CN102391965A

CN102391965A - 防治人参病害的生物菌剂的制备方法

Info

Publication number: CN102391965A
Application number: CN2011103642251A
Authority: CN
Inventors: 李国君; 回云静; 吴长宝; 徐小明; 朱峰
Original assignee: JILIN JIHAN BIO-FERTILIZER Co Ltd
Current assignee: JILIN JIHAN BIO-FERTILIZER Co Ltd
Priority date: 2011-11-17
Filing date: 2011-11-17
Publication date: 2012-03-28
Anticipated expiration: 2031-11-17
Also published as: CN102391965B

Abstract

本发明涉及一种生物菌剂，即防治人参病害的生物菌剂的制备方法。其步骤如下：(1)菌种培养；(2)种子液制备；(3)种子罐培养；(4)发酵罐培养。使用方法：田间病害防治方法的施用浓度为10⁷cfu/ml，施用量为1.5L/m²，施用方式采用全株均匀喷施并配合地下灌施，在人参生长期每隔10-20天喷施一次，每个生长期至少施用3次。本方法生产操作简单、成本低、菌体发酵完全、芽孢形成率高。试验表明，枯草芽孢杆菌生物菌剂对人参的主要病害人参疫病、人参立枯病、人参黑斑病均具有一定的抑菌效果。

Description

防治人参病害的生物菌剂的制备方法

技术领域

本发明涉及一种生物菌剂，即防治人参病害的生物菌剂的制备方法。

背景技术

在现有技术中，人参为五加科，属多年生草本植物，喜阴凉、湿润的气候，多生长于昼夜温差小的海拔500～1100米山地缓坡或斜坡地的针阔混交林或杂木林中，是名贵中药材。性味甘、微苦。具有微温、补气、生津安神、益气等功能。我国人工栽种人参历史悠久，传统的人参种植是在山坡上采取仿生态的伐林栽种，给生态环境带来了严重的破坏，严重影响了生态和社会健康、有序、高效、和谐的可持续发展。现在国家非常重视中药产业发展，积极推进中药产业化、现代化建设，发展非林地人参种植得到推广，由于田间病害严重，造成人参减产已引起人们的广泛重视，尽管化学农药在防病有一定的效果，但长期使用不仅能使作物产生耐药性，而且还留有残毒污染。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，是芽孢杆菌属的一种。单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。活菌数≥250亿/克。枯草芽孢杆菌不仅在饲料中应该比较广泛，在污水处理及生物肥发酵或发酵床制作中应用也相当广泛，是一种多功能的微生物。

日本于1998年登记了枯草芽孢杆菌可湿性粉剂，主要用于防治茄子和番茄灰霉病；2001年制成混合生防药剂，叶面施用可防治蔬菜和水果的细菌及真菌病害。英国研究发现枯草芽孢杆菌对导致食品腐败的细菌、霉菌和酵母菌有一定程度的抑制作用，其中对真菌和革兰氏阳性菌的抑制作用更强，已经被商业化生产。澳大利亚研究发现，枯草芽孢杆菌对土传病害具有很好的防治和增产作用，随着对枯草芽孢杆菌研究开发的深入，会有更多的枯草芽孢杆菌及制剂被广泛应用。

何红等(2003)研究证实枯草芽孢杆菌对多种植物病原真菌具有较强拮抗作用，对辣椒、白菜、香蕉等炭疽病和蔬菜苗期立枯病具有良好的防治效果。李晶等(2004)研究发现，枯草芽孢杆菌水剂以浸种、灌根并用的方式可防治黄瓜枯萎病，此外，对黄瓜植株还具有一定的促生作用。陈莉等(2004)研究发现枯草芽孢杆菌对葡萄、草莓、辣椒、番茄灰霉病菌菌丝生长具有抑制作用。顾真荣等(2005)研究发现枯草芽孢杆菌在土壤中，可抑制水稻纹枯病病菌菌核形成。毕阳等(2008)研究发现枯草芽孢杆菌对甜瓜采后黑斑病和粉霉病具有抑制效果。但是枯草芽孢杆菌生物菌剂在人参病害防治机理及田间防治效果的研究更是显见报道。

发明内容

本发明的目的是针对上述情况而提供一种枯草芽孢杆菌制备方法，该菌剂可以防治人参病害。

本发明的技术解决方案是：防治人参病害的生物菌剂的制备方法，其步骤如下：

(1)菌种培养：将LB培养基分装于试管中，每管装入10ml培养基，常规方法灭菌，制成斜面；将枯草芽孢杆菌(常规菌种)菌种接入斜面培养基，置于37℃恒温培养箱中，培养18-24小时；

(2)种子液制备：将培养基分装于1000ml三角瓶中，每瓶装液200ml，常规方法灭菌，无菌条件下将斜面培养菌种接入三角瓶进行振荡培养，培养温度37℃±1℃，摇床转速200r/min，恒温培养18-24小时；所述培养基是：LB培养基+2％葡萄糖；

(3)种子罐培养：将培养好的摇瓶种子液接入种子罐中进行种子扩繁培养；培养基：红糖1％+葡萄糖1％+酵母粉1％；培养温度37℃，通气起始比为1∶0.5，种子罐培养18-24小时后，移入发酵罐进行发酵培养；

(4)发酵罐培养：将培养好的菌种接入发酵罐中，进行发酵；培养基：红糖1％+葡萄糖1％+酵母粉1％；培养温度37℃，培养40-50小时，通气起始比为1∶0.5；待芽孢形成率达到80％以上发酵完毕，得菌液(发酵液)。菌数浓度为2亿左右/毫升的菌液。

使用方法：田间病害防治方法的施用浓度为10⁷cfu/ml，施用量为1.5L/m²，施用方式采用全株均匀喷施并配合地下灌施，在人参生长期每隔10-20天喷施一次，每个生长期(6个月左右)至少施用3次。

本发明的优点是：1、本方法生产操作简单、成本低、菌体发酵完全、芽孢形成率高。2、通过试验研究发现枯草芽孢杆菌生物菌剂能够抑制人参病原菌的生长，将该菌剂应用在人参种植中，起到有效防治人参病害，降低农药残留的重要作用。3、本发明采用生物菌剂对生物拮抗的防病机理，实现枯草芽孢杆菌对人参病原菌的防治；形成与常规防治措施协调应用的病害生物防治技术，降低农药使用量，解决农药过量施用造成人参农残、重金属超标问题，保护土壤及环境不受污染，实现人参产品的生态种植，无公害生产。4、本菌剂是一种低毒、污染小、效果明显、易生产、使用方便的生物菌剂。5、试验表明，枯草芽孢杆菌生物菌剂对人参的主要病害人参疫病、人参立枯病、人参黑斑病均具有一定的抑菌效果。试验表明，枯草芽孢杆菌生物菌剂对人参的施用方式采用喷施加灌施的防治效果最好，单独喷施的方式效果次之。

下面将结合实施例、试验例对本发明的实施方式作进一步详细描述。

具体实施方式

实施例

防治人参病害的生物菌剂的制备方法，其步骤如下：

1、菌种：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

2、菌种活化培养：

(1)斜面培养

培养基制备：

将LB培养基分装于试管中，每管装入10ml培养基，常规方法灭菌，制成斜面。将枯草芽孢杆菌菌种接入斜面培养基，置于恒温培养箱中37℃，培养24小时。

(2)种子液制备：

将培养基分装于1000ml三角瓶中，每瓶装液200ml，常规方法灭菌，无菌条件下将斜面培养菌种接入三角瓶进行振荡培养，培养温度37℃，摇床转速200r/min，恒温培养18小时。

3.种子罐培养：

将培养好的摇瓶种子液接入种子罐中进行种子扩繁培养。培养温度37℃，通气起始比为1∶0.5，种子罐培养18小时后，移入发酵罐进行发酵培养。

4.发酵罐培养：

将培养好的菌种接入发酵罐中，进行发酵。培养温度37℃，培养48小时，通气起始比为1∶0.5。待芽孢形成率达到80％以上发酵完毕。

试验例1

枯草芽孢杆菌室内抑菌效果测定：

1、本研究采用两种实验方法测定了枯草芽孢杆菌生物菌剂的菌悬液与发酵液对3种人参病原菌的抑菌效果。结果证明，枯草芽孢杆菌生物菌剂对人参的主要病害人参疫病、人参立枯病、人参黑斑病均具有一定的抑菌效果，且枯草芽孢杆菌菌悬液对人参疫病、人参黑斑病的抑菌效果强于枯草芽孢杆菌发酵液，但是枯草芽孢杆菌发酵液对立枯病的抑菌效果强于枯草芽孢杆菌菌悬液。取适量的菌种加入到无菌水中混匀，制成菌数浓度为10⁷cfu/ml的菌悬液。

2、实验结果

2.1、滤纸片测定法抑菌结果

从滤纸片法测定的不同处理的发酵液及菌悬液对人参3种病原菌抑菌圈结果看，发酵液及菌悬液处理都表现出了对人参3种病原菌的抑制作用，但以菌悬液处理对人参疫病、人参黑斑病抑制作用强于发酵液，而发酵液对人参立枯病的抑菌效果强于菌悬液。枯草芽孢杆菌菌悬液及发酵液的抑菌效果见表-1

表-1枯草芽孢杆菌菌悬液及发酵液对人参3种病原菌的抑菌作用

2.2、菌饼测定法抑菌结果

由表-2可见，24小时观察枯草芽孢杆菌菌悬液及发酵液对供试人参3种病原菌菌丝生长均有抑制作用。其中枯草芽孢杆菌的菌悬液及发酵液对人参疫病达到了很好的抑制作用，但菌悬液的抑菌效果强于发酵液。其中菌悬液对人参疫病的抑菌率达到88.89％，发酵液抑菌效果略低于菌悬液，抑菌率为85.19％。枯草芽孢杆菌对人参黑斑病的抑菌作用较强，菌悬液对人参黑斑病的抑菌率达到了68.75％，而发酵液抑菌率低于菌悬液，抑菌作用减弱，但也达到50％。枯草芽孢杆菌菌悬液及发酵液对人参立枯病的抑菌作用较弱，抑菌率分别为15.78％，21.05％。24小时观察枯草芽孢杆菌菌悬液及发酵液的抑菌效果见表-2：

表-2 24小时观察枯草芽孢杆菌菌悬液及发酵液对3种人参病原菌的抑制作用

试验例2

枯草芽孢杆菌生物菌剂田间试验：

1、试验材料

人参试验田由双岔非林地人参种植基地提供，年生分别为2年生、3年生、4年生人参；用本发明枯草芽孢杆菌生物菌剂(发酵液)。

2、试验设计

分别对2年生、3年生、4年生的人参进行喷施(浓度为10⁷cfu/ml，喷施量按1L/m²对全株进行均匀喷施)、喷施+灌施(浓度为10⁷cfu/ml，喷施量按1.5L/m²对全株进行均匀喷施并且利用地灌方式进行灌施)、清水对照，试验分为9个处理。分别在生长期每隔15天施用一次，共施用3次。

3、田间试验调查结果

通过施用枯草芽孢杆菌生物菌剂，对人参发病率进行调查，试验设置了喷施、喷施加灌施和清水对照三种施用方式。试验表明，枯草芽孢杆菌生物菌剂对人参的施用方式采用喷施加灌施的防治效果最好，单独喷施的方式效果次之。人参施用枯草芽孢杆菌生物菌剂后发病率调查结果见下表：

人参发病率调查表

处理	调查植株数	发病植株数	发病率
				2CK	200株	21株	10.5％
2P	200株	12株	6％
				2(P+G)	200株	9株	4.5％
3CK	200株	26株	13％
				3P	200株	16株	8％
3(P+G)	200株	10株	5％
				4CK	200株	35株	17.5％
4P	200株	20株	10％
				4(P+G)	200株	14株	7％

Claims

1.一种防治人参病害的生物菌剂的制备方法，其特征在于步骤如下：

(1)菌种培养：将LB培养基分装于试管中，每管装入10ml培养基，常规方法灭菌，制成斜面；将枯草芽孢杆菌菌种接入斜面培养基，置于37℃恒温培养箱中，培养18-24小时；

(4)发酵罐培养：将培养好的菌种接入发酵罐中，进行发酵；培养基：红糖1％+葡萄糖1％+酵母粉1％；培养温度37℃，培养40-50小时，通气起始比为1∶0.5；待芽孢形成率达到80％以上发酵完毕，得菌液。

2.按照权利要求1所述的防治人参病害的生物菌剂的制备方法，其特征在于步骤如下：

(1)菌种培养：将LB培养基分装于试管中，每管装入10ml培养基，常规方法灭菌，制成斜面；将枯草芽孢杆菌菌种接入斜面培养基，置于37℃恒温培养箱中，培养24小时；

(2)种子液制备：将培养基分装于1000ml三角瓶中，每瓶装液200ml，常规方法灭菌，无菌条件下将斜面培养菌种接入三角瓶进行振荡培养，培养温度37℃±1℃，摇床转速200r/min，恒温培养18小时；所述培养基是：LB培养基+2％葡萄糖；

(3)种子罐培养：将培养好的摇瓶种子液接入种子罐中进行种子扩繁培养；培养基：红糖1％+葡萄糖1％+酵母粉1％；培养温度37℃，通气起始比为1∶0.5，种子罐培养18小时后，移入发酵罐进行发酵培养；

(4)发酵罐培养：将培养好的菌种接入发酵罐中，进行发酵；培养基：红糖1％+葡萄糖1％+酵母粉1％；培养温度37℃，培养48小时，通气起始比为1∶0.5；待芽孢形成率达到80％以上发酵完毕，得菌液。