CN102397582A - 一种丝素蛋白纳米纤维血管支架的制备方法 - Google Patents

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韩志超
许杉杉
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Abstract

本发明公开了一种丝素蛋白纳米纤维血管支架的制备方法，先将未处理的蚕丝纤维经脱胶、透析后形成丝素蛋白海绵，然后在冰浴中滴加氯磺酸到吡啶中，将丝素蛋白海绵放入此溶液放中，经沉淀、溶解、透析脱盐后形成硫酸化丝素蛋白，最后将硫酸化丝素蛋白在机溶液中电纺形成丝素蛋白纳米纤维血管支架；本发明是通过丝素蛋白与氯磺酸反应所得，硫化后的丝素能延长血液凝固时间，并且随着硫酸基团的增加，抗血凝性也有了明显的提高，将硫酸化丝素蛋白进行静电纺丝制得，并且同时具备优良的生物相容性、生物降解性、良好的氧气/水得渗透性和卓越的力学性能，可以应用于小口径血管移植组织工程中，可实现大规模产业化。

Description

一种丝素蛋白纳米纤维血管支架的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种纳米纤维血管支架的制备方法，尤其涉及一种具有抗凝血功能的丝素蛋白纳米纤维血管支架的制备方法。
背景技术：
血管系统疾病是导致糖尿病人残疾和死亡的主要原因。可是，许多需要做动脉旁路手术的患者，都没有合适的血管使用。在过去十年中，由于在手术过程中需要大量血管移植，血管替代品得到了迅速发展。尽管血管移植物已成功地代替大直径(内血管直径＞6毫米)血管，小直径(内径＜6毫米)的长期血管移植物仍然没有让人满意，主要是由于血栓形成。组织工程提供了一种替代的方法，即通过设计不形成血栓的界面来解决小直径血管移植的需要。多年来，为了达到这个目标，人们尝试过许多方法，然而，至今还没有报道成功的临床结果。
丝素蛋白是一种从蚕丝中提取的蛋白质，它具有良好的生物相容性、生物降解性、良好的氧气/水渗透性和卓越的力学性能；目前丝素蛋白材料在生物医学材料领域被广泛的研究，丝素蛋白是一种可以制造支架的新型生物材料，丝素蛋白可以电纺形成管状纳米纤维支架，应用于小口径血管移植术；在血管移植中，血管内壁任何裸露的区域都会成为血栓形成的要点；闭塞性血栓，可迅速导致移植失败，并可能导致灾难性的后果，如心肌梗死及肢体缺血；然而，如果在裸露的区域有抗凝血活性以防止血小板粘附和聚集，就可以大大提高血管重建成功的机会；一个成功的组织工程血管移植，必须具备两个基本生物学性质：一是要表达的抗凝血活性直到内皮细胞充分覆盖，二是支持细胞的生长和扩张，因此，制备在裸露区域含有抗凝血活性的材料是本领域亟待解决的问题。
发明内容：
本发明针对现有技术的不足，提供了一种具有抗凝血活性的丝素蛋白纳米纤维血管支架的制备方法。
一种丝素蛋白纳米纤维血管支架的制备方法，步骤如下：
(1)蚕丝纤维预处理；将未处理的蚕丝纤维用0.05-0.5％W/V碳酸钠溶液脱胶，溶解于氯化钙∶乙醇∶水，摩尔比例1∶1∶5-1∶4∶10的混合溶液中，以60-80℃连续搅拌，并随后用蒸馏水以截留分子量2000-4000的透析管进行透析；最后，将丝素蛋白溶液冻干，12-48小时后形成丝素蛋白海绵，保存在真空干燥器中备用。
(2)硫酸化丝素蛋白的制备；在冰浴中缓慢滴加15-50毫升氯磺酸到50-100毫升吡啶中，将此溶液放入玻璃烧杯中并加入丝素蛋白海绵，逐渐加热反应体系到60-100℃，在恒温冰浴中搅拌反应0.5-5小时；反应后，加入50-500毫升的蒸馏水，随后加入氢氧化钠溶液把反应液调至中性；不溶性部分用真空过滤除去，可溶性部分用500-1000毫升的乙醇沉淀，离心收集沉淀并用少量水溶解；然后，用蒸馏水以截留分子量2000-4000的透析管进行透析脱盐；在冷冻干燥后，硫酸化丝素蛋白保存在真空干燥箱中。
(3)丝素蛋白纳米纤维血管支架的制备；硫酸化丝素蛋白溶解在5-50％W/V有机溶液中；通过直径1-3mm钢制的毛细针头在绝缘板上移动进行电纺；毛细管以固定的高电势和与基底平行的高度移动；毛细管与装有纺丝溶液的注射器相连；用注射器泵来保持恒定0.1-1mL/h的体积流量；用5-20千伏的高压将溶液纺成纤维和并在一个与针尖10-20厘米的覆盖有铝箔盖的收集板上收集；然后，电纺纳米纤维支架均采用100％甲醇处理5-20分钟，以促使β片层的构象转变，使其在水中不溶解。
所述的有机溶液为：二甲基甲酰胺(DMF)、丙酮、氯仿、六氟异丙醇、四氢呋喃中的一种。
本发明是通过丝素蛋白与氯磺酸反应所得，硫化后的丝素能延长血液凝固时间，并且随着硫酸基团的增加，抗血凝性也有了明显的提高，将硫酸化丝素蛋白进行静电纺丝制得，并且同时具备优良的生物相容性、生物降解性、良好的氧气/水得渗透性和卓越的力学性能，可以应用于小口径血管移植组织工程中，生产工艺简单、易于操作，可实现大规模产业化。
具体实施方式：
为了加深对本发明的理解，下面结合实施例对本发明作进一步详述。
一种丝素蛋白纳米纤维血管支架的制备方法，步骤如下：
(1)蚕丝纤维预处理：将未处理的蚕丝纤维用0.1％W/V碳酸钠溶液脱胶，溶解于氯化钙∶乙醇∶水，摩尔比例1∶2∶8的混合溶液中，以78℃连续搅拌，并随后用蒸馏水以截留分子量3500的透析管进行透析；最后，将丝素蛋白溶液冻干，24小时后形成丝素蛋白海绵，保存在真空干燥器中备用。
(2)硫酸化丝素蛋白的制备：在冰浴中缓慢滴加10毫升氯磺酸到60毫升吡啶中，将此溶液放入玻璃烧杯中并加入丝素蛋白海绵，逐渐加热反应体系到80℃，在恒温冰浴中搅拌反应1小时；反应后，加入200毫升的蒸馏水，随后加入氢氧化钠溶液把反应液调至中性；不溶性部分用真空过滤除去，可溶性部分用500毫升的乙醇沉淀，离心收集沉淀并用少量水溶解；然后，用蒸馏水以截留分子量3500的透析管进行透析脱盐；在冷冻干燥后，硫酸化丝素蛋白保存在真空干燥箱中。
(3)丝素蛋白纳米纤维血管支架的制备：硫酸化丝素蛋白溶解在10％W/V六氟异丙醇溶液中，通过直径1.5mm钢制的毛细针头在绝缘板上移动进行电纺，毛细管以固定的高电势和与基底平行的高度移动。毛细管与装有纺丝溶液的注射器相连；用注射器泵来保持恒定0.8mL/h的体积流量，用10千伏的高压将溶液纺成纤维和并在一个与针尖15厘米的覆盖有铝箔盖的收集板上收集，然后，电纺纳米纤维支架均采用100％甲醇处理10分钟，以促使β片层的构象转变，使其在水中不溶解。

Claims (2)

1.一种丝素蛋白纳米纤维血管支架的制备方法，其特征在于：步骤如下：
(1)蚕丝纤维预处理；将未处理的蚕丝纤维用0.05-0.5％W/V碳酸钠溶液脱胶，溶解于氯化钙∶乙醇∶水，摩尔比例1∶1∶5-1∶4∶10的混合溶液中，以60-80℃连续搅拌，并随后用蒸馏水以截留分子量2000-4000的透析管进行透析；最后，将丝素蛋白溶液冻干，12-48小时后形成丝素蛋白海绵，保存在真空干燥器中备用。
(2)硫酸化丝素蛋白的制备：在冰浴中缓慢滴加15-50毫升氯磺酸到50-100毫升吡啶中，将此溶液放入玻璃烧杯中并加入丝素蛋白海绵，逐渐加热反应体系到60-100℃，在恒温冰浴中搅拌反应0.5-5小时；反应后，加入50-500毫升的蒸馏水，随后加入氢氧化钠溶液把反应液调至中性；不溶性部分用真空过滤除去，可溶性部分用500-1000毫升的乙醇沉淀，离心收集沉淀并用少量水溶解；然后，用蒸馏水以截留分子量2000-4000的透析管进行透析脱盐；在冷冻干燥后，硫酸化丝素蛋白保存在真空干燥箱中。
(3)丝素蛋白纳米纤维血管支架的制备；硫酸化丝素蛋白溶解在5-50％W/V有机溶液中；通过直径1-3mm钢制的毛细针头在绝缘板上移动进行电纺；毛细管以固定的高电势和与基底平行的高度移动；毛细管与装有纺丝溶液的注射器相连；用注射器泵来保持恒定0.1-1mL/h的体积流量；用5-20千伏的高压将溶液纺成纤维和并在一个与针尖10-20厘米的覆盖有铝箔盖的收集板上收集；然后，电纺纳米纤维支架均采用100％甲醇处理5-20分钟，以促使β片层的构象转变，使其在水中不溶解。
2.根据权利要求1所述的一种丝素蛋白纳米纤维血管支架的制备方法，其特征在于：所述的有机溶液为：二甲基甲酰胺、丙酮、氯仿、六氟异丙醇、四氢呋喃中的一种。
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