CN102399750B - 重组msg1蛋白单克隆抗体及检测猪嗜血支原体特异性抗体的阻断elisa方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了重组MSG1蛋白单克隆抗体及检测猪嗜血支原体特异性抗体的阻断ELISA方法。分泌猪嗜血支原体重组MSG1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株1A7，保藏号为CGMCC NO.4860，保藏日为2011年5月13日。猪嗜血支原体重组MSG1蛋白的单克隆抗体，该单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO.4860的杂交瘤细胞株1A7分泌。该单克隆抗体与猪嗜血支原体MSG1重组蛋白和病原蛋白都具有良好的反应特异性。本发明将该单克隆抗体应用于检测猪嗜血支原体特异性抗体的阻断ELISA法，通过大量实验优化了检测条件，使该方法具备良好的重复性、敏感性和特异性。

Description

重组MSG1蛋白单克隆抗体及检测猪嗜血支原体特异性抗体的阻断ELISA方法

技术领域

本发明属于血清学领域，涉及重组MSG1蛋白单克隆抗体及检测猪嗜血支原体特异性抗体的阻断ELISA方法。

背景技术

目前已报道的M.suis血清抗体检测的方法主要包括补体结合试验、间接血凝试验和酶联免疫吸附试验(ELISA)，其中ELISA方法具有高通量、易标准化等特点，已成为常规诊断试剂的首选。检测病原抗体的ELISA方法中，单抗阻断ELISA因能够排除包被抗原中杂蛋白成分的干扰而具有良好的特异性，现今很多商品化试剂盒如猪瘟诊断试剂盒(IDEXX)、伪狂犬诊断试剂盒等(IDEXX)均是应用阻断ELISA方法，在临床上得到广泛的应用。由于猪嗜血支原体尚无成熟的体外培养方法，使抗原的来源受到限制，而利用基因工程方法表达重组蛋白将解决抗原来源困难的问题。Hozole(2007)等用猪嗜血支原体重组抗原MSG1蛋白、HspA1蛋白分别建立了间接EL ISA检测方法，并证明重组抗原ELISA的敏感性和特异性等同或高于天然抗原ELISA。猪嗜血支原体MSG1(M.suis GAPDH-like protein 1)蛋白能够介导猪嗜血支原体对宿主红细胞的粘附作用，是猪嗜血支原体感染宿主过程中的关键致病蛋白之一，该蛋白具有良好的免疫原性，可以作为单抗制备的免疫原。目前国内外还没有MSG1蛋白单抗制备的报道，也没有相关阻断ELISA检测方法建立的报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种一株分泌猪嗜血支原体重组MSG1蛋白单克隆抗体。

本发明的另一目的是提供检测猪嗜血支原体特异性抗体的阻断ELISA方法。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一株分泌猪嗜血支原体重组MSG1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株1A7，分类命名为鼠源单克隆杂交瘤细胞，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.4860，保藏日为2011年5月13日。

猪嗜血支原体重组MSG1蛋白的单克隆抗体anti-MSG1-1A7，该单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO.4860的杂交瘤细胞株1A7分泌。

所述的猪嗜血支原体重组MSG1蛋白单克隆抗体anti-MSG1-1A7在制备猪嗜血支原体MSG1蛋白检测试剂中的应用。

一种检测猪嗜血支原体特异性抗体的阻断ELISA方法，将所述的猪嗜血支原体重组MSG1蛋白的单克隆抗体anti-MSG1-1A7进行HRP标记作为酶标抗体，并且判断标准如下：只有阴性对照的平均OD450大于0.5，阳性对照阻断率大于50％，该检测结果才能有效。当被检血清阻断率＜23.71％时判为血清抗体阴性反应，PI≥36.35％时判为血清抗体阳性反应，23.71％＜PI＜36.36％时判为可疑，需重复检测1次，如果仍低于36.35％则判为血清抗体阴性反应，所述的阻断率按照如下公式计算：

阻断率＝(阴性血清OD450nm值-被检血清OD450nm值)/阴性血清OD450nm值×100％。

所述的检测猪嗜血支原体特异性抗体的阻断ELISA方法，包括如下步骤：

(1)在酶标板上每孔加入终浓度为0.5μg/ml的重组MSG1蛋白，4℃包被过夜，PBST洗板；

(2)加入含5％脱脂乳的PBST，200μL/孔，37℃2h封闭，PBST洗板；

(3)加入1∶1稀释的待检血清样品，100μL/孔，设标准阴性血清对照和标准阳性血清对照，37℃1h，PBST洗板；

(4)加入1∶10000稀释的酶标单抗HRP-MAb，100μL/孔，37℃1h，PBST洗板；

(5)加入TMB底物溶液，100μL/孔，37℃10min。加入2mol/L的H₂SO₄50μL/孔终止反应，用酶标仪读取各孔OD450nm值，计算阻断率，进行结果判断：

阻断率＝(阴性血清OD450nm值-被检血清OD450nm值)/阴性血清OD450nm值×100％，

判断标准如下：当阻断率≤23.71％时判为血清抗体阳性反应，PI≥36.35％时判为血清抗体阴性反应，23.71％＜PI＜36.36％时判为可疑，需重复检测1次，如果仍低于36.35％则判为血清抗体阴性反应。

其中，所述的重组MSG1蛋白序列为SEQ ID NO.1。

所述的重组MSG1蛋白通过基因工程方法得到，其制备、纯化和鉴定方法详见实施例1。

有益效果：

本发明以原核表达纯化的猪嗜血支原体MSG1蛋白免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体，并应用纯化和标记后的单克隆抗体建立阻断ELISA检测方法。

试验证明，本发明制备的杂交瘤细胞具有稳定的抗体分泌能力，所分泌的单克隆抗体与猪嗜血支原体MSG1重组蛋白和病原蛋白都具有良好的反应特异性。此研究为以后进行M.suis病原学及其致病机理的研究奠定了良好的物质基础。

阻断ELISA方法基于待检血清样品抑制酶标单抗与MSG1蛋白的结合，以检测M.suis特异性抗体，本方法能够排除包被抗原中杂蛋白成分的干扰，与其他抗体检测方法相比具有更好的特异性，而且该方法操作简单，易于大范围推广应用，在M.suis血清学诊断方面具有广阔的应用前景。本发明通过大量实验优化了检测猪嗜血支原体特异性抗体的阻断ELISA法，使该方法用于检测猪嗜血支原体特异性抗体具备良好的重复性、敏感性和特异性。

附图说明

图1MSG1蛋白的表达和鉴定，

A.MSG1蛋白表达的SDS-PAGE电泳。M：中分子量蛋白质Marker；1：未诱导样品；2：诱导样品。B.Western-blot鉴定结果。1：诱导样品；2：未诱导样品。

图2抗原蛋白及对照蛋白的SDS-PAGE分析

M：蛋白Marker；1：诱导后的空载体对照蛋白；2：纯化的MSG1蛋白；3：未纯化的MSG1蛋白；4：大肠杆菌Top10。

图3anti-MSG1-1A7与MSG1重组蛋白反应的western blot鉴定。

1.纯化的MSG1蛋白；2.诱导后的空载体对照.

图4间接免疫荧光试验

A.M.suis阳性红细胞，箭头指的是红细胞周围的特异性荧光；B.与A图同一视野中的细胞图；C.M.suis阴性红细胞；D.与图C同一视野中的细胞图.

图5单抗纯化前后SDS-PAGE分析结果图。

M：蛋白Marker；1：腹水纯化前；2：腹水纯化后.

生物样品保藏信息

杂交瘤细胞株1A7，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCCNO.4860，保藏日为2011年5月13日。

具体实施方式

实施例1猪嗜血支原体重组MSG1蛋白和检测蛋白的制备

1.1MSG1基因的改造与人工合成

按E.coli的密码子偏嗜性和克服UGA所编码的色氨酸翻译时所遇到的障碍，按密码子的兼并性对MSG1全基因序列进行改造，同时在基因的5’端和3’端分别添加了KpnI和EcoRI酶切位点，序列为SEQ ID NO.2。全基因序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2MSG1基因的克隆与鉴定

对pBAD/HisB载体(Invitrogen公司)进行KpnI和EcoRI双酶切后进行凝胶回收，然后将回收的载体与合成的MSG1基因进行连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，将转化产物涂布氨苄青霉素抗性平板，挑取抗性平板上的细菌液体培养后提取质粒进行KpnI和EcoRI双酶切鉴定，鉴定正确的重组质粒命名为pBAD-msg1。

1.3MSG1蛋白的表达

质粒pBAD-msg1转化Top10大肠杆菌感受态细胞(Invitrogen公司)，将转化产物涂布氨苄青霉素抗性平板(含100μg/ml氨苄青霉素)，挑取单个重组克隆，接种2mLLB培养基(含50μg/mL氨苄青霉素)，37℃振荡过夜。取过夜培养物50μL接种5mL含50μg/mL氨苄青霉素的LB试管，37℃振荡培养，在OD₆₀₀达到0.4～0.6时加入50μL 0.2％的L-阿拉伯糖，诱导2h，从管中取1.0mL菌液，12000r/min离心30s，设立不加诱导剂的未诱导平行对照。用100.0μL的1×上样缓冲液重悬沉淀，煮沸5min，进行SDS-PAGE电泳，SDS-PAGE结果显示，同未诱导的样品相比，诱导样品在45ku处有一明显蛋白条带(见图1A)。

1.4表达蛋白的鉴定

将SDS-PAGE胶上的蛋白质条带转印到NC膜上，然后进行Western-blot鉴定。半干转印30min，取下NC膜，丽春红染色2min，10％脱脂乳封闭3～4h，His单抗(天根生化科技有限公司)作用2h，用PBST洗涤三次，10min/次；羊抗鼠IgG-HRP二抗作用1h，用PBST洗涤三次，10min/次，将显色液A、B(Biouniquer公司)等体积混合，铺满印有蛋白的一面，用保鲜膜包好NC膜，蛋白面紧贴X光片，置暗盒中曝光30s，取出后依次显影、洗涤、定影。最后用清水冲洗胶片，晾干保存，Western-blot结果显示，同未诱导样品相比，诱导样品在45ku处出现单一的目的条带(见图1B)。

1.5MSG1蛋白的纯化

按Ni-NTA试剂(Invitrogen公司)的说明书分别进行了表达蛋白变性条件和杂交条件下的纯化。

1.6检测蛋白的制备

将pBAD//HisB空质粒转入Top10，同一条件下(同1.3MSG1蛋白的表达)进行诱导表达，收集菌体，超声裂解后分离上清，-20℃保存，作为检测用对照蛋白。将诱导表达的MSG1蛋白和空载体对照蛋白进行SDS-PAGE电泳分析，目的蛋白(重组MSG1蛋白)大小约为45KDa，结果见图2。

实施例2猪嗜血支原体重组MSG1蛋白单克隆抗体的制备

2.1动物免疫

取6～8周龄健康BALB/c雌性小鼠(购自南京青紫兰科技有限公司)，皮下多点注射免疫，抗原(重组MSG1蛋白，实施例1中制备纯化)剂量为首免100μg，二免100μg，三免200μg。首免时将抗原与等体积完全弗氏佐剂乳化，二免、三免时将抗原与等体积不完全弗氏佐剂乳化。每次免疫间隔14d，第3次免疫10d后尾静脉采血，测定抗体效价，选效价1∶10000以上的小鼠在细胞融合前3d经腹腔注射未乳化抗原200μg加强免疫。

2.2间接ELISA筛选方法

抗原(重组MSG1蛋白，实施例1中制备纯化)包被浓度为0.5μg/mL，100μL/孔，待检的杂交瘤细胞培养上清作为一抗，1∶100稀释的MSG1多抗鼠血清作为阳性对照，进行ELISA反应，读取OD450nm值；以P/N≥2.1判定为阳性。以P/N≥2.1的最大稀释度作为抗体效价。

2.3MAb的制备

2.3.1细胞融合

2.3.11融合所用材料准备

96孔细胞板(6-8块)、50mL尖底离心管(2支)、水浴锅、滤布、杀鼠工具(2套)、10mL玻璃注射器(2支)、烧杯(2个)、玻璃平皿(2个)、封口膜等。以上材料均于实验前超净工作台紫外消毒30min；配置100mL纯RPMI 1640培养基(含青霉素100单位/mL，链霉素100单位/mL)、100mL HAT培养基(含青霉素100单位/mL，链霉素100单位/mL、2％HAT、20％新生牛血清，RPMI 1640补至100mL)，实验前预热至37-40℃。

2.3.1.2SP2/0骨髓瘤细胞的准备

融合前一周，复苏冻存的SP2/0骨髓瘤细胞(购自ATCC)，用含20％新生牛血清的RPMI1640营养液进行维持培养。融合前两天，以1∶2比例传代培养，使细胞达到对数分裂期，确保形态均一，浑圆透亮，边界清晰，活力达到95％以上。再用无血清的RPMI 1640培养液洗涤细胞3次，悬浮细胞计数，并用RPMI 1640调整细胞浓度为1×10⁶个/mL，体积为10mL左右，放置37℃、5％CO₂、饱和湿度培养箱中备融合用。

2.3.1.3饲养细胞的制备

取成熟健康的普通清洁级(ICR)小鼠(购自南京青紫兰科技有限公司)，断颈处死后浸没于75％乙醇中5min；腹部朝上，将其固定在解剖台板上，无菌条件下剪开腹部皮肤，充分暴露腹部；用注射器向腹腔中注入10mL 1640培养液，用酒精棉球轻轻按压腹部，最后将腹腔内的培养液吸出，悬浮细胞，血球计数板计数；用HAT培养基重悬调节细胞数至5×10⁵个/mL，按每孔0.1mL加入96孔培养板，置37℃、5％CO₂、饱和湿度培养箱中培养。

2.3.1.4免疫脾细胞的制备

取免疫的Balb/c小鼠，摘除眼球采血，分离血清作为阳性对照。断颈处死小鼠后浸没于75％乙醇中5min，随即放置超净台内的解剖板上，腹部朝上，四肢固定，无菌打开腹腔取出脾脏，将其置于无菌玻璃培养皿中的滤布袋里，用弯头镊子研磨，使脾细胞充分释放，再用无血清1640培养液悬浮细胞后计数，以无血清1640培养液调整细胞浓度为1×10⁷个/mL，获得约10mL细胞悬液。

2.3.1.5细胞融合

(1)将准备好的SP2/0骨髓瘤细胞和免疫脾细胞以1∶5的比例混和，置于50mL离心管内，用无血清1640培养液洗涤3次，调整终体积为35mL，充分混匀，1000rpm离心10min，彻底弃上清，轻叩离心管底部，使细胞松散。

(2)将离心管置于37℃水浴中，用巴氏吸管吸取1mL PEG4000加入离心管，边滴加边轻轻搅拌，使其平均在45s内加完，加完后再轻轻搅拌1min。然后缓慢加入10mL无血清1640，第1分钟前30s每2s加一滴，后30s每1s加一滴，第2分钟加入2mL，第3分钟加入3mL，直至加完10ml 1640培养液。

(3)37℃静置10min，1000rpm离心10min弃去上清。同时制备饲养细胞，将饲养细胞混入提前配好并预热的HAT营养液中。

(4)将含有巨噬细胞的HAT营养液轻轻重悬并稀释融合细胞，铺96孔细胞板。将细胞板放置37℃、5％CO₂、饱和湿度温箱中培养，融合后四天用HAT培养液换液，融合后一周吸取培养上清，用间接ELISA检测筛选阳性杂交瘤细胞株，同时向细胞孔内补加HT培养液。

2.3.2阳性杂交瘤细胞的筛选及亚克隆

分别将实施例1中纯化的重组MSG1蛋白和空载体对照蛋白包被酶标板，对杂交瘤细胞上清采用间接ELISA进行检测，重组MSG1蛋白筛选为阳性而空载体对照蛋白筛选为阴性的克隆可初步判定为阳性克隆。经ELISA方法筛选出来的阳性细胞要及时亚克隆，本研究采用有限稀释法进行亚克隆。按2.3.1.3方法制备饲养细胞，用HT营养液接种到96孔板，每孔0.1mL，置于37℃、5％CO₂、饱和湿度培养箱中过夜培养。将待克隆的杂交瘤细胞吹散，取10μL细胞悬液10倍稀释后进行细胞计数，经计算从相应孔中取50个细胞加至5mL HT培养液中，接种于铺有饲养细胞的96孔细胞培养板，0.1mL/孔，即每孔约1个细胞。将细胞板置于37℃、5％CO₂、饱和湿度培养箱中培养，一周后挑选单克隆进行ELISA检测，将多次检测均为阳性的单克隆细胞再次进行亚克隆。一般需进行2-3次亚克隆，直至最后一次亚克隆后，凡是有细胞的生长孔培养上清全部都为阳性，则表示建立了稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。由此获得杂交瘤细胞株1A7，间接ELISA法检测无血清培养上清效价为1∶4096。将杂交瘤细胞1A7送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC NO.4860，保藏日为2011年5月13日。

2.3.3腹水的制备

采取小鼠体内繁殖法大量制备单克隆抗体anti-MSG1-1A7。取6-8周龄Balb/c小鼠，腹腔注射灭菌液体石蜡，0.5mL/只。7-10d后，每只小鼠腹腔接种3-5×10⁶个杂交瘤细胞1A7(CGMCC NO.4860)。接种前，先用无血清的RPMI 1640培养液将杂交瘤细胞洗涤两次，尽量洗去杂蛋白，然后用无血清的RPMI 1640培养液配成浓度为1×10⁷个/mL的细胞悬液。接种时每只小鼠取0.5mL细胞悬液，于无菌条件下注射入腹腔。杂交瘤细胞以腹水瘤形式在小鼠腹腔内大量繁殖。一周后，小鼠腹部胀大，触之有波动感即腹腔内出现腹水，此时即可收集腹水。将腹水收集至离心管，5000rpm离心10min，取上清(勿吸取离心管最上层的不溶物质及油状物)，56℃水浴30min灭活补体和蛋白水解酶，再置室温待其冷却，从1∶100开始倍比稀释，用ELISA方法检测抗体效价，以SP2/0细胞制备的腹水作为阴性对照，腹水效价为1∶1638400。将腹水置于-20℃冻存备用。

2.4MAb特性的鉴定

2.4.1Western blot鉴定

猪嗜血支原体重组MSG1蛋白经SDS-PAGE电泳后，转印至硝酸纤维素(NC)膜上，以杂交瘤细胞1A7上清作为一抗，HRP-羊抗鼠IgG为二抗进行Western blot鉴定，同时设pBAD空载体诱导的菌体蛋白作为对照，结果显示，单抗anti-MSG1-1A7能特异性地识别45KDa的MSG1重组蛋白，与预期条带大小一致，结果见图3。

2.4.2间接免疫荧光试验

取临床PCR检测为猪嗜血支原体阳性的抗凝血，用甲醇固定红细胞，待甲醇挥发干以后，用PBST洗涤，1％BSA37℃封闭2h，以杂交瘤细胞1A7(CGMCC NO.4860)上清作为一抗，FITC-羊抗鼠IgG为二抗进行间接免疫荧光试验，同时设PCR检测为阴性的猪红细胞作为对照，400倍荧光显微镜观察结果显示，阳性红细胞周围有较明显的特异性荧光，而对照红细胞周围则没有特异性荧光，证明单抗anti-MSG1-1A7能够特异的与病原中的抗原蛋白发生反应，结果见图4。

2.4.3Ig亚型鉴定

按Pierce公司小鼠单抗亚类鉴定ELISA试剂盒说明操作，取阳性细胞培养上清用TBS以1∶20稀释，将50μL稀释上清与50μL羊抗小鼠IgG+IgA+IgM-HRP共同加入反应孔，室温孵育1h，洗涤3次后拍干，加入TMB底物溶液(75μL/孔)显色5-15min，再加入终止液(75μL/孔)终止反应，测定OD₄₅₀值。对获得的MAb进行亚型鉴定。鉴定结果单抗anti-MSG1-1A7的亚型属于IgG1，轻链为κ型。

2.4.4抗体分泌稳定性及效价测定

将杂交瘤细胞1A7(CGMCC NO.4860)连续传代20次后，取培养液上清，分别取第5代、10代、20代的培养上清用间接ELISA法测定其抗体效价。检测结果见表1，试验结果证明ELISA抗体效价基本一致。将液氮冻存后的杂交瘤细胞1A7(CGMCC NO.4860)复苏，取培养液上清，用间接ELISA法测定其抗体效价，前后两次复苏检测杂交瘤上清的效价均为1∶4096，表明杂交瘤细胞1A7(CGMCC NO.4860)具有稳定分泌抗体的能力。

表1不同代次细胞上清的效价

实施例3猪嗜血支原体酶标记单抗阻断ELISA检测方法的建立

3.1单克隆抗体的纯化和辣根过氧化物酶(HRP)标记

将制备好的腹水送金斯瑞生物工程公司进行单抗的纯化和标记。抗体的纯度达到97.6％，腹水纯化前后SDS-PAGE分析结果见图5。

3.2阻断ELISA最佳反应条件的选择

3.2.1抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的选择

按棋盘法进行，以pH9.6的碳酸盐缓冲液将纯化后的重组MSG1蛋白分别稀释至终浓度为2.0，1.0，0.5，0.25μg/ml，4℃包被过夜。然后用含0.05％吐温20的0.05mol/LPBS(简称PBST，pH为7.2)洗5min×3次。加入含5％脱脂乳的PBST，200μL/孔，37℃2h封闭，洗涤后加入用PBST1∶1、1∶5、1∶10、1∶50、1∶100、1∶200稀释的M.suis标准阳性血清(采自猪嗜血支原体发病猪场，PCR检测为抗原阳性，间接ELISA检测为抗体阳性)和标准阴性血清(采自常年无猪嗜血支原体感染猪场，PCR检测为抗原阴性，间接ELISA检测为抗体阴性)，100μL/孔，37℃1h，洗涤后加入用PBST1∶10000稀释的酶标单抗HRP-MAb，100μL/孔，37℃1h，洗涤后加入TMB底物溶液，100μL/孔，37℃10min。加入2mol/L的H₂SO₄50μL/孔终止反应，用酶标仪读取各孔OD450nm值，每个稀释度重复一次，取其平均值。按照以下公式计算阳性血清的阻断率，阻断率(PI)＝(阴性血清OD450nm值-被检血清OD450nm值)/阴性血清OD450nm值×100％。选择阻断率最高的反应条件作为阻断ELISA最佳反应条件。结果见表2。结果表明，最佳抗原包被浓度为0.5μg/ml，血清最佳稀释度为1∶1。

表2抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的选择

3.2.2封闭液的选择

以pH9.6的碳酸盐缓冲液将纯化的重组MSG1蛋白稀释至终浓度为0.5μg/ml，4℃过夜包被酶标板，洗涤后，分别用含5％脱脂乳、1％BSA、0.1％BSA、和2％明胶的PBST 200μL/孔37℃封闭2h，标准阴阳性血清均用PBST以1∶1稀释，进行阻断ELISA测定，其它步骤同本实施例中3.2.1。计算各组阳性血清阻断率，以选择合适的封闭液。结果见表3。结果表明，5％脱脂乳为最佳封闭液。

表3封闭液的选择

3.2.3封闭时间的选择

按照最佳条件包被酶标板，洗涤后，用含5％脱脂乳的PBST 200μL/孔进行封闭，分成3组，分别为37℃封闭1h，37℃2h，37℃3h。封闭后，标准阴阳性血清均用PBST以1∶1稀释，进行阻断ELISA测定，其它步骤同本实施例中3.2.1。计算各组阳性血清阻断率，以选择合适的封闭时间。结果见表4。结果表明，最佳封闭时间为37℃2h。

表4封闭时间的选择

3.2.4待检血清作用时间的选择

酶标板按最佳条件包被、封闭后，加入稀释好的待检血清，37℃分别作用0.5、1.0、1.5和2.0h，对标准阴阳性血清进行阻断ELISA测定，比较各组阳性血清的阻断率，以选择合适的血清作用时间。结果见表5。结果表明，待检血清最佳作用时间为37℃1.5h。

表5血清最佳作用时间的选择

3.2.5酶标单抗工作浓度的选择

待检血清按最佳条件作用后，洗涤酶标板，将酶标单抗分别用PBST按照1∶5000、1∶10000、1∶15000和1∶20000进行稀释，100μL/孔，对标准阴阳性血清进行阻断ELISA测定，比较各组阳性血清的阻断率，以选择合适的酶标单抗工作浓度。结果见表6。结果表明，酶标单抗最佳稀释浓度为1∶10000。

表6酶标单抗最佳稀释浓度的选择

3.2.6酶标单抗工作时间的选择

将酶标单抗按确定好的稀释倍数加入酶标板后，37℃分别作用20，40，60，80min，对标准阴阳性血清进行阻断ELISA测定，比较各组阳性血清的阻断率，以选择合适的酶标单抗作用时间。结果见表7。结果表明，酶标单抗最佳作用时间为37℃60min。

表7酶标单抗最佳反应时间的选择

3.2.7底物最佳反应时间的选择

酶标抗体按确定好的时间作用、洗涤、加入底物后，37℃分别作用5、10和15min，用2mol/L的H₂SO₄50μL/孔终止后读数，计算各组阳性血清阻断率，以确定最佳底物作用时间。结果见表8。底物最佳作用时间为10min

表8底物最佳反应时间的选择

3.2.8阻断ELISA最佳反应条件

根据3.2.1～3.2.7摸索的阻断ELISA最佳反应条件为：

(1)在酶标板上每孔加入终浓度为0.5μg/ml的重组MSG1蛋白，4℃包被过夜，PBST洗板；

(2)加入含5％脱脂乳的PBST，200μL/孔，37℃2h封闭，PBST洗板；

(3)加入1∶1稀释的待检血清样品，100μL/孔，设标准阴性血清对照和标准阳性血清对照，37℃1h，PBST洗板；

(4)加入1∶10000稀释的酶标单抗HRP-MAb，100μL/孔，37℃1h，PBST洗板；

(5)加入TMB底物溶液，100μL/孔，37℃10min。加入2mol/L的H₂SO₄50μL/孔终止反应，用酶标仪读取各孔OD450nm值，计算阻断率。

3.3临界值的确定

自猪嗜血支原体阴性猪场采取血液样品，取经间接ELISA检测为阴性的猪血清样品100份，按照3.2.8中的阻断ELISA方法检测其阻断率，结果经统计学分析，计算出血清样品的平均阻断率(X)为-1.55％，标准差(S)为12.63％，X+2S＝23.71％；X+3S＝36.35％，当PI≥36.35％时判为血清抗体阳性反应，PI≤23.71％时判为血清抗体阴性反应，23.71％＜PI＜36.35％时判为可疑，需重复检测1次，如果仍低于36.35％则判为血清抗体阴性反应。

3.4阻断ELISA的重复性试验

使用5批不同时间表达和纯化的MSG1蛋白包被阻断ELISA板，选用经间接ELISA检测为M.suis阴性、弱阳性、强阳性的3份试验猪血清，用相同批次和不同批次各5个EL ISA板，按照2.2.8确定的最佳反应条件进行批内和批间重复性试验，计算变异系数。结果见表9。结果显示，3份血清在批内和批间试验中的变异系数均小于10％，证明该阻断ELISA检测方法具有良好的重复性。

表9阻断ELISA的重复性试验结果

3.5阻断ELISA的敏感性试验和特异性试验

从猪M.suis阳性猪场采取母猪血液样品，对于PCR阳性的母猪分不同时期收集其血清样品，取50份经间接ELISA(张长莹，李玉峰，华荣蓉等，猪支原体重组MSG1蛋白间接ELISA检测方法的建立，畜牧与兽医，2011，43(2)：12-18)检测为阳性的猪血清样品用阻断ELISA方法进行检测，结果有4份血清检测结果为阴性，46份血清检测结果为阳性，证明本方法的相对敏感性为92％(46/50)。另外从M.suis常年阴性猪场采取猪血液样品，取50份经间接ELISA鉴定为阴性的猪血清样品用阻断ELISA方法进行检测，结果这50份血清检测结果均为阴性，证明本方法的相对特异性为100％(50/50)。

3.6阻断ELISA的交叉反应试验

用按照3.2.8确定的阻断EL ISA方法对已知猪圆环病毒2型(PCV2)、副猪嗜血杆菌(HPs)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪脑心肌炎病毒(EMCV)参考阳性血清进行检测，同时设立M.suis标准阴阳性对照。结果见表10。结果表明，除M.suis阳性血清为阳性反应外，其他几种猪病毒参考阳性血清均为阴性反应，证明该阻断ELISA方法可特异性检测M.suis抗体，并与其他几种猪病原血清无交叉反应。

表10阻断ELISA的交叉反应试验结果

Claims (3)

1.一株分泌猪嗜血支原体重组MSG1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株1A7，其特征在于保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.4860，保藏日为2011年5月13日。

2.猪嗜血支原体重组MSG1蛋白的单克隆抗体anti-MSG1-1A7，其特征在于该单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO.4860的杂交瘤细胞株分泌。

3.权利要求2所述的单克隆抗体在制备猪嗜血支原体MSG1蛋白检测试剂中的应用。

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