，在OR²基团和酰胺部分之间是邻位关系(即，OR²和C(＝O)NH官能团连接于HET环上的毗邻原子)。

本发明一方面还涉及包含式(1)或式(2)所示化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体的药物组合物。

本发明一方面还涉及治疗癌症、炎症、自身免疫疾病、糖尿病和糖尿病并发症、感染、心血管疾病和缺血-再灌注损伤的方法，包括给予需要此类治疗的哺乳动物，例如人，治疗有效量的式(1)或式(2)所示化合物或其药学上可接受的盐。

本发明一方面还涉及抑制哺乳动物，例如人中直接或间接通过NF-κB途径的基因表达和信号转导的方法，包括给予需要此类治疗的哺乳动物治疗有效量的式(1)或式(2)所示化合物或其药学上可接受的盐。

附图简述

附图代表所述发明的具体实施方式，因此，仅用于说明的目的。所以，附图并非要限制本发明的范围。

图1显示实施例1的化合物对HEK-293细胞中两种NF-κB依赖性报道基因，萤光素酶(A)和绿色荧光蛋白(GFP)(B)表达的浓度依赖性抑制作用。

图2显示实施例1的化合物对hPBMC的细胞毒性作用不大。用实施例1或DHMEQ处理人外周血单核细胞(hPBMC)，药物处理后24小时评估活细胞百分比。该图代表了三次重复实验的平均值±标准偏差。

图3显示了实施例1的化合物对hPBMC中可溶性IL-2Rα(一种NF-κB调节细胞因子)的NF-κB依赖性表达的影响。该图是两次独立实验的平均值。

图4显示实施例1的化合物以剂量依赖性方式抑制乳腺癌细胞中炎性细胞因子，IL-6(A)和IL-8(B)分泌的能力。具体地说，A和B显示实施例1的化合物对20ng/mL TNF-α刺激MDA-MB-231细胞分泌IL-6和IL-8的影响。用所示浓度的实施例1化合物处理细胞2小时，然后加入TNF-α，持续培养4小时。

图5显示实施例1的化合物以剂量依赖性方式抑制LPS刺激的小鼠巨噬细胞中炎性细胞因子IL-6和PGE₂分泌的能力。具体地说，A和B显示实施例1的化合物对1μg/mL LPS刺激RAW264.7细胞分泌可溶性PGE₂和IL-6的影响。用所示浓度的实施例1化合物处理细胞2小时，然后加入LPS，持续培养4小时。

图6显示实施例1的化合物以剂量依赖性方式阻断RelA/p65从胞质转运入核的能力。具体地说，实施例1的化合物导致活化的RelA/p65在细胞胞质中累积。用DHMEQ或实施例1的化合物(所示的)与TNFα(20ng/ml)处理Hek293细胞30分钟。培养后，用抗-p65抗体(C-20)抗体(加利福尼亚州圣克鲁斯的圣克鲁斯生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA))免疫染色细胞，用Dapi复染核。利用装有表荧光照明器(epifluorescence illuminator)(莫提克公司(Motic)，厦门，中国)和ProgRes C3照相机(JP公司(JENOPTIK)，耶拿，德国)的AE31倒置显微镜捕捉图像。合并p65和相应核的各图像作为最终图。对照处理细胞(仅有DMSO)显示TNFα刺激后p65的核累积。1到12μM的实施例1化合物显著阻断TNFα诱导的p65核累积，而DHMEQ需要更高的浓度才能实现相同作用。

图7显示实施例2的化合物抑制经典途径中p65(RelA)结合DNA远强于DHMEQ和小白菊内酯。

图8显示实施例2的化合物抑制非经典途径中RelB结合DNA(IC₅₀约2uM)，而DHMEQ和小白菊内酯不抑制(IC₅₀＞20uM)。

图9显示实施例2的化合物与硼替佐米(bortezomib)(PS-341)一样降低异种移植小鼠中的RPMI8226肿瘤生长。在该项研究中，与载体处理相比，PS-341(1mg/kg静脉内，1，4天/周x 4周)或实施例2的化合物(15mg/kg腹膜内，每天一次x 21)处理均为获得统计学显著的肿瘤生长抑制(P＞0.10)。

图10显示实施例2的化合物在胶原诱导类风湿性关节炎(CIA)的小鼠模型中表现出与依那西普一样的抗炎效力。实施例2的化合物(15mg/kg皮下，每天一次，第21-35天)和依那西普(50ug/小鼠腹膜内，每天一次，第21-35天)处理组实现统计学显著的抗炎症作用(与载体处理组相比P＜0.05)。

图11显示实施例2的化合物(10uM)不与人P450和hERG相互作用(＜50％抑制)。

发明详述

定义

用于描述本发明的术语具有以下意义。本发明的化合物和中间体可按照IUPAC(国际理论和应用化学联合会)或CAS(化学文摘服务部)命名体系命名。

本文的各种含烃部分的碳原子含量可以通过指定该部分中最低和最高碳原子数的前缀来表示，例如前缀(Ca-Cb)烃基表示具有整数“a”到“b”个碳原子的烃基部分。因此，例如(C1-C6)烃基指1-6个碳原子的烃基。术语“烃基”表示仅具有氢原子取代基的直链或支链碳原子，其中所述碳链任选含有一个或多个双键或三键，或双键和三键的组合。烃基的例子包括但不限于：甲基、乙基、丙基、异丙基、丙烯基、丙炔基、己二烯基等。

术语“烷氧基”指直链或支链、单价、饱和脂族碳原子链，其中所述碳原子之一被氧原子替代。烷氧基的例子包括但不限于：甲氧基、乙氧基和异丙氧基。

术语“环烃基”指饱和和任选不饱和的单环或双环脂族链。环烃基的例子包括但不限于：环丙基、环丁基、环戊基和环己烯基。环烃基还可任选与芳族烃，例如苯稠合以形成稠合环烃基，例如茚满基等。

术语“卤素”指氯、溴、氟或碘。

术语“取代的”指某分子上的氢原子被不同的原子或分子替代。替代氢原子的原子或分子称为“取代基”。

术语“HET”指饱和或不饱和的单环或多环碳环，其中一个或多个环碳原子被N、S、P或O替代。术语“HET”指包括完全饱和和不饱和的环系统以及部分不饱和的环系统，包括杂环的所有可能的异构形式(例如，吡咯基包括1H-吡咯基和2H-吡咯基)。其中HET是单环(例如，4-、5-或6-元环)或双环(例如，5/6、5/5、6/6系统)饱和杂环的例子包括但不限于：四氢呋喃基、吡咯烷基、四氢噻吩基、二氢

唑基、哌啶基、六氢嘧啶基、二

烷基、吗啉基、二噻烷基、硫代吗啉基、哌嗪基等。其中HET是单环、双环或三环的部分饱和杂环的例子包括但不限于：吡咯啉基、咪唑啉基、吡唑啉基、2，3-二氢苯并呋喃基、1，3-苯并二氧戊环基、2，3-二氢-1，4-苯并二英基、二氢吲哚基等。其中HET是单环、双环或三环的芳族杂环的例子包括但不限于：吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、

唑基、异

唑基、噻唑基、异噻唑基、吡唑基、1，2，3-三唑基、1，2，5-噻二唑基、1，2，3-噻二唑基、1，2，3-

二唑基、1，2，5-

二唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、三嗪基、苯并呋喃基、异苯并呋喃基、苯并噻吩基、异苯并噻吩基、中氮茚基、吲哚基、异吲哚基、苯并

唑基、苯并咪唑基、吲唑基、苯并异

唑基、苯并异噻唑基、苯并吡唑基、苯并

二唑基、苯并噻二唑基、苯并三唑基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基、喹嗪基、酞嗪基、喹喔啉基、喹唑啉基、萘啶基、蝶啶基、吡咯并吡啶基、噻吩并吡啶基、呋喃并吡啶基、异噻唑并吡啶基、噻唑并吡啶基、异

唑并吡啶基、

唑并吡啶基、吡唑并吡啶基、咪唑并吡啶基、吡咯并吡嗪基、噻吩并吡嗪基、呋喃并吡嗪基、异噻唑并吡嗪基、噻唑并吡嗪基、异

唑并吡嗪基、

唑并吡嗪基、吡唑并吡嗪基、咪唑并吡嗪基、吡咯并嘧啶基、噻吩并嘧啶基、呋喃并嘧啶基、异噻唑并嘧啶基、噻唑并嘧啶基、异

唑并嘧啶基、

唑并嘧啶基、吡唑并嘧啶基、咪唑并嘧啶基、吡咯并哒嗪基、噻吩并哒嗪基、呋喃并哒嗪基、异噻唑并哒嗪基、噻唑并哒嗪基、异

唑并哒嗪基、

唑并哒嗪基、吡唑并哒嗪基、咪唑并哒嗪基、二唑并吡啶基、噻二唑并吡啶基、三唑并吡啶基、二唑并吡嗪基、噻二唑并吡嗪基、三唑并吡嗪基、

二唑并嘧啶基、噻二唑并嘧啶基、三唑并嘧啶基、

二唑并哒嗪基、噻二唑并哒嗪基、三唑并哒嗪基、异

唑并三嗪基、异噻唑并三嗪基、吡唑并三嗪基、

唑并三嗪基、噻唑并三嗪基、咪唑并三嗪基、

二唑并三嗪基、噻二唑并三嗪基、三唑并三嗪基、咔唑基等。

短语“治疗有效量”指(i)治疗或预防特定疾病、病情或病症，(ii)减弱、缓解或消除特定疾病、病情或病症的一种或多种症状，或(iii)防止或延缓特定疾病、病情的一种或多种症状发作的化合物的量。

短语“药学上可接受的”表示指定的载体、运载体、稀释剂、赋形剂和/或盐总体上与构成制剂的其它成分化学和/或物理学相容，并与其受者在生理学上相容。

术语“哺乳动物”指作为分类学哺乳纲成员的各动物。哺乳动物的例子包括但不限于：人、狗、猫、马和牛等。在本发明中，优选的哺乳动物是人。

外消旋化合物2-羟基-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂二环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)喹啉-3-羧酰胺描述于本文实施例2，其通篇指实施例2的化合物。

在示范性实施方式中，本发明化合物具有式(3)所示结构和立体化学特性。

可通过本领域技术人员熟知的方法将这些化合物拆分成它们的对映体。例子包括形成可通过例如结晶分开的非对映体盐；形成可通过例如结晶、气-液或液相色谱分开的非对映体衍生物或复合物；将一种对映体与对映体特异性制剂选择性反应，例如酶促醚化作用；或在手性环境中，例如用手性支持物，如结合有手性配体的二氧化硅，或在有手性溶剂存在下作气-液或液相色谱。应该知道如果通过上述示范性的分离方法将所需立体异构体转换成另一化学实体，还需要释放所需对映体形式的步骤。或者，可利用光学活性起始材料，通过利用光学活性试剂、底物、催化剂或溶剂的不对称合成，或通过不对称转化将一种立体异构体转换成另一种而合成具体的立体异构体。

如果所述化合物含有一个或多个附加的立体中心(stereogenic center)，本领域技术人员应知道本文所示和讨论的所有非对映体和非对映体混合物属于本发明的范围。可通过本领域技术人员熟知的方法分离这些非对映异构体，例如通过结晶、气-液或液相色谱。或者，合成期间的中间体可存在外消旋混合物，可通过本领域技术人员熟知的方法拆分，例如形成可通过例如结晶分开的非对映体盐；形成可通过例如结晶、气-液或液相色谱分开的非对映体衍生物或复合物；将一种对映体与对映体特异性制剂选择性反应，例如酶促醚化作用；或在手性环境中，例如用手性支持物，如结合有手性配体的二氧化硅，或在有手性溶剂存在下作气-液或液相色谱。应该知道如果通过上述示范性分离方法将所需立体异构体转换成另一化学实体，还需要释放所需对映体形式的步骤。或者，可利用光学活性起始材料，例如通过利用光学活性试剂、底物、催化剂或溶剂的不对称合成，或通过不对称转化将一种立体异构体转换成另一种而合成具体的立体异构体。这些方法在诸如“《手性药物》(Chiral Drugs)”，Cynthia A.Challener(编)，Wiley，2002或“手性药物分离(Chiral Drug Separation)”Bingyunh Li和Donald T.Haynia，刊于“《化学加工百科全书》(Encyclopedia of Chemical Processing)”Sunggyu Lee和Lee Lee(编)，CRC出版社，2005等教材中有更详细描述。

本发明化合物及其盐可以非溶剂化以及含有药学上可接受的溶剂，例如水、乙醇等的溶剂化形式存在。

选择的式(1)和式(2)所示化合物和它们的盐及溶剂化物可存在多种晶型。式(1)和式(2)所示化合物的多晶型构成本发明的一部分，可在不同条件下结晶式(1)和式(2)所示化合物来制备。例子包括利用不同溶剂或溶剂混合物作重结晶；在不同温度下结晶；和结晶过程中各种形式的冷却，从极快到极慢冷却。还可通过加热或熔化式(1)和式(2)所示化合物，然后逐步或快速冷却以获得多晶型。可通过，例如固态NMR光谱法、IR光谱法、差示扫描量热法、粉末X-射线衍射或其它此类技术测定多晶型是否存在。

本发明还包括同位素标记的化合物，它们与式(1)和式(2)所示化合物相同，但一个或多个原子被原子量或质量数不同于自然界中常见原子量或质量数的原子替代。可掺入本发明化合物的同位素的例子包括氢、碳、氮、氧、硫和氟的同位素，例如分别为²H、³H、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁸O、¹⁷O、³⁵S、 ³⁶Cl、¹²⁵I、¹²⁹I和¹⁸F。含有上述同位素和/或其它原子的其它同位素的本发明化合物和所述化合物的药学上可接受的盐属于本发明的范围。本发明的某些同位素标记化合物，例如掺入诸如²H(氘)等同位素的那些能因更大的代谢稳定性而在治疗上具有优势，例如体内半衰期增加或剂量需求降低，因此在一些情况中是优选的。通常可通过实施以下方案和/或实施例所述的方法，用易得同位素标记的试剂取代非同位素标记的试剂来制备同位素标记的本发明式(1)和式(2)所示化合物及其盐和溶剂化物。

本文所用的本发明化合物的药学上可接受的盐包括所述化合物的药学上可接受的无机和有机盐。这些盐可在化合物的最终分离和纯化期间原位制备，或将所述化合物单独与合适的有机或无机酸反应并分离如此形成的盐。代表性的盐包括但不限于：氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、草酸盐、苯磺酸盐、樟脑磺酸盐、棕榈酸盐、丙二酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苹果酸盐、硼酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、六氟磷酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐、甲酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘酸盐(naphthylate)、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖醛酸盐和月桂基磺酸盐等。本发明化合物还可与药学上可接受的金属和有机和无机碱形成的胺阳离子反应形成盐。术语“药学上可接受的金属阳离子”包括衍生自钠、钾、钙、镁、铝、铁、锌等的带正电荷的金属离子。术语“药学上可接受的胺阳离子”包括衍生自铵和足够强从而能形成此类阳离子的有机含氮碱的带正电荷阳离子。可用于形成本发明化合物的药学上可接受的无毒碱加成盐的碱构成了本领域技术人员不难知道其局限性的类别(参见，例如Berge等.，“药物盐(Pharmaceutical Salts)”J.Pharm.Sci.，66：1-19(1977))。

本发明还包括式(I)所示化合物的前药。可采用常规方法，利用化合物的官能团，例如氨基、羟基或羧基形成式(I)所示化合物的前药。术语“前药”指能在体内转化形成式(I)或式(II)所示化合物或该化合物的药学上可接受的盐或溶剂化物的化合物。所述转化可通过各种机制进行，例如通过在血液中水解。前药用途的讨论见T.Higuchi和W.Stella，″前药作为新型递送系统(Pro-drugs as Novel Delivery Systems)″A.C.S.论坛丛书，第14卷，和“药物设计中的生物可逆载体”(Bioreversible Carriers in Drug Design)，Edward B.Roche编，美国医学协会和佩格蒙出版社(American Pharmaceutical Association and Pergamon Press)，1987。例如，如果本发明化合物含有醇官能团，可用以下基团替代该醇基团的氢原子形成前药，例如COR⁶基团以提供酯前药；CONHR⁶以提供氨基甲酸酯前药；COOR⁶以提供碳酸酯前药；CH₂OCOR⁶以提供烃基羰基氧基甲基前药；P(O)(OH)₂以提供磷酸盐或酯前药；P(O)(O(C1-C6)烃基)₂以提供磷酸盐或酯前药；P(O)(OCH2OCO(C1-C6)烃基)₂以提供磷酸盐或酯前药；P(O)(OH)(OCH2OCO(C1-C6)烃基)以提供磷酸盐或酯前药；P(O)(OH)(OC1-C6)烃基)以提供磷酸盐或酯前药；或P(O)(OH)(C1-C6)烃基)以提供膦酸盐或酯前药，和磷酸盐或酯及膦酸盐或酯前药的相应无机盐，或糖基(除去半缩醛形式的碳水化合物的羟基得到的基团)，其中R⁶是C1-C6烃基、三氟甲基、环丙基、环己基、环己基甲基、苯基，用氟、氯、溴、羟基、三氟甲基、(C1-C4)烃基、(C1-C4)烷氧基取代的苯基，苯基甲基、用氟、氯、溴、羟基、三氟甲基、(C1-C4)烃基、(C1-C4)烷氧基取代的苯基甲基，2-、3-或-4-吡啶基，2-、-4-或5-嘧啶基。

注意力集中在NF-κB活化的“下游”事件，从而阻止p65、RelB和c-Rel结合DNA增强子序列和激活转录。该方法可能与不同的化合物一起或单独调节经典和非经典途径。此外，“下游”NF-κB抑制剂可避免许多“上游”NF-κB抑制剂观察到的副作用。已建立了药物筛选范例来鉴定Rel家族的新型和专有的NF-κB抑制剂。采取三种平行方案来鉴定合适的前导分子：(1)利用p65的晶体结构计算机模拟(in-silico)筛选5,000,000种化合物，(2)利用基于细胞的筛选系统对多样性化合物文库作广谱高通量筛选，和(3)进行修饰以改进现有的p65抑制剂。与已知的p65拮抗剂，例如天然产物小白菊内酯和合成分子脱羟基甲基环氧醌霉素(DHMEQ)相比，本发明化合物抗p65(RelA)的效力明显提高(参见图7)。

与DHMEQ或小白菊内酯不同，发现本发明化合物还抑制RelB(参见图8)和c-Rel(表1)。因此，这些化合物是经典和非经典途径的双重抑制剂以及单独抑制剂。

通常，通过反应方案1和2概述的通用合成方法制备本发明化合物，其中方案中显示的“R”是以下所示部分，且HET如本文所述。

参考反应方案1，可根据公布的参考文献的方法(参见，例如Taylor等.，Synthesis 1998，775)制备化合物2-5。0℃到室温的温度下，在甲醇或四氢呋喃中用二叔丁基碳酸氢酯(Boc₂O)和三乙胺处理2，5-二甲氧基苯胺1得到保护的苯胺衍生物2。0℃，在甲醇中用二(乙酰氧基碘)苯氧化得到缩酮3。0℃到室温的温度下，在四氢呋喃水溶液中用30％过氧化氢水溶液和碱，例如氢氧化钠或碳酸钾水溶液作单环氧化得到4。0℃到室温的温度下，用4/1二氯甲烷/三氟乙酸混合物选择性除去Boc基团得到游离的胺5。或者，可在室温，在诸如二氯甲烷等溶剂中利用三氟化硼-乙醚络合物和活化的分子筛实现该脱保护。然后在-78℃，在诸如无水四氢呋喃等溶剂中利用碱，例如叔丁醇锂(LiO^tBu)将胺5偶联于酰氯(RCl)，获得缩酮6。通过在无杂质亚硫酰氯中回流从相应的羧酸制备各种酰氯(RCl)。在0℃到室温的温度下，在诸如二氯甲烷等溶剂中利用酸性介质，例如三氟乙酸对缩酮6脱保护得到二酮7。在0℃到室温的温度下，在诸如甲醇等溶剂中，用略微过量的温和还原剂，例如三乙酰氧基硼氢化钠(NaBH(OAc)₃)处理实现7的区域选择性还原。

备选的合成途径描述于反应方案2。在0℃到室温的温度下，在诸如无水四氢呋喃等溶剂中用酰氯(RCl)和诸如吡啶等碱处理2，5-二甲氧基苯胺1得到10。0℃，在甲醇中用二(乙酰氧基碘)苯氧化得到缩酮11。0℃到室温的温度下，用30％过氧化氢水溶液和碱，例如氢氧化钠水溶液作单环氧化得到6。在0℃到室温的温度下，在诸如二氯甲烷等溶剂中利用酸性介质，例如三氟乙酸对缩酮6脱保护得到二酮7。在0℃到室温的温度下，在诸如甲醇等溶剂中，用略微过量的温和还原剂，例如三乙酰氧基硼氢化钠(NaBH(OAc)₃)处理实现7的区域选择性还原得到8。

发现反应方案(2)中所述通式(7)的二酮中间体也表现出作为NF-κB抑制剂的显著活性。因此，本文所述通式(2)的二酮是本发明的一部分。

反应方案1

反应方案2

本发明的药物组合物包含治疗有效量的式(1)所示化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体、运载体、稀释剂或赋形剂。优选的本发明药物组合物包含治疗有效量的式(2)所示化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体、运载体、稀释剂或赋形剂。虽然不难给予各种剂型的通过混合本发明化合物和药学上可接受的载体、运载体或稀释剂形成的药物组合物，例如片剂、粉末剂、锭剂、糖浆、可注射溶液等。如果需要，这些药物组合物含有附加成分，例如调味剂、粘合剂、赋形剂等。

因此，为口服给药，含有各种赋形剂，例如柠檬酸钠、碳酸钙和/或磷酸钙的片剂可与各种崩解剂，例如淀粉、藻酸和/或某些复合硅酸盐以及粘合剂，例如聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、明胶和/或阿拉伯胶一起使用。此外，润滑剂，例如硬脂酸镁、月桂基硫酸钠和滑石粉常用于压片目的。相似类型的固体组合物也可用作软和硬填充明胶胶囊中的填充剂。为此的优选材料包括乳糖和高分子量聚乙二醇。如果需要口服给予酏剂的水性悬液，其中的活性药物试剂可与各种甜味剂或调味剂、着色物质或染料，和软化剂或悬浮剂(如果需要的话)以及稀释剂，例如水、乙醇、丙二醇、甘油和/或它们的组合混合。

对于胃肠外给药，可利用芝麻油或花生油、水性丙二醇或无菌水溶液配制的本发明化合物或组合物的溶液。如果需要，可适当缓冲此类水性溶液，含充足盐水或葡萄糖的液体稀释剂首先赋予等渗性。这些特定的水性溶液尤其适合静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内给药。就此而言，通过本领域技术人员已知的标准技术不难获得所用的无菌水性介质。

在示范性实施方式中，药物制剂是单位剂型。在此类剂型中，该制剂再分成单位剂量，其中含有合适量的活性成分。单位剂型可以是包装的制剂，例如小瓶或安瓿中的包装片剂、胶囊和粉末。单位剂型还可以是胶囊、扁囊剂或片剂本身，或者其可以是适当数量的任何这些包装形式。

本领域技术人员已知制备含有一定量活性成分的各种药物组合物的方法。制备药物组合物的方法的例子可参见通过引用全文纳入本文的《雷明顿：药学科学和实践》(Remington：The Science and Practice of Pharmacy)，Lippincott，Williams和Wilkins，第21版.(2005)。

在本发明的一个实施方式中，本发明化合物还可与至少一种附加的治疗剂混合。

实施例

实施例1：制备(±)-2-羟基-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)烟酰胺(8a)

A.制备2，5-二甲氧基苯基氨基甲酸叔丁酯(2)

在惰性氮气气氛下，向冰浴中的2，5-二甲氧基苯胺1(50g，326mmol)的甲醇溶液(1L)中加入三乙胺(55mL，397mmol)，然后滴加甲醇(150mL)配制的Boc₂O(78g，359mmol)。搅拌反应过夜。通过薄层层析判断反应未完全后，加入额外的Boc₂O(22g，69mmol)和三乙胺(55mL，397mmol)，溶液搅拌3天。除去甲醇，将残留物溶解于乙酸乙酯，用稀盐酸(2x)和盐水洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，再过滤，蒸发溶剂得到50g(61％)棕色油状的2，5-二甲氧基苯基氨基甲酸叔丁酯(2)。¹H NMR与文献报道的一致(Synthesis 1998，775)。

B.制备6，6-二甲氧基-3-氧代环己-1，4-二烯基氨基甲酸叔丁酯(3)

在冰浴中冷却化合物2(29g，115mmol)的甲醇(700mL)溶液，然后在30分钟期间分6批加入二(乙酰氧基碘)苯(62g，194mmol)。在冰浴中搅拌溶液2小时，然后升温至室温并搅拌过夜。用乙酸乙酯(1.5L)稀释反应混合物，用水、稀盐酸和盐水洗涤。用乙酸乙酯反萃取水相一次，合并有机相，用无水硫酸镁干燥，然后过滤并蒸发溶剂。利用梯度乙酸乙酯的庚烷溶液(0到2％)，硅胶纯化所得液体得到6.9g(21％)黄橙色固体状(3)。¹HNMR检测到该物质足够纯(约95％)，与文献报道的一致(Synthesis 1998， 775)。

C.制备2，2-二甲氧基-5-氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基氨基甲酸叔丁酯(4)

冰浴中冷却四氢呋喃(93mL)配制的化合物3(3.4g，12.7mol)。利用两个独立的加料漏斗和克来森适配器(Claisen adapter)向搅拌的溶液中先后滴加过氧化氢(30％水溶液.，22mL)和氢氧化钠水溶液(1M，61mL)。在冰浴中搅拌反应混合物30分钟，然后在室温下搅拌5小时。在冰浴中冷却烧瓶，用二氧化锰小心猝灭过氧化物。用小的硅胶床过滤混合物后，用乙酸乙酯洗涤硅胶，用盐水洗涤混合物。随后有机相经无水硫酸镁干燥，过滤并蒸发。溶剂蒸发后用戊烷处理所得油，有白色固体沉淀，从而得到2g(56％)化合物(4)。¹H NMR表明混合物中有20％起始物，它们易在下一步骤中除去(用TFA处理)。产品的¹H NMR与文献报道的一致(Synthesis 1998，775)。

D.制备4-氨基-5，5-二甲氧基-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-2-酮(5)

氮气气氛下，在冰浴中搅拌化合物4(300mg，1.1mmol)的无水二氯甲烷(6mL)溶液。向该溶液中滴加三氟乙酸(1.5mL)，将溶液升温至室温，搅拌3小时。薄层层析判断反应完全后，蒸发溶剂并将残留物溶解于乙酸乙酯中。小心地加入固体碳酸氢钠(2g)，搅拌溶液10分钟。过滤盐，用乙酸乙酯洗涤，然后蒸发溶剂。利用梯度乙酸乙酯的庚烷溶液(0到100％)，硅胶纯化所得粗制化合物。用100％乙酸乙酯洗脱产物得到178mg(91％)化合物(5)。该产物的¹H NMR与文献报道的一致(Synthesis 1998，775)。

E.制备N-(2，2-二甲氧基-5-氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)-2-羟基烟酰胺(6a)

2-羟基烟酸(112mg，0.81mmol)和亚硫酰氯(650mL，8.9mmol)的混合物加热回流30分钟。冷却至室温后，真空除去过量的亚硫酰氯，得到的酰氯保存在惰性氮气气氛下。在惰性氮气气氛下，另将含有无水四氢呋喃(4mL)配制的胺5(100mg，0.54mmol)的烧瓶冷却至-78℃，然后滴加叔丁醇锂(1M四氢呋喃配制，540mL，0.54mmol)。该溶液搅拌30分钟，然后滴加粗制2-羟基烟酰氯(2-hydroxynicotinoyl chloride)(1mL四氢呋喃配制)。-78℃搅拌反应混合物30分钟，然后升温至室温，搅拌1小时。液相色谱-质谱法(LC-MS)表明同时存在所需和过酰化的产物。然后用乙酸乙酯稀释反应混合物，依次用饱和的氯化铵和盐水洗涤，用乙酸乙酯反萃取水相，然后用盐水洗涤。无水硫酸镁干燥合并的有机相，然后过滤和溶剂蒸发，得到169mg粗制物质。利用梯度乙酸乙酯的庚烷溶液(50到100％)，硅胶层析得到产物和起始物质的混合物56mg，所需产物和过酰化产物的混合物56mg，以及主要是过酰化的产物31mg(粗产率：99％)。将所需/过酰化物质的混合物56mg溶解于甲醇(1.4mL)和水(200mL)中，然后加入碳酸钾(9mg，约1当量)。室温下搅拌反应混合物2小时，然后通过薄层层析判断是否反应完全。用乙酸乙酯稀释溶液，盐水洗涤，然后无水硫酸镁干燥，过滤和溶剂蒸发得到50mg化合物6a。通过¹H NMR证实产物结构。NMR(CDCl₃)：δ12.10(br.s，1H)，10.60(br.s，1H)，8.62(m，IH)，7.55(m，1H)，7.25(m，1H)，6.60(m，1H)，3.85(m，1H)，3.70(s，3H)，3.50(m，1H)，3.40(s，3H)ppm。

F.制备N-(2，5-二氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)-2-羟基烟酰胺(7a)

室温下向6a(50mg，0.16mmol)的无水二氯甲烷(2mL)溶液中慢慢加入三氟乙酸(0.5mL)。搅拌过夜后，LC-MS表明存在27％的起始物质。加入额外的三氟乙酸(0.5mL)，反应混合物再搅拌24小时，此时判断是否反应完全。在冰浴中冷却溶液，用额外的二氯甲烷(10mL)稀释，然后缓慢加入饱和的碳酸氢钠溶液直至搅拌混合物呈碱性。然后将混合物分相，除去有机溶剂并用盐水洗涤。用乙酸乙酯萃取水层两次，用盐水洗涤有机层。合并所有的有机层，无水硫酸镁干燥，然后过滤并蒸发溶剂，得到淡黄色固体状7a(30mg，71％)。LC-MS表明80％纯度，该物质不作进一步纯化直接用于下一步骤。

G.制备(±)-2-羟基-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)烟酰胺(8a)

惰性氮气气氛下，向冷却到0℃的化合物7a(30mg，0.092mmol，80％纯度)的甲醇(4mL)溶液中一次性加入三乙酰氧基硼氢化钠(30mg，0.142 mmol)。在该温度下搅拌溶液15分钟，然后升温至室温。再搅拌45分钟后，通过TLC判断反应完全。将甲醇蒸发至约2mL体积，在冰浴中冷却烧瓶10分钟。然后过滤沉淀物并用甲醇(2x 3mL)洗涤。高度真空干燥后，分离10mg(42％产率)淡黄色固体状化合物8a。通过HPLC检测纯度为95％(Restek Pinnacle II柱，C18，5μ，250x 4.6mm；流动相：5％乙腈水溶液，5分钟；然后5到100％乙腈水溶液，20分钟；流速：1.5毫升/分钟；检测器：316nm(VWD))。通过¹H NMR证实产物结构。NMR(DMSO-d₆)：δ12.70(br.s，1H)，12.50(br.s，1H)，8.35(m，IH)，7.85(m，IH)，6.90(m，IH)，6.55(m，2H)，4.80(m，1H)，3.80(m，1H)，3.40(m，1H)ppm。

实施例2：(±)-2-羟基-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)喹啉-3-羧酰胺(8b).

采用实施例1的方法制备2-羟基-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)喹啉-3-羧酰胺，但在步骤E中利用2-羟基喹啉-3-羧酸代替2-羟基烟酸。

A.制备N-(2，2-二甲氧基-5-氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)-2-羟基喹啉-3-羧酰胺(6b)

在装有2-羟基喹啉-3-羧酸(528mg，2.8mmol)的干燥圆底烧瓶中装入亚硫酰氯(4mL，57mmol)。将混合物加热回流20分钟，然后旋转蒸发亚硫酰氯。在另一烧瓶中，在惰性氮气气氛下将胺5(430mg，2.3mmol)溶解于无水四氢呋喃(17mL)并冷却至-78℃。向冷却的胺溶液中缓慢加入叔丁醇锂(1M四氢呋喃配制；3mL，3mmol)，然后搅拌15分钟。然后将该酰氯悬浮在四氢呋喃中(12mL)，并直接加入冷却的胺溶液。反应混合物搅拌过夜，期间升温至室温。用乙酸乙酯稀释反应混合物，用盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤并浓缩得到550mg含有10％O-芳酰化产物的粗物质(通过LC-MS测定)。在含有25mg碳酸钾的8/1甲醇/水(9mL)中搅拌固体1小时，然后用乙酸乙酯稀释，用饱和的碳酸氢钠溶液和盐水洗涤。无水硫酸镁干燥乙酸乙酯，过滤并浓缩得到含有少量酯的固体。然后用二氧化硅小塞纯化产物，用95/5二氯甲烷/乙酸乙酯洗脱得到530mg淡黄色固体 (64％产率)。通过¹H NMR证实产物结构。NMR(CDCl₃)：δ12.30(br.s，1H)，10.60(br.s，1H)，9.00(m，IH)，7.80(m，IH)，7.65(m，IH)，7.40(m，2H)，5.60(m，1H)，3.85(m，1H)，3.70(s，3H)，3.50(m，1H)，3.40(s，3H)ppm。

B.制备N-(2，5-二氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)-2-羟基喹啉-3-羧酰胺(7b)

向装有N-(2，2-二甲氧基-5-氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)-2-羟基喹啉-3-羧酰胺(65mg，0.18mmol)的烧瓶中一次性加入三氟乙酸(15mL)。搅拌溶液3小时，然后通过TLC判断反应是否完全。真空除去三氟乙酸，用氮气流干燥产物得到含有约15％副产物的57mg(100％)标题产物，提示是水解产物(酰胺和环氧化物位置；M⁺204)。该固体不作其它鉴定或纯化而用于下一步骤。

C.制备(±)-2-羟基-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)喹啉-3-羧酰胺(8b)

将以上得到的化合物溶解于2/1四氢呋喃/甲醇混合物(36mL)并冷却至0℃。然后一次性加入三乙酰氧基硼氢化钠，将反应升温至室温。搅拌30分钟后，LC-MS判断反应完全。然后蒸发溶剂，并加入甲醇(5mL)。混合物经简单超声处理，在冰浴中冷却15分钟。然后过滤固体，用甲醇(2x2mL)洗涤，收集，高度真空下干燥得到18mg(78％)产物。通过HPLC检测纯度为94％(Restek Pinnacle II柱，C18，5μ，150x 4.6mm；流动相：5％乙腈水溶液(0.1％TFA)，5分钟；然后5到100％乙腈水溶液(0.1％三氟乙酸)，20分钟；流速：1.5毫升/分钟；检测器：316nm(VWD))。通过¹H NMR证实产物结构。NMR(DMSO-d₆)：δ12.70(br.s，1H)，12.50(br.s，1H)，9.00(m，IH)，8.00(m，IH)，7.75(m，IH)，7.40(m，1H)，7.30(m，1H)，6.85(m，1H)，6.65(m，1H)，4.90(m，1H)，3.80(m，1H)，3.40(m，1H)ppm。

实施例3：(±)-3-羟基-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)吡啶酰胺.

¹H NMR.NMR(DMSO-d₆)：δ11.20(br.s，1H)，10.70(br.s，1H)，8.20(m，1H)，7.60(m，1H)，7.50(m，1H)，6.90(m，1H)，6.80(m，1H)，4.90(m，1H)， 3.85(m，1H)，3.45(m，1H)ppm。

实施例4：(±)-4-羟基-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂-双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)-烟酰胺.

¹H NMR.NMR(DMSO-d₆)：δ12.90(br.s，1H)，8.50(m，1H)，7.80(m，1H)，6.90(m，1H)，6.45(m，2H)，4.75(m，1H)，3.80(m，1H)，3.40(m，1H)ppm。

实施例5：(±)-6-氯-4-羟基-喹啉-3-羧酸-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂-双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)-酰胺.

¹H NMR.NMR(DMSO-d₆)：δ13.1(br.s，1H)，12.50(br.s，1H)，8.90(m，1H)，8.20(m，1H)，7.80(m，1H)，7.75(m，1H)，6.90(m，1H)，6.60(m，1H)，4.80(m，1H)，3.80(m，1H)，3.40(m，1H)ppm。

实施例6：(±)-4-羟基-8-三氟甲基-喹啉-3-羧酸-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂-双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)-酰胺.

¹H NMR.NMR(DMSO-d₆)：δ12.30(br.s，1H)，8.75(m，1H)，8.60(m，1H)，8.25(m，1H)，7.70(m，1H)，6.90(m，1H)，6.60(m，1H)，4.80(m，1H)，3.80(m，1H)，3.40(m，1H)ppm。

实施例7：(±)-5-氯-2-羟基-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂-双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)-烟酰胺.

¹H NMR.NMR(DMSO-d₆)：δ13.10(br.s，1H)，12.65(br.s，1H)，8.25(m，1H)，8.20(m，1H)，8.05(m，1H)，6.90(m，1H)，6.55(m，1H)，4.80(m，1H)，3.80(m，1H)，3.40(m，1H)ppm。

实施例8：(±)-4-羟基-2-苯基嘧啶-5-羧酸(2-羟基-5-氧代-7-氧杂-双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)-酰胺.

¹H NMR.NMR(DMSO-d₆)：δ13.70(br.s，1H)，12.00(br.s，1H)，8.75(m，1H)，8.20(m，2H)，7.50(m，3H)，6.90(m，1H)，6.60(m，1H)，4.80(m，1H)， 3.80(m，1H)，3.40(m，1H)ppm。

实施例9：(±)-3-羟基-喹喔啉-2-羧酸(2-羟基-5-氧代-7-氧杂-双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)-酰胺.

¹H NMR.NMR(DMSO-d₆)：δ13.00(br.s，1H)，7.90(m，1H)，7.70(m，1H)，7.40(m，2H)，6.90(m，1H)，6.60(m，1H)，4.80(m，1H)，3.80(m，1H)，3.40(m，1H)ppm.

实施例10：(±)-2-羟基-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂-双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)-6-甲基-烟酰胺.

¹H NMR.NMR(DMSO-d₆)：δ12.60(br.s，1H)，12.20(s，1H)，8.25(m，1H)，6.90(m，1H)，6.60(m，1H)，6.40(m，1H)，4.80(m，1H)，3.80(m，1H)，3.40(m，1H)，2.35(s，3H)ppm.

实施例11：(±)-4-羟基-2-哌啶-1-基-嘧啶-5-羧酸(2-羟基-5-氧代-7-氧杂-双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)-酰胺.

¹H NMR.NMR(DMSO-d₆)：8.50(m，1H)，6.80(m，1H)，6.50(m，1H)，4.75(m，1H)，3.85(m，1H)，3.80(m，4H)，3.40(m，1H)，1.6(m，6H)ppm.

实施例12：(±)-3-羟基-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)哌啶酰胺，甲磺酸盐.

¹H NMRNMR(DMSO-d₆)：δ10.60(br.s，1H)，8.30(m，1H)，7.60(m，1H)，7.50(m，1H)，6.90(m，1H)，5.00(m，1H)，3.80(m，1H)，3.40(m，1H)，3.20(m，1H)，2.20(s，3H)ppm

实施例13：(±)-3-羟基-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧代双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)哌啶酰胺三氟乙酸盐.

¹H NMR.NMR(DMSO-d₆)：δ11.10(br.s，1H)，10.60(br.s)，8.30(m，1H)，7.60(m，1H)，7.50(m，1H)，6.90(m，1H)，6.80(m，1H)，3.80(m，1H)，3.40(m， 1H)ppm.

实施例14：(±)-3-羟基-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)哌啶酰胺甲苯磺酸盐.

¹H NMR.NMR(DMSO-d₆)：δ10.60(br.s，1H)，8.20(m，1H)，7.60(m，1H)，7.50(m，1H)，7.40(m，2H)，7.10(m，2H)，6.80(m，1H)，4.80(m，1H)，3.80(m，1H)，3.40(m，1H)，2.2(s，3H)ppm.

实施例15：(±)-3-羟基-喹啉-2-羧酸-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂-双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)-酰胺.

¹H NMR.NMR(DMSO-d₆)：δ10.90(br.s，1H)，10.80(br.s，1H)，7.90(m，3H)，7.60(m，2H)，6.90(m，1H)，6.80(m，1H)，4.90(m，1H)，3.80(m，1H)，3.40(m，1H)ppm.

实施例16：(±)-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂-双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)-2-甲氧基-烟酰胺.

¹H NMR.NMR(DMSO-d₆)：δ10.70(br.s，1H)，8.40(m，1H)，8.35(m，1H)，7.20(m，1H)，6.90(m，1H)，6.80(m，1H)，4.80(m，1H)，4.05(s，3H)，3.80(m，1H)，3.40(m，1H)ppm.

实施例17：(±)-3-羟基-喹啉-2-羧酸-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂-双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)-酰胺甲磺酸盐

¹H NMR.NMR(DMSO-d₆)：δ10.90(br.s，1H)，10.80(br.s，1H)，7.90(m，3H)，7.60(m，2H)，6.90(m，1H)，4.80(m，1H)，3.80(m，1H)，3.40(m，1H)，2.30(s，3H)ppm.

实施例18：(±)-3-羟基-喹啉-2-羧酸-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂-双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)-酰胺三氟乙酸盐.

¹H NMR.NMR(DMSO-d₆)：δ10.90(br.s，1H)，10.80(br.s，1H)，7.90(m， 3H)，7.60(m，2H)，6.90(m，1H)，6.80(m，1H)4.90(m，1H)，3.90(m，1H)，3.50(m，1H)ppm.

实施例19.(±)-3-羟基-喹啉-2-羧酸-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂-双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)-酰胺甲苯磺酸盐.

¹H NMR.NMR(DMSO-d₆)：δ10.90(br.s，1H)，10.80(br.s，1H)，7.90(m，3H)，7.60(m，2H)，7.40(m，2H)，7.1(m，2H)，6.80(m，1H)4.90(m，1H)，3.90(m，1H)，3.50(m，1H)，2.2(s，3H)ppm.

实施例20：(±)-3-甲氧基-吡啶-2-羧酸(2-羟基-5-氧代-7-氧杂-双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)-酰胺.

¹H NMR.NMR(DMSO-d₆)：δ10.60(br.s，1H)，8.30(m，1H)，7.80(m，1H)，7.65(m，1H)，7.00(m，IH)，5.70(m，1H)，4.90(m，1H)，4.00(s，3H)，3.90(m，1H)，3.40(m，1H)ppm.

实施例21：(±)-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂-双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)-2-甲氧基-烟酰胺三氟乙酸盐.

¹H NMR.NMR(DMSO-d₆)：δ10.70(br.s，1H)，8.40(m，1H)，8.35(m，1H)，7.20(m，1H)，6.90(m，IH)，6.80(m，1H)，4.80(m，1H)，4.05(s，3H)，3.80(m，1H)，3.40(m，1H)ppm.

实施例22：(±)-3-甲氧基-吡啶-2-羧酸(2-羟基-5-氧代-7-氧杂-双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)-酰胺三氟乙酸盐.

¹H NMR.NMR(DMSO-d₆)：δ10.40(br.s，1H)，8.30(m，1H)，7.80(m，1H)，7.65(m，1H)，6.80(m，IH)，4.90(m，1H)，3.90(s，3H)，3.80(m，1H)，3.40(m，1H)ppm.

实施例23：(±)-2-羟基-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂-双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)-6-三氟甲基-烟酰胺.

¹H NMR.NMR(DMSO-d₆)：δ11.80(br.s，1H)，8.50(m，1H)，7.20(m，1H)，6.90(m，1H)，6.80(m，1H)，4.80(m，1H)，3.80(m，1H)，3.40(m，1H)ppm.

实施例24：(±)-4-羟基-2-甲基-嘧啶-5-羧酸(2-羟基-5-氧代-7-氧杂-双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)-酰胺.

¹H NMR.NMR(DMSO-d₆)：δ13.40(br.s，1H)，11.80(br.s，1H)，8.60(s，1H)，6.90(m，IH)，6.60(m，1H)，4.80(m，1H)，3.80(m，1H)，3.40(m，1H)ppm.

实施例25：(±)-2-甲氧基-喹啉-3-羧酸(2-羟基-5-氧代-7-氧杂-双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)-酰胺.

¹H NMR.NMR(DMSO-d₆)：δ10.80(br.s，1H)，9.00(m，1H)，8.10(m，1H)，7.80(m，2H)，7.50(m，IH)，6.90(m，2H)，4.90(m，1H)，4.20(s，3H)，3.90(m，1H)，3.40(m，1H)ppm.

实施例26：(±)-3-甲氧基-吡嗪-2-羧酸(2-羟基-5-氧代-7-氧杂-双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)-酰胺.

¹H NMR.NMR(DMSO-d₆)：δ10.30(br.s，1H)，8.60(s，1H)，8.35(m，1H)，6.80(m，IH)，6.70(m，1H)，4.80(m，1H)，4.00(s，3H)，3.80(m，1H)，3.40(m，1H)ppm.

实施例27：(±)-1-氯-4-羟基-异喹啉-3-羧酸(2-羟基-5-氧代-7-氧杂-双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)-酰胺.

¹H NMR.NMR(DMSO-d₆)：δ12.30(br.s，1H)，10.30(br.s，1H)，8.40(m，2H)，8.10(m，2H)，6.90(m，1H)，6.80(m，1H)，4.80(m，1H)，3.80(m，1H)，3.40(m，1H)ppm.

实施例28：(±)-N-(2，5-二氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)-2-羟基喹啉-3-羧酰胺.

¹H NMR.NMR(DMSO-d₆)：δ12.60(br.s，1H)，10.30(br.s，1H)，9.00(m， 1H)，8.00(m，1H)，7.70(m，1H)，7.5(m，2H)，7.30(m，1H)，4.20(m，1H)，3.90(m，1H)ppm.

实施例29：(±)-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)-8-甲氧基喹啉-7-羧酰胺.

¹H NMR.NMR(DMSO-d₆)：δ11.10(br.s，1H)，9.10(s，1H)，8.50(m，1H)，8.05(m，1H)，7.70(m，1H)，6.90(m，1H)，6.80(m，1H)，4.90(m，1H)，4.35(s，3H)，3.80(m，1H)，3.40(m，1H)ppm.

实施例30：(±)-N-(2，5-二氧代-7-氧杂-双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)-2-甲氧基-烟酰胺.

¹H NMR.NMR(DMSO-d₆)：δ10.60(br.s，1H)，8.50(m，1H)，8.30(m，1H)，7.40(m，1H)，7.20(m，IH)，4.20(m，1H)，4.10(s，3H)，3.95(m，1H)ppm.

实施例31：(±)-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)-3-甲氧基喹啉-2-羧酰胺.

¹H NMR.NMR(DMSO-d₆)：δ10.60(br.s，1H)，8.05(s，1H)，8.00(m，2H)，7.60(m，2H)，6.80(m，1H)，6.60(m，1H)，4.80(m，1H)，3.80(m，1H)，3.40(m，1H)ppm.

实施例32：(±)-N-(2，5-二氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)-8-甲氧基喹啉-7-羧酰胺.

¹H NMR.NMR(DMSO-d₆)：δ11.20(br.s，1H)，9.00(s，1H)，8.50(m，1H)，8.10(m，1H)，7.90(m，1H)，7.70(m，1H)，7.40(m，1H)，4.40(s，3H)，4.20(m，1H)，4.00(m，1H)ppm.

实施例33：(±)-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)-8-甲氧基喹啉-7-羧酰胺三氟乙酸盐.

¹H NMR.NMR(DMSO-d₆)：δ11.20(br.s，1H)，9.00(s，1H)，8.50(m，1H)， 8.10(m，1H)，7.90(m，1H)，7.70(m，1H)，7.00(m，1H)，4.90(s，3H)，3.90(m，1H)ppm.

实施例34：(±)-N-(2，5-二氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)-3-羟基异烟酰胺.

¹H NMR.NMR(DMSO-d₆)：δ8.30(s，1H)，8.00(m，1H)，7.40(m，1H)，4.20(s，1H)，4.00(m，1H)ppm.

实施例35：(±)-N-(2，5-二氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)-2-甲氧基喹啉-3-羧酰胺.

¹H NMR.NMR(DMSO-d₆)：δ11.00(br.s，1H)，9.00(s，1H)，7.90(m，2H)，7.75(m，2H)，7.50(m，1H)，4.40(s，3H)，4.00(s，1H)，3.90(m，1H)ppm.

实施例36：(±)-2-羟基-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)-6-甲氧基喹啉-3-羧酰胺.

¹H NMR.NMR(DMSO-d₆)：δ12.50(br.s，1H)，8.90(m，IH)，7.50(m，IH)，7.40(m，2H)，6.90(m，1H)，6.60(m，1H)，4.90(m，1H)，3.80(m，4H)，3.40(m，1H)ppm.

实施例37：(±)-6-羟基-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)苯并[d]

唑-5-羧酰胺.

采用实施例1的方法制备(±)-6-羟基-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)苯并[d] 唑-5-羧酰胺，但在步骤E中利用6-羟基苯并[d] 唑-5-羧酸代替2-羟基烟酸。

实施例38：(±)-6-羟基-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)苯并[d]噻唑-5-羧酰胺.

采用实施例1的方法制备(±)-6-羟基-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)苯并[d]噻唑-5-羧酰胺，但在步骤E中利用6-羟基苯并[d] 噻唑-5-羧酸代替2-羟基烟酸。

实施例39：(±)-3-羟基-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)哌啶-2-羧酰胺.

采用实施例1的方法制备(±)-3-羟基-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)哌啶-2-羧酰胺，但在步骤E中利用6-羟基哌啶-2-羧酸代替2-羟基烟酸。

实施例40：(±)-3-羟基-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)吡嗪-2-羧酰胺.

采用实施例1的方法制备(±)-3-羟基-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)吡嗪-2-羧酰胺，但在步骤E中利用3-羟基吡嗪-2-羧酸代替2-羟基烟酸。

实施例41：(±)-5-羟基-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)嘧啶-4-羧酰胺.

采用实施例1的方法制备(±)-5-羟基-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)嘧啶-4-羧酰胺，但在步骤E中利用5-羟基嘧啶-4-羧酸代替2-羟基烟酸。

实施例42：(±)-2-羟基-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)-1，8-萘啶-3-羧酰胺.

采用实施例1的方法制备(±)-2-羟基-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)-1，8-萘啶-3-羧酰胺，但在步骤E中利用2-羟基-1，8-萘啶-3-羧酸代替2-羟基烟酸。

实施例43：(±)-7-羟基-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-羧酰胺.

采用实施例1的方法制备(±)-7-羟基-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂双环 [4.1.0]庚-3-烯-3-基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-羧酰胺，但在步骤E中利用7-羟基-吡啶[2，3-d]嘧啶-6-羧酸代替2-羟基烟酸。

实施例44：(±)-4-羟基-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)哒嗪-3-羧酰胺.

采用实施例1的方法制备(±)-4-羟基-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)哒嗪-3-羧酰胺，但在步骤E中利用4-羟基-哒嗪-3-羧酸代替2-羟基烟酸。

实施例45：(±)-4-羟基-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)-1H-吡唑-3-羧酰胺.

采用实施例1的方法制备(±)-4-羟基-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)-1H-吡唑-3-羧酰胺，但在步骤E中利用4-羟基-1H-吡唑-3-羧酸代替2-羟基烟酸。

实施例46：4-羟基-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)呋喃-3-羧酰胺.

采用实施例1的方法制备4-羟基-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)呋喃-3-羧酰胺，但在步骤E中利用4-羟基呋喃-3-羧酸代替2-羟基烟酸。

实施例47：(±)-4-羟基-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)噻吩-3-羧酰胺.

采用实施例1的方法制备(±)-4-羟基-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)噻吩-3-羧酰胺，但在步骤E中利用4-羟基噻吩-3-羧酸代替2-羟基烟酸。

实施例48：(±)-3-羟基-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)异噻唑-4-羧酰胺.

采用实施例1的方法制备(±)-3-羟基-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)异噻唑-4-羧酰胺，但在步骤E中利用3-羟基异噻唑-4-羧酸代替2-羟基烟酸。

实施例49：(±)-3-羟基-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)异

唑-4-羧酰胺.

采用实施例1的方法制备(±)-3-羟基-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)异

唑-4-羧酰胺，但在步骤E中利用3-羟基异

唑-4-羧酸代替2-羟基烟酸。

实施例50：(±)-6-羟基-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)-1H-吲哚-5-羧酰胺.

采用实施例1的方法制备(±)-6-羟基-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)-1H-吲哚-5-羧酰胺，但在步骤E中利用6-羟基-1H-吲哚-5-羧酸代替2-羟基烟酸。

实施例51：(±)-6-羟基-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-5-羧酰胺.

采用实施例1的方法制备(±)-6-羟基-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-5-羧酰胺，但在步骤E中利用6-羟基-1H-苯并[d]咪唑-5-羧酸代替2-羟基烟酸。

实施例52：(±)-2-羟基-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)吗啉-3-羧酰胺.

采用实施例1的方法制备(±)-2-羟基-N-(2-羟基-5-氧代-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-基)吗啉-3-羧酰胺，但在步骤E中利用2-羟基吗啉-3-羧酸代替2-羟基烟酸。

实施例1的化合物抑制细胞中的NF-κB.采用两个报道基因细胞试验来测定实施例1的化合物抑制NF-κB驱动转录的能力。第一个试验是稳定整合了含有3个NF-κB启动子元件的pNF-κB-luc报道质粒的293-细胞试验。第二试验是稳定整合了含有4个NF-κB启动子元件的pTRH1-NF-κB-dscGFP报道质粒的293-细胞试验。用0、0.2、1、10、20和40μM实施例1的化合物处理细胞2小时，然后用20ng/ml TNF-α诱导18小时。诱导后，利用BC(Beckman-Coulter)2300酶标仪定量测定发光或荧光。图1A和B显示分别从发光和荧光数据产生的剂量应答曲线。观察到实施例1的化合物以剂量依赖性方式抑制萤光素酶基因表达，中值IC₅₀(50％抑制浓度)为16.2±1.1μM。实施例1的化合物还以剂量依赖性方式抑制绿色荧光蛋白基因表达，中值IC₅₀为6.2±0.5μM。这些数值代表从3个独立实验得到的中值±标准误差。作为对照，比较0.5％DMSO处理和未处理细胞以验证实施例1载体是否对萤光素酶的表达或试验读数有影响。DMSO处理群体中试验的输出值略有降低，但在统计学上不显著。作为对照的结果，比较与DMSO对照样品相比药物处理样品中活性的降低。

实施例1的化合物的细胞毒性特性.测定实施例1的化合物对人外周血单核细胞(hPBMC)的细胞毒性。参见图2。对于活性试验，用0、0.2、1、10、20和40μM实施例1的化合物处理hPBMC 2小时，然后用20ng/mlTNF-α诱导48小时。采用CellTiter-Glo发光细胞活力试验(普洛迈格(Promega)(目录号G7573))测定活细胞数。代表性实验示于图2。如图所示，测试的最高40μM的实施例1化合物对这些细胞的毒性几乎检测不到。相反，DHMEQ显示在40μM抑制细胞生长高于60％。与未处理hPBMC相比，用0.5％DMSO处理的细胞显示没有可检测的细胞毒性作用。给实施例1的化合物指定选择性指数(细胞毒性CC₅₀对抑制性IC₅₀之比)。根据上述抑制和毒性实验得到的结果，实施例1的化合物显示选择性(即，活性较高，细胞毒性较低)高于DHMEQ。

可溶性IL-2Rα受NF-κB的转录调节.图3证明实施例1处理的细胞影响sIL-2Rα的血清水平。用0、0.2、1、10、20和40μM的实施例1的化合物处理人PBMC同时作PHA-P活化。细胞再培养3天，收集培养液以供标记物评估。图3显示PHA-P活化显著诱导sIL-2Rα。此外，该图明显证明加入实施例1的化合物以剂量依赖性方式影响sIL-2Rα，其中10μM实施例1的化合物产生统计学显著的作用。

实施例1的化合物抑制IL-6和IL-8分泌.在过去几年，对乳腺癌的详细研究认识到HER2、雌激素受体(ER)的过表达和包括p53、BRCA1和BRCA2在内的基因突变通过诱导包括核因子κB在内的多种血管生成性、促细胞凋亡(proapoptotic)调节剂而在乳腺癌的产生和进展中起重要作用。NF-κB在乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌和黑色素瘤中常是组成型活化的。许多研究显示NF-κB的组成型活化导致乳腺癌细胞系不依赖激素的生长进展。

NF-κB信号传导途径在组成型分泌IL-6和IL-8的MDA-MB-231细胞中组成型活化，而加入TNF-α进一步加速该分泌(参见图4A和4B)。观察到实施例1的化合物以剂量依赖性方式抑制MDA-MB-231组成型分泌IL-6和IL-8。即使用TNF-α(20ng/mL)刺激细胞，20μM实施例1的化合物完全抑制这些细胞分泌IL-6和IL-8(图4A和4B)。

巨噬细胞在免疫反应、变态反应和炎症中起重要作用。过度巨噬细胞活化还可增强实体瘤、糖尿病和神经疾病，例如阿尔茨海默病和帕金森病。因此，抑制过度巨噬细胞活性应可用作这些疾病的化疗方法。为进行细胞培养研究，小鼠细胞系RAW264.7常用作巨噬细胞模型。巨噬细胞对微生物及其产物，例如脂多糖(LPS)起反应，通过活化核因子NF-κB而分泌各种炎性细胞因子，包括白介素(IL)-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12和肿瘤坏死因子(TNF)-α，并表达NF-κB-依赖性诱导型NO合酶(iNOS)和环加氧酶-2(COX-2)。主要通过巨噬细胞中的各种Toll-样受体，由胞外信号活化NF-κB。免疫系统对微生物感染的检测和反应取决于称为Toll-样受体(TLR)的模式识别受体家族。这些受体在进化上保守从而能识别病原体相关分子模式(PAMP)，包括来自革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌、DNA和RNA病毒、真菌和原生动物的分子；它们显示极高的靶标特异性。TLR4对于宿主对革兰氏阴性细菌的LPS的有效应答至关重要。

LPS刺激诱导负责前列腺素E2的酶COX-2表达。用实施例1的化合物预处理导致6-12小时时强烈抑制表达。图5A所示下游PGE₂合成中的降低表示LPS-诱导COX-2表达的这种降低是剂量依赖性的。

图5B显示实施例1的化合物以剂量依赖性方式抑制炎性细胞因子IL-6。该抑制作用与MDA-MB-231乳腺癌细胞系中IL-6的抑制作用一致。

RelA/p65的免疫染色.实施例1的化合物导致活化的RelA/p65在细胞质中累积。用DHMEQ或实施例1的化合物(如图所示)与TNFα(20ng/ml)处理Hek293细胞30分钟。温育后，用抗-p65抗体(C-20)抗体(加利福尼亚州圣克鲁斯的圣克鲁斯生物技术公司)免疫染色细胞，用Dapi复染核。利用装有表荧光照明器(epifluorescence illuminator)(莫提克公司，厦门，中国)和ProgRes C3照相机(JP公司，耶拿，德国)的AE31倒置显微镜捕捉图像。合并p65和相应核的各图像作为最终图。对照处理细胞(仅有DMSO)显示TNFα刺激后p65的核累积。1到12μM的实施例1化合物显著阻断TNFα诱导的p65核累积，而DHMEQ需要更高的浓度才能实现相同作用。参见图6。

TransAM NF-κB家族DNA结合ELISA：采用TransAM NF-κB家族结合ELISA(活性基序公司(Active Motif))评估与药物组分接触的活化核提取物或纯化的重组NF-κB蛋白的NF-κB异源二聚体或同源二聚体亚单位的结合活性。室温下，将3-5μgTNFα活化Hela或Raji细胞的核提取物(活性基序公司)或20ng纯化的重组蛋白(活性基序公司的p65和p50，圣克鲁斯生物技术公司的p52)与用不含DTT的完全裂解缓冲液稀释的20μL药物化合物温育1小时。然后将处理的样品转移至NF-κB共有寡核苷酸预包被的微量板孔的30μL完全结合缓冲液(含DTT)。对照包括含有裂解缓冲液而不含任何提取物或重组蛋白的非特异性结合(NSB)孔(背景)，含有仅用DMSO处理的核提取物或重组蛋白的孔(最大结合)，和含有提取物/蛋白加上20皮摩尔游离野生型NF-κB寡核苷酸作为竞争物或20皮摩尔游离突变型NF-κB寡核苷酸作为对照的孔来测定特异性。平板在室温下温育1小时并温和振荡，然后用200μL 1x洗涤缓冲液洗涤3次。用100μL该亚单位的特异性一抗(用1x抗体缓冲液作1∶1000稀释)检测与平板结合的NF-κBp65、p50、p52、RelB或c-Rel亚单位。室温下温育平板1小时，然后用200μL 1x洗涤缓冲液洗涤3次。然后将100μL HRP偶联的山羊抗家兔抗体 (用1x抗体缓冲液作1∶1,000稀释)加入各孔。室温下温育平板1小时，然后用200μL 1x洗涤缓冲液洗涤4次。将100μL室温显影液加入各孔。反应显影2-10分钟直至产生中等深蓝色(取决于所用提取物批次或重组蛋白批次中的亚单位活性)，然后用100μL终止液终止反应，产生黄色。利用B-D(Becton-Dickinson)DTX 880多模检测器记录450nm的吸光度，扣除620nm的参比波长。图7和8说明实施例2、DHMEQ和小白菊内酯对抑制RelA和RelB结合NF-κB位点的作用。

除了实施例1和2的化合物，表1列出了其它化合物抑制1)HEK293细胞中NF-κB驱动萤光素酶和GFP表达，2)RAW264细胞释放Il-6和PGE2，和3)RelA、RelB、c-Rel、p50和p52结合NF-κB位点的活性。

表1.化合物抑制NF-κB驱动报道基因表达、阻止细胞因子释放和抑制Rel蛋白结合NF-κB位点的药理学活性。(N/D：未测定)

在一系列体外实验中，本发明的NF-κB抑制剂阻止细胞因子释放和广谱癌症细胞系生长。这些化合物不抑制细胞色素P450活性或阻断hERG通道。在啮齿类疾病模型中评估了几种化合物以供功效研究。我们首先试图获得化合物在多发性骨髓瘤中的体内功效，该疾病的经典和非经典途径的组成型活化发生率均高。在人RPMI8226多发性骨髓瘤的异种移植模型中，实施例2的化合物获得的肿瘤生长降低水平与PS-341(硼替佐米，Velcade

)相同，后者批准作为该适应症的一线治疗(参见图9)。此外，实施例2的化合物比PS-341的耐受性好。然而，统计学分析显示PS-341或实施例2处理均未获得统计学显著的肿瘤生长抑制作用(P＞0.05)。

抑制多聚(ADP-核糖)聚合酶-1(PARP-1)或下调p65(RelA)能增强针对癌症细胞系的射线(IR)-诱导细胞毒性。在本项研究中，在野生型小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)或PARP-1^-/-或p65^-/-MEF中评估新型小分子p65(RelA) 抑制剂作为射线增敏剂。克隆原存活试验中发现p65^-/-MEF对IR比p65^+/+MEF敏感≥2-倍，因此证明NF-κB活化赋予射线耐受性。与实施例2的化合物(1.4μM，非细胞毒性剂量)温育使得p65^+/+MEF对射线敏感(与单用IR的2.3Gy相比，IR+实施例2的化合物的LD₅₀值是1.5Gy)。实施例2的化合物对p65^-/-MEF的辐射致敏没有进一步的影响，表明实施例2的化合物的药理学作用由p65介导。采用RNA干扰技术下调p65^+/+MEF而非p65^-/-MEF中的p65表达水平(＞95％)观察到相似的辐射致敏作用。然后在PARP-1^+/+或PARP-1^-/-MEF中测试实施例2的化合物。证明实施例2的化合物(1.4μM)处理或p65的siRNA下调均增加PARP-1^+/+而非PARP-1^-/-MEF对IR的辐射敏感性，提示PARP-1在NF-κB途径活化的上游。还在MEF中证实了实施例2的化合物或p65 siRNA对NF-κB的抑制。10Gy IR后，p65^+/+MEF中的NF-κB-依赖性萤光素酶表达增加2.5-倍。用实施例2的化合物或p65 siRNA处理显著降低萤光素酶基因转录。类似地，IR增加p65^+/+MEF核提取物NF-κB DNA结合活性两倍，通过实施例2的化合物温育或p65 siRNA处理显著降低这些细胞中的该活性。该p65抑制剂经证明能增强体外放射性，与以前显示的PARP-1抑制剂能做到的一样。需要其它体内研究以完全了解实施例2的化合物作为辐射增敏剂的潜在应用。

另一研究的目的是在酶和放射性配体结合试验中评估实施例2化合物的活性。该研究中采用的方法自科技文献改进以尽可能提高可靠性和再现性。参比标准品作为各试验的组成部分运行以确保所得结果的有效性。利用

(ID商业解决方案有限公司(ID Business Solutions Ltd.)，英国)，通过非线性、最小二乘回归分析测定IC₅₀值。采用Cheng和Prusoff的方程(Cheng 1973)，利用观察到的测试化合物的IC₅₀，试验所用放射性配体的浓度和配体的K¹的历史值(实验获得)计算抑制常数(K3/4)值。利用

计算决定竞争性结合曲线斜率的希尔系数(n1/2)。希尔系数明显不同于1.0，可能提示结合置换不符合单一结合位点的质量作用规则。如果没有提供IC₅₀、K3/4和/或n1/2数据的平均值标准误差(SEM)，数据对于定量不充分。如果需要，在本报道的附件中提供各反应。图11显示的结果没有估算的IC₅₀和/或K3/4值，因为没有抑制作用超过50％。

RNA干扰筛选鉴定到p53和ras突变是NF-κB的经典和非经典途径合成致死性的(Barbie 2009；Meylan 2009)。合成抑制剂能拮抗RelA(p65)、RelB和c-rel与NF-κB位点结合，因此能抑制经典和非经典途径。一种此类示范性化合物是实施例2的化合物，其在野生型和p65^-/-小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中作为辐射致敏剂，和在p53缺陷型和KRAS(G13D)突变型乳腺癌细胞系MDA-MB-231中作为辐射致敏剂和化疗剂进行评估。克隆原存活试验中发现p65^-/-MEF对射线(IR)比p65^+/+MEF敏感≥2-倍，因此证明NF-κB活化赋予射线耐受性。与实施例2的化合物(1.4μM，非细胞毒性浓度)温育使得p65^+/+MEF对射线敏感(与单用IR的2.3Gy相比，IR+实施例2的化合物的LD₅₀值是1.5Gy)。实施例2的化合物对p65^-/-MEF的辐射致敏没作用，表明实施例2的化合物的辐射致敏作用由p65介导。采用RNA干扰技术下调p65^+/+MEF而非p65^-/-MEF中的p65表达水平＞95％观察到相似的辐射致敏作用。还在MEF中证实了实施例2的化合物或p65siRNA对NF-κB的抑制。10Gy IR后，p65^+/+MEF中的NF-κB-依赖性萤光素酶表达增加2.5-倍。用实施例2的化合物或p65siRNA处理显著降低萤光素酶表达。类似地，IR增加p65^+/+MEF核提取物NF-κB DNA结合活性两倍，通过实施例2的化合物温育或p65siRNA处理显著降低这些细胞中的该活性。

还在组成型NF-κB活化的MDA-MB-231乳腺癌细胞中研究了实施例2的化合物。首先测试实施例2的化合物作为单一试剂对乳腺癌细胞生长的作用。观察到实施例2的化合物对MDA-MB-231细胞的显著细胞毒性作用，LD₅₀值为0.4μM。然后测试这些细胞中实施例2的化合物与射线的协同作用。观察到与0.2μM实施例2的化合物温育显著增强辐射作用1.5倍(与单用IR的2.55Gy相比，IR+实施例2的化合物的LD₅₀值是1.66Gy)。描述的这些研究证明NF-κB的Rel抑制剂能通过阻断经典途径增强放射性。其还能选择性杀伤具有p53和KARS突变的肿瘤细胞，可能是通过阻断经典和非经典途径。

类风湿性关节炎的最近基因组广泛相关性研究鉴定到编码c-Rel的REL基因座作为新确定的该疾病的风险因素(Gregersen 2009)。c-Rel是转录因子NF-κB家族的一员，介导NF-κB的经典和非经典途径。遗传缺失 c-Rel的小鼠耐受胶原诱导的关节炎。合成的低分子量抑制剂阻断c-Rel、RelA和RelB与NF-κB位点结合。在胶原诱导关节炎的小鼠模型中测试实施例2的化合物—NF-κB的经典和非经典途径的双重抑制剂—的抗炎活性。在类风湿性关节炎的小鼠模型中比较实施例2的化合物与依那西普(TNFα阻断剂)的作用。在第1天和第21天，在尾部注射牛CII胶原使得雄性DBA小鼠产生关节炎。各组动物(n＝10)作以下处理：1)假手术，2)载体(DMSO)，3)依那西普(50微克/小鼠，腹膜内，每日，第21天-第35天)，4)实施例2的化合物(15mg/kg，皮下，每日，第21天-第35天)，5)实施例2的化合物(15mg/kg，腹膜内，每日，第21天-第35天)，6)实施例2的化合物(50mg/kg，腹膜内，每日，第21天-第35天)。关节炎指数评分评估到实施例2的化合物处理显著降低小鼠后爪红斑和肿胀，与依那西普处理相当(图10)。依那西普和实施例2的化合物均降低爪水肿(与载体组相比，P＜0.01)。在所有实验组中，小鼠的体重丧失未观察到显著不同。第35天对关节的组织学评估显示实施例2的化合物或依那西普处理的小鼠中炎症显著减轻。检测髓过氧化物酶活性显示实施例2的化合物或依那西普处理导致粒细胞溶菌酶特异性酶相伴降低。总之，我们证明NF-κB的Rel抑制剂能保护小鼠免于产生炎性关节炎。在小鼠类风湿性关节炎模型中实施例2的化合物的抗炎活性与依那西普等的相当。实施例2的化合物的功效在小鼠良好耐受的剂量下实现。

本发明的NF-κB抑制剂在结肠炎动物模型中作为抗炎剂、作为实体瘤的照射疗法的辐射致敏剂、作为单用或与各种批准的癌症药物联用的化疗剂进行测试。鉴定了经典和非经典途径的双重抑制剂和经典途径的单一抑制剂。

无需进一步描述，相信本领域普通技术人员采用以上描述和示范性实施例可制备和利用本发明化合物并实施本发明方法。虽然参考各种具体的材料、方法和实施例描述和说明了本发明，但应该知道本发明不限于为该目的而选择的材料和方法的特定组合。本领域技术人员应知道此类细节暗示有多种变化。本申请通篇引用的所有专利、专利申请和其它参考文献通过引用全文纳入本文。

参考文献

Aggarwal BB，Shishodia S，Sandur SK，Pandey MK，Sethi G(2006)炎症和癌症：联系有多紧密？(Inflammation and cancer：how hot is the link？)Biochem Pharmacol 72(11)：1605-1621；

Arcaroli J，Silva E，Maloney JP，He Q，Svetkauskaite D，Murphy JR，Abraham E(2006)变体IRAK-1单倍型与核因子-κB活化增加和脓毒症结果恶化相关(Variant IRAK-1 haplotype is associated with increased nuclear factor-kappaB activation and worse outcomes in sepsis).Am J Respir Crit Care Med 173(12)：1335-1341；

Argyropoulos C，Mouzaki A(2006)HIV疾病中的免疫抑制药物(Immunosuppressive drugs in HIV disease).Curr Top Med Chem 6(16)：1769-1789；

Ariga A，Namekawa J-i，Matsumoto N，Inoue J-i，Umezawa K(2002)脱羟基甲基环氧醌霉素抑制肿瘤坏死因子α诱导核转移和NF-κB活化(Inhibition of tumor necrosis factor0alpha-induced nuclear translocation and activation of NF-kappaB by dehydroxymethylepoxyquinomicin).J.Biol.Chem.277(27)：24625-24630；

Atreya I，Atreya R，Neurath MF(2008)炎性肠病中的NF-κB(NF-kappaB in inflammatory bowel disease).J Intern Med 263(6)：591-596；

Baba M(2006)HIV-1基因表达抑制剂的最新状况(Recent status of HIV-1 gene expression inhibitors).Antiviral Res 71(2-3)：301-306；

Barbie DA，Tamayo P，Boehm JS等.(2009)全身性RNA干扰揭示致癌KRAS-驱动癌症需要TBK1(Systematic RNA interference reveals that oncogenic KRAS-driven cancers require TBK1).Nature 462(7269)：108-112；

Barnes PJ(1997)核因子-κB(Nuclear factor-kappa B).Int J Biochem Cell Biol 29(6)：867-870；

Bosisio D，Marazzi I，Agresti A，Shimizu N，Bianchi ME，Natoli G(2006)启动子结合的和核浆二聚体控制NF-κB-依赖性基因活性之间的高度动力学平衡(A hyper-dynamic equilibrium between promoter-bound and nucleoplasmic dimers controls NF-kappaB-dependent gene activity).Embo J25(4)：798-810；

Bouma G，Strober W(2003)炎性肠病的免疫学和遗传基础(The immunological and genetic basis of inflammatory bowel disease).Nat Rev Immunol 3(7)：521-533；

Burstein E，Duckett CS(2003)为NF-κB而死？通过凋亡机制的转录调控来控制细胞死亡(Dying for NF-kappaB？Control of cell death by transcriptional regulation of the apoptotic machinery).Curr Opin Cell Biol15(6)：732-737；

Calzado MA，Bacher S，Schmitz ML(2007)治疗炎性疾病和癌症的NF-κB抑制剂(NF-kappaB inhibitors for the treatment of inflammatory diseases and cancer).Curr Med Chem 14(3)：367-376；

Chaicharoenpong C，Kato K，Umezawa K(2002)作为NF-κB功能抑制剂的脱羟基甲基环氧醌霉素类似物的合成和结构活性关系(Synthesis and structure-activity relationship of dehydroxymethylepoxyquinomicin analogues as inhibitors of NF-kappaB functions).Bioorg Med Chem 10(12)：3933-3999；

Cheng Y，Prusoff WH(1973)抑制常数(K1)与导致酶反应50％抑制的抑制剂浓度(I50)之间的关系(Relationship between the inhibition constant(K1)and the concentration of inhibitor which causes 50 per cent inhibition(I50)of an enzymatic reaction)Biochem.Pharmacol.22：3099-3108；

Dejardin E(2006)其它NF-κB途径的生物化学到生物学特性：未来药物开发的陷阱和希望(The alternative NF-kappaB pathway from biochemistry to biology：pitfalls and promises for future drug development.)Biochem.Pharmacol.72：1161-1179；

Flory E，Kunz M，Scheller C，Jassoy C，Stauber R，Rapp UR，Ludwig S(2000)流感病毒诱导NF-κB-依赖性基因表达由病毒蛋白过表达介导并涉及氧化自由基和IκB激酶的活化(Influenza virus-induced NF-kappaB-dependent gene expression is mediated by overexpression of viral proteins and involves oxidative radicals and activation of IkappaB kinase).JBiol Chem 275(12)：8307-8314；

Giri RK，Rajagopal V，Shahi S，Zlokovic BV，Kalra VK(2005)单核细胞中淀粉样肽诱导CCR5表达和Egr-1的siRNA对其抑制的机制(Mechanism of amyloid peptide induced CCR5 expression in monocytes and its inhibition by siRNA for Egr-1).Am J Physiol Cell Physiol 289(2)：C264-276；

Goldring SR，Jasty M，Roelke MS，Rourke CM，Bringhurst FR，Harris WH(1986)骨-牙骨质界面滑膜样膜的形成。其在全髋关节置换后的骨再吸收和植入体松散中的作用(Formation of a synovial-like membrane at the bone-cement interface.Its role in bone resorption and implant loosening after total hip replacement).Arthritis Rheum 29(7)：836-842；

Greten FR，Karin M(2004)IKK/NF-κB活化途径-预防和治疗癌症的靶标(The IKK/NF-kappaB activation pathway-a target for prevention and treatment of cancer).Cancer Lett 206(2)：193-199；

Gregersen PK，Amos CL，Lee At等.(2009)编码转录因子的NF-κB家族成员的REL是类风湿性关节炎的新确定风险基因座(REL，encoding a member of the NF-kappaB family of transcription factors，is a newly defined risk locus for rheumatoid arthritis).Nat Genet 41(7)：820-823；

Hacker H，Karin M(2006)IKK和IKK-相关激酶的调控和功能(Regulation and function of IKK and IKK-related kinases).Sci STKE 2006(357)：re13；

Harris WH(1995)问题在于骨质溶解(The problem is osteolysis).Clin Orthop Relat Res(311)：46-53；

Hayden MS，Ghosh S(2004)向NF-κB的信号传导(Signaling to NF-kappaB).Genes Dev 18(18)：2195-2224；

Hayden MS，West AP，Ghosh S(2006a)NF-κB和免疫反应(NF-kappaB and the immune response).Oncogene 25(51)：6758-6780；

Hayden MS，West AP，Ghosh S(2006b)简述：NF-κB信号传导途径(SnapShot：NF-kappaB Signaling Pathways).Cell 127(6)：1286-1287；

Helbig G，Christopherson KW，2nd，Bhat-Nakshatri P，Kumar S，Kishimoto H，Miller KD，Broxmeyer HE，Nakshatri H(2003)NF-κB通过诱导趋化因子受体CXCR4表达来促进乳腺癌细胞迁移和转移(NF-kappaB promotes breast cancer cell migration and metastasis by inducing the expression of the chemokine receptor CXCR4).J Biol Chem 278(24)：21631-21638；

Iordanskiy S，Iordanskaya T，Quivy V，Van Lint C，Bukrinsky M(2002)百日咳毒素的B-寡聚物通过阻止NF-κB p65亚单位活性来抑制HIV-1 LTR-驱动转录(B-oligomer of pertussis toxin inhibits HIV-1 LTR-driven transcription through suppression of NF-kappaB p65 subunit activity).Virology 302(1)：195-206；

Israel A(2000)IKK复合物：活化NF-κB的所有信号的集合体(The IKK complex：an integrator of all signals that activate NF-kappaB？)Trends Cell Biol 10(4)：129-133；

Jung M，Zhang Y，Lee S，Dritschilo A(1995)通过截短的IκB-α校正运动失调性毛细血管扩张症细胞中的辐射敏感性(Correction of radiation sensitivity in ataxia telangiectasia cells by a truncated I kappa B-alpha).Science 268(5217)：1619-1621；

Karin M(1999)如何活化NF-κB：IκB激酶(IKK)复合物的作用(How NF-kappaB is activated：the role of the IkappaB kinase(IKK)complex).Oncogene 18(49)：6867-6874；

Karin M(2006)癌症产生和进展中的核因子-κB(Nuclear factor-kappaB in cancer development and progression).Nature 441(7092)：431-436；

Ketas TJ，Kuhmann SE，Palmer A，Zurita J，He W，Ahuja SK，Klasse PJ，Moore JP(2007)CCR5的细胞表面表达和其它宿主因子影响CCR5配体抑制HIV-1感染人淋巴细胞(Cell surface expression of CCR5 and other host factors influence the inhibition of HIV-1 infection of human lymphocytes by CCR5 ligands).Virology 364(2)：281-90；

Lawrence RC，Helmick CG，Arnett FC，Deyo RA，Felson DT，Giannini EH，Heyse SP，Hirsch R，Hochberg MC，Hunder GG，Liang MH，Pillemer SR，Steen VD，Wolfe F(1998)美国关节炎和所选肌肉骨骼疾病的流行性的估计(Estimates of the prevalence of arthritis and selected musculoskeletal disorders in the United States).Arthritis Rheum 41(5)：778-799；

Liao F，Andalibi A，Qiao JH，Allayee H，Fogelman AM，Lusis AJ(1994)小鼠中介导氧化应激、炎性基因诱导和主动脉脂肪纹形成的共有途径的遗传证据(Genetic evidence for a common pathway mediating oxidative stress，inflammatory gene induction.and aortic fatty streak formation in mice).J Clin Invest 94(2)：877-884；

Liu R，Zhao X，Gurney TA，Landau NR(1998)邻近CCR5启动子的功能分析(Functional analysis of the proximal CCR5promoter).AIDS Res Hum Retroviruses 14(17)：1509-1519；

Maruyama I，Shigeta K，Miyahara H，Nakajima T，Shin H，Ide S，Kitajima I(1997)凝血酶通过凝血酶受体活化NF-κB并导致血管平滑肌细胞增殖：凝血酶在动脉粥样硬化和再狭窄中的作用(Thrombin activates NF-kappa B through thrombin receptor and results in proliferation of vascular smooth muscle cells：role of thrombin in atherosclerosis and restenosis).Ann N Y Acad Sci 811：429-436；

Meylan E，Dooley AL，Feldser DM等.(2009)肺腺癌的小鼠模型需要NF-κB信号传导(Requirement for NF-kappaB signalling in a mouse model of lung adenocarcinoma).Nature 462(7269)：104-107；

Mukerjee R，Sawaya BE，Khalili K，Amini S(2006)p65和C/EBPβ与HIV-1 LTR结合调节病毒启动子转录(Association of p65 and C/EBPbeta with HIV-1 LTR modulates transcription of the viral promoter).J Cell Biochem100(5)：1210-6；

Natoli G，Saccani S，Bosisio D，Marazzi I(2005)NF-κB与染色质相互作用：处于正确时间正确位置的艺术(Interactions of NF-kappaB with chromatin：the art of being at the right place at the right time).Nat Immunol 6(5)：439-445；Neurath MF，Fuss I，Schurmann G，Pettersson S，Arnold K， Muller-Lobeck H，Strober W，Herfarth C，Buschenfelde KH(1998)炎性肠病患者中NF-κB家族成员促进细胞因子基因转录(Cytokine gene transcription by NF-kappa B family members in patients with inflammatory bowel disease).Ann N Y Acad Sci 859：149-159；

Niu J，Azfer A，Kolattukudy PE(2008)可溶性Fas的心脏特异性表达对小鼠的脂多糖诱导心肌功能障碍的保护作用(Protection against lipopolysaccharide-induced myocardial dysfunction in mice by cardiac-specific expression of soluble Fas).J Mol Cell Cardiol 44(1)：160-169；

Pahl HL.Baeuerle PA(1995)流感病毒血凝素的表达活化转录因子NF-κB(Expression of influenza virus hemagglutinin activates transcription factor NF-kappa B).J Virol 69(3)：1480-1484；

Palmieri C，Trimboli F，Puca A，Fiume G，Scala G，Quinto I(2004)NF-κB的IκB-αS32/36A阻遏剂抑制原代人单核细胞中的HIV-1复制(Inhibition of HIV-1 replication in primary human monocytes by the IkappaB-alphaS32/36A repressor of NF-kappaB).Retrovirology 1(1)：45；

Pihlstrom BL，Michalowicz BS，Johnson NW(2005)牙周病(Periodontal diseases).Lancet 366(9499)：1809-1820；

Platt EJ，Wehrly K，Kuhmann SE，Chesebro B，Kabat D(1998)CCR5和CD4细胞表面浓度对1型人免疫缺陷病毒的巨噬细胞分离物所致感染的影响(Effects of CCR5 and CD4 cell surface concentrations on infections by macrophagetropic isolates of human immunodeficiency virus type 1).J Virol 72(4)：2855-2864；

Reeves JD，Gallo SA，Ahmad N，Miamidian JL，Harvey PE，Sharron M，Pohlmann S，Sfakianos JN，Derdeyn CA，Blumenthal R，Hunter E，Doms RW(2002)HIV-1对进入抑制剂的敏感性与包膜/共受体亲和力、受体密度和融合动力学相关(Sensitivity of HIV-1 to entry inhibitors correlates with envelope/coreceptor affinity，receptor density，and fusion kinetics).Proc Natl Acad Sci U S A99(25)：16249-16254；

Rizzi C，Alfano M，Bugatti A，Camozzi M，Poli G，Rusnati M(2004)百日咳毒素B-寡聚物抑制胞内和胞外Tat功能和HIV表达(Inhibition of intra-and extra-cellular Tat function and HIV expression by pertussis toxin B-oligomer).Eur J Immunol 34(2)：530-536；

Saccani S，Marazzi I，Beg AA，Natoli G(2004)启动子结合的p65/RelA的降解对于促进核因子κB反应终止至关重要(Degradation of promoter-bound p65/RelA is essential for the prompt termination of the nuclear factor kappaB response).J Exp Med 200(1)：107-113；

Scheidereit C(2006)IκB激酶复合物：NF-κB活化和转录的途径(IkappaB kinase complexes：gateways to NF-kappaB activation and transcription).Oncogene 25(51)：6685-6705；

Sui Z，Sniderhan LF，Fan S，Kazmierczak K，Reisinger E，Kovacs AD，Potash MJ，Dewhurst S，Gelbard HA，Maggirwar SB(2006)人免疫缺陷病毒编码Tat活化糖原合酶激酶-3β以拮抗神经元中核因子-κB存活途径(Human immunodeficiency virus-encoded Tat activates glycogen synthase kinase-3beta to antagonize nuclear factor-kappaB survival pathway in neurons).Eur J Neurosci 23(10)：2623-2634；

Takeuich T，Umezawa K，To-E S，Matsumoto N，Sawa T，Yoshioka T，Agata N，Hirano S-i，Isshiki K(2003)水杨酰胺衍生物(Salicylamide deratives).美国专利6,566,394 B1；

Tergaonkar V(2006)NFκB途径：良好的信号传导模式和治疗靶标(NFkappaB pathway：a good signaling paradigm and therapeutic target).Int J Biochem Cell Biol 38(10)：1647-1653；

Tilg H，Moschen AR，Kaser A，Pines A，Dotan I(2008)肠道、炎症和骨质疏松症：基础和临床概念(Gut，inflammation and osteoporosis：basic and clinical concepts).Gut 57(5)：684-694；

Suzuki Y，Sugiyama C，Ohno O，Umezawa K(2004)一种新型NF-κB抑制剂-光学活性脱羟基甲基环氧醌霉素的制备和生物学活性(Preparation and biological activities of optically active dehydroxymethylepoxyquinomicin，a novel NF-kB inhibitor).Tetrahedron 60：7061-7066；

Umezawa K(2006)NF-κB抑制剂抑制肿瘤生长(Inhibition of tumor growth by NF-kappaB inhibitors).Cancer Sci 97(10)：990-995；

Williams SA，Chen LF，Kwon H，Ruiz-Jarabo CM，Verdin E，Greene WC(2006)NF-κB p50通过HDAC募集和阻遏转录起始而促进HIV潜伏(NF-kappaB p50 promotes HIV latency through HDAC recruitment and repression of transcriptional initiation).Embo J 25(1)：139-149；

Williams SA，Kwon H，Chen LF，Greene WC(2007)潜伏HIV-1的有效表达需要持续诱导NF-κB(Sustained Induction of NF-{kappa}B Is Required for Efficient Expression of Latent HIV-1).J Virol 81(11)：6043-56.；

Wirtz S，Neurath MF(2007)炎性肠病的小鼠模型(Mouse models of inflammatory bowel disease).Adv Drug Deliv Rev59(11)：1073-1083；

Yamamoto M，Horie R，Takeiri M，Kozawa I，Umezawa K(2008)通过(-)-脱羟基甲基环氧醌霉素与特定半胱氨酸残基的共价结合灭活NF-κB抑制剂组分(Inactivation of NF-kappaB components by covalent binding of (-)-dehydroxymethylepoxyquinomicin to specific cysteine residues).J.Med Chem 51(8)：5780-5788。

Claims

1.一种式(1)或式(2)所示化合物或其药学上可接受的盐：

式中：

HET是饱和或不饱和的单环或多环碳环，其中一个或多个环碳原子被N、S、P或O替代；

各R¹独立为氢；CF₃；任选用以下取代的苯基：氰基、卤素、硝基、羟基、(C1-C6)烃基、(C1-C6)烃基-OH、(C1-C6)烷氧基、COR³、NR⁴R⁵或NHCO(C1-C6)烃基)；氰基；卤素；硝基；羟基；(C1-C6)烃基；(C1-C6)烃基-OH；(C1-C6)烷氧基；(C1-C6)硫代烷氧基；苯氧基；COR³；NR⁴R⁵；NHCO(C1-C6)烃基；SO₂(C1-C6)烃基；或SO₂NR⁴R⁵；

R²是H、R⁶、COR⁶、CONHR⁶、COOR⁶、CH₂OCOR⁶、P(O)(OH)₂、P(O)(O(C1-C6)烃基)₂、P(O)(OCH₂OCO(C1-C6)烃基)₂、P(O)(OH)(OCH₂OCO(C1-C6)烃基)、P(O)(OH)(OC1-C6)烃基)或P(O)(OH)(C1-C6)烃基)，糖基或P(O)(OH)₂、P(O)(O(C1-C6)烃基)₂、P(O)(OCH₂OCO(C1-C6)烃基)₂、P(O)(OH)(OCH₂OCO(C1-C6)烃基)、P(O)(OH)(OC1-C6)烃基)或P(O)(OH)(C1-C6)烃基)的无机盐；

R⁶是C1-C6烃基、三氟甲基、(C3-C6)环烃基、环己基甲基或苯基，其中所述苯基被0到4个选自以下的基团取代：氟、氯、溴、羟基、三氟甲基、(C1-C4)烃基、(C1-C4)烷氧基和苯基甲基，其中所述苯基甲基在苯环上被0到4个选自以下的基团取代：氟、氯、溴、羟基、三氟甲基、(C1-C4)烃基、(C1-C4)烷氧基、2-，3-或-4-吡啶基和2-，-4-或5-嘧啶基；

R³独立为羟基、(C1-C6)烷氧基、苯氧基或-NR⁴R⁵；

R⁴和R⁵各自独立为氢、(C1-C6)烃基或(C3-C6)环烃基；和

n＝0-3，

其中HET上，在OR²基团和酰胺部分之间是邻位关系。

2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，R²＝H。

3.如权利要求1或2所述的化合物，其特征在于，HET是吡啶基，n＝0。

4.具有式(3)所示结构的权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐

式中R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶和n如权利要求1中限定。

5.如权利要求4所述的化合物，其特征在于，R²＝H。

6.一种药物组合物，其包含权利要求1所述的式(1)或式(2)所示化合物或其药学上可接受的盐并与药学上有效的稀释剂或载体组合。

7.一种药物组合物，其包含权利要求4所述的式(3)所示化合物或其药学上可接受的盐并与药学上有效的稀释剂或载体组合。

8.一种与抑制NF-κB活化相关的治疗哺乳动物疾病的方法，包括给予有此需要的哺乳动物有效量的权利要求1所述的式(1)或式(2)所示化合物或其药学上可接受的盐。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述疾病选自：癌症、炎症、自身免疫疾病、糖尿病和糖尿病并发症、感染、心血管疾病和缺血-再灌注损伤。

10.一种与抑制NF-κB活化相关的治疗哺乳动物疾病的方法，包括给予有此需要的哺乳动物有效量的权利要求4所述的式(3)所示化合物或其药学上可接受的盐。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述疾病选自：癌症、炎症、自身免疫疾病、糖尿病和糖尿病并发症、感染、心血管疾病和缺血-再灌注损伤。

12.如权利要求9或11所述的方法，其特征在于，所述疾病是癌症。

13.如权利要求9或11所述的方法，其特征在于，所述疾病是糖尿病。