CN102409030A - 谷氨酸脱氢酶的一种提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种谷氨酸脱氢酶的提取方法，属于生物技术领域。该方法的主要步骤为：动物肝脏原料预处理、粗酶制备、酸沉淀、硫酸铵盐析、磷酸钙凝胶吸附、透析、柱层析、冷冻干燥获得谷氨酸脱氢酶成品。本发明工艺成熟，操作简单、安全，成本低，提取率高，产品回收率可达到17％以上，产品活性高，比酶活可达到7900U/mg以上，同时可实现资源的高效利用，减少废液排放，有效降低环境污染，适合于大规模生产。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及以动物肝脏为原料提取谷氨酸脱氢酶的一种方法。
背景技术
谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase)是一种催化使氨还原性地固定到α-酮戊二酸上形成谷氨酸反应的酶。它广泛分布于细菌、酵母、植物和哺乳动物组织中，其中动物肝脏内含量最高，该酶在氮素代谢中起着中心作用，对细胞内氨的固定或氢的转运起着重要的生物学作用，催化反应如下所示，可将氨固定形成谷氨酸，氨基被用于许多其他氨基酸的合成中。目前，谷氨酸脱氢酶已应用到医疗诊断中，此外，谷氨酸脱氢酶是制备尿素氮试剂盒(速率法)的必需酶之一。
国内研制尿素氮试剂盒所用的谷氨酸脱氢酶大多从国外进口，因此试剂盒的成本较高，为降低其成本必须解决谷氨酸脱氢酶的来源问题。国内有关谷氨酸脱氢酶的研究较少，医疗诊断用酶一直靠进口供给，因此，加强对谷氨酸脱氢酶的提取研究具有重要意义。
发明内容
本发明提供了谷氨酸脱氢酶的一种提取方法，依此法可以有效提高谷氨酸脱氢酶的回收率和产品纯度，降低生产成本，提高废弃物的利用率，减少环境污染。
谷氨酸脱氢酶的一种提取方法，主要通过如下技术方案实现：
(1)粗酶液的制备
称取定量的动物新鲜肝脏，在高速组织捣碎机中捣碎10分钟(2000rmp)，加入0.05M，pH 7.6磷酸盐缓冲液(内含0.15M NaCl)，充分搅拌，置4℃冰箱中过夜抽提，8000rmp离心20分钟，收集上清液获得粗酶液。
(2)酸沉淀
所得粗酶液用10％酸溶液调节pH，4℃放置1小时(期间缓慢搅拌数次)，8000rmp离心15分钟，沉淀用0.1M pH 7.6磷酸缓冲液溶解。
(3)(NH4)2SO4盐析
第一次盐析：取定量上述酸沉淀溶解液，在室温下慢慢加入固体(NH4)2SO4到29％饱和度，4℃过夜，8000rmp离心10分钟。
第二次盐析：取29％(NH4)2SO4盐析后的上清液定量，加固体(NH4)2SO4到48％饱和度，4℃过夜，离心，沉淀溶解在pH 7.6的磷酸缓冲液中。
第三次盐析：在48％硫酸铵饱和度盐析沉淀溶解液中加(NH4)2SO4至49％饱和度，沉淀溶解在pH 7.6磷酸盐缓冲液中。
(4)磷酸钙凝胶吸附
取定量49％(NH4)2SO4盐析沉淀溶解液按比例加Ca3(PO4)2凝胶，充分搅拌，4℃冰箱过夜，得上清液。
(5)柱层析
磷酸钙凝胶吸附溶液4℃透析后，浓缩上样，用磷酸缓冲液(0.05mol/L，pH7.6)进行洗脱，流速18mL/h，每管收集3mL；测定谷氨酸脱氢酶活性，收集活性较高的各管酶液。
(6)谷氨酸脱氢酶的制备
柱层析洗脱液浓缩后冷冻干燥，制备获得谷氨酸脱氢酶产品，检测产品比酶活，计算酶活回收率。
本发明的优点：
(1)采用现代生物技术进行动物肝脏内谷氨酸脱氢酶提取工艺的开发：用硫酸铵盐析、磷酸钙凝胶吸附取代了传统工艺中大量酸碱溶液的使用，在降低污染实现绿色生产的同时产品的回收率可达到17％以上，产品比酶活达到7900U/mg以上，产品质量可达到国际同类产品水平。
(2)谷氨酸脱氢酶的制备工艺具有周期短、生产设备典型、操作工艺简单、成本低、效率高、产品纯度高等优点，在技术上处于国内领先水平。
(3)以动物肝脏为原料完成谷氨酸脱氢酶的制备，可实现资源的高效利用，减少废液排放，降低环境污染，从而实现谷氨酸脱氢酶的节约型生产。
附图说明
附图1是以动物肝脏为原料，经预处理、粗酶制备、酸沉淀、硫酸铵盐析、磷酸钙凝胶吸附、透析、柱层析、冷冻干燥获得谷氨酸脱氢酶成品的工艺流程图。谷氨酸脱氢酶的酶活回收率达到17％以上，产品比酶活高于7900U/mg，纯化倍数达到75倍以上。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明进一步说明。
实施例一
(1)粗酶液的制备
称新鲜猪肝100kg，在高速组织捣碎机中捣碎60分钟(2000rmp)后，加入5倍体积0.05M，pH 7.6磷酸盐缓冲液(内含0.15M NaCl)，充分搅拌，置4℃冰箱中过夜抽提，8000rmp离心30分钟，收集上清液为粗酶液。
(2)酸沉淀
将所得粗酶液，用10％乙酸调至pH至4.5，4℃放置1小时(期间缓慢搅拌数次)，8000rmp离心15分钟，沉淀用0.1M pH 7.6磷酸缓冲液溶解。
(3)(NH4)2SO4盐析
第一次盐析：在室温下将上述酸沉淀样品1480毫升慢慢加入固体(NH4)2SO4到29％饱和度，4℃过夜，8000rmp离心10分钟。
第二次盐析：取29％(NH4)2SO4盐析后的上清液1400毫升，加固体(NH4)2SO4到48％饱和度，4℃过夜，离心，沉淀溶解在pH 7.6的磷酸缓冲液中，体积250毫升。
第三次盐析：在48％硫酸铵饱和度盐析沉淀溶解液中加(NH4)2SO4至49％饱和度，沉淀溶解在pH 7.6磷酸盐缓冲液中。
(4)磷酸钙凝胶吸附
将150毫升49％(NH4)2SO4盐析沉淀溶解液按1∶0.25比例(v/w)加Ca3(PO4)2凝胶，充分搅拌，4℃冰箱过夜，得上清液148毫升。
(5)柱层析
Sephadex G-150凝胶柱按产品说明书要求处理，装柱(20cm×97cm)后，用磷酸缓冲液(0.05mol/L，pH 7.6)冲洗一定体积。
磷酸钙凝胶吸附溶液4℃透析后，浓缩至10mL上样，用磷酸缓冲液(0.05mol/L，pH 7.6)进行洗脱，流速18mL/h，每管收集3mL；测定谷氨酸脱氢酶活性，收集活性较高的各管酶液。
(6)谷氨酸脱氢酶的制备
柱层析洗脱液浓缩后冷冻干燥，制备获得谷氨酸脱氢酶产品，检测产品比酶活为7950U/mg，酶活回收率为17.2％，纯化倍数为75.2倍。
实施例二
(1)粗酶液的制备
称新鲜牛肝100kg，在高速组织捣碎机中捣碎60分钟(2000rmp)后，加入4倍体积0.05M，pH 7.6磷酸盐缓冲液(内含0.15M NaCl)，充分搅拌，置4℃冰箱中过夜抽提，8000rmp离心30分钟，收集上清液为粗酶液。
(2)酸沉淀
将所得粗酶液，用10％甲酸调至pH至4.8，4℃放置1小时(期间缓慢搅拌数次)，8000rmp离心15分钟，沉淀用0.1M pH 7.6磷酸缓冲液溶解。
(3)(NH4)2SO4盐析
第一次盐析：在室温下将上述酸沉淀样品1480毫升慢慢加入固体(NH4)2SO4到29％饱和度，4℃过夜，8000rmp离心10分钟。
第二次盐析：取29％(NH4)2SO4盐析后的上清液1400毫升，加固体(NH4)2SO4到48％饱和度，4℃过夜，离心，沉淀溶解在pH 7.6的磷酸缓冲液中，体积250毫升。
第三次盐析：在48％硫酸铵饱和度盐析沉淀溶解液中加(NH4)2SO4至49％饱和度，沉淀溶解在pH 7.6磷酸盐缓冲液中。
(4)磷酸钙凝胶吸附
将150毫升49％(NH4)2SO4盐析沉淀溶解液按1∶0.5比例(v/w)加Ca3(PO4)2凝胶，充分搅拌，4℃冰箱过夜，得上清液149毫升。
(5)柱层析
Sephadex G-150凝胶柱按产品说明书要求处理，装柱(20cm×97cm)后，用磷酸缓冲液(0.05mol/L，pH 7.6)冲洗一定体积。
磷酸钙凝胶吸附溶液4℃透析后，浓缩至10mL上样，用磷酸缓冲液(0.05mol/L，pH 7.6)进行洗脱，流速18mL/h，每管收集3mL；测定谷氨酸脱氢酶活性，收集活性较高的各管酶液。
(6)谷氨酸脱氢酶的制备
柱层析洗脱液浓缩后冷冻干燥，制备获得谷氨酸脱氢酶产品，检测产品比酶活为7805U/mg，酶活回收率为17.1％，纯化倍数为75.3倍。
实施例三
(1)粗酶液的制备
称新鲜羊肝100kg，在高速组织捣碎机中捣碎60分钟(2000rmp)后，加入3倍体积0.05M，pH 7.6磷酸盐缓冲液(内含0.15M NaCl)，充分搅拌，置4℃冰箱中过夜抽提，8000rmp离心30分钟，收集上清液为粗酶液。
(2)酸沉淀
将所得粗酶液，用10％盐酸调至pH至4.6，4℃放置1小时(期间缓慢搅拌数次)，8000rmp离心15分钟，沉淀用0.1M pH 7.6磷酸缓冲液溶解。
(3)(NH4)2SO4盐析
第一次盐析：在室温下将上述酸沉淀样品1480毫升慢慢加入固体(NH4)2SO4到29％饱和度，4℃过夜，8000rmp离心10分钟。
第二次盐析：取29％(NH4)2SO4盐析后的上清液1400毫升，加固体(NH4)2SO4到48％饱和度，4℃过夜，离心，沉淀溶解在pH 7.6的磷酸缓冲液中，体积252毫升。
第三次盐析：在48％硫酸铵饱和度盐析沉淀溶解液中加(NH4)2SO4至49％饱和度，沉淀溶解在pH 7.6磷酸盐缓冲液中。
(4)磷酸钙凝胶吸附
将150毫升49％(NH4)2SO4盐析沉淀溶解液按1∶0.3比例(v/w)加Ca3(PO4)2凝胶，充分搅拌，4℃冰箱过夜，得上清液155毫升。
(5)柱层析
Sephadex G-150凝胶柱按产品说明书要求处理，装柱(20cm×97cm)后，用磷酸缓冲液(0.05mol/L，pH 7.6)冲洗一定体积。
磷酸钙凝胶吸附溶液4℃透析后，浓缩至10mL上样，用磷酸缓冲液(0.05mol/L，pH 7.6)进行洗脱，流速18mL/h，每管收集3mL；测定谷氨酸脱氢酶活性，收集活性较高的各管酶液。
(6)谷氨酸脱氢酶的制备
柱层析洗脱液浓缩后冷冻干燥，制备获得谷氨酸脱氢酶产品，检测产品比酶活为7990U/mg，酶活回收率为17.5％，纯化倍数为75.4倍。
实施例四
(1)粗酶液的制备
称新鲜鸡肝10kg，在高速组织捣碎机中捣碎10分钟(2000rmp)后，加入5倍体积0.05M，pH 7.6磷酸盐缓冲液(内含0.15M NaCl)，充分搅拌，置4℃冰箱中过夜抽提，8000rmp离心20分钟，收集上清液为粗酶液。
(2)酸沉淀
将所得粗酶液，用10％盐酸调至pH至4.6，4℃放置1小时(期间缓慢搅拌数次)，8000rmp离心15分钟，沉淀用0.1M pH 7.6磷酸缓冲液溶解。
(3)(NH4)2SO4盐析
第一次盐析：在室温下将上述酸沉淀样品148毫升慢慢加入固体(NH4)2SO4到29％饱和度，4℃过夜，8000rmp离心10分钟。
第二次盐析：取29％(NH4)2SO4盐析后的上清液140毫升，加固体(NH4)2SO4到48％饱和度，4℃过夜，离心，沉淀溶解在pH 7.6的磷酸缓冲液中，体积25毫升。
第三次盐析：在48％硫酸铵饱和度盐析沉淀溶解液中加(NH4)2SO4至49％饱和度，沉淀溶解在pH 7.6磷酸盐缓冲液中。
(4)磷酸钙凝胶吸附
将15毫升49％(NH4)2SO4盐析沉淀溶解液按1∶0.25(1∶0.25-1∶0.5)比例(v/w)加Ca3(PO4)2凝胶，充分搅拌，4℃冰箱过夜，得上清液13毫升。
(5)柱层析
Sephadex G-25凝胶柱按产品说明书要求处理，装柱(20cm×97cm)后，用磷酸缓冲液(0.05mol/L，pH 7.6)冲洗一定体积。
磷酸钙凝胶吸附溶液4℃透析后，浓缩至5mL上样，用磷酸缓冲液(0.05mol/L，pH 7.6)进行洗脱，流速18mL/h，每管收集3mL；测定谷氨酸脱氢酶活性，收集活性较高的各管酶液。
(6)谷氨酸脱氢酶的制备
柱层析洗脱液浓缩后冷冻干燥，制备获得谷氨酸脱氢酶产品，检测产品比酶活为7815U/mg，酶活回收率为17.5％，纯化倍数为75.1倍。
Claims (8)
1.谷氨酸脱氢酶的一种提取方法，其特征在于：以动物肝脏为原料提取获得谷氨酸脱氢酶粗酶液，依次经酸沉淀、硫酸铵盐析、磷酸钙凝胶吸附、透析、柱层析及冷冻干燥后获得谷氨酸脱氢酶成品。
2.如权利要求1所述的谷氨酸脱氢酶的一种提取方法，其特征在于动物肝脏包括猪、牛、羊、鸡等畜禽。
3.如权利要求1所述的谷氨酸脱氢酶的一种提取方法，其特征在于粗酶制备工艺为：称取定量动物新鲜肝脏，在高速组织捣碎机中捣碎10分钟(2000rmp)，加入0.05M，pH 7.6磷酸盐缓冲液(内含0.15M NaCl)，充分搅拌，置4℃冰箱中过夜抽提，8000rmp离心20分钟，收集上清液获得粗酶液，其中加入的磷酸缓冲液体积为动物肝脏的3～5倍。
4.如权利要求1所述的谷氨酸脱氢酶的一种提取方法，其特征在于：酸沉淀工艺为：谷氨酸脱氢酶粗酶液用10％酸溶液调节pH，4℃放置1小时(期间缓慢搅拌数次)，8000rmp离心15分钟，沉淀用0.1M pH值7.6磷酸缓冲液溶解，其中10％的酸溶液可以为甲酸、乙酸、盐酸，pH值调节为4.5～4.8。
5.如权利要求1所述的谷氨酸脱氢酶的一种提取方法，其特征在于：硫酸铵盐析工艺为：
第一次盐析：在室温下将酸沉淀定量样品慢慢加入固体(NH4)2SO4到29％饱和度，4℃过夜，8000rmp离心10分钟。
第二次盐析：取29％(NH4)2SO4盐析后的上清液定量，加固体(NH4)2SO4到48％饱和度，4℃过夜，离心，沉淀溶解在pH 7.6的磷酸缓冲液中。
第三次盐析：在48％硫酸铵饱和度盐析沉淀溶解液中加(NH4)2SO4至49％饱和度，沉淀溶解在pH 7.6磷酸盐缓冲液中。
6.如权利要求1所述的谷氨酸脱氢酶的一种提取方法，其特征在于：磷酸钙凝胶吸附工艺为：取定量49％硫酸铵盐析沉淀溶解液按比例加Ca3(PO4)2凝胶，充分搅拌，4℃冰箱过夜，得上清液，其中硫酸铵盐析液同磷酸钙凝胶的比例为1∶0.25～1∶0.5(v/w)。
7.如权利要求1所述的谷氨酸脱氢酶的一种提取方法，其特征在于：柱层析工艺为：磷酸钙凝胶吸附溶液4℃透析后，浓缩上样，用磷酸缓冲液(0.05mol/L，pH 7.6)进行洗脱，流速18mL/h，每管收集3mL；测定谷氨酸脱氢酶活性，收集活性较高的各管酶液，浓缩后冷冻干燥，制备获得谷氨酸脱氢酶产品，其中柱层析选用柱料为Sephadex G-150或Sephadex G-25。
8.如权利要求1所述的谷氨酸脱氢酶的一种提取方法，其特征在于：制备获得的谷氨酸脱氢酶产品的比酶活高于7900U/mg，酶活回收率高于17％。
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Cited By (2)
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| CN104178465A (zh) * | 2014-08-19 | 2014-12-03 | 西藏天虹科技股份有限责任公司 | 一种从牛肝脏中提取谷氨酸脱氢酶的方法 |
| CN110551704A (zh) * | 2019-08-30 | 2019-12-10 | 集美大学 | 一种从猪肺中分离提纯血管紧张素转化酶的方法 |
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| CN110551704A (zh) * | 2019-08-30 | 2019-12-10 | 集美大学 | 一种从猪肺中分离提纯血管紧张素转化酶的方法 |
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