CN102375227B - 显微镜和重影消除方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了显微镜和重影消除方法。该显微镜包括：第一成像光学系统，对透过设置在载物台上的样本透过光进行摄像；以及第二成像光学系统，对从该第一成像光学系统分支出的样本透过光的一部分进行摄像。这里，该第二成像光学系统包括：光束分支元件，从该第一成像光学系统分支样本透过光的一部分，并具有预定阈值以上的厚度；摄像元件，对所分支出的样本透过光的相差图像进行摄像；一个或多个光学元件，在该摄像元件上对所分支出的样本透过光的相差图像进行成像；以及滤波器，遮挡在该摄像元件上成像的所分支的样本透过光的一部分。

Description

显微镜和重影消除方法

技术领域

本发明涉及显微镜和重影消除方法。

背景技术

在现有技术中，已经公开了电动式显微镜，其中，根据物镜的切换自动调节聚光透镜、视场光阑、孔径光阑、用于载物台的物镜的光轴方向驱动机构、滤波器、关于光源的调光电源等(例如，见日本未审查专利申请公开第11-133311号)。

发明内容

然而，为了实现关于在日本未审查专利申请公开第11-133311号中所描述的显微镜的自动聚焦功能，已经考虑到将使用获取待被观察的散焦位置的相差光学系统的自动聚焦设备安装至显微镜。在这种情况下，光束分支元件设置在用于将透过样本的光在摄像元件上成像的成像光学系统的光轴上，使得透过样本的光的一部分光被导向至相差光学系统。

通过本发明的发明人进行的关于使用相差光学系统的自动聚焦设备的深入研究的结果，发现通过光束分支元件所引起的重影影响通过成像光学系统和相差光学系统所成像的图像。

本发明将解决以上问题，并且期望提供具有使用相差光学系统的自动聚焦功能的显微镜，并且提供关于显微镜的重影消除方法，其中消除光束分支元件所引起的重影。

根据本发明的实施方式，提供了一种显微镜，包括：第一成像光学系统，对透过设置在载物台上的样本的样本透过光进行摄像；以及第二成像光学系统，对从第一成像光学系统分支出的样本透过光的一部分进行摄像。这里，第二成像光学系统可以包括：光束分支元件，从该第一成像光学系统分支出样本透过光的一部分，并且具有预定阈值以上的厚度；摄像元件，对所分支出的样本透过光的相差图像进行摄像；一个或多个光学元件，在摄像元件上对所分支出的样本透过光的相差图像进行成像；以及滤波器，遮挡在该摄像元件上聚焦的所分支出的样本透过光的一部分。

可以在第一成像光学系统中对光束分支元件所反射的样本透过光进行摄像，并且可以在第二成像光学系统中对透过光束分支元件的样本透过光的相差图像进行摄像。

可以在第一成像光学系统中对透过光束分支元件的样本透过光进行摄像，并且可以在第二成像光学系统中对光束分支元件所反射的样本透过光的相差图像进行摄像。

滤波器可以为设置有通孔组的光阑，其中，该通孔组用于允许成为相差图像的光通量组经过，并且光束分支元件的厚度可以具有比根据通孔的直径、通孔组的通孔的中心间距离和样本透过光在滤波器的位置处的光通量直径所计算的特征值更大的值。

光束分支元件的厚度可以具有比根据下面不等式1所计算的特征值更大的值，不等式1被表示为

[不等式1]

$t>k\×\left(\frac{\mathrm{\φa}+\mathrm{\φb}+d}{2}\right)$

其中，t表示光束分支元件的厚度，k表示光学系统中的特定常数，表示样本透过光在滤波器位置处的光通量直径，表示通孔的直径，并且d表示通孔组的通孔中心之间的距离。

根据发明的另一实施方式，提供了一种重影消除方法，包括：通过具有预定阈值以上的厚度的光束分支元件分支出透过设置在载物台上的样本的样本透过光的一部分；并且通过设置在用于对所分支出的样本透过光的相差图像进行摄像的摄像元件和光束分支元件之间的滤波器来遮挡光束分支元件所分支出的样本透过光的一部分中的由相应的光束分支元件所引起的重影光。

如上所述，关于具有使用相差光学系统的自动聚焦功能的显微镜，可消除由光束分支元件所引起的重影。

附图说明

图1是示出了根据本发明第一实施方式的显微镜的结构的示图；

图2是示出了根据本发明第一实施方式的集成控制单元的结构的框图；

图3是示出了光束分支元件的示图；

图4是示出了根据本发明第一实施方式的散焦量检测单元的实例的示图；

图5是示出了光束分支元件的表面透过率与重影的SN比率之间的关系的图表；

图6是示出了光束分支元件的厚度与偏转量之间的关系的图表；

图7是示出了根据本发明第一实施方式的两个目镜滤波器的实例的示图；

图8是示出了波前像差与光学分支元件厚度之间的关系的图表；以及

图9是示出了根据本发明第二实施方式的散焦量检测单元的实例的示意图。

具体实施方式

下文中，将参照附图详细描述发明的示意性实施方式。在整个附图和说明书中，相同的参考标号被赋予实际上具有相同功能和结构的组成元件，因此将省略其重复描述。

此外，将以下面顺序进行描述：

(1)第一实施方式

(1-1)显微镜的结构

(1-2)光束分支元件

(1-3)散焦量检测单元的结构

(2)第二实施方式

(第一实施方式)

<显微镜的结构>

将参照图1描述根据本发明第一实施方式的显微镜1的结构。图1是示出了根据实施方式的显微镜1的结构的示图。

[整体结构]

如图1所示，根据本实施方式的显微镜1包括：缩略图像摄像单元10，用于对嵌入了生物样本SPL的整个标本PRT的图像(下文中，被称作“缩略图像”)进行摄像；以及放大图像摄像单元20，用于对以预定放大比率放大生物样本SPL的图像(下文中，被称作“放大图像”)进行摄像。此外，在放大图像摄像单元20中，设置了用于检测存在于放大图像摄像单元20中的照明视场光阑的散焦量的散焦量检测单元30。

通过使用预定的固定装置将包括例如诸如血液的结缔组织、上皮组织、或该两种组织的组织切片或者涂抹细胞的生物样本SPL固定在载玻片上来获取标本PRT。组织切片或涂抹细胞根据需要施加各种染色。该染色包括通过HE(苏木精和伊红)染色、姬姆萨染料染色和帕帕尼科拉乌染色所表示的一般染色以及诸如FISH(荧光原位杂交)、酶抗体法等的荧光染色。

此外，描述用于指定相应的生物样本SPL的补充信息(例如，样本采集人的姓名、采集日期和染色类型等)的标签被贴附至标本PRT。

在根据本实施方式的显微镜1中，提供了放置上述标本PRT的载物台40和用于在各个方向上移动载物台40的载物台驱动机构41。通过载物台驱动机构41，在垂直于与载物台表面平行的方向(X轴和Y轴方向)的方向(Z轴方向)上自由移动载物台40。

此外，在放大图像摄像单元20中，设置作为用于照明视场光阑的聚焦调节单元的实例的聚光透镜驱动机构42。

<缩略图像摄像单元>

如图1所示，缩略图像摄像单元10主要包括光源11、物镜12和摄像元件13。

光源11设置在与布置有载物台40的标本的表面相对的表面上。光源11可以通过切换用于照射已经经过一般染色的生物样本SPL的光(下文中，称为明视场照明光，或简称为照明光)和用于照射已经经过特殊染色的生物样本SPL的光(下文中，称为暗视场照明光)来执行照射。此外，光源11可以仅利用明视场照明光和暗视场照明光中的一个来执行照射。在这种情况下，诸如用于照射明视场照明光的光源和用于照射暗视场照明光的光源的两种类型的光源可设置为光源11。

此外，在缩略图像摄像单元10中，可以不单独设置标签光源(未示出)，该标签光源照射用于对贴附至标本PRT的标签上所描述的补充信息进行摄像的光。

具有预定放大倍率的物镜12设置在载物台40的标本配置面侧，将标本配置面中的缩略图像摄像单元10的参考位置的法线用作光轴SRA。透过设置在载物台40上的标本PRT的透过光被物镜12会聚，并且在物镜12的后面(即，照明光的前进方向)所设置的摄像元件13上成像。

包括放置在载物台40的标本配置面中的整个标本PRT的摄像范围的光(换句话说，透过整体标本PRT的透过光)在摄像元件13上成像。在摄像元件13上所成像的图像为通过对整个标本PRT进行摄像所获得的显微图像的缩略图像。

<放大图像摄像单元>

如图1所示，放大图像摄像单元20主要包括光源21、聚光透镜22、物镜23和摄像元件24。此外，在放大图像摄像单元20中设置照明视场光阑(未示出)。

光源21照射明视场照明光，并且被设置在与布置载物台40的标本的表面相对的表面上。此外，照射暗视场照明光的光源(未示出)设置在与光源21不同的位置(例如，样本配置面侧)。

聚光透镜22为会聚从光源21所照射的明视场照明光或从用于暗视场照明的光源所照射的暗视场照明光并将所会聚的光导向至载物台40上的标本PRT的透镜。聚光透镜22设置在载物台40和光源21之间，使用标本配置面中的放大图像摄像单元20的参考位置的法线作为光轴ERA。此外，聚光透镜驱动机构42可以在光轴ERA的方向上驱动聚光透镜22。聚光透镜22可以通过聚光透镜驱动机构42改变在光轴ERA上的位置。

预定放大倍率的物镜23设置在载物台40的标本配置面侧，使用标本配置面中的放大图像摄像单元20的参考位置的法线作为光轴ERA。在放大图像摄像单元20中，通过适当地改变物镜23以各种放大倍率放大生物样本SPL，并且对放大图像进行摄像。透过设置在载物台40上的标本PRT的透过光被物镜23会聚，并且在物镜23后面(即，照明光的前进方向)所设置的成像单元24上被成像。

此外，在作为第一成像光学系统的实例的物镜23与摄像元件24之间的光轴ERA上，设置光束分支元件31，并且透过物镜23的透过光的一部分被导向至散焦量检测单元30，将在稍后进行描述。

在摄像元件24中，在载物台40的标本配置面上具有预定宽度和高度的摄像范围的图像依赖于摄像元件24的像素尺寸和物镜23的放大倍率被成像。此外，由于生物样本SPL的一部分被物镜23放大，所以上述摄像范围为与摄像元件13的摄像范围相比为令人满意的较窄范围。

这里，如图1所示，设置缩略图像摄像单元10和放大图像摄像单元20，使得缩略图像摄像单元10和放大图像摄像单元20中的每个的参考位置的法线的光轴SRA和ERA在Y轴方向上彼此距离D。距离D被设定为用于小型化且同时使得支撑放大图像摄像单元20的物镜23的镜筒(未示出)不出现在摄像元件13的摄像范围内的短距离。

<散焦量检测单元>

如图1所示，作为第二成像光学系统实例的散焦量检测单元30主要包括光束分支元件31、聚光透镜32、双目镜滤波器33、双目镜34和摄像元件35。

如上所述，光束分支元件31设置在放大图像摄像单元20的物镜23与摄像元件24之间的光轴ERA上，使得透过物镜23的样本透过光的一部分(透过样本的光)被反射。换句话说，通过光束分支元件31，透过物镜23的样本透过光在散焦量检测单元30中被分支为向摄像元件24前进的透过光和向聚光透镜32前进的反射光，稍后将进行描述。

根据本实施方式，在通过光束分支元件31所分支的反射光的前进方向侧，设置聚光透镜32。聚光透镜32会聚通过光束分支元件31所分支的反射光，并且将会聚光导向至聚光透镜32后面(反射光前进方向侧)所设置的双目镜34。

双目镜滤波器33为设置在将在稍后描述的聚光透镜32与双目镜34之间并遮挡在散焦量检测单元30内所设置的摄像元件35上所成像的反射光(样本透过光的反射光)的一部分的滤波器。透过双目镜滤波器33的反射光被导向至双目镜滤波器33后面所设置的双目镜34。

双目镜34将通过聚光透镜32所引入的光通量分离成两个光通量。分离的光通量在双目镜34后面(反射光前进方向侧)所设置的摄像元件35的摄像面上形成一组目标图像。

透过双目镜34的每束光在摄像元件35上被成像。结果，在摄像元件35的摄像面上形成目标图像组。由于从聚光透镜32所发射的各个方向的光通量入射在双目镜34上，所以在所形成的目标图像组之间存在相差。下文中，目标图像组被称作相差图像。根据本实施方式的散焦量检测单元30使用相差来检测存在于放大图像摄像单元20中的照明视场光阑的散焦量。

此外，在上面的描述中，示出了设置有散焦量检测单元30内作为相差AF光学系统的聚光透镜、双目镜滤波器、双目镜和摄像元件的结构，然而结构不限于实例。只要其它光学系统能够实现与诸如相差AF光学系统相同的功能，则可以使用另一种光学系统，例如，使用场镜和分离透镜代替聚光透镜和双目镜。

此外，被分别设置在缩略图像摄像单元10、放大图像摄像单元20和散焦量检测单元30上的摄像元件可以为一维摄像元件或二维元件。

此外，将在下面再次详细描述散焦量检测单元30。

<控制单元>

如图1所示，用于控制显微镜各个位置的控制单元连接至根据本实施方式的显微镜1。具体地，用于控制包括光源11和光源21的显微镜1的各个光源的照明控制单元51连接至根据本实施方式的显微镜1，并且用于控制载物台驱动机构41的载物台驱动控制单元52连接至载物台驱动机构41。此外，用于执行聚光透镜22的位置控制的聚光透镜驱动控制单元53连接至聚光透镜22。此外，相差图像摄像控制单元54连接至用于对相差图像进行摄像的摄像元件35，且缩略图像摄像控制单元55连接至用于对缩略图像进行摄像的摄像元件13。此外，放大图像摄像控制单元56连接至用于对生物样本SPL的放大图像进行摄像的摄像元件24。经由各种数据通信信道，关于用于执行控制的位置连接这些控制单元。

此外，在根据本实施方式的显微镜1中，用于控制整体显微镜的控制单元(下文中，称为集成控制单元50)被单独设置并经由各种数据通信通道连接至上述控制单元。

通过CPU(中央处理单元)、GPU(图形处理单元)、ROM(只读存储器)、RAM(随机访问存储器)、存储设备、通信设备、运算电路等实现上述控制单元。

下文中，将简要描述上述控制单元的功能。

<照明控制单元>

照明控制单元51为用于控制根据本实施方式的显微镜1的各个光源的处理单元。当表示生物样本SPL的照明方法的信息从集成控制单元50中被输出时，照明控制单元51根据表示所获取的照明方法的信息来执行相应光源的照射控制。

例如，此处关注照明控制单元51控制在缩略图像摄像单元10中所设置的光源11的情况。在这种情况下，参照表示照明方法的信息，照明控制单元51确定执行获取明视场图像需要的模式(下文中，被称作明视场模式)和获取暗视场图像需要的模式(下文中，被称作暗视场模式)中的一种。此后，照明控制单元51依赖于关于光源11的每种模式来设定参数，并从光源11照射被应用于每种模式的照明光。因此，从光源11所照射的照明光通过载物台40的开口被照射至整个生物样本SPL。此外，作为通过照明控制单元51所设定的参数的实例，可以给出照明光的强度、光源类型的选择等。

此外，此处关注照明控制单元51控制在放大图像摄像单元20中所设置的光源21的情况。在这种情况下，参照表示照明方法的信息，照明控制单元51确定执行明视场模式和暗视场模式的一种。此后，照明控制单元51依赖于关于光源21的每一种模式来设定参数，并从光源21照射被应用于每种模式的照明光。因此，从光源21所照射的照明光通过载物台40的开口被照射至整个生物样本SPL。此外，作为通过照明控制单元51所设定的参数的实例，可以给出照明光的强度、光源类型的选择等。

此外，作为明视场模式中的照明光，可以使用可见光。此外，作为暗视场模式的照明光，可以使用包括能够激发在特殊染色中所使用的荧光标记的波长的光。此外，在暗视场模式中，荧光标记的背景部分被切掉。

<载物台驱动控制单元>

载物台驱动控制单元52为控制用于驱动在根据本实施方式的显微镜1中所设置的载物台的载物台驱动机构41的处理单元。当表示生物样本SPL的成像方法的信息从集成控制单元50中被输出时，载物台驱动控制单元52根据表示所获取的成像方法来控制载物台驱动机构41。

例如，此处关注通过根据本实施方式的显微镜1来对缩略图像进行成像的情况。当对表示生物样本SPL的缩略图像进行成像的信息从集成控制单元50中被输出时，载物台驱动控制单元52在载物台表面方向(X-Y轴方向)上移动载物台40，使得整个标本PRT在摄像元件13的成像范围内。此外，载物台驱动控制单元52在Z轴方向移动载物台40，使得物镜12的焦点与整个标本PRT匹配。

此外，此处关注通过根据本实施方式的显微镜1对放大图像进行成像的情况。当对表示生物样本SPL的放大图像进行成像的信息从集成控制单元50中被输出时，载物台驱动控制单元52驱动并控制载物台驱动机构41，并且在载物台表面方向上移动载物台40，使得生物样本SPL被定位在光源11与物镜12之间以及聚光透镜22与物镜23之间。

此外，载物台驱动控制单元52在载物台表面方向(X-Y轴方向)上移动载物台40，使得生物样本的预定部分被定位在通过摄像元件24所摄像的摄像范围内。

此外，载物台驱动控制单元52在垂直于载物台表面的方向(Z轴方向，以及组织切片的深度方向)上移动载物台40，使得通过驱动并控制载物台驱动机构41，使位于预定摄像范围内的生物样本SPL的位置与物镜23的焦点匹配。

<聚光透镜驱动控制单元>

聚光透镜驱动控制单元53为控制用于驱动在根据本实施方式的显微镜1的放大图像摄像单元20中所设置的聚光透镜22的聚光透镜驱动机构42的处理单元。当关于照明视场光阑的散焦量的信息从集成控制单元50中输出时，聚光透镜驱动控制单元53根据所获取的关于散焦量的信息来控制聚光透镜驱动机构42。

如下所述，当在放大图像摄像单元20中所设置的照明视场光阑没有被正确成像时，放大图像所生成的对比度被劣化。在根据本实施方式的显微镜1中，为了防止对比度的劣化，在稍后将被描述的集成控制单元50中，根据通过散焦量检测单元30所生成的相差图像关于照明视场光阑的散焦量执行指定处理。集成控制单元50将表示指定的照明视场光阑的散焦量的信息输出至聚光透镜驱动控制单元53，并改变聚光透镜22的位置，使得照明视场光阑被成像。

聚光透镜驱动控制单元53校正聚光透镜22的位置(光轴ERA上的位置)，使得通过执行聚光透镜驱动机构42的驱动控制来对照明视场光阑进行成像。

<相差图像摄像控制单元>

相差图像摄像控制单元54为控制在散焦量检测单元30中所设置的摄像元件35的处理单元。相差图像摄像控制单元54根据摄像元件35中的明视场模式或暗视场模式来设定参数。此外，当获取从摄像元件35输出的、相当于在摄像元件35的成像面上所成的像的输出信号时，相差图像摄像控制单元54使用所获取的输出信号作为相当于相差图像的输出信号。当获取相当于相差图像的输出信号时，相差图像摄像控制单元54将相当于所获取的信号的数据输出至集成控制单元50。此外，作为通过相差图像摄像控制单元54所设定的参数的实例，可以给出曝光的启动定时和终止定时(换句话说，曝光时间)等。

<缩略图像摄像控制单元>

缩略图像摄像控制单元55为控制在缩略图像摄像单元10中所设置的摄像元件13的处理单元。缩略图像摄像控制单元55根据摄像元件13中的明视场模式或暗视场模式来设定参数。此外，当获取从摄像元件13输出的、相应于在摄像元件13的成像面上所成的像的输出信号时，缩略图像摄像控制单元55使用所获取的输出信号作为相应于缩略图像的输出信号。当获取相应于缩略图像的输出信号时，缩略图像摄像控制单元55将相应于所获取信号的数据输出至集成控制单元50。此外，作为通过缩略图像摄像控制单元55所设定的参数的实例，可以给出曝光的启动定时和终止定时(曝光时间)等。

<放大图像摄像控制单元>

放大图像摄像控制单元56为控制在放大图像摄像单元20中所设置的摄像元件24的处理单元。放大图像摄像控制单元56根据摄像元件24中的明视场模式或暗视场模式来设定参数。此外，当获取从摄像元件24输出的、相应于在摄像元件24的成像面上所成的像的输出信号时，放大图像摄像控制单元56使用所获取的输出信号作为相应于放大图像的输出信号。当获取相应于放大图像的输出信号时，放大图像摄像控制单元56将相应于所获取的信号的数据输出至集成控制单元50。此外，作为通过放大图像摄像控制单元56所设定的参数的实例，可以给出曝光的启动定时和终止定时(曝光时间)等。

存储单元57为在根据本实施方式的显微镜1中所包括的存储设备的实例。在存储单元57中，用于控制根据本实施方式的显微镜1的各种设定信息、各种数据库、或查找表等被存储。此外，在存储单元57中，诸如显微镜1中的样本的成像历史的各种历史信息可以被记录。此外，在存储单元57中，当通过根据本实施方式的显微镜1(具体地，集成控制单元50)执行某处理时必须保存的各种参数、处理进程、各种数据库或程序等被适当地记录。

在存储单元57中，对于在显微镜1中所包括的各个处理单元，能够自由执行记录和写入。

<集成控制单元>

集成控制单元50为控制包括上述各种处理单元的整体显微镜的处理单元。

集成控制单元50获取关于通过显微镜1所成像的相差图像的数据，并且根据相差图像数据来计算照明视场光阑的散焦量和载玻片厚度的改变量。集成控制单元50使用散焦量和载玻片厚度的改变量执行存在于显微镜1的放大图像摄像单元20中的光学系统的成像，使其能够进一步改进所获取的放大图像的成像精度。

此外，集成控制单元50通过显微镜1获取关于通过显微镜1成像的缩略图像和放大图的显微图像数据，并且显影这些数据，或执行预定的数字处理。此后，集成控制单元50通过诸如互联网、专线等的网络将从缩略图像或放大图中所获取的显微图像数据上载至图像管理服务器。因此，能够通过被连接至网络的客户设备浏览通过显微镜1所成像的样本的显微图像。

此后，参照图2，将详细描述根据本发明的集成控制单元50的结构。图2示出了根据本实施方式的集成控制单元50的结构的框图。

如图2所示，根据本实施方式的集成控制单元50主要包括集成驱动控制单元501、图像获取单元503、图像处理单元505、特征值计算单元507、显微图像输出单元509和通信控制单元511。

例如，通过CPU、ROM、RAM等实现集成驱动控制单元501。集成驱动控制单元501为集成控制用于控制显微镜1每个部分的控制单元(照明控制单元51、载物台驱动控制单元52、聚光透镜驱动控制单元53和相差图像摄像控制单元54、缩略图像摄像控制单元55和放大图像摄像控制单元56)的驱动控制单元。集成驱动控制单元501关于显微镜1的每个部分设定各种信息(例如，各种设定参数等)，或从显微镜1的每个部分获取各种信息。集成驱动控制单元501可以将从显微镜1的每个部分所获取的各种信息输出至特征值计算单元507，稍后将对其进行描述。

例如，通过CPU、ROM、RAM、通信设备等实现图像获取单元503。图像获取单元503通过每个摄像控制单元获取相应于通过缩略图像摄像单元10所成像的缩略图像的数据、相应于通过放大图像摄像单元20所成像的放大图像的数据和相应于通过散焦量检测单元30所成像的相差图像的数据。

当通过每个摄像控制单元获取图像数据时，图像获取单元503将所获取的图像数据输出至图像处理单元505，稍后将对其进行描述。

此外，图像获取单元503可以将所获取的图像数据(显微图像数据)与关于获取日期等的信息相关联，并且将相关信息存储在存储单元57等中。

例如，通过CPU、GPU、ROM、RAM等实现图像处理单元505。图像处理单元505对从图像获取单元503输出的显微图像执行预定图像处理。

具体地，当获取从图像获取单元503输出的相差图像数据、缩略图像数据和放大图像数据(具体而言，这些图像的RAW数据)时，图像处理单元505执行RAW数据的显影处理。此外，图像处理单元505执行构成这些图像的多个图像被连接在一起的处理(拼接处理)，同时执行图像数据的显影处理。

此外，图像处理单元505根据需要执行所获取的数字图像数据的转换处理(自动译码)。就数字图像的转换处理而言，可以给出数字图像被压缩从而生成JPEG图像的处理或被压缩成JPEG图像的数据被转换成不同类型(例如，GIF格式等)的压缩图像的处理。此外，在数字图像的转换处理中，可以包括压缩图像数据被一次解压并稍后经受诸如边缘增强等的处理的重压缩处理或改变压缩图像的压缩率的处理。

当关于相差图像数据执行上述图像处理时，图像处理单元505将执行图像处理后所获取的相差图像数据输出至特征值计算单元507，将在稍后进行描述。此外，当关于缩略图像数据和放大图像数据执行上述图像处理时，图像处理单元505将从这些图像中所获取的显微图像和表示显微图像的各种元数据输出至显微图像输出单元509，稍后将进行描述。

例如，通过CPU、GPU、ROM、RAM等实现特征值计算单元507。特征值计算单元507获取关于通过显微镜1所成像的相差图像的数据，并根据相差图像数据来计算被放置在显微镜1载物台中的样本的散焦量。此外，特征值计算单元507能够根据相差图像数据来计算照明视场光阑的散焦量和载玻片厚度的改变量。集成控制单元50使用散焦量和载玻片厚度的改变量来执行存在于显微镜1的放大图像摄像单元20中的光学系统的成像，使其能够进一步改进所获取的放大图像的成像精度。

通过特征值计算单元507所计算的上述各种特征值被输出至集成驱动控制单元501。

例如，通过CPU、ROM、RAM等实现显微图像输出单元509。显微图像输出单元509通过通信控制单元511将诸如从图像处理单元505所输出的显微图像、与显微图像相关的元数据等的各种信息输出至图像管理服务器，将在稍后进行描述。因此，通过图像管理服务器来管理通过显微镜1所成像的样本的显微图像(数字显微图像)。

例如，通过CPU、ROM、RAM、通信设备等实现通信控制单元511。通信控制单元511在集成控制单元50与被外部提供至显微镜1的图像管理服务器之间执行通过诸如互联网、专线等的网络所执行的通信的控制。

如上，已经示出了根据本实施方式的集成控制单元50的功能的实例。可以使用通用目的的组件或电路构成上述部件，或者可以通过专用于每个部件功能的硬件来构成上述部件。此外，通过CPU等整体执行每个部件的功能。因此，依赖于当执行本实施方式时的技术水平，能够适当地改变待被使用的结构。

此外，能够预备用于实现根据本实施方式的集成控制单元或其它控制单元的每个功能的计算机程序，并在个人计算机等中执行所预备的计算机程序。此外，能够提供上述计算机程序被存储在其中的计算机可读记录介质。例如，记录介质为磁盘、光盘、磁性光盘、闪存等。此外，例如，可以通过网络而不使用记录介质传递计算机程序。

如上，已经参照图1～图2详细描述了根据本实施方式的显微镜1的整体结构。

<光束分支元件>

接下来，在详细描述根据本实施方式的散焦量检测单元30之前，将参照图3详细描述通过本发明人对于光束分支元件所进行的研究。图3示出了光束分支元件的示图。

如图3所示，入射在光束分支元件上的光被分支成从光束分支元件的正面所反射的反射光R1和透过光束分支元件的正面和背面的透过光T1T2。但是，除了反射光R1和透过光T1T2之外，入射在光束分支元件上的光在光束分支元件内被多重反射，从而变为被称作重影光的反射光或透过光。

例如，入射在光束分支元件上的光通过光束分支元件的背面被反射，并且进一步从光束分支元件的正面溢出(图3的T1R2T1中所示的光束)，从而变为反射光R1的重影光。类似地，入射在光束分支元件上的光通过光束分支元件的背面和正面被反射，并且从光束分支元件的背面溢出(图3的T1R2R1T2中所示的光束)，从而变为透过光T1T2的重影光。如图3所示，反射光或透过光和相应于这个光的重影光以间隔Δ被彼此分开，并且由于重影光引起图像模糊等。

透过光或反射光与重影光之间的分离距离Δ依赖于光束分支元件的厚度t而改变，并且当光束分支元件的反射率n均匀时，Δ随着厚度t的减小而减小。据此，在相关技术中，能够通过减小厚度t使重影光与透过光或反射光尽可能匹配。

此外，如上所述，由于在光束分支元件内通过反射生成了重影光，所以光束分支元件在相关技术中进行了AR涂层等，从而在透过侧或反射侧中的重影光的生成被抑制。

此处，通过图1可以明显看出，在根据本实施方式的显微镜1中，在显微镜1内所执行的各种处理中使用光束分支元件的透过光和反射光二者，使其需要抑制透过侧和反射侧两者处的重影光的生成。

然而，即使在光束分支元件上执行涂覆，也很难抑制透过侧和反射侧二者上的重影光的生成。此外，本发明人已经进行了将薄膜镜用作光束分支元件的研究，但是，发现存在诸如温度特性、由于镜子自身的偏转所引起的波前扰动等的问题。

因此，本发明人已经对于能够在包括相差自动聚焦光学系统的显微镜中使用透过侧和反射侧二者的光通量消除由于光束分支元件所引起的重影的方法的深入研究。结果，如下所述，获取根据本实施方式的显微镜1。

<散焦量检测单元的结构>

下文中，将参照图4至图7详细描述在根据本实施方式的散焦量检测单元30中所包括的相差自动聚焦(AF)光学系统(下文中，简称相差光学系统)。

如图4所示，根据本实施方式的散焦量检测单元30所包括的相差光学系统包括：光束分支元件31，用于对透过样本SPL的光的一部分(样本透过光)进行分支；聚光透镜32，用于会聚通过光束分支元件31所分支的样本透过光；双目镜滤波器33；双目镜34以及摄像元件35。

此处，根据本实施方式的光束分支元件31被设置在成像光学系统内，其包括：聚光透镜23，用于会聚透过样本SPL的光(样本透过光)；以及摄像元件24，对通过聚光透镜23所会聚的样本透过光进行摄像。此外，由于根据本实施方式的光束分支元件31消除上述重影光，所以光束分支元件31具有大于预定阈值的厚度。

如上所述，透过光或反射光与重影光之间的分离距离Δ与光束分支元件的厚度t成比例。因此，为了尽可能从在显微镜1中所使用的透过光和反射光中分离出重影光，光束分支元件31的厚度比相关技术的光束分支元件更厚。光束分支元件31具有大于预定阈值的厚度，使得在光束分支元件31中所生成的重影光从通过光束分支元件31所反射的样本透过光(表面反射光)中被显著分离。结果，能够通过双目镜滤波器33遮挡从表面反射光中被显著分离的重影光，将在稍后进行描述，使其能够防止重影光在摄像元件35上被成像。

此处，通过增加光束分支元件31的厚度，光束分支元件的变形量被改变。图5是示出了其中使用BK7作为玻璃材料的平板以平板的自由端被固定的这种方式被固定并且玻璃材料的变形量被测量的结果的示图。从图5中可以明显看出，发现在玻璃材料中所产生的变形量随着玻璃材料厚度的减小急剧增加。此外，在图5中，使用BK7作为玻璃材料的情况被示出，但是，即使使用其它玻璃材料，使得变形量随着厚度的减小而增加的行为是普遍的。

在使用玻璃材料制造光束分支元件的情况下，光束分支元件的反射面具有由于光束分支元件的变形所引起的与原始平面反射镜不同的曲面反射镜的功能。因此，诸如根据本实施方式的光束分支元件31，光束分支元件的厚度与相关技术相反地增加，使其能够实现重影光的分离，并防止光束分支元件的变形。此处，为了防止由于上述变形所引起的影响，在根据本实施方式的光束分支元件31中，光束分支元件31的板厚优选增大，使得变形可以忽略。

此外，考虑玻璃材料的温度特性等优选制造光束分支元件时所使用的玻璃材料。例如，由于由热膨胀所引起的光束分支元件的板厚的改变与玻璃材料的热膨胀系数成比例，所以与BK7等的热膨胀系数相比，使用具有约8％的热膨胀系数的人造石英，使其能够抑制关于热膨胀的影响，并进一步抑制由于厚度改变所引起的影响。

此外，如上所述，通过光束分支元件31所分支的光束被用于通过散焦量检测单元30(相差光学系统)获取聚焦信息(散焦信息)。因此，即使散焦的光束能够被检测，光束分支元件31也优选具有在期望的散焦范围内没有光束渐晕的平面尺寸。

如上所述，在根据本实施方式的显微镜1中，重影光被设置在相差光学系统中的双目镜遮挡，使其优选所期望的光量被导向相差光学系统，稍后，使在成像光学系统(放大图像摄像单元20)的摄像元件24中所生成的重影光的影响变为最小。

例如，在成像光学系统中所设置的摄像元件24为具有12位灰阶的摄像元件的情况下，优选摄像元件24对于重影光量的比率SNR至少为20log(2¹²/1)＝72.24dB。

此外，假设光束分支元件的正面反射率和透过率分别为R1和T1，并且背面反射率和透过率为R2和T2。在这种情况下，对于重影光量的反射侧的比率被表示为20log(R1/(T1R2T1))，并且对于重影光量的透过侧的比率被表示为20log(1/(R1R2))。

因此，例如，在背面上执行AR(防反射)涂层，并且图6中示出在T2＝0.98并且R2＝0.02的情况下的重影光量被计算。在图6中，重影光的影响近似为摄像元件24中的摄像元件24的噪声水平，当如图4所示摄像元件24被设置在光束分支元件31的透过光侧时，优选满足T1＞0.988和R1＜0.012。

此外，根据将在稍后被描述的本发明的第二实施方式，当摄像元件24被设置在光束分支元件31的反射光侧时，优选满足T1＜0.11和R1＞0.89。

此外，就在光束分支元件31上所执行的涂覆而言，优选在显微镜1中所使用的整个波长范围(即，可见光区)内满足上述条件。此外，即使在显微镜1中使用紫外(UV)波长区或红外(IR)波长范围的情况下，也优选即使在这些波长区的涂层性能满足上述条件。

此外，就在光束分支元件31上执行的涂覆而言，优选在入射光束的整个角度范围内满足上述条件。例如，诸如图4中所示的根据本实施方式的显微镜，当光束分支元件31被安装从而与主光束成45°倾斜时，优选在包括以45°角为中心的轴外光束的范围内满足上述条件。

此外，在光束分支元件31中使用正面反射光，由于板厚变化引起的影响能够被忽略。因此，优选将正面反射光导向被安装在反射光侧的摄像元件24或相差光学系统。

接下来，将参照图7考虑光束分支元件31的厚度与双目镜滤波器33之间的关系进一步描述光束分支元件31的厚度。图7示出了根据本实施方式的双目镜滤波器33的实例的示图。

如图7所示，根据本实施方式的双目镜滤波器33为设置有通孔组的光阑，其中，成为相差图像的光通量(图7中的光通量A)可通过该通孔组。在根据本实施方式的相差光学系统中，通过增大光束分支元件31的厚度t，将相应于重影光的光通量(图7中的光通量B)从成为相差图像的光通量(光通量A)中分离出来。当通过从成为相差图像的光通量中分离出相应于重影光的光通量而使得相应于重影光的光通量没有通过通孔时，能够防止重影光在摄像元件35上成像。

此处，如图7所示，在设置双目镜滤波器33的位置处的光通量A和光通量B中的每一个的光通量直径被表示为在双目镜滤波器33中所设置的通孔的直径(即，光阑的直径)被表示为并且通孔之间的中心距离被表示为d。当光学系统以光通量A的中心为双目镜滤波器33的中心的这种方式被调节时，光通量A与光通量B之间的分离距离x可以满足下面不等式101所示出的关系，使得相应于重影光的光通量不通过通孔。此外，根据下面不等式101所计算的距离x的阈值可以考虑光学系统的散焦特性等被校正为更大的值。

[不等式101]

$t>\left(\frac{\mathrm{\&phi;a}+\mathrm{\&phi;b}+d}{2}\right)$

此外，如上所述，分离距离x与光束分支元件31的厚度t相比，其比例常数在光学系统中是固有的。因此，光束分支元件31的厚度t可以被确定，满足下面不等式102中所示的关系。此处，在下面不等式102中，系数k为分离距离x与光束分支元件31的厚度t之间的光学系统中的固有的比例常数的倒数。

[不等式102]

$t>k\&times;\left(\frac{\mathrm{\&phi;a}+\mathrm{\&phi;b}+d}{2}\right)$

如上所述，在根据本实施方式的散焦量检测单元30中，光束分支元件31的厚度t至少为预定的阈值，使得通过光束分支元件31所生成的重影光可以从显微镜1中的处理中所使用的反射光中被充分分离。如上所述被分离的重影光被相差光学系统内所设置的双目镜滤波器遮挡，使得所分离的重影光不在光学系统内的摄像元件35上成像。因此，在根据本实施方式的显微镜1中，能够消除由光束分支元件31所生成的重影光。

此外，在光束分支元件31的透过侧上所设置的摄像元件24中，能够通过调节在光束分支元件31所执行的涂层等将由于重影光所引起的影响抑制得不高于摄像元件24的噪声水平。因此，即使在光束分支元件31的透过侧上所设置的摄像元件中，也能够消除由于重影光引起的影响。

<第二实施方式>

根据本发明第一实施方式的显微镜1将相差光学系统安装在光束分支元件31的反射光侧，并且将放大图像摄像单元20的摄像元件24安装在光束分支元件31的透过光侧。在根据下面将被描述的本发明第二实施方式的显微镜1中，相差光学系统被安装在光束分支元件31的透过光侧，并且放大图像摄像单元20的摄像元件24被安装在光束分支元件31的反射光侧。

在根据本发明当前实施方式的显微镜1中，通过光束分支元件31所分支的透过光和反射光都被用在显微镜1的处理中。关于通过光束分支元件31所反射的反射光，使用正面反射光，使其能够抑制由于光束分支元件31的板厚所引起的影响，但是，透过光束分支元件31的透过光受到由光束分支元件31的板厚所引起的效果的影响。

此外，如图1所示，为了对透过样本的光束进行分支，光束分支元件31被安装，关于入射光束的法线方向具有倾角。由此，由于图像高度所引起的光束的偏差量被改变，使得存在失真、放大倍率色差、波前像差等被改变的可能性。

例如，假设透过聚光透镜23的光束被光束分支元件31分支，并且所分支的光束在放大图像摄像单元20的摄像元件24或散焦量检测单元30(相差光学系统)中被检测。在这种情况下，在相差光学系统中，光束在双目镜34中被检测，并且光束在光阑(双目镜滤波器)中受损，使得入射侧的数值孔径(NA)变得小于光束在摄像元件24中被检测的情况。

图8是示出了在成像系统(放大图像摄像单元20)中所传播的光和在成像系统及相差光学系统中所传播的光的波前像差(WFE)的大小与光束分支元件31的板厚之间的关系的示图。如图8所示，由于入射侧的数值孔径变得更小，所以发现由于板厚所引起的波前像差的影响在相差光学系统中被减小。

因此，如图9所示，在根据本实施方式的显微镜1中，散焦量检测单元30(相差光学系统)安装在光束分支元件31的透过光侧，并且放大图像摄像单元20(即，成像光学系统)安装在光束分支元件31的反射光侧。

由于放大图像摄像单元20所包括的摄像元件24为用于精确成像样本的放大图像的摄像元件，所以摄像元件24对于像差影响敏感。因此，放大图像摄像单元20的光学系统被设置在光束分支元件31的反射光侧，并且仅使用光束分支元件31的正面反射光，使其能够消除由光束分支元件厚度所引起的像差的影响。此外，当设置放大图像摄像单元20时，优选反射来自光束分支元件31的载物台侧的样本透过光。

此外，存在光束分支元件31的透过光侧受到诸如失真、放大倍率色差、波前像差等的像差效果影响的可能性，然而如图8所示，相差光学系统设置在光束分支元件31的透过光侧，从而降低由于像差所引起的影响。

此外，除了满足正面透射率T1＜0.11和正面反射率R1＞0.89之外，可以使用与根据第一实施方式相同的根据本实施方式的光束分支元件31。采用上述光束分支元件31，使得能够使用双目镜滤波器33来消除在相差光学系统中所传播的重影光，并且抑制对于摄像元件24所成像的重影光的强度，从而不影响摄像元件24的处理。

此外，可以使用与根据第一实施方式相同的根据本实施方式的聚光透镜32、双目镜滤波器33、双目镜34和摄像元件35。因此，此处忽略其重复描述。

如上所述，在根据本实施方式的显微镜1中，相差光学系统被安装在光束分支元件31的透过光侧，并且放大图像摄像单元20的摄像元件24被安装在光束分支元件31的反射光侧，使其能够消除由光束分支元件所引起的重影，并且消除摄像元件24中各种像差的影响。结果，能够进一步改进摄像元件24中所成像的显微图像的精度。

本发明包含于2010年8月16日向日本专利局提交的日本在先专利申请JP2010-181760中所公开的主题，其全部内容结合于此作为参考。

本领域的技术人员应当理解，根据设计需求和其他因素，可以进行各种修改、组合、子组合和变形，均应包含在所附权利要求或其等同物的范围之内。

Claims (4)

1.一种显微镜，包括：

第一成像光学系统，对透过设置在载物台上的样本的样本透过光进行摄像；以及

第二成像光学系统，对所述样本透过光的从所述第一成像光学系统分支出的一部分进行摄像，

其中，所述第二成像光学系统包括：

光束分支元件，从所述第一成像光学系统分支出所述样本透过光的一部分，由所述光束分支元件提供的分支透射所述样本透过光和所述样本透过光的一部分中的一个，并且反射所述样本透过光和所述样本透过光的一部分中的另一个，所述样本透过光的一部分变成分支出的样本透过光，所述光束分支元件具有厚度；

摄像元件，对所述分支出的样本透过光的相差图像进行摄像；

多个光学元件，将所述分支出的样本透过光的相差图像成像在所述摄像元件上，

其中，所述多个光学元件包括聚光透镜、双目镜滤波器和位于所述摄像元件前面的双目镜，其中，

所述滤波器遮挡所述分支出的样本透过光的一部分以防被成像到所述摄像元件上，所述一部分是在所述光束分支元件内通过反射生成的重影光，

其中，所述滤波器为设置有通孔组的光阑，其中，所述通孔组用于使成为所述相差图像的光通量组经过，

其中，所述光束分支元件的厚度具有比根据以下不等式1所计算的特征值更大的值，所述不等式1表示为

[数学式1]

$t>k\&times;\frac{(\mathrm{\&phi;}a+\mathrm{\&phi;}b+d)}{2}$

其中，t表示所述光束分支元件的厚度，k表示光学系统中的固有常数，φa表示所述样本透过光在滤波器位置处的光通量直径，φb表示所述通孔的直径，并且d表示所述通孔组的通孔的中心间距离。

2.根据权利要求1所述的显微镜，其中，在所述第一成像光学系统中对所述光束分支元件所反射的所述样本透过光进行摄像，并且

在所述第二成像光学系统中对透过所述光束分支元件的所述样本透过光的所述相差图像进行摄像。

3.根据权利要求1所述的显微镜，其中，在所述第一成像光学系统中对透过所述光束分支元件的所述样本透过光进行摄像，并且

在所述第二成像光学系统中对所述光束分支元件所反射的所述样本透过光的相差图像进行摄像。

4.一种用于消除显微镜中重影的重影消除方法，所述显微镜包括对透过设置在载物台上的样本的样本透过光进行摄像的第一成像光学系统，以及对所述样本透过光的从所述第一成像光学系统分支出的一部分进行摄像的第二成像光学系统，所述方法包括：

在所述第二成像光学系统中，通过具有厚度的光束分支元件分支出样本透过光的一部分，由所述光束分支元件提供的分支透射所述样本透过光和所述样本透过光的一部分中的一个，并且反射所述样本透过光和所述样本透过光的一部分中的另一个，所述样本透过光的一部分变成分支出的样本透过光；以及

所述第二成像光学系统中包括对所述分支出的样本透过光的相差图像进行摄像的摄像元件和将所述分支出的样本透过光的相差图像成像在所述摄像元件上的多个光学元件，所述多个光学元件包括聚光透镜、双目镜滤波器和位于所述摄像元件前面的双目镜，用所述滤波器来遮挡所分支出的样本透过光的一部分以防被成像到所述成像元件上，所述一部分是在所述光束分支元件内通过反射所引起的重影光，

其中，所述滤波器为设置有通孔组的光阑，其中，所述通孔组用于使成为所述相差图像的光通量组经过，

其中，所述光束分支元件的厚度具有比根据以下不等式1所计算的特征值更大的值，所述不等式1表示为

[数学式1]

$t>k\&times;\frac{(\mathrm{\&phi;}a+\mathrm{\&phi;}b+d)}{2}$

其中，t表示所述光束分支元件的厚度，k表示光学系统中的固有常数，φa表示所述样本透过光在滤波器位置处的光通量直径，φb表示所述通孔的直径，并且d表示所述通孔组的通孔的中心间距离。