CN102399263A

CN102399263A - 鲤春病毒血症抗原表位

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Publication number: CN102399263A
Application number: CN2010102801928A
Authority: CN
Inventors: 李月红; 张林波; 张培军
Original assignee: Individual
Current assignee: Jilin Agricultural University
Priority date: 2010-09-14
Filing date: 2010-09-14
Publication date: 2012-04-04
Anticipated expiration: 2030-09-14
Also published as: CN102399263B

Abstract

一种鲤春病毒血症抗原表位，属于生物技术领域。本发明通过噬菌体展示技术，利用鲤春病毒血症病毒（SVCV）单克隆抗体筛选出阳性克隆，找出与SVCV单克隆抗体结合的保守序列，筛到的抗原型表位制备临床诊断试剂，小分子抗原肽作为疫苗防治鲤春病毒血症。本发明基因序列是SEQ　ID　NO：1。本发明利用噬菌体展示技术，通过SVCV单克隆抗体筛选阳性克隆，找出在随机肽库中能与中和SVCV活性的单克隆抗体结合的保守序列。确定该抗原决定簇的位点，分析其序列，结构与功能的关系；研究小肽竞争与SVCV受体结合，针对SVCV而产生抑制作用，对未来小分子抗原肽作为疫苗，将具有巨大的应用价值。

Description

鲤春病毒血症抗原表位

技术领域

本发明属于生物技术领域。

背景技术

我国是水产养殖大国，水产养殖总量世界第一，水产品出口量占世界第一。鲤春病毒血症（SVC）是鱼类最主要的疾病之一，以发病急、死亡率高为特征。鲤春病毒血症病毒的宿主范围很广,能感染四大家鱼和其他几种鲤科鱼,包括鲤鱼和锦鲤、鳙鱼、草鱼、鲢鱼、黑鲫、鲫鱼、丁鳜和欧鲇等,鲤鱼是其中主要的、最易感的宿主。近几年来该病在我国大部分地区均有发生，，已成为我国淡水养殖鱼类的主要病害。鲤春病毒血症是水产动物一类传染病，是鱼类口岸检疫的第一类检疫对象。

目前, 在我国对SVC病毒的检测方法主要是病毒分离后用RT-PCR。PCR 技术虽然具有高灵敏度的优越性, 但缺点是：

1、结果判断上常常会出现假阳性的情况；

2、需要专业人员和昂贵的仪器试剂；

3、不符合国际兽疫局（OIE）推荐的检测方法。

发明内容

本发明通过噬菌体展示技术，利用鲤春病毒血症病毒（SVCV）单克隆抗体筛选出阳性克隆，找出与SVCV单克隆抗体结合的保守序列，筛到的抗原型表位制备临床诊断试剂，小分子抗原肽作为疫苗防治鲤春病毒血症。

本发明基因序列是SEQ　ID　NO：1。

本发明鲤春病毒血症抗原表位在制备鲤春病毒血症疫苗的应用。

本发明利用噬菌体展示技术，通过SVCV单克隆抗体筛选阳性克隆，找出在随机肽库中能与中和SVCV活性的单克隆抗体结合的保守序列。确定该抗原决定簇的位点，分析其序列，结构与功能的关系；研究小肽竞争与SVCV受体结合，针对SVCV而产生抑制作用，对未来小分子抗原肽作为疫苗，将具有巨大的应用价值。

附图说明

图1是本发明第1、2 轮筛选6 次洗脱扩增的噬菌体克隆点杂交结果；

图2是本发明第3 轮筛选3 次洗脱扩增的阳性克隆点杂交结果；

图3是本发明短肤触合蛋白组的设计表达与纯化；

图4是本发明抗原表位在ELISA和Westernblot的结果中，均被免疫血清所识别；

图5是本发明短肽融合蛋白与细胞结合活性测定；

图6是本发明加入抗血清后短肽蛋白与细胞结合活性测定；

图7是本发明阳性杂交瘤细胞染色体形态；

图8是本发明2A3抗体与不同浓度抗原结合的ELISA曲线图；

图9是本发明3H7抗体与不同浓度抗原结合的ELISA曲线图；

图10是本发明SVXV 单克隆抗体正辛酸纯化的SDS-PAGE电泳结果；

图11是本发明2株腹水与抗原的反应结果。

具体实施方式

本发明鲤春病毒血症抗原表位基因序列是SEQ　ID　NO：1。

一、鲤春病毒血症病毒(SVCV)单克隆抗体制备

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂

弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂和二氨基联苯胺（DAB）以及青霉素G（钠盐）和链霉素（硫酸盐）购自北京鼎国生物技术公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG购自北京中山生物技术公司；RPMI-1640培养基、100倍HT和100倍HAT、HEPES、二甲基亚砜（DMSO）、聚乙二醇4000、秋水仙素、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠（SDS）、过硫酸铵、PNA,β-巯基乙醇和硝酸纤维素膜购自Sigma公司；抗体亚类鉴定试剂（IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA）购自Pharmacia公司；低分子量标准蛋白（97.4、66.2、43.0、31.0、20.1和14.4kD）购自TaKaRa公司；胎牛血清购自HyClone公司；其它试剂均为进口分装或国产分析纯化学试剂。

1.1.2 鲤春病毒血症病毒

鲤春病毒血症病毒本实验室保存

1.1.3 实验动物

BALB/c小鼠购自长春生物制品研究所实验动物中心。

1.1.4 细胞株

SP2/0骨髓瘤细胞为军事医学科学院十一所细菌室保存。EPC购自中科院上海细胞所

1.1.5 主要培养液及缓冲液

青、链霉素（双抗）溶液：取青霉素G（钠盐）100万U和链霉素（硫酸盐）1g，溶于100ml去离子水中，过滤除菌，分装小瓶，-20℃保存备用。

50%聚乙二醇：取PEG 0.5g于0.5ml去离子水中，121℃高压灭菌15min备用。

RPMI-1640培养液：取商品化RPMI-1640培养基粉剂按说明书配制，充分溶解后每1000ml加HEPES 2g，青、链霉素（双抗）溶液1ml，用HCl或NaOH调pH值为7.2，过滤除菌，分装后-20℃保存备用。

20%胎牛血清RPMI-1640培养液：RPMI-1640培养液80ml加胎牛血清20ml。

HAT选择培养液：RPMI-1640培养液80ml，加100倍HAT 1.0ml，胎牛血清20ml。

HT选择培养液：RPMI-1640培养液80ml，加100倍HT 1.0ml，胎牛血清20ml。

细胞冻存液：90ml胎牛血清加10ml二甲基亚砜，-20℃保存备用。

0.2%台盼蓝溶液：0.2g台盼蓝溶于100ml PBS中。

抗原包被液（pH7.6）：NaCO₃1.59g，NaHCO₃2.93g，溶于1000ml蒸馏水中。

PBS（pH7.4）：NaCl 8.0g，Na₂HPO₄??12H₂O 2.9g，KCl 0.2g，溶于1000ml蒸馏水。

封闭液：3％BSA，用pH7.4的PBS配制。

抗体稀释液：0.3％BSA，用pH7.4的PBS配制。

洗涤液：100ml PBS 中加0.1ml Tween-20。

底物溶液（OPD-H₂O₂溶液）：4mg OPD溶于10ml pH5.0的磷酸盐－柠檬酸缓冲液中，加30％H₂O₂15μl。

1.1.6 主要仪器

二氧化碳培养箱、-70℃超低温冰箱（SANYO公司产品），倒置显微镜（XDS-1B，重庆光电仪器总公司产品），96孔酶标板、96孔及24孔细胞培养板（NUNC公司产品），超净工作台（苏净集团安泰公司产品），酶联免疫检测仪（ELX800，Bio-TEK公司产品），垂直板电泳仪（槽）（BIO-RAD公司产品），转移电泳槽（北京六一仪器厂产品），其它仪器为国产普通小型仪器。

1.2 方法

1.2.1 动物免疫

培养鲤鱼上皮瘤细胞(EPC) , 传代24～ 48 h 之后接种SVCV。当细胞产生90% 病变之后反复冻融3 次, 收集病毒液。将病毒液以4℃ 8 000 r/min 离心1 h, 取上清以12℃ 35000 r/min 超速离心3 h, 取沉淀溶于适量PBS 中, 将部分样品加于浓度为30% 蔗糖界面上, 45 000 r/min离心5 h, 收获沉淀溶于PBS 中, 以40 000 r/min 离心

3 h 去除蔗糖, 沉淀溶于少量PBS 中。按同样的方法处理正常的EPC 作为对照。用纯化的SVCV 抗原免疫8 周龄BALB/c 小鼠, 免疫3 次, 每次间隔2 周。初次免疫时抗原加等量弗氏完全佐剂, 后2 次加等量弗氏不完全佐剂, 免疫剂量均为100 Lg/只, 免疫途径为颈背部多点皮下注射; 融合前3 天做加强免疫, 用不加佐剂抗原腹腔注射, 100 Lg/只。

1.2.2 小鼠腹腔巨噬细胞制备饲养细胞

取一只没有免疫的健康BALB/c小鼠，拉颈处死，浸入75%的酒精中消毒10min，移入超净台，用无菌手术剪剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用玻璃注射器注入腹腔10ml RPMI-1640培养液，按摩腹部，用注射器吸取培养液，然后用5mlRPMI-1640培养液重复一次，合并两次吸出的液体，滴入3块96孔培养板，每孔50μl，37℃5%CO₂培养箱培养12~24h备用。

1.2.3 骨髓瘤细胞悬液的制备

在细胞融合前24h，给预先培养的骨髓瘤细胞换液一次，使其处于对数生长期，融合前从培养瓶移出骨髓瘤细胞于灭菌的离心管，用10ml RPMI-1640培养液洗涤3次（1000rpm，5min），用RPMI-1640培养液重悬细胞，对细胞悬液计数，调整细胞数为1×10⁵~5×10⁵个/ml。

1.2.4 免疫脾细胞悬液的制备

在最后一次免疫注射后第3d，取免疫的小鼠，摘除眼球放血，收集血液分离血清，供检测抗体和作实验的阳性对照用。小鼠拉颈处死，用自来水冲洗后浸入75%酒精中消毒10min，随即放入超净台内，用无菌剪刀剪开小鼠腹腔，取出脾脏，放入玻璃培皿中的消毒铜网上，滴入2ml无血清RPMI-1640培养液，用5ml注射器针筒芯研磨脾脏，使之成浆状，用镊子夹住铜网，滴加适量无血清RPMI-1640培养液洗涤，将培养皿静置3~5min，待大的组织块沉淀后，小心吸取细胞悬液，移入50ml塑料离心管内，用RPMI-1640培养液洗涤细胞2次（1000rpm，10min），用RPMI-1640培养液重新悬浮细胞并计数，调整细胞数为1×10⁸个/ml。

1.2.5 细胞融合

将已制备好的骨髓瘤细胞与脾细胞混合于50ml离心管内，脾细胞与骨髓瘤细胞之比为10:1，用RPMI-1640培养液洗涤细胞2次（1200rpm，10min），同时将50%PEG和10ml RPMI-1640培养液于37℃水浴预热。最后一次洗涤后弃去上清液，用力振动离心管，振散细胞团块，置于37℃水浴中。在1min内滴加0.5ml 50%PEG，缓慢振荡，加完后静置90s，在1min内滴加4ml无血清RPMI-1640培养液，在3min内加1ml无血清RPMI-1640培养液，补加至30ml，静置10min，1000rpm离心10min，弃去上清液，轻轻振散细胞团块，加入15ml含20%小牛血清的HAT RPMI-1640培养液，制成细胞悬液。加入含有饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔0.1ml，于37℃5%CO₂培养箱培养。融合后每天观察细胞生长情况，于第4、6、8、10d每孔吸去50μl培养液上清，加入50μl HAT培养液，第11d改换同量的HT RPMI-1640培养液。

1.2.6 杂交瘤抗体检测

鲤春病毒血症病毒抗原用包被缓冲液50倍稀释，滴加入3块96孔酶标板，每孔100μl，置4℃冰箱过夜，次日甩干包被液，每孔加入100ul封闭液，置37℃温箱中孵育4h，取出后甩干封闭液，洗涤液洗涤3次，每次3min。将融合细胞培养上清加入封闭过的酶标板中，其中两孔加入SP2/0培养上清作为阴性对照，另外两孔加入抗血清作为阳性对照，置37℃温箱中孵育1h，取出后洗涤液洗涤3次，每次3min。洗涤后于酶标板每孔中加入1︰5000倍稀释的酶标二抗100μl，置37℃温箱中孵育1h，取出后洗涤液洗涤3次，每次3min。加入底物溶液，每孔100μl，置37℃温箱中孵育20min显色，取出后每孔加入50μl终止液，终止显色反应。于酶标仪上测定各孔OD_490nm值。被测孔OD_490nm值大于阴性2倍以判定为阳性。

1.2.7 阳性杂交瘤细胞克隆化

将经ELISA检测为阳性的杂交瘤细胞吹打成细胞悬液，进行细胞计数，然后按照1个/孔的稀释度稀释细胞悬液，加入含饲养细胞的96孔细胞培养板培养。对有细胞克隆生长的培养孔，待其生长至一个视野的1/2以上时即可按1.2.6杂交瘤抗体检测的方法进行检测。检测获得的阳性孔再次按同样的方法进行克隆、检测，直至所有克隆化的细胞全部都为阳性，挑选生长良好且阳性较强的细胞孔，将细胞吹打下来，移入24孔板扩大培养，培养换液时收集培养液上清，部分冻存，部分备用。

1.2.8 阳性杂交瘤细胞克隆株的冻存

将24孔板中扩大培养的细胞株，进一步在5ml、10ml、50ml培养瓶中逐步扩大培养，除一部分用于腹水的制备之外，其余细胞在对数生长期时，收集细胞悬液，离心后倾去上清，加入含10%二甲基亚砜的小牛血清，混均后移入细胞冻存管内，-70℃冰箱中过夜，次日放入液氮罐中保存。

1.2.9 腹水的制备

取成年BALB/c雌性小鼠，腹腔注射0.5ml石蜡油，一周后取处在对数生长期的阳性杂交瘤细胞株，倒掉培养上清，用无血清RPMI-1640培养液悬浮细胞，细胞计数，调整细胞数为6×10⁵/ml。将其注入经石蜡油处理过的小鼠腹腔内，每只注入0.5ml。待小鼠腹腔明显胀大后，采集腹水，1d后再采集一次。收集到的腹水置37℃温箱2h，4000rpm离心10min，吸取上清液，56℃水浴灭活30min后，置-20℃冰箱冰存备用。

1.2.10 阳性杂交瘤细胞染色体测定^[138]

取对数生长期杂交瘤细胞用终浓度为0.25umol/L秋水仙素处理4 h，收集细胞后用低渗KCl溶液处理15min，固定液固定，吸管滴加细胞悬液到4℃预冷的载波片上，载波片室温下自然干燥，吉姆萨染色，显微镜下观察并照相，统计染色体数目。

1.2.11 杂交瘤细胞株分泌单克隆抗体的稳定性测定

将亚克隆阳性率达100%的细胞株体外连续培养2个月，每隔一周取细胞培养上清液检测抗体效价；将冻存6个月后的细胞株复苏，取培养上清液检测抗体效价。

1.2.12 单克隆抗体ELISA最佳反应浓度的测定

采用间接ELISA方阵检测。将鲤春病毒血症病毒抗原倍比稀释纵向包被酶标板，3%牛血清白蛋白封闭1h，洗涤3遍。抗体倍比稀释横向包被酶标板，37℃温箱孵育1h，洗涤3遍。加入HRP-羊抗鼠IgG酶标二抗，37℃温箱孵育1h，洗涤3遍，显色后测定各孔OD_490nm值，确定单克隆抗体最佳反应浓度。

1.2.13 单克隆抗体亚类鉴定

采用间接ELISA法。纯化的每株单克隆抗体1000倍稀释后包被酶标板，每孔100μl，37℃孵育1h，洗涤后每孔加入1000倍稀释的抗体亚类试剂100μl，37℃孵育1h，洗涤3遍。然后加入HRP-羊抗鼠IgG酶标二抗，37℃孵育1h，洗涤后加入底物显色，确定各株单克隆抗体的亚类。

1.2.14 单克隆抗体亲和力测定^[139]

采用非竞争酶免疫实验。纯化的每株单克隆抗体，经紫外分光光度计280nm测定其起始浓度，以不同抗原浓度进行抗体倍比稀释的间接ELISA检测，绘制反应曲线，以曲线上最大OD_490nm值一半时的抗体浓度计算单克隆抗体的亲和力常数，确定抗体与抗原的结合能力。抗体亲和力常数以如下公式计算。

公式中：[Ab’]：表示抗原浓度为[Ag’]时OD=1/2ODmax对应的抗体浓度；

[Ab]_t：表示抗原浓度为[Ag]_t时OD=1/2ODmax对应的抗体浓度；

n：为抗原[Ag’]与[Ag]_t间的稀释倍数。

1.2.15正辛酸纯化法

用4倍体积醋酸缓冲液稀释腹水，调至pH4.5，缓慢滴加2.5倍的正辛酸，搅拌30min，离心取上清，加入1/10体积的10倍PBS，调至pH7.4，4℃预冷后，用45%饱和硫酸铵沉淀，离心后取沉淀，用PBS稀释后移入透析袋，在50倍体积PBS中透析，透析期间多次换液，透析结束后，紫外分光光度计280nm测定蛋白浓度并分装冻存。

1.2.16 免疫印迹分析

(1) SDS2PA GE 电泳: 制胶(5% 浓缩胶、12% 分离胶) , 120 V 稳压电泳1. 5 h。

(2) 转膜: 采用浸润法。按常规放置滤纸、胶、PVDF 膜和滤纸的“三明治”夹层,200 mA 稳流电转1 h。剪取M arker 做考马斯亮蓝染色。

(3) 抗体检测: 剩余膜用5% 脱脂奶粉封闭1 h, 加入2 500 倍稀释的腹水作用1 h, 洗涤后加入1∶5 000 倍

稀释辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG 37℃作用1 h,洗涤后将膜浸泡于新配制的DAB 底物溶液中, 室温反应至条带清晰, 用蒸馏水终止反应。

2 结果

2.1 杂交瘤细胞的制备

小鼠脾细胞和SP2/0细胞融合于3块96孔细胞培养板，结果有245个孔有融合细胞生长，融合率为85%。经ELISA检测，其中5个孔为分泌抗体的阳性孔，经选择培养、特异性抗体检测、筛选和3次克隆后，克隆阳性率达100%，最终获得了2株稳定分泌抗体的阳性杂交瘤细胞，分别命名为2A3、3H7。

2.2 阳性杂交瘤细胞培养上清及腹水效价

经间接ELISA测定，3株阳性杂交瘤细胞培养上清及腹水效价见表1-1。

表1-1 杂交瘤细胞培养上清及腹水抗体效价

Table 1-1 Titers of antibodies in hybridoma culture supernatant and fluid in peritoneal cavity of mouse

	2A3	3H7
			培养上清	1:360	1:680
腹水	1:2×10⁴	1:8×10⁵

2.3 阳性杂交瘤细胞染色体数目

杂交瘤细胞染色体数目与其分泌抗体的稳定性有关。细胞经秋水仙素处理后停止于细胞分裂中期，染色体形态规则，观察50个杂交瘤细胞染色体并统计其数目，其中所占比例最大的即为杂交瘤细胞染色体数目。骨髓瘤细胞染色体数为62~68，小鼠正常体细胞染色体数为40，染色体计数结果显示3株杂交瘤细胞染色体数分别为84、96和98，表明杂交瘤细胞是骨髓瘤细胞和小鼠脾细胞的杂合体，能够稳定分泌抗体。阳性杂交瘤细胞染色体形态见图7。

2.4 杂交瘤细胞株分泌单克隆抗体的稳定性

2A3、3H7株阳性杂交瘤细胞连续培养2个月后培养上清的效价保持不变，冻存6个月复苏后培养上清的效价分别为1:600和1:780，表明获得的杂交瘤细胞株在体外长期培养和长期冻存时仍保持稳定的抗体分泌能力。

2.5 单克隆抗体的ELISA最佳反应浓度

经间接ELISA方阵检测，2A3、3H7株单克隆抗体的ELISA最佳反应浓度见表1-2。

表1-2 单克隆抗体的ELISA最佳反应浓度

Table 1-2 The optimal reaction concentration of McAb

	2A3	3H7
			抗原包被浓度（μg）	60	80
抗体包被浓度（稀释倍数）	1:800	1:3200

2.6 单克隆抗体的亚类

表1-3 单克隆抗体亚类检测结果

Table 1-3 Subclass of McAb

用Ig亚类鉴定试剂（IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA）经间接ELISA检测，结果表明2A3、3H7株单克隆抗体分别属于IgG1亚类，测定结果见表1-3。

2.7 单克隆抗体的亲和力

纯化的2A3、3H7单抗的起始浓度分别为1.92、3.42 mg/ml，2株单抗分别与20、40和80倍稀释的抗原进行非竞争酶免疫实验，绘制ELISA反应曲线图，以图中曲线上最大OD_490nm值一半时抗体的浓度计算各单克隆抗体的亲和力常数，结果表明2A3的亲和常数为4.86×10⁸ L/mol，3H7的亲和常数为1.86×10⁹ L/mol，，2株单抗的亲和力为3H7＞2A3。2株单抗的非竞争ELISA反应曲线见图8、9。

2．8 鲤春病毒血症病毒单克窿抗体正辛酸纯化

SVCV单克窿抗体经过正辛酸和硫酸铵的沉淀，透析纯化后，获得了初步纯化的SVCV单克窿抗体蛋白。其SDS-PAGE电泳结果见图10。从电泳结果看出，其中大部分杂蛋白已被去除。图中1蛋白质分子量标准；2未经纯化的单克隆抗体；3-4．经正辛酸纯化的单克隆抗体。

2.9 免疫印迹分析

图11 所示2株腹水与抗原的反应结果。从图谱中看出, 2株单抗腹水与SVCV 的分子量约47 kD 处蛋白结合。

3 小结

3.1 以鲤春病毒血症病毒为抗原免疫BALB/c鼠制备的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，制备了2A3、3H7株单克隆抗体；

3.2 二株单克隆抗体的染色体数分别为84、96；属于IgG1抗体亚类；

3.3 二株单克隆抗体培养上清的效价分别为1:360、1:680，腹水的效价分别为1:2×104、1:8×105 ；

3.4 二株单克隆抗体的最佳抗原包被浓度分别为60、80μg；最佳抗体稀释倍数分别为1:1600、1:3200；

3.5 二株单克隆抗体亲和力常数分别为4.86×108 L/mol、1.86×109 L/mol，相对亲和力为： 3H7＞2A3。

二、噬菌体展示技术筛选鲤春病毒血症病毒抗原表位

本研究旨在利用噬菌体展示技术，通过与SVCV单克隆抗体筛选阳性克隆,以期找出在随机7肽库中能与单克隆抗体2A3株结合的保守序列，在SVCV分子上找出该抗原决定簇的位点，分析其序列，结构与功能的关系；为进行多肽疫苗的设计提供理论和实验依据。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 抗SVCV单克隆抗体2A3株，本实验室保存，能抑制SVCV的生物学活性，质粒pGEX-6P-l、大肠杆菌Dh5a及BL21均为本实验室保存。

1.1.2 试剂及器材： PEG8000购自华美公司；硝酸纤维膜， 96孔酶标板购自Greiner 公司；限制性内切酶BamH1，xhol，EcoR1，T4DNA连接酶均为宝生物(大连)有限公司产品; IPTG，AP标记抗鼠IgG为Promage产品;凝胶回收试剂盒为华舜生物工程有限公司产品。HRP-抗噬菌体抗体购自Phalmacia 公司，羊抗鼠lgG-HRP购自华美公司。噬菌体随机七肽库购自NEB 公司，复杂度为2.8 xl0⁹。

1.2 方法 1.2.1 噬菌体库的筛选

包被单抗2A3, 10μm/ml，100μL，4 ℃ 过夜。BSA封闭缓冲液200μL4℃ 封闭2小时。用灭菌的TBS-0.1% Tween20洗3 次，每次3 分钟，吸干液体。每孔加90μL TBS-0.1％Tween20 , 10μL噬菌体随机7肽库，使加入噬菌体数量约为2xl0¹¹pfu/100μL，室温下摇晃7小时。吸去液体，用TBS-0.1％Tween20洗涤10 次，每次2 分钟，以洗去非特异性结合的噬菌体。用TBS-0.1％Tween20 pH7.4 稀释使含SVCV 800ng/mL，每孔100μL，进行竞争洗脱2 次，每次1 小时，液体收集到灭菌离心管中。每孔再用100μL Ph2.2 甘氨酸缓冲液洗脱10 分钟，液体收集到预加有10μL pH9.1 的Tris-HCl缓冲液的离心管中。收集的噬菌体洗脱液经计数、扩增后，重复进行第2 、3 轮筛选，除洗涤时用TBS-0.5 % Tween20 外，其余同。洗脱液均进行噬菌体计数。

1.2.2 点杂交

用点杂交的方法检验阳性率，把每轮筛选洗脱的噬菌体作单个克隆扩增：3ml的LB培养液中加人30μL的培养过夜的TG1培养液，挑选单个噬菌体克隆到培养液中，37 ℃ 剧裂震摇5 小时，1000r／min离心10分钟。上清液移人另一离心管中，用20 % PEG8000／NaCI 沉淀噬菌体，把噬菌体溶于50μL TBS 。把1μL噬菌体溶液点在硝酸纤维膜上约0.25cm²的小格，室温干燥。用BSA 封闭液封闭1 小时，加人1:5 000的抗SVCV单抗2A3 , 4 ℃ 3 小时。用1 : 1000 HRP-羊抗鼠lgG抗体检测，DAB 显色。用野生型噬菌体vcsml3 作阴性对照。

1.2.3 测序

三轮筛选后单个噬菌体克隆扩增及提取单链DNA ，进行测序。由基因公司完成。

1.2.4 短肽融合蛋白表达质粒的构建及表达纯化

BamH1，xhol双切质粒pGEx-6P-1，回收双切线性化载体;琼脂糖凝胶回收按试剂盒说明进行;T4NDA连接酶连接过夜，转化大肠杆菌DH5a，重组子经酶切鉴定后命名为pGEx-slcl，重组质粒送上海博亚生物技术有限公司测序以最终验证序列。将重组质粒转化感受态大肠杆菌BL21。大肠杆菌感受态的制备，质粒的连接转化按常规方法进行。将表达菌种接种于含100ug/ ml氨节青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜后，按1:100接种于新鲜2xYT培养基中，继续培养至对数生长期(A600=0.5-0.7)，加PITG诱导，培养物离心后用1/20体积PBS重悬，超声波裂解后12000rpm离心分离上清和沉淀:12%凝胶SDS-PAGE电泳检测表达情况。短肽融合蛋白用谷肤甘肽sepharose4B Redipack亲和层析柱(phmaraeiaBioteeh)纯化，操作步骤按说明进行。纯化后测定蛋白含量，-20℃保存备用。

1.2.5 动物免疫

15只6周龄BALB/c小鼠以纯化的融合蛋白免疫处理。第一次免疫用弗氏完全佐剂苗。加强免疫用不完全佐剂苗。每隔两周加强免疫一次。第二次加强免疫后一周采血分离血清，-20℃保存备用。

1.2.6 Westenblot检测短肽融合蛋白与免疫血清的免疫反应性

样品经SDS一PAGE电泳后，转印至硝酸纤维素膜上，5%脱脂乳4℃封闭过夜，TTBS洗三遍，浸入l:100稀释的SARS阳性血清中，室温作用h2，TTBS洗二遍后浸入l:5000稀释的H即标记羊抗人gIG抗体，室温作用lh，洗涤三次后用DAB显色。与免疫血清作用时血清为1:200稀释，二抗为l:5000稀释的碱性磷酸酶标记羊抗鼠IgG抗体，用BcIP/NBT显色系统显色。

1.2.7 ELISA检测短肽融合蛋白与免疫血清的免疫反应性

用0.lmol/ml碳酸盐缓冲液(pH9.6)将超声裂解物上清经50倍稀释，以100ul/孔包被ELIsA板，4℃过夜，用5%脱脂乳室温封闭3h。封闭后用PBST(PBS含0.1%Tween-20)洗二遍，加入10000倍稀释的血清，37℃作用lh，PBST洗五遍;加入l:5000稀释的HRp标记羊抗鼠IgG抗体，37oc作用111，PBST洗七遍，加入OPD显色液显色15分钟，50ul/孔2mol/LH₂SO₄终止，490nm波长测量吸收值。

1.2.8间接免疫荧光试验

融合短肽经裂解、变性、复性后感染单层细胞72h后，离心收集细胞，PBS洗两遍，涂片待干燥后于丙酮中固定15min。固定好的片子于PBS中洗2min后加入50倍稀释的鼠抗短肽融合蛋白血清。37℃孵育lh。PBS中洗三遍，5min每次。加入100倍稀释FITC标记的羊抗鼠IgG (JacksonIR)，37℃孵育lh。PBS洗三遍后，加缓冲甘油封片于显微镜下观察。

2 结果

2.1 噬菌体库的筛选

与2A3结合的抗原表位的阳性噬菌体克隆被特异地筛选、洗脱、计数和扩增。三轮筛选（每轮3 次洗脱）.

2.2 点杂交

点杂交的结果见图1为第1、2 轮筛选6 次洗脱扩增的噬菌体克隆，每次洗脱扩增20 个克隆，共120 个噬菌体克隆；图2为第3 轮筛选3 次洗脱扩增的阳性克隆，每次洗脱扩增30 个克隆，共90 个。

第1 轮和第2 轮筛选共6 次洗脱每次洗脱扩增20 个克隆，最后一轮筛选每次洗脱扩增30 个克隆，共扩增210 个克隆。与阴性对照颜色一致的克隆可视为阴性，由点杂交的结果可见除在第1 轮筛选第1 次洗脱3 个克隆（2 ,12,17号）与阴性结果颜色相近外，其余的都比阴性对照颜色深，表明噬菌体上的随机态能与2A3结合。

2 .3 测序

取最后一次洗脱的10 个克隆进行测序，结果如下:

gataaag atggtataaa attcacaaga ggagac。

2.4 短肤融合蛋白的表达与纯化

将编码各短肤的寡核普酸退火后插入表达载体经诱导后，各融合蛋白均得到了表达，表达产物均为可溶解形式。各融合蛋白经亲和层析纯化后得到了纯化的融合蛋白(图3)。

2.5 抗原表位免疫验证

短肽融合蛋白经表达与纯化后，用ELsIA和Westenblot方法对其进行免疫反应性扫描。结果发现在ELISA和Westernblot(图4)的结果中，均被免疫血清所识别。

2.6 间接免疫荧光试验。

结果短肽融合蛋白均能结合细胞，而加入抗血清则不能。结果表明这些表位是位于SVCV糖蛋白表面结构域上的，属于SVCV抗原表位(图5，图6)。

Claims

1.一种鲤春病毒血症抗原表位，其特征在于：基因序列是SEQ　ID　NO：1。

2.权利要求1所述的鲤春病毒血症抗原表位在制备鲤春病毒血症疫苗的应用。