CN102355844B - 荧光观察系统、荧光观察装置以及荧光观察方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种荧光观察系统(1)，其充分去除了残留于相除图像的对于距离和角度的依赖性利用定量性较高的荧光图像进行观察。荧光观察系统(1)具有：荧光观察装置(100)；校正装置(101)，其与荧光观察装置(100)连接，具有标准样本(30)和以能够变更的方式对该标准样本(30)设定荧光观察装置(100)的观察距离(D)和观察角度(θ)的观察状态设定机构(31、32)；以及观察条件调节部(10)，其根据所设定的观察距离(D)和观察角度(θ)以及通过荧光观察装置(100)对标准样本(30)进行摄影而获得的参照图像(G1)和荧光图像(G2)，调节观察条件。

Description

荧光观察系统、荧光观察装置以及荧光观察方法
技术领域
本发明涉及荧光观察系统、荧光观察装置以及荧光观察方法。
背景技术
以往已知用荧光图像与反射光图像相除，校正观察距离和角度导致的荧光图像的明亮度变动的方法(例如参见日本专利文献1～专利文献3)。
现有技术文献
专利文献
【专利文献1】日本特开昭62-247232号公报
【专利文献2】日本特公平3-58729号公报
【专利文献3】日本特开2006-175052号公报
发明内容
发明要解决的课题
然而就荧光和反射光而言，所摄像的明亮度对于观察距离的依赖性和对于观察角度的依赖性不同，因此存在仅凭荧光图像除以反射光图像无法完全校正距离和角度的影响的问题。
本发明就是鉴于上述情况而完成的，其目的在于提供一种荧光观察装置、荧光观察系统以及荧光观察方法，能够通过充分去除残留于相除后图像的相对于距离与角度的依赖性来利用定量性较高的荧光图像进行观察。
用于解决课题的手段
本发明第1方面的荧光观察系统具有：荧光观察装置，其具有具备照射照明光和激励光的光源的照明部、对在被摄体产生的荧光进行摄影并获得荧光图像的荧光摄像部、对从被摄体返回的返回光进行摄影并获得参照图像的返回光摄像部、以及使用该返回光摄像部获得的参照图像对上述荧光摄像部摄像的荧光图像进行校正的图像校正部；校正装置，其与该荧光观察装置连接，具有标准样本以及以能够变更的方式对该标准样本设定上述荧光观察装置的观察距离和观察角度的观察状态设定机构；以及观察条件调节部，其根据该校正装置设定的观察距离和观察角度以及通过上述荧光观察装置对上述标准样本进行摄影而获得的荧光图像和参照图像，调节观察条件，该观察条件调节部根据上述校正装置设定的观察距离和观察角度以及通过上述荧光观察装置对上述标准样本进行摄影而获得的荧光图像和参照图像，计算指数a～d，调节上述观察条件使得ε＝|ad-bc|小于等于既定阈值εmax的方式，上述图像校正部进行如下处理：
FLrevised＝FLafter/RLafter
其中，FLrevised是校正后的荧光图像的亮度值，
FLafter＝A×FLbefore x
RLafter＝B×RLbefore y
FLbefore、RLbefore是所获得的荧光图像、参照图像的亮度值，
A、B是常数，
x＝(cn-dm)/(bc-ad)      (1)
y＝(an-bm)/(bc-ad)      (2)
a是对朝上述标准样本照射既定强度的激励光时上述荧光摄像部获得的上述荧光图像的亮度的从上述照明部到上述标准样本的距离特性进行幂近似而获得的指数，
b是对朝上述标准样本照射既定强度的激励光时上述荧光摄像部获得的上述荧光图像的亮度的从上述照明部到上述标准样本的余弦特性进行幂近似而获得的指数，
c是对朝上述标准样本照射既定强度的照明光时上述返回光摄像部获得的上述参照图像的亮度的从上述照明部到上述标准样本的距离特性进行幂近似而获得的指数，
d是对朝上述标准样本照射既定强度的照明光时上述返回光摄像部获得的上述参照图像的亮度的从上述照明部到上述标准样本的余弦特性进行幂近似而获得的指数，
rD |m|·rθ |n|≤1+emax   (3)
rD＝Dmax/Dmin
rθ＝cosθmin/cosθmax
Dmax是设想的最大观察距离，
Dmin是设想的最小观察距离，
θmax是设想的最大观察角度，
θmin是设想的最小观察角度(其中，0°≤θmin＜θmax≤90°)，
m、n是满足式(3)的任意常数，
emax：(FLafter/RLafter)max÷(FLafter/RLafter)min-1
(FLafter/RLafter)max是设想的最小观察距离到最大观察距离的范围且最小观察角度到最大观察角度的范围内的最大值，
(FLafter/RLafter)min是设想的最小观察距离到最大观察距离的范围且最小观察角度到最大观察角度的范围内的最小值，
其中，当bc-ad＝0时，x、y根据满足x∶y＝c∶a＝d∶b的任意实数来设定。
根据本发明的第1方面，在荧光观察之前将荧光观察装置设置于校正装置，从而能够根据使用标准样本摄影得到的图像，通过观察条件调节部的工作，计算出荧光观察装置中更为正确的指数a～d，而且能够设定ε小于等于阈值εmax这样的观察条件。由此能够在不受到荧光观察装置所存在的个体差异和存在拆装部件时的个体差异的影响，设定充分降低了对于观察距离和观察角度的依赖性的适当的指数x、y。
即，在进行荧光观察时，若从照明部向被摄体照射激励光，则存在于被摄体内的荧光物质会被激励而产生荧光。所产生的荧光被荧光摄像部摄影而获得荧光图像。而从照明部向被摄体照射照明光时，在被摄体表面反射等而返回的返回光会被返回光摄像部摄影而获得参照图像。图像校正部使用参照图像校正所获得的荧光图像。
其中，所获得的荧光图像的各像素的亮度值FLbefore和参照图像的亮度值RLbefore分别为FLbefore∝Dacosbθ、RLbefore∝Dccosdθ，对于距离和角度具有各自的依赖性。于是考虑通过某指数x对亮度值FLbefore求幂，通过某指数y对亮度值RLbefore求幂，从而降低这些依赖性，此时，使用如上计算出的指数a～d和满足式(3)的常数m、n，还使用通过式(1)、(2)计算出的指数x、y，从而能抑制观察条件导致的变动，获得将对于观察距离和观察角度的依赖性抑制在最大允许误差率的范围内的荧光图像，能进行定量性较高的荧光观察。
本发明的第2方面的荧光观察系统具有：荧光观察装置，其具有具备照射照明光和激励光的光源的照明部、对在被摄体产生的荧光进行摄影并获得荧光图像的荧光摄像部、对从被摄体返回的返回光进行摄影并获得参照图像的返回光摄像部、以及使用该返回光摄像部获得的参照图像对上述荧光摄像部摄像的荧光图像进行校正的图像校正部；校正装置，其与该荧光观察装置连接，具有标准样本以及以能够变更的方式对该标准样本设定上述荧光观察装置的观察距离和观察角度的观察状态设定机构；以及观察条件调节部，其调节观察条件，该观察条件调节部根据上述校正装置设定的观察距离和观察角度以及通过上述荧光观察装置对上述标准样本进行摄影而获得的荧光图像和参照图像，计算指数a～d，调节上述观察条件使得ε＝|ad-bc|小于等于既定阈值εmax，上述图像校正部进行如下处理：
FLrevised＝(FLafter/RLafter)1/x
其中，FLrevised是校正后的荧光图像的亮度值，
FLafter＝A×FLbefore x
RLafter＝B×RLbefore y
FLbefore、RLbefore是所获得的荧光图像、参照图像的亮度值，
A、B是常数，
x∶y＝c∶(a-m)＝d∶(b-n)      (4)
a是对朝上述标准样本照射既定强度的激励光时上述荧光摄像部获得的上述荧光图像的亮度的从上述照明部到上述标准样本的距离特性进行幂近似而获得的指数，
b是对朝上述标准样本照射既定强度的激励光时上述荧光摄像部获得的上述荧光图像的亮度的从上述照明部到上述标准样本的余弦特性进行幂近似而获得的指数，
c是对朝上述标准样本照射既定强度的照明光时上述返回光摄像部获得的上述参照图像的亮度的从上述照明部到上述标准样本的距离特性进行幂近似而获得的指数，
d是对朝上述标准样本照射既定强度的照明光时上述返回光摄像部获得的上述参照图像的亮度的从上述照明部到上述标准样本的余弦特性进行幂近似而获得的指数，
rD |m|·rθ |n|≤1+emax        (3)
rD＝Dmax/Dmin
rθ＝cosθmin/cosθmax
Dmax是设想的最大观察距离，
Dmin是设想的最小观察距离，
θmax是设想的最大观察角度，
θmin是设想的最小观察角度(其中，0°≤θmin＜θmax≤90°)，
m、n是满足式(3)和式(4)的任意常数，
emax：(FLafter/RLafter)max÷(FLafter/RLafter)min-1
(FLafter/RLafter)max是设想的最小观察距离到最大观察距离的范围且最小观察角度到最大观察角度的范围内的最大值，
(FLafter/RLafter)min是设想的最小观察距离到最大观察距离的范围且最小观察角度到最大观察角度的范围内的最小值。
根据本发明第2方面，实施了通过指数x求幂以降低依赖度的处理之后，再通过指数1/x求幂，从而能够在保持最终获得的所校正的荧光图像的亮度值与被摄体内包含的荧光物质的浓度的比例关系的情况下，降低距离和角度的依赖性。
在上述第1方面和第2方面之中，可以m＝0。
这样能消除对于影响较大的观察距离的依赖性，将对于观察角度的依赖性收敛于容许误差的范围内，能进行定量性更高的荧光观察。
本发明第3方面的荧光观察装置具有：具备照射照明光和激励光的光源的照明部；对在被摄体产生的荧光进行摄影并获得荧光图像的荧光摄像部；对从被摄体返回的返回光进行摄影并获得参照图像的返回光摄像部；使用该返回光摄像部获得的参照图像对上述荧光摄像部所拍摄的荧光图像进行校正的图像校正部；拆装部件，其为了变更观察条件而被拆装；识别信息输入装置，其输入该拆装部件所附的识别信息；存储部，其将上述识别信息、指数x、y、上述观察条件对应起来存储；以及观察条件调节部，其在安装有上述拆装部件时，设定为与上述识别信息输入装置所输入的上述识别信息对应地存储于上述存储部的观察条件，上述图像校正部使用与上述识别信息输入装置所输入的上述识别信息对应地存储于上述存储部的指数x、y进行如下处理：
FLrevised＝FLafter/RLafter
其中，FLrevised是校正后的荧光图像的亮度值，
FLafter＝A×FLbefore x
RLafter＝B×RLbefore y
FLbefere，RLbefore是所获得的荧光图像、参照图像的亮度值，
A、B是常数，
x＝(cn-dm)/(bc-ad)      (1)
y＝(an-bm)/(bc-ad)           (2)
a是对朝上述被摄体照射既定强度的激励光时上述荧光摄像部获得的上述荧光图像的亮度的从上述照明部到上述被摄体的距离特性进行幂近似而获得的指数，
b是对朝上述被摄体照射既定强度的激励光时上述荧光摄像部获得的上述荧光图像的亮度的从上述照明部到上述被摄体的余弦特性进行幂近似而获得的指数，
c是对朝上述被摄体照射既定强度的照明光时上述返回光摄像部获得的上述参照图像的亮度的从上述照明部到上述被摄体的距离特性进行幂近似而获得的指数，
d是对朝上述被摄体照射既定强度的照明光时上述返回光摄像部获得的上述参照图像的亮度的从上述照明部到上述被摄体的余弦特性进行幂近似而获得的指数，
rD |m|·rθ |n|≤1+emax       (3)
rD＝Dmax/Dmin
rθ＝cosθmin/cosθmax
Dmax是设想的最大观察距离，
Dmin是设想的最小观察距离，
θmax是设想的最大观察角度，
θmin是设想的最小观察角度(其中，0°≤θmin＜θmax≤90°)，
m、n是满足式(3)的任意常数，
emax：(FLafter/RLafter)max÷(FLafter/RLafter)min-1
(FLafter/RLafter)max是设想的最小观察距离到最大观察距离的范围且最小观察角度到最大观察角度的范围内的最大值，
(FLafter/RLafter)min是设想的最小观察距离到最大观察距离的范围且最小观察角度到最大观察角度的范围内的最小值，
其中，当bc-ad＝0时，x、y根据满足x∶y＝c∶a＝d∶b的任意实数来设定。
本发明第4方面的荧光观察装置具有：具备照射照明光和激励光的光源的照明部；对在被摄体产生的荧光进行摄影并获得荧光图像的荧光摄像部；对从被摄体返回的返回光进行摄影并获得参照图像的返回光摄像部；使用该返回光摄像部获得的参照图像对上述荧光摄像部所拍摄的荧光图像进行校正的图像校正部；拆装部件，其为了变更观察条件而被拆装；识别信息输入装置，其输入该拆装部件所附的识别信息；存储部，其将上述识别信息、指数x、y、上述观察条件对应起来存储；以及观察条件调节部，其在安装有上述拆装部件时，设定为与上述识别信息输入装置所输入的上述识别信息对应地存储于上述存储部的观察条件，上述图像校正部使用与上述识别信息输入装置所输入的上述识别信息对应地存储于上述存储部的指数x、y进行如下处理：
FLrevised＝(FLafter/RLafter)1/x
其中，FLrevised是校正后的荧光图像的亮度值，
FLafter＝A×FLbefore x
RLafter＝B×RLbefore y
FLbefore、RLbefore是所获得的荧光图像、参照图像的亮度值，
A、B是常数，
x∶y＝c∶(a-m)＝d∶(b-n)     (4)
a是对朝上述被摄体照射既定强度的激励光时上述荧光摄像部获得的上述荧光图像的亮度的从上述照明部到上述被摄体的距离特性进行幂近似而获得的指数，
b是对朝上述被摄体照射既定强度的激励光时上述荧光摄像部获得的上述荧光图像的亮度的从上述照明部到上述被摄体的余弦特性进行幂近似而获得的指数，
c是对朝上述被摄体照射既定强度的照明光时上述返回光摄像部获得的上述参照图像的亮度的从上述照明部到上述被摄体的距离特性进行幂近似而获得的指数，
d是对朝上述被摄体照射既定强度的照明光时上述返回光摄像部获得的上述参照图像的亮度的从上述照明部到上述被摄体的余弦特性进行幂近似而获得的指数，
rD |m|·rθ |n|≤1+emax       (3)
rD＝Dmax/Dmin
rθ＝cosθmin/cosθmax
Dmax是设想的最大观察距离，
Dmin是设想的最小观察距离，
θmax是设想的最大观察角度，
θmin是设想的最小观察角度(其中，0°≤θmin＜θmax≤90°)，
m、n是满足式(3)和式(4)的任意常数，
emax：(FLafter/RLafter)max÷(FLafter/RLafter)min-1
(FLafter/RLafter)max是设想的最小观察距离到最大观察距离的范围且最小观察角度到最大观察角度的范围内的最大值，
(FLafter/RLafter)min是设想的最小观察距离到最大观察距离的范围且最小观察角度到最大观察角度的范围内的最小值。
根据本发明的第4方面，当对拆装部件进行拆装而变更观察条件并从识别信息输入部输入了拆装部件所附的识别信息时，能够设定在存储部中与识别信息对应起来存储的观察条件和指数x、y。作为拆装部件，例如能举出内窥镜装置的内窥镜(scoope)等。此时，作为通过拆装部件的拆装而变更的观察条件，可举出物镜光学系统的NA和瞳径、可观察的荧光波长等，作为通过观察条件调节部而调节的观察条件，可举出ε小于等于阈值εmax这样的照明光的波长和物镜光学系统的光圈值或者照明部的光圈值。例如当通过内窥镜的更换而变更了物镜光学系统的NA和瞳径的情况下，通过观察条件调节部对照明光的波长进行了调节，能对于所变更的观察条件和所调节的观察条件设定最能够降低距离依赖性和角度依赖性的指数x、y，在观察条件变动的情况下也能够进行定量性较高的荧光观察。
在上述第3方面和第4方面之中，可以m＝0。
这样能消除对于影响较大的观察距离的依赖性，将对于观察角度的依赖性收敛于容许误差的范围内，能进行定量性更高的荧光观察。
在上述第2方面和第4方面中，上述观察条件调节部可以是调节上述照明光的波长的波长调节部。
在上述第2方面和第4方面中，还可以具有会聚从上述被摄体返回的荧光和返回光的物镜光学系统，上述观察条件调节部可以是上述物镜光学系统所设置的可变光圈。
在上述任一方面中，上述观察条件调节部可以是调节上述照明光和上述激励光的光束直径的可变光圈。
通过改变照明光的波长、物镜光学系统的开口直径、照明光和激励光的光束直径，也能够使被摄体中光的散射和路径发生变化，因此表示观察距离和观察角度的依赖性的指数a～d会发生变动，而用于对其进行校正的指数x、y也会发生变化。因此能够通过对观察条件的调节而获得用于得到充分抑制了观察距离和观察角度的依赖性的校正荧光图像，由此能进行定量性更高的荧光观察。
本发明第5方面的荧光观察方法在变更观察距离和观察角度的同时向标准样本照射照明光和激励光，对在上述标准样本产生的荧光进行摄影，获得观察距离和/或观察角度不同的多个荧光图像，对从上述标准样本返回的返回光进行摄影，获得观察距离和/或观察角度不同的多个参照图像，根据所获得的多个荧光图像和参照图像，计算指数a～d，预先调节观察条件使得ε＝|ad-bc|小于等于既定阈值εmax，向被摄体照射照明光和激励光，使用对从被摄体返回的返回光进行摄影而获得的参照图像，对拍摄在被摄体产生的荧光而获得的荧光图像进行如下校正处理：
FLrevised＝FLafter/RLafter
其中，FLrevised是校正后的荧光图像的亮度值，
FLafter＝A×FLbefore x
RLafter＝B×RLbefore y
FLbefore、RLbefore是所获得的荧光图像、参照图像的亮度值，
A、B是常数，
x＝(cn-dm)/(bc-ad)       (1)
y＝(an-bm)/(bc-ad)       (2)
a是对朝上述标准样本照射既定强度的激励光时荧光摄像部获得的上述荧光图像的亮度的从上述照明部到上述标准样本的距离特性进行幂近似而获得的指数，
b是对朝上述标准样本照射既定强度的激励光时上述荧光摄像部获得的上述荧光图像的亮度的从上述照明部到上述标准样本的余弦特性进行幂近似而获得的指数，
c是对朝上述标准样本照射既定强度的照明光时返回光摄像部获得的上述参照图像的亮度的从上述照明部到上述标准样本的距离特性进行幂近似而获得的指数，
d是时朝上述标准样本照射既定强度的照明光对上述返回光摄像部获得的上述参照图像的亮度的从上述照明部到上述标准样本的余弦特性进行幂近似而获得的指数，
rD |m|·rθ |n|≤1+emax   (3)
rD＝Dmax/Dmin
rθ＝cosθmin/cosθmax
Dmax是设想的最大观察距离，
Dmin是设想的最小观察距离，
θmax是设想的最大观察角度，
θmin是设想的最小观察角度(其中，0°≤θmin＜θmax≤90°)，
m、n是满足式(3)的任意常数，
emax：(FLafter/RLafter)max÷(FLafter/RLafter)min-1
(FLafter/RLafter)max是设想的最小观察距离到最大观察距离的范围且最小观察角度到最大观察角度的范围内的最大值，
(FLafter/RLafter)min是设想的最小观察距离到最大观察距离的范围且最小观察角度到最大观察角度的范围内的最小值，
其中，当bc-ad＝0时，x、y根据满足x∶y＝c∶a＝d∶b的任意实数来设定。
本发明第6方面的荧光观察方法在变更观察距离和观察角度的同时向标准样本照射照明光和激励光，对在上述标准样本产生的荧光进行摄影，获得观察距离和/或观察角度不同的多个荧光图像，对从上述标准样本返回的返回光进行摄影，获得观察距离和/或观察角度不同的多个参照图像，根据所获得的多个荧光图像和参照图像，计算指数a～d，预先调节观察条件使得ε＝|ad-bc|小于等于既定阈值εmax，向被摄体照射照明光和激励光，使用对从被摄体返回的返回光进行摄影而获得的参照图像，对拍摄在被摄体产生的荧光而获得的荧光图像进行如下校正处理：
FLrevised＝(FLafter/RLafter)1/x
其中，FLrevised是校正后的荧光图像的亮度值，
FLafter＝A×FLbefore x
RLafter＝B×RLbefore y
FLbefore、RLbefore是所获得的荧光图像、参照图像的亮度值，
A、B是常数，
x∶y＝c∶(a-m)＝d∶(b-n)           (4)
a是对朝上述标准样本照射既定强度的激励光时荧光摄像部获得的上述荧光图像的亮度的从上述照明部到上述标准样本的距离特性进行幂近似而获得的指数，
b是对朝上述标准样本照射既定强度的激励光时上述荧光摄像部获得的上述荧光图像的亮度的从上述照明部到上述标准样本的余弦特性进行幂近似而获得的指数，
c是对朝上述标准样本照射既定强度的照明光时返回光摄像部获得的上述参照图像的亮度的从上述照明部到上述标准样本的距离特性进行幂近似而获得的指数，
d是对朝上述标准样本照射既定强度的照明光时上述返回光摄像部获得的上述参照图像的亮度的从上述照明部到上述标准样本的余弦特性进行幂近似而获得的指数，
rD |m|·rθ |n|≤1+emax       (3)
rD＝Dmax/Dmix
rθ＝cosθmin/cosθmax
Dmax是设想的最大观察距离，
Dmin是设想的最小观察距离，
θmax是设想的最大观察角度，
θmin是设想的最小观察角度(其中，0°≤θmin＜θmax≤90°)，
m、n是满足式(3)和式(4)的任意常数，
emax：(FLafter/RLafter)max÷(FLafter/RLafter)min-1
(FLafter/RLafter)max是设想的最小观察距离到最大观察距离的范围且最小观察角度到最大观察角度的范围内的最大值，
(FLafter/RLafter)min是设想的最小观察距离到最大观察距离的范围且最小观察角度到最大观察角度的范围内的最小值。
发明效果
本发明可获得如下效果：能通过充分去除残留于相除后图像的对距离和角度的依赖性来利用定量性较高的荧光图像进行观察。
附图说明
图1是示出本发明的一个实施方式的荧光观察系统的整体构成图。
图2是示出图1的荧光观察系统的校正装置的图。
图3是示出图1的荧光观察系统的依赖常数确定部对指数x、y的设定方法的流程图。
图4是说明图3的流程图中指数a～d的计算子程序的流程图。
图5是示出图1的荧光观察系统的第1变形例的整体构成图。
图6是示出图1的荧光观察系统的第2变形例的整体构成图。
图7是说明开口具有有限大小时在被摄体上的照射面的照度与距离的关系的图。
图8A是示出对图7中改变了开口直径时的既定条件下获得的照度的观察距离特性进行幂近似而得到的图表的图。
图8B是示出对图7中改变了开口直径时的既定条件下获得的照度的观察距离特性进行幂近似而得到的图表的图。
图8C是示出对图7中改变了开口直径时的既定条件下获得的照度的观察距离特性进行幂近似而得到的图表的图。
图9是示出图1的荧光观察系统的第3变形例的整体构成图。
图10A是说明图1的荧光观察系统中距离依赖性的测量的图。
图10B是说明图1的荧光观察系统中角度依赖性的测量的图。
图11A是示出基于图10A的测量结果的观察距离特性与基于该特性的幂近似曲线的图表的图。
图11B是示出基于图10B的测量结果的观察角度特性与基于该特性的幂近似曲线的图表的图。
图11C是示出基于图10A的测量结果的观察距离特性与基于该特性的幂近似曲线的图表的图。
图11D是示出基于图10B的测量结果的观察角度特性与基于该特性的幂近似曲线的图表的图。
图12是示出本发明的一个实施方式的荧光观察装置的整体构成图。
具体实施方式
下面参照附图说明本发明一个实施方式的荧光观察系统1。
如图1所示，本实施方式的荧光观察系统1具有由内窥镜装置构成的荧光观察装置100、组合到该荧光观察装置100的校正装置101。
荧光观察装置100具有插入到体内的细长的插入部2、光源(照明部)3、从插入部2的前端向被摄体X照射来自该光源3的照明光和激励光的照明单元(照明部)4、设置于插入部2的前端以获得作为被摄体X的活体组织的图像信息的摄像单元5、配置于插入部2的基端侧以对摄像单元5获得的图像信息进行处理的图像处理部6、显示该图像处理部6所处理的图像G的监视器7。
光源3具有2个氙灯8、从一个氙灯8所发出的照明光中切取激励光(例如波长频带650～740nm)的激励滤波器9、可以变更从另一个氙灯8所发出的照明光中切取的波长的过滤转台(turret)(波长调节部；观察条件调节部)10、会聚通过激励滤波器9和过滤转台10切取出的激励光和照明光的耦合透镜11、将该耦合透镜11所会聚的激励光和照明光合并为同一光路的二向色镜12。图中的符号13是镜片。
照明单元4具有配置于插入部2的长度方向的大致全长范围，引导耦合透镜11所会聚的激励光和照明光的光导纤维14；设置于插入部2的前端，使光导纤维14所引导的激励光和照明光扩散，照射到与插入部2的前端面2a相对的被摄体X的照明光学系统15。
摄像单元5具有会聚从被摄体X的既定观察范围返回的返回光的物镜16；对该物镜16会聚的返回光中大于等于激励波长的光(激励光和荧光)进行反射，并透射波长比激励波长短的照明光的二向色镜17；分别会聚通过了二向色镜17的照明光和被二向色镜17反射的荧光的2个聚光透镜(摄像光学系统)18；对聚光透镜18会聚的荧光和照明光进行摄像的如CCD那样的2个摄像元件19、20。图中的符号21是从二向色镜17反射的光中切断激励光的激励光截止滤波器。
图像处理部6具有根据摄像元件19获得的参照图像信息S1生成参照图像G1的参照图像生成部22、根据摄像元件20获得的荧光图像信息S2生成荧光图像G2的荧光图像生成部23、根据这些通过参照图像生成部22和荧光图像生成部23生成的参照图像G1和荧光图像G2生成校正后的荧光图像G3的图像校正部24、将该图像校正部24生成的所校正的荧光图像G3与参照图像生成部22所生成的参照图像G1合成起来生成图像G的图像合成部25。
其中，作为荧光图像G2，例如使用荧光色素Cy7组成的荧光图像即可。尤其，若事先向被摄体X投放将对于肿瘤特异性荧光药剂、例如癌特异性分子CEA的抗体(Anti-CEA抗体)与Cy7结合起来的荧光药剂，则能获得肿瘤特异性荧光图像G2。作为参照图像G1，例如使用基于照明光在被摄体X表面反射的返回光和在被摄体X内部散射的返回光的图像即可。
图像处理部6还具有依赖常数确定部26，该依赖常数确定部26根据从后述的校正装置101发送来的距离和角度信息以及从参照图像生成部22发送来的参照图像G1和从荧光图像生成部23发送来的荧光图像G2，计算后述的指数x、y。
依赖常数确定部26切换使过滤转台10动作而切取的照明光的波长，同时向校正装置101输出启动信号S3，对各照明光的波长计算后述的指数a～d。而且依赖常数确定部26求出ε＝|ad-bc|最小的照明光的波长，设定过滤转台10使得该波长的滤波器10a配置于光路上，并根据此时的指数a～d选择指数x、y。依赖常数确定部26和过滤转台10构成观察条件调节部。
此处说明依赖常数确定部26的指数a～d的计算方法。
即，改变从照明单元4到被摄体X的距离D，同时对于距离D标绘从照明单元4向被摄体X照射激励光和照明光而获得的荧光图像G2和参照图像G1中预先确定的区域的亮度值的平均值。对如上获得的距离特性进行幂近似，即使其回归幂函数Da、Dc，从而获得表示对观察距离D的依赖性的指数a、c。
同样地，改变照明单元4的光轴与被摄体X的角度θ，同时对于角度的余弦值cosθ标绘从照明单元4向被摄体X照射激励光和照明光而获得的荧光图像G2和参照图像G1中预先确定的区域的亮度值的平均值。对如上获得的余弦特性进行幂近似、即使其回归为幂函数cosbθ、cosdθ，从而获得表示对观察角度θ的依赖性的指数b、d。
接着说明依赖常数确定部26的指数x、y的计算方法。
通常荧光图像G2和参照图像G1相对于观察距离D和观察角度θ具有如下依赖性。
FLbefore∝Dacosbθ、RLbefore∝Dccosdθ
将其直接相除可得FLbefore/RLbefore∝Da-ccosb-dθ。
其中，观察距离D例如可以是从插入部2的前端到被摄体X表面的距离，观察角度θ例如可以是被摄体X的表面法线与物镜16的光轴(或插入部2的长轴方向)构成的角度。
于是，当将指数x、y分别求幂为荧光图像G2、参照图像G1的亮度值的情况下，成为
FLbefore x/RLbefore y∝Dax-cycosbx-dyθ，
因此设m＝ax-cy、n＝bx-dy，设定指数x、y使得m、n为允许限度。
即，x＝(cn-dm)/(bc-ad)    (1)
y＝(an-dm)/(bc-ad)        (2)，
当分母bc-ad＝0的情况下，设定指数x、y使得x∶y＝c∶a＝d∶b。
设所设想的最大观察距离为Dmax、最小的观察距离为Dmin、所设想的最大观察角度为θmax、最小的观察角度为θmin(0°≤θmin＜θmax≤90°)，则各自的比rD、rθ为rD＝Dmax/Dmin，rθ＝cosθmin/cosθmax，使用校正荧光图像的最大允许误差率emax，计算满足rD |m|·rθ |n|≤1+emax    (3)的m、n。
此时，所设想的观察距离D的范围例如可通过物镜16的被摄场深度求出，所设想的观察角度θ的范围例如可通过物镜16的视场角求出。
emax可通过(FLafter/RLafter)max÷(FLafter/RLafter)min＝1+emax求出。
因此首先设定最大允许误差率emax，接着设定满足式(3)的m、n，根据所设定的m、n设定满足式(1)和式(2)的x、y即可。
图像合成部25例如以并列配置参照图像G1与所校正的荧光图像G3并将它们同时显示于监视器7的方式合成图像G，并输出给监视器7。
图像校正部24具有对参照图像生成部22生成的参照图像G1和荧光图像生成部23生成的荧光图像G2实施前处理的前处理部27、用在该前处理部27实施了前处理的荧光图像G2’除以实施了前处理的参照图像G1’的除法处理部28。
前处理部27实施如下的图像处理方法。
FLafter＝A×FLbefore x       (5)
RLafter＝B×RLbefore y       (6)，
其中，FLbefore、RLbefore是所获得的荧光图像G2、参照图像G1的亮度值，
FLafter、RLafter是进行了前处理的荧光图像G2’、参照图像G1’的亮度值，
A、B是常数。
除法处理部28对于每个像素使用上述前处理后的荧光图像G2’的亮度值FLafter和参照图像G1’的亮度值RLafter，进行如下除法运算，获得校正后的荧光图像G3的亮度值FLrevised。
FLrevised＝FLafter/RLafter
如图2所示，校正装置101具有固定插入部2的支座29、与固定于该支座29的插入部2的前端面2a隔开观察距离相对的标准样本30、变更插入部2的前端面2a与标准样本30之间的观察距离D的直动工作台31、变更标准样本30相对于物镜16的光轴的表面角度(观察角度)的倾斜工作台32、控制这些工作台31、32的控制部33。
其中，参照图3和图4说明依赖常数确定部26对指数x、y的设定方法。
如图3所示，依赖常数确定部26首先启动过滤转台10，切换配置于光路上的滤波器10a(步骤S1)。然后依赖常数确定部26实施指数a～d计算步骤S2。
如图4所示，在指数a～d计算步骤S2中由依赖常数确定部26向控制部33输出启动信号S3(步骤S21)，控制部33接受到来自依赖常数确定部26的启动信号S3，驱动各工作台31、32。
控制部33首先以使得插入部2的前端面2a处于观察开始距离的方式向标准样本30的表面驱动直动工作台31(步骤S22)，将此时的观察距离D输出给荧光观察装置100的依赖常数确定部26(步骤S23)。在该状态下，从照明单元4向标准样本30照射照明光和激励光，对返回光和荧光进行摄影(步骤S24)。将在荧光图像生成部20生成的荧光图像G2的亮度值和在参照图像生成部21生成的参照图像G1的亮度值发送给依赖常数确定部26(步骤S25)。
然后控制部33重复多次上述步骤S22～S25的处理，直到达到预先确定的次数(步骤S26)。由此，移动标准样本30，使得插入部2的前端面2a与标准样本30的表面的距离为多点观察距离D，每次移动都将观察距离D输出给依赖常数确定部26。在各观察距离D获得的荧光图像G2的亮度值和参照图像G1的亮度值从荧光图像生成部23和参照图像生成部22发送给依赖常数确定部26。
由此，在依赖常数确定部26中存储多个观察距离D和与多个观察距离D对应起来的荧光图像G2和参照图像G1的亮度值的数据组。而且当汇集了预先确定数量的据组时，如上所述将其回归为幂函数(步骤S27)，计算出表示对于观察距离D的依赖性的指数a、c(步骤S28)。
接下来，控制部33驱动直动工作台31和倾斜工作台32，使得插入部2的前端面2a相对于标准样本30的表面成为观察开始的距离和角度(步骤S29)，将此时的观察角度θ输出给荧光观察装置100的依赖常数确定部26(步骤S30)。在该状态下，从照明单元4向标准样本30照射照明光和激励光，对返回光和荧光摄影(步骤S31)。将在荧光图像生成部23生成的荧光图像G2的亮度值和在参照图像生成部22生成的参照图像G1的亮度值发送给依赖常数确定部26(步骤S32)。
然后，控制部33重复多次上述步骤S29～S32，直到达到预先确定的次数(步骤S33)。由此，移动标准样本30使得插入部2的前端面2a与标准样本30的表面的角度为多点观察角度θ，每次移动都将观察角度θ输出给依赖常数确定部26。在各观察角度θ获得的荧光图像G2的亮度值和参照图像G1的亮度值从荧光图像生成部23和参照图像生成部22发送给依赖常数确定部26。由此，在依赖常数确定部26中存储多个观察角度θ和与多个观察角度θ对应起来的荧光图像G2和参照图像G1的亮度值的数据组，当汇集了预先确定数量的个数据组时，如上所述将其回归为幂函数(步骤S34)，计算出表示对于观察角度θ的依赖性的指数b、d(步骤S35)。由此结束指数a～d计算步骤S2。
接着，依赖常数确定部计算ε＝|ad-bc|(步骤S3)，将ε、a～d和照明光的波长对应起来存储(步骤S4)，对所需的所有波长判定是否计算出指数a～d(步骤S5)。当没有对所需的所有波长计算出指数a～d时，返回步骤S1切换照明光的波长，重复步骤S2～步骤S5。而当对所需的所有波长计算出指数a～d时，比较ε，确定为最小值的照明光的波长和指数a～d(步骤S6)。
然后，依赖常数确定部26设定过滤转台10使得所确定的照明光的波长被照射(步骤S7)。进而，依赖常数确定部26使用根据如上求出的指数a～d和预先设定的最大允许误差emax而设定的常数m、n，计算用于校正亮度变动的指数x、y(步骤S8)。
其中，若假设能够设定为m＝n＝0，则能够将最大允许误差emax设定为无限接近0的值。即能够将误差抑制在最小限度。
另一方面，当通常对m＝ax-cy、n＝bx-dy将常数m、n设定为m＝n＝0时，由于不存在x＝y＝0之外的解，因此无法进行如上设定。其中，设|ad-bc|＝ε，若能够设定照明光的波长以获得对于ε＝0的观察距离D的依赖性或对于观察角度θ的依赖性，则对于m＝ax-cy、n＝bx-dy将常数m、n设定为m＝n＝0时，也能够设定使得x∶y＝c∶a＝d∶b的指数x、y。
因此，优选将照明光的波长设定为ε＝0或尽可能接近0的值。这样就能够大致消除校正后的荧光图像G3的对于观察距离D和观察角度θ的依赖性这双方，能使误差大致为零，能够最大限度提升荧光图像G3的定量性。
据此，选择能获得对于观察距离和观察角度的依赖性的照明光的波长，使得ε为最小值即尽可能接近0的值，从而能将误差抑制在最小限度。也就是说，存在将最大允许误差emax设定为尽可能小的值也能满足式(3)的常数m、n，能够根据常数m、n设定指数x、y。
例如当作为荧光观察装置100应用于内窥镜的情况下，即便存在硬性镜和软性镜那样种类的不同或者上部消化道内窥镜和下部消化道内窥镜等观察部位的不同等，也能对其分别设定ε为最小的照明光的波长，因此能设定分别与之对应的最佳校正用指数x、y。即使是相同种类的荧光观察装置100，也无关于个体差异，能够对每个装置设定ε为最小的照明光的波长，能设定分别与之对应的最佳指数x、y。
根据如上构成的本实施方式的荧光观察系统1，能够以彼此不同的依赖性在可允许的范围内充分降低在荧光图像G2和参照图像G1内包含的观察距离D和观察角度θ的依赖性。因此具有能获得定量性较高的校正后的荧光图像G3，能精度良好地进行观察的优点。
在本实施方式中，在摄像元件19、20获得的参照图像G1和荧光图像G2中含有摄像元件19、20的暗电流和读取所导致的噪声。进行除法处理时，若参照图像G1存在亮度值为零的像素，则除法结果会变得无穷大，无法进行适当校正。
于是可以在前处理部27对荧光图像G2赋予去除暗电流和读取所导致的噪声分量的补偿(offset)，对参照图像G1赋予去除暗电流和读取所导致的噪声分量之后使得所有像素的像素值不会为零的补偿。
在本实施方式中，选择的是能设定ε为最小的指数x、y的照明光的波长，也可以代之设置既定阈值εmax，选择能设定成为ε≤εmax的指数x、y的照明光的波长。
作为本实施方式的标准样本30，既可以使用具有与希望观察的活体相同的散射和吸收特性的模型，也可以使用人或动物(猪和鼠等)的切除组织。
在本实施方式中，作为观察条件调节部举例示出了波长调节部即过滤转台10，但也可以采用滑动式切换滤波器和音响光学元件等其他任意单元作为波长调节部。可以如图5所示，取代过滤转台10，在物镜16的后级设置可变光圈36，调节物镜16的开口，从而能使得指数a～d为最佳。图中的符号37是使照明光和激励光的波长频带通过的滤波器。
所观察的光不仅包括被摄体X表面的反射光，还包括很多在被摄体X内部散射并返回的光。物镜16的开口越大，则越能较多地取入多重散射后从大幅偏离光轴的部位传播来的光。即，开口越大则从被摄体X内部返回的光的作用就越大。由于被摄体X的表面反射与来自内部的返回光的比率同对于观察距离D和观察角度θ的依赖性相关，因此通过调整开口就能调节指数a～d。
如图6所示，可以在照明单元4设置可变光圈38。例如当开口为点的情况下，被摄体X处的照度与距离的平方成反比例，然而开口不为点的情况下会偏离与平方成反比例的关系。
此处作为例子，考察照明光以光轴为中心具有高斯分布，开口具有有限大小时在被摄体X上的照射面的照度与距离的关系。如图7所示，考虑存在于照明光的光轴上，相比照明光学系统15的开口离开距离d1的被摄体X上的照射面的照度与距离的变化。设开口半径为a1，距离为d1。这里表示的是在照明光学系统的开口平面上离开光轴a1’～a1’+da1’，从角度θ～θ+dθ的范围放出的光到达照射面时的照度。角度θ如图7下侧的图那样(从下方观察照明光学系统的开口的图)定义。2根单点划线是与照明光学系统的光轴交叉并彼此垂直的直线。作为与照明光的分布成比例的常数α、照明光的总强度E，如下示出照射面的照度。
【式1】
其中，β是与高斯的半幅值相关的常数(正实数)。(β越大则半幅值越小。)因此从开口内所有点发出的光到达照射面时的照度的合计即总照度如下所示。
【式2】
其中，若将指数函数的指数近似为4次幂的项，则总照度如下。
【式3】
根据式3，开口越大则与距离d1的4次幂成反比例的项的作用就越大，总照度就越脱离与距离平方成反比例的性质。此时，虽然并非单纯的幂函数，然而通过获得最小二乘法等的近似曲线，能大致求出该值。
例如，设E＝10、α＝1、β＝1.5，将观察距离2～15的回归曲线分别以a1＝0.2、1、1.5计算出来，则如图8A～图8C所示，能近似为与距离的-1.997次幂、-1.931次幂和-1.849次幂成比例的函数。
由此能进行定量性更高的荧光观察。
如图9所示，还可以具有后处理部35，该后处理部35用于进一步通过指数1/x对除法处理部28获得的除法值求幂，计算荧光图像G3’。
荧光图像G2的荧光强度与荧光色素的浓度成比例。具体而言，例如设聚集于病变部等的荧光色素的浓度为C(mol/L)、样本体积为V(cm3)、在与病变部的上表面平行的平面切断时的截面积为S(cm2)时，由病变部产生的荧光的亮度E(W/cm2·sr)为
其中，t(cm)表示病变部的厚度。因此所摄影的荧光图像G2的灰度值FLbefore与蓄积于病变部的荧光色素的浓度和病变部的厚度大致成比例。即大致为FLbefore∝Ct。
然而如上所述，当实施以指数x对荧光图像G2的亮度值求幂的前处理时，所校正的荧光图像G3的灰度值FLrevised与Ct处于FLrevised∝(Ct)x的关系，x＝1之外的情况下，无法成为线性表现荧光浓度的荧光图像G3。于是通过在后处理部35以指数1/x求幂，能获得线性表现荧光浓度的荧光图像G3’。因此能够提高荧光图像的定量性，还能更为正确地反映荧光浓度和荧光色素所聚集的病变部的厚度。
此时，优选包括后处理部35进行的后处理，除去对观察距离D和观察角度θ的依赖性，因此可以取代上述实施例中设定为m＝ax-cy、n＝bx＝dy的情况，而设为m＝(ax-cy)/x、n＝(bx＝dy)/x，设定指数x、y使得m、n处于允许限度。
其中，为了使这些式子关于x、y具有x＝y＝0之外的解，必须满足
x∶y＝c∶(a-m)＝d∶(b-n)       (4)。
因此设定满足式(4)和式(3)的m、n，根据所设定的m、n使用式(4)设定x、y即可。
这里，当m＝0时，若ε＝|ad-bc|，则由式(4)而成为n＝(bc-ad)/c＝-ε/c(bc-ad＜0时)。因此如上所述，以设定为ε为最小值的方式调整参照图像G1和荧光图像G2的波长，从而能够在满足式(3)的范围内进一步使n的值为最小，能够使得校正后的荧光图像G3的对于观察距离D和观察角度θ的依赖性为最小。此时还可以设定物镜16和照明单元4的开口大小。通过这些调整，能进一步最大限度提升荧光图像G3的定量性。
尤其是，如果能设定照明光的波长或物镜13和照明单元4的开口大小使得能获得对于ε＝0的观察距离D的依赖性或对于观察角度θ的依赖性，则能基于式(4)设定满足m＝n＝0且x∶y＝c∶a＝d∶b的x、y，因此能消除校正后的荧光图像G3的对于观察距离D和观察角度θ的依赖性这双方，能使误差几乎为零。
本实施方式中也选择了能设定ε为最小的指数x、y的照明光的波长，但也可以代之设置既定阈值εmax，选择能设定成为ε≤εmax的指数x、y的照明光的波长。
例如考虑到通常表示距离依赖性的指数a、c的绝对值大于指数b、d的绝对值，考虑将m＝0这样的x、y例如设为x＝c、y＝a的情况。于是由式(4)成为n＝(bc-ad)/c＝-ε/c(bc-ad＜0时)。
因此，若设定满足式(3)的εmax，则εmax需要满足
εmax≤|c|×log(1+emax)/log(rθ)。
其中，例如使用通过后述实验例求出的指数a～d、a＝-1.518、b＝0.514、c＝-1.605、d＝0.675，则成为
通常消化道内窥镜的视场角为单侧75°左右。因此可设想为θ最大也就是75°左右。另外，若最大允许误差εmax在该范围内被抑制为20％左右，则为
rθ＝cosθmin/cosθmax＝cos0°/cos75°＝3.86，
因此例如能够将εmax设定为
于是可认为在该条件下，ε满足
这表示同时获得了的最大允许误差εmax范围内的定量性。因此若在该实验条件下进行观察，则始终能进行保证了最大允许误差εmax范围内的定量性的观察。
通过如上适当调整ε的值，能够获得低于最大允许误差εmax的条件下的定量性。
若ε足够小，则n＝(bc-ad)/c＝-ε/c(bc-ad＜0时)也能相对于m＝0而变得足够小。因此即使将最大允许误差emax尽可能设定得较小，由于存在满足式(3)和式(4)的m、n，能根据常数m、n设定指数x、y。
下面参照附图说明使用本实施方式的荧光观察系统1的实验例。
使用包含白色光和荧光药剂的激励光的频带(波长频带400～740nm)的光作为照明光，采用在样本Y表面反射回来的照明光的反射光图像作为参照图像G1。采用注入到样本Y内部的荧光色素Cy7所产生的荧光图像作为荧光图像G2。采用猪的摘除直肠作为样本Y。
如图10A、图10B所示，使插入部2的前端面2a与样本Y的表面相对。
距离依赖性的测量图10A中，在插入部2的轴线与直动工作台31的放置面34的法线平行的位置处，使直动工作台31下降并增大观察距离D，同时在多个观察距离D照射照明光和激励光，获得了参照图像G1和荧光图像G2。其结果获得了图11A、图11C所示的表示观察距离特性的图(plot)。
角度依赖性的测量图10B中，从插入部2的轴线与放置面34的法线平行的位置起绕配置于放置面34上的中心线使其旋转，在多个观察角度照射照明光和激励光，获得了参照图像G1和荧光图像G2。其结果获得了图11B、图11D所示的表示观察角度特性的图。
而如图中实线所示，使这些图回归为Y＝P·XQ(X为横轴、Y为纵轴、P为常数、Q为指数)的曲线，从而计算出与观察距离有关的指数a、c以及与观察角度有关的指数b、d，则可获得a＝-1.518、b＝0.514、c＝-1.605、d＝0.675。
下面参照附图说明本发明一个实施方式的荧光观察装置40。
在本实施方式的说明中，对于与上述一个实施方式的荧光观察系统1构成相同的部分赋予相同符号并省略说明。
如图12所示，本实施方式的荧光观察装置40设置为插入部2(拆装部件)可拆装于光源3。这种情况下，通过拆装插入部2并更换为其他插入部2，能对物镜16以及插入部2所包含的各种光学系统进行变更，因此通过物镜16的开口数(NA)和瞳径等的变化或者检测出的荧光的波长、观察对象部位(胃组织和大肠组织等)等的变化，使得上述指数a～d发生变化。
于是在本实施方式中，插入部2具有存储识别信息的IC芯片(识别信息输入装置)41，在安装有插入部2的光源3侧具有读取IC芯片41内的识别信息的读取装置42、将识别信息、照明光的波长以及适于各插入部2的指数x、y对应起来存储的存储部43。而且前处理部27从读取装置42接受与从存储部43输出的插入部2的识别信息对应的指数x、y，进行上述运算，并驱动过滤转台(观察条件调节部)10以成为从存储部43输出的照明光的波长。
通过如上处理，即使对光源3更换了插入部2，也能按照该插入部2选择使ε为最小的照明光的波长，按照该插入部2设定最佳指数x、y，具有能始终获得定量性较高的荧光图像G3的优点。
在本实施方式中，作为识别信息输入装置举例示出的是IC芯片41，也可以采用键盘等其他基于手动输入的任意输入单元代替该IC芯片41。
在本实施方式中，作为观察条件调节部举例示出过滤转台10，也可以采用物镜光学系统的可变光圈36和照明光学系统的可变光圈38代替该过滤转台10。
符号说明
X被摄体；1荧光观察系统；2插入部(拆装部件)；3光源(照明部)；4照明单元(照明部)；10过滤转台(波长调节部；观察条件调节部)；15照明光学系统；16物镜(物镜光学系统)；19摄像元件(返回光摄像部)；20摄像元件(荧光摄像部)；24图像校正部；26依赖常数确定部(观察条件设定部)；30标准样本；31直动工作台(观察状态设定机构)；32倾斜工作台(观察状态设定机构)；36、38可变光圈(观察条件调节部)；40、100荧光观察装置；41IC芯片(识别信息输入装置)；42读取装置(观察条件调节部)；43存储部；101校正装置。

Claims (12)

1.一种荧光观察系统，其具有：
荧光观察装置，其具有具备照射照明光和激励光的光源的照明部、对在被摄体产生的荧光进行摄影并获得荧光图像的荧光摄像部、对从被摄体返回的返回光进行摄影并获得参照图像的返回光摄像部、以及使用该返回光摄像部获得的参照图像对上述荧光摄像部所拍摄的荧光图像进行校正的图像校正部；
校正装置，其与该荧光观察装置连接，具有标准样本以及以能够变更的方式对该标准样本设定上述荧光观察装置的观察距离和观察角度的观察状态设定机构；以及
观察条件调节部，其根据该校正装置设定的观察距离和观察角度以及通过上述荧光观察装置对上述标准样本进行摄影而获得的荧光图像和参照图像，调节观察条件，
该观察条件调节部根据上述校正装置设定的观察距离和观察角度以及通过上述荧光观察装置对上述标准样本进行摄影而获得的荧光图像和参照图像，计算指数a～d，调节上述观察条件使得ε＝|ａｄ－ｂｃ|小于等于既定阈值εｍａｘ，
上述图像校正部进行如下处理：
ＦＬrevised＝ＦＬａｆｔｅｒ/ＲＬａｆｔｅｒ
其中，ＦＬrevised是校正后的荧光图像的亮度值，
ＦＬａｆｔｅｒ＝Ａ×ＦＬｂｅｆｏｒｅ ｘ
ＲＬａｆｔｅｒ＝Ｂ×ＲＬｂｅｆｏｒｅ ｙ
ＦＬｂｅｆｏｒｅ、ＲＬｂｅｆｏｒｅ是所获得的荧光图像、参照图像的亮度值，
A、B是常数，
ｘ＝(ｃｎ－ｄｍ)/(ｂｃ－ａｄ)   (1)
ｙ＝(ａｎ－ｂｍ)/(ｂｃ－ａｄ)   (2)
a是对朝上述标准样本照射既定强度的激励光时上述荧光摄像部获得的上述荧光图像的亮度的从上述照明部到上述标准样本的距离特性进行幂近似而获得的指数，
b是对朝上述标准样本照射既定强度的激励光时上述荧光摄像部获得的上述荧光图像的亮度的从上述照明部到上述标准样本的余弦特性进行幂近似而获得的指数，
c是对朝上述标准样本照射既定强度的照明光时上述返回光摄像部获得的上述参照图像的亮度的从上述照明部到上述标准样本的距离特性进行幂近似而获得的指数，
d是对朝上述标准样本照射既定强度的照明光时上述返回光摄像部获得的上述参照图像的亮度的从上述照明部到上述标准样本的余弦特性进行幂近似而获得的指数，
ｒＤ |ｍ|·ｒθ |ｎ|≦1+ｅｍａｘ   (3)
ｒＤ＝Ｄｍａｘ/Ｄｍｉｎ
ｒθ＝ｃｏｓθｍｉｎ/ｃｏｓθｍａｘ
Ｄｍａｘ是设想的最大观察距离，
Ｄｍｉｎ是设想的最小观察距离，
θｍａｘ是设想的最大观察角度，
θｍｉｎ是设想的最小观察角度(其中，0°≦θｍｉｎ＜θｍａｘ≦90°)，
m、n是满足式(3)的任意常数，
ｅｍａｘ＝(ＦＬａｆｔｅｒ/ＲＬａｆｔｅｒ)ｍａｘ÷(ＦＬａｆｔｅｒ/ＲＬａｆｔｅｒ)ｍｉｎ－1
(ＦＬａｆｔｅｒ/ＲＬａｆｔｅｒ)ｍａｘ是设想的最小观察距离到最大观察距离的范围且最小观察角度到最大观察角度的范围内的最大值，
(ＦＬａｆｔｅｒ/ＲＬａｆｔｅｒ)ｍｉｎ是设想的最小观察距离到最大观察距离的范围且最小观察角度到最大观察角度的范围内的最小值，
其中，当bc-ad＝0时，x、y根据满足ｘ：ｙ＝ｃ：ａ＝ｄ：ｂ的任意实数来设定。
2.一种荧光观察系统，其具有：
荧光观察装置，其具有具备照射照明光和激励光的光源的照明部、对在被摄体产生的荧光进行摄影并获得荧光图像的荧光摄像部、对从被摄体返回的返回光进行摄影并获得参照图像的返回光摄像部、以及使用该返回光摄像部获得的参照图像对上述荧光摄像部所拍摄的荧光图像进行校正的图像校正部；
校正装置，其与该荧光观察装置连接，具有标准样本以及以能够变更的方式对该标准样本设定上述荧光观察装置的观察距离和观察角度的观察状态设定机构；以及
观察条件调节部，其调节观察条件，
该观察条件调节部根据上述校正装置设定的观察距离和观察角度以及通过上述荧光观察装置对上述标准样本进行摄影而获得的荧光图像和参照图像，计算指数a～d，调节上述观察条件使得ε＝|ａｄ－ｂｃ|小于等于既定阈值εｍａｘ，
上述图像校正部进行如下处理：
ＦＬrevised＝(ＦＬａｆｔｅｒ/ＲＬａｆｔｅｒ)1/ｘ
其中，ＦＬrevised是校正后的荧光图像的亮度值，
ＦＬａｆｔｅｒ＝Ａ×ＦＬｂｅｆｏｒｅ ｘ
ＲＬａｆｔｅｒ＝Ｂ×ＲＬｂｅｆｏｒｅ ｙ
ＦＬｂｅｆｏｒｅ、ＲＬｂｅｆｏｒｅ是所获得的荧光图像、参照图像的亮度值，
A、B是常数，
ｘ：ｙ＝ｃ：(ａ－ｍ)＝ｄ：(ｂ－ｎ)   (4)
a是对朝上述标准样本照射既定强度的激励光时上述荧光摄像部获得的上述荧光图像的亮度的从上述照明部到上述标准样本的距离特性进行幂近似而获得的指数，
b是对朝上述标准样本照射既定强度的激励光时上述荧光摄像部获得的上述荧光图像的亮度的从上述照明部到上述标准样本的余弦特性进行幂近似而获得的指数，
c是对朝上述标准样本照射既定强度的照明光时上述返回光摄像部获得的上述参照图像的亮度的从上述照明部到上述标准样本的距离特性进行幂近似而获得的指数，
d是对朝上述标准样本照射既定强度的照明光时上述返回光摄像部获得的上述参照图像的亮度的从上述照明部到上述标准样本的余弦特性进行幂近似而获得的指数，
ｒＤ |ｍ|·ｒθ |ｎ|≦1+ｅｍａｘ   (3)
ｒＤ＝Ｄｍａｘ/Ｄｍｉｎ
ｒθ＝ｃｏｓθｍｉｎ/ｃｏｓθｍａｘ
Ｄｍａｘ是设想的最大观察距离，
Ｄｍｉｎ是设想的最小观察距离，
θｍａｘ是设想的最大观察角度，
θｍｉｎ是设想的最小观察角度(其中，0°≦θｍｉｎ＜θｍａｘ≦90°)，
m、n是满足式(3)和式(4)的任意常数，
ｅｍａｘ＝(ＦＬａｆｔｅｒ/ＲＬａｆｔｅｒ)ｍａｘ÷(ＦＬａｆｔｅｒ/ＲＬａｆｔｅｒ)ｍｉｎ－1
(ＦＬａｆｔｅｒ/ＲＬａｆｔｅｒ)ｍａｘ是设想的最小观察距离到最大观察距离的范围且最小观察角度到最大观察角度的范围内的最大值，
(ＦＬａｆｔｅｒ/ＲＬａｆｔｅｒ)ｍｉｎ是设想的最小观察距离到最大观察距离的范围且最小观察角度到最大观察角度的范围内的最小值。
3.根据权利要求1或2所述的荧光观察系统，其中，m＝0。
4.根据权利要求1或2所述的荧光观察系统，其中，上述观察条件调节部是调节上述照明光的波长的波长调节部。
5.根据权利要求1或2所述的荧光观察系统，其中，具有会聚从上述被摄体返回的荧光和返回光的物镜光学系统，
上述观察条件调节部是设置于上述物镜光学系统的可变光圈。
6.根据权利要求1或2所述的荧光观察系统，其中，上述观察条件调节部是调节上述照明光和上述激励光的光束直径的可变光圈。
7.一种荧光观察装置，其具有：具备照射照明光和激励光的光源的照明部；对在被摄体产生的荧光进行摄影并获得荧光图像的荧光摄像部；以及对从被摄体返回的返回光进行摄影并获得参照图像的返回光摄像部，
其特征在于，所述荧光观察装置还具有：
使用该返回光摄像部获得的参照图像对上述荧光摄像部所拍摄的荧光图像进行校正的图像校正部；
拆装部件，其为了变更观察条件而被拆装；
识别信息输入装置，其输入该拆装部件所附的识别信息；
存储部，其将上述识别信息、指数x、y、上述观察条件对应起来存储；以及
观察条件调节部，其在安装有上述拆装部件时，设定为与上述识别信息输入装置所输入的上述识别信息对应地存储于上述存储部的观察条件，
上述图像校正部使用与上述识别信息输入装置所输入的上述识别信息对应地存储于上述存储部的指数x、y进行如下处理：
ＦＬrevised＝ＦＬａｆｔｅｒ/ＲＬａｆｔｅｒ
其中，ＦＬrevised是校正后的荧光图像的亮度值，
ＦＬａｆｔｅｒ＝Ａ×ＦＬｂｅｆｏｒｅ ｘ
ＲＬａｆｔｅｒ＝Ｂ×ＲＬｂｅｆｏｒｅ ｙ
ＦＬｂｅｆｏｒｅ、ＲＬｂｅｆｏｒｅ是所获得的荧光图像、参照图像的亮度值，
A、B是常数，
ｘ＝(ｃｎ－ｄｍ)/(ｂｃ－ａｄ)   (1)
ｙ＝(ａｎ－ｂｍ)/(ｂｃ－ａｄ)   (2)
a是对朝上述被摄体照射既定强度的激励光时上述荧光摄像部获得的上述荧光图像的亮度的从上述照明部到上述被摄体的距离特性进行幂近似而获得的指数，
b是对朝上述被摄体照射既定强度的激励光时上述荧光摄像部获得的上述荧光图像的亮度的从上述照明部到上述被摄体的余弦特性进行幂近似而获得的指数，
c是对朝上述被摄体照射既定强度的照明光时上述返回光摄像部获得的上述参照图像的亮度的从上述照明部到上述被摄体的距离特性进行幂近似而获得的指数，
d是对朝上述被摄体照射既定强度的照明光时上述返回光摄像部获得的上述参照图像的亮度的从上述照明部到上述被摄体的余弦特性进行幂近似而获得的指数，
ｒＤ |ｍ|·ｒθ |ｎ|≦1+ｅｍａｘ   (3)
ｒＤ＝Ｄｍａｘ/Ｄｍｉｎ
ｒθ＝ｃｏｓθｍｉｎ/ｃｏｓθｍａｘ
Ｄｍａｘ是设想的最大观察距离，
Ｄｍｉｎ是设想的最小观察距离，
θｍａｘ是设想的最大观察角度，
θｍｉｎ是设想的最小观察角度(其中，0°≦θｍｉｎ＜θｍａｘ≦90°)，
m、n是满足式(3)的任意常数，
ｅｍａｘ＝(ＦＬａｆｔｅｒ/ＲＬａｆｔｅｒ)ｍａｘ÷(ＦＬａｆｔｅｒ/ＲＬａｆｔｅｒ)ｍｉｎ－1
(ＦＬａｆｔｅｒ/ＲＬａｆｔｅｒ)ｍａｘ是设想的最小观察距离到最大观察距离的范围且最小观察角度到最大观察角度的范围内的最大值，
(ＦＬａｆｔｅｒ/ＲＬａｆｔｅｒ)ｍｉｎ是设想的最小观察距离到最大观察距离的范围且最小观察角度到最大观察角度的范围内的最小值，
其中，当bc-ad＝0时，x、y根据满足ｘ：ｙ＝ｃ：ａ＝ｄ：ｂ的任意实数来设定。
8.一种荧光观察装置，其具有：具备照射照明光和激励光的光源的照明部；对在被摄体产生的荧光进行摄影并获得荧光图像的荧光摄像部；以及对从被摄体返回的返回光进行摄影并获得参照图像的返回光摄像部，
其特征在于，所述荧光观察装置还具有：
使用该返回光摄像部获得的参照图像对上述荧光摄像部所拍摄的荧光图像进行校正的图像校正部；
拆装部件，其为了变更观察条件而被拆装；
识别信息输入装置，其输入该拆装部件所附的识别信息；
存储部，其将上述识别信息、指数x、y、上述观察条件对应起来存储；以及
观察条件调节部，其在安装有上述拆装部件时，设定为与上述识别信息输入装置所输入的上述识别信息对应地存储于上述存储部的观察条件，
上述图像校正部使用与上述识别信息输入装置所输入的上述识别信息对应地存储于上述存储部的指数x、y进行如下处理：
ＦＬrevised＝(ＦＬａｆｔｅｒ/ＲＬａｆｔｅｒ)1/ｘ
其中，ＦＬrevised是校正后的荧光图像的亮度值，
ＦＬａｆｔｅｒ＝Ａ×ＦＬｂｅｆｏｒｅ ｘ
ＲＬａｆｔｅｒ＝Ｂ×ＲＬｂｅｆｏｒｅ ｙ
ＦＬｂｅｆｏｒｅ、ＲＬｂｅｆｏｒｅ是所获得的荧光图像、参照图像的亮度值，
A、B是常数，
ｘ：ｙ＝ｃ：(ａ－ｍ)＝ｄ：(ｂ－ｎ)   (4)
a是对朝上述被摄体照射既定强度的激励光时上述荧光摄像部获得的上述荧光图像的亮度的从上述照明部到上述被摄体的距离特性进行幂近似而获得的指数，
b是对朝上述被摄体照射既定强度的激励光时上述荧光摄像部获得的上述荧光图像的亮度的从上述照明部到上述被摄体的余弦特性进行幂近似而获得的指数，
c是对朝上述被摄体照射既定强度的照明光时上述返回光摄像部获得的上述参照图像的亮度的从上述照明部到上述被摄体的距离特性进行幂近似而获得的指数，
d是对朝上述被摄体照射既定强度的照明光时上述返回光摄像部获得的上述参照图像的亮度的从上述照明部到上述被摄体的余弦特性进行幂近似而获得的指数，
ｒＤ |ｍ|·ｒθ |ｎ|≦1+ｅｍａｘ   (3)
ｒＤ＝Ｄｍａｘ/Ｄｍｉｎ
ｒθ＝ｃｏｓθｍｉｎ/ｃｏｓθｍａｘ
Ｄｍａｘ是设想的最大观察距离，
Ｄｍｉｎ是设想的最小观察距离，
θｍａｘ是设想的最大观察角度，
θｍｉｎ是设想的最小观察角度(其中，0°≦θｍｉｎ＜θｍａｘ≦90°)，
m、n是满足式(3)和式(4)的任意常数，
ｅｍａｘ＝(ＦＬａｆｔｅｒ/ＲＬａｆｔｅｒ)ｍａｘ÷(ＦＬａｆｔｅｒ/ＲＬａｆｔｅｒ)ｍｉｎ－1
(ＦＬａｆｔｅｒ/ＲＬａｆｔｅｒ)ｍａｘ是设想的最小观察距离到最大观察距离的范围且最小观察角度到最大观察角度的范围内的最大值，
(ＦＬａｆｔｅｒ/ＲＬａｆｔｅｒ)ｍｉｎ是设想的最小观察距离到最大观察距离的范围且最小观察角度到最大观察角度的范围内的最小值。
9.根据权利要求7或8所述的荧光观察装置，其中，m＝0。
10.根据权利要求7或8所述的荧光观察装置，其中，上述观察条件调节部是调节上述照明光的波长的波长调节部。
11.根据权利要求7或8所述的荧光观察装置，其中，上述荧光观察装置具有会聚从上述被摄体返回的荧光和返回光的物镜光学系统，
上述观察条件调节部是设置于上述物镜光学系统的可变光圈。
12.根据权利要求7或8所述的荧光观察装置，其中，上述观察条件调节部是调节上述照明光和上述激励光的光束直径的可变光圈。
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