CN102348707A - 作为syk激酶抑制剂的嘧啶甲酰胺衍生物 - Google Patents

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Abstract

式(I)化合物或其盐，优选药学上可接受的盐，是脾酪氨酸激酶(SYK)的抑制剂，因此潜在地可用于治疗起因于不当肥大细胞活化的疾病，例如过敏性疾病和炎性疾病，以及潜在地可用于癌症治疗，具体为血红素恶性肿瘤。

Description

作为SYK激酶抑制剂的嘧啶甲酰胺衍生物
技术领域
本发明涉及具有针对脾酪氨酸激酶(Syk激酶)的活性的新颖化合物、它们的制备方法、包含它们的药学上可接受的制剂以及它们在治疗中的用途。
背景技术
Syk激酶是参与将活化的免疫受体偶联到介导多样化细胞应答(包括增殖、分化和吞噬)的信号下游事件的非受体酪氨酸激酶。Syk激酶广泛地表达于造血细胞。Syk激酶抑制剂具有潜在的抗炎和免疫调节活性。它们抑制Syk激酶介导的IgG Fcε和γ受体以及BCR受体信号传导，造成对肥大细胞、巨噬细胞和B细胞活化，以及相关的炎症反应和组织损伤的抑制。因此，Syk激酶抑制剂在多个治疗领域(包括类风湿性关节炎、B细胞淋巴瘤以及哮喘/鼻炎的治疗)中引人关注。
类风湿性关节炎(RA)是影响大约1％人口的自身免疫疾病。其特征是导致骨和软骨的衰弱性破坏的关节接合处炎症。最近用利妥昔单抗(其引起可逆的B细胞减少)的临床研究(J.C.W.Edwards等2004，New Eng.J.Med.350：2572-2581)已显示，靶向B细胞功能是对诸如RA的自身免疫疾病的适当治疗策略。临床益处与自身反应性抗体(或类风湿因子)的减少关联，并且这些研究表明B细胞功能和实际上自身抗体产生是疾病中进行性病理的核心。
使用Syk激酶缺乏小鼠细胞的研究已证实该激酶在B细胞功能中绝非多余的作用。缺乏Syk激酶的特征在于B细胞发育的阻断(M.Turner等1995Nature 379：298-302和Cheng等1995，Nature 378：303-306)。这些研究，连同对缺乏Syk激酶的成熟B细胞的研究(Kurasaki等2000，Immunol.Rev.176：19-29)证实，B细胞的分化和活化需要Syk激酶。因此，RA患者中Syk激酶的抑制可能阻断B细胞功能，并因此减少类风湿因子产生。除了Syk激酶在B细胞功能中的作用外，与RA治疗相关的是，在Fc受体(FcR)信号传导中需要Syk激酶活性。在RA中通过免疫复合物活化FcR已表明有助于多种促炎介质的释放。
Wong等(2004，ibid)已对Syk激酶依赖性过程对RA病理的贡献做了综述。
syk激酶抑制剂R788(fostamatinib二钠，Rigel)的12周临床试验结果已公开：Treatment of rheumatoid arthritis with a syk kinase inhibitor：A twelve-week，randomized，placebo-controlled trial(用syk激酶抑制剂治疗类风湿性关节炎：十二周、随机、安慰剂对照试验)，Arthritis &Rheumatis，58(11)，2008，3309-3318。
Syk抑制剂也可用于癌症治疗，具体为血红素恶性肿瘤，尤其是非何杰金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin’s Lymphoma)，包括滤泡性淋巴瘤(FL)、套细胞淋巴瘤、伯基特(Burkittt)淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。
研究已显示，在多种原发B-淋巴瘤肿瘤以及还在B-淋巴瘤细胞系中Syk通过过量表达和/或组成性活化而失调。Syk通过PI3K/AKT通路、PLD通路和AKT非依赖性信号传导活化mTOR(雷帕霉素的哺乳动物靶标)，其继而增加B-细胞存活和增殖。Syk的体外抑制造成mTOR活化降低和FL细胞阵挛性减少。在B淋巴瘤(BKS-2)的鼠模型中用姜黄素抑制Syk激酶得到通过总脾细胞数测量的肿瘤负荷显著减少。(Leseux L.等，Blood，2006年12月15日，第108卷，第13期，第4156-4162页，以及Gururajan M.等，Journal of Immunology，2007，178，第111-121页)。
R788(fostamatinib二钠)在复发的或难治的B细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)患者中的2期临床试验结果显示，该化合物被这些患者良好耐受，以及在罹患弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤(CLL/SLL)的患者中的治疗益处。尽管存在该试验中登记的患者患有晚期疾病并且用市售治疗剂治疗无效的事实，但是他们中相当数量的患者尤其响应使用R788的Syk抑制(www.Rigel.com)。
Syk抑制剂也可用于哮喘和鼻炎的治疗，因为它们在转导与交联FcεR1和或FcγR1受体相关联的下游细胞信号中是重要的，并且位于信号级联放大的早期。在肥大细胞中，例如，在受体-IgE复合物的过敏原交联之后的FcεR1信号传导早期首先涉及Lyn(Src家族酪氨酸激酶)，然后涉及Syk激酶。
过敏性鼻炎和哮喘是与涉及众多细胞类型的过敏性反应和炎性事件相关联的疾病，众多细胞类型包括肥大信号、嗜酸性粒细胞、T细胞和树突细胞。在暴露至过敏原后，IgE和IgG的高亲和力免疫球蛋白受体(FcεRI和FcγRI)交联，并活化肥大细胞和其他细胞类型中的下游过程，引起促炎介质和气道致痉原释放。在肥大细胞中，例如过敏原与IgE受体交联引起从预先形成的颗粒释放介质(包括组胺)，以及新合成的脂质介质(包括前列腺素和白三烯)的合成和释放。
在治疗过敏性鼻炎的I/II期研究中鼻内给药的Syk激酶抑制剂R112(Rigel)显示，得到PGD2(与过敏性鼻溢的改善高度相关的关键性免疫介质)的统计学上显著的减少，并且在一系列指标上都是安全的，因此提供了局部Syk激酶抑制剂的临床安全性和功效的第一手证据(参见Meltzer，EIi O.；Berkowitz，Robert B.；Grossbard，Elliott B.Anintranasal Syk kinase inhibitor(R112)improves the symptoms of seasonalallergic rhinitis in a park environment(鼻内Syk激酶抑制剂(R112)改善公园环境中季节性过敏性鼻炎的症状).Journal of Allergy and ClinicalImmunology(2005)，115(4)，791-796)。在进一步的II期临床试验中，对于过敏性鼻炎，却显示R112相比安慰剂缺乏功效(临床试验政府编号(Clinical Trials.gov Identifier)NCT0015089)。
EP1184376B1/WO200007513和EP1054004/WO9903101073(Yamanouchi Pharmaceutical Co Ltd)描述了具有Syk抑制活性的新颖杂环甲酰胺衍生物。它们被进一步描述于“Synthetic studies on novelSyk Inhibitors.Part 1：Synthesis and structure-activity relationships of 5-pyrimidine-5-carboaxamidr derivatives(新Syk抑制剂的合成研究。第1部分：5-嘧啶-5-甲酰胺衍生物的合成和结构-活性关系)”(H.Hisamichi等，Bioorg Med Chem 13(2005)4936-4951)。特别地，从这篇文章看来，优选的化合物是式(A)化合物：
Figure BPA00001434066000041
WO9903101073的范围描述了较宽范围的类似物，包括乙二胺部分被顺-1，2-二氨基环己基取代的一组类似物。
WO 04/035604公开了人Syk蛋白的结构坐标。
然而，依然需要鉴定为Syk激酶抑制剂的另外的化合物。
发明内容
因此，在本发明的第一方面，本发明提供式(I)化合物：
或其盐，优选其药学上可接受的盐。
式(I)化合物具有化学名：
2-{[(3R，4R)-3-氨基四氢-2H-吡喃-4-基]氨基}-4-[(4-甲基苯基)氨基]-5-嘧啶甲酰胺。
本发明化合物可用作Syk抑制剂。本发明化合物还表现出相对其他关键性激酶(尤其是激酶VEGFR2和Aurora B)例如至少10×(基于酶的pKi值或pIC50值)的Syk激酶选择性。本发明化合物还在hERG试验(潜在心脏毒性的关键测量)中表现出低活性。
本发明化合物因此潜在地可用于治疗一些癌症治疗(尤其血红素恶性肿瘤)，以及涉及B细胞和/或活化的巨噬细胞的炎性病症，还有起因于不当的肥大细胞活化的疾病，例如过敏性疾病和炎性疾病。
在用于本文时，术语“药学上可接受的”是指，在合理的医学判断范围内适合用于与人和动物的组织接触而无过度毒性、刺激或其他问题或并发症(与合理的收益/风险比相当)的那些化合物、物质、组合物和剂型。本领域技术人员将认识到，可制备本发明化合物的药学上可接受的盐。
本文所用术语“药学上可接受的盐”是指保留主题化合物的期望生物活性并表现最小的非所需毒理学作用的盐。这些药学上可接受的盐可在化合物的最终分离和纯化过程中原位制备，或者可通过单独地将游离酸或游离碱形式的纯化化合物分别与合适的碱或酸反应来制备。实际上，在本发明某些实施方案中，药学上可接受的盐可优先于各自的游离碱或游离酸，因为这样的盐赋予分子更高的稳定性或溶解性，由此有利于配制成剂型。
式(I)化合物是碱性的，因此一般能够通过用合适的酸处理来形成药学上可接受的酸加成盐。合适的酸包括药学上可接受的无机酸和药学上可接受的有机酸。代表性的药学上可接受的酸加成盐包括盐酸盐、氢溴酸盐、硝酸盐、甲基硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、氨基磺酸盐、磷酸盐、乙酸盐、羟基乙酸盐、苯基乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、异丁酸盐、戊酸盐、马来酸盐、羟基马来酸盐、丙烯酸盐、富马酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、水杨酸盐、对氨基水杨酸盐、乙醇酸盐、乳酸盐、庚酸盐、邻苯二甲酸盐、草酸盐、琥珀酸盐、苯甲酸盐、邻乙酰氧基苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、扁桃酸盐、单宁酸盐、甲酸盐、硬脂酸盐、抗坏血酸盐、棕榈酸盐、油酸盐、丙酮酸盐、扑酸盐、丙二酸盐、月桂酸盐、戊二酸盐、谷氨酸盐、依托酸盐、甲磺酸盐(methanesulfonate/mesylate)、乙磺酸盐(ethanesulfonate/esylate)、2-羟基乙磺酸盐、苯磺酸盐(benzenesulfonate/besylate)、对氨基苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐(托西酸盐)和萘-2-磺酸盐。
本发明化合物可存在为固体或液体形式。处于固态时，本发明化合物可存在为晶体或非晶体(无定形)形式，或者作为其混合物存在。对于晶体形式的本发明化合物，本领域技术人员将认识到，可以形成药学上可接受的溶剂化物，其中溶剂分子在结晶过程中结合到晶格中。溶剂化物可包含非水溶剂，例如但不限于乙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、丙酮、四氢呋喃、二氧六环、DMSO、乙酸、乙醇胺和乙酸乙酯，或者它们可包含水作为结合到晶格中的溶剂。其中水是结合到晶格中的溶剂的溶剂化物通常被称作“水合物”。水合物包括化学计量水合物，以及含有可变量水的组合物。本发明包括所有这样的溶剂化物。
本领域技术人员将进一步认识到，以晶体形式存在的本发明化合物(包括其各种溶剂化物)可以表现出多形性(即以不同晶体结构存在的能力)。这些不同的晶形通常称为“多晶型物”。本发明包括所有这样的多晶型物。多晶型物具有相同的化学组成，但在堆积(pack)、几何排列和晶体固态的其他描述性性质方面不同。因此，多晶型物可具有不同的物理性质，例如形状、密度、硬度、可变形性、稳定性和溶解性质。多晶型物通常表现出可用于鉴定的不同熔点、IR光谱和X射线粉末衍射图。本领域技术人员将认识到，可例如通过改变或调节用于制备化合物的反应条件或试剂来生产不同的多晶型物。例如温度、压力或溶剂的改变可得到多晶型物。此外，在特定条件下，一种多晶型物可自发地转变为另一种多晶型物。
式(I)化合物及其可通过下文所述通用合成方案来制备。
方案1-合成1，1-二甲基乙基[(3R，4R)-4-氨基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基甲酸酯
Figure BPA00001434066000071
(i)甲磺酰氯、Et3N、DCM；
(ii)DBU；
(iii)mCPBA、CHCl3；
(iv)[(1S)-1-苯基乙基]胺、2-PrOH/70℃或2-BUOH/90℃；
(V)Pd(OH)2/C、H2、EtOH；
(vi)(Boc)2O、Et3N、MeOH；
(vii)甲磺酰氯、Et3N、DCM；
(viii)NaN3、NaOAc、DMF；
(ix)PtO2、H2、EtOH。
方案2-备选合成3，6-二氢-2H-吡喃
Figure BPA00001434066000081
(i)10N NaOH。
方案3
(i)PCl5；
(ii)NH3、1，4-二氧六环；
(iii)对甲苯胺、Et3N、DMF；
(iv)[(3R，4R)-4-氨基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基甲酸1，1-二甲基乙基酯、Et3N、DMF；
(v)HCl/异丙醇。
因此，在另一方面，本发明提供一种用于制备式(I)化合物的方法，所述方法包括将式(II)化合物：
用式(III)化合物处理：
Figure BPA00001434066000092
其中P是保护基团，例如叔丁氧羰基(Boc)，
以及随后去除所述保护基团。
式(IV)的以下中间化合物：
其中X是N3或NH2，Y是保护基团，例如叔丁氧羰基(Boc)，并且其具有(3R，4R)立体化学；
所述中间化合物是新颖的，可用于制备式(I)化合物，因此提供本发明的另一方面。
式(III)化合物和式(IV)化合物的制备中重要的方面是在C-3和C-4引入适当的立体化学。已发现这可通过式(V)环氧化物在C-3的区域特异性开环来有利地实现：
Figure BPA00001434066000101
所述开环通过在升高的温度(优选在回流条件下)与手性胺前体(例如[(1S)-1-苯基乙基]胺)在C2-4醇(优选仲醇，例如2-丙醇或2-丁醇)中反应而进行。反应也可在三甲基铝存在下在诸如二氯甲烷等溶剂中进行，接着用氟化钠结束反应(work-up)以分解铝酸盐。初始反应产物可能是两种C-3非对映异构体和两种C-4非对映异构体的混合物，C-3：C-4比取决于环氧化物开环的区域特异性。然后可以分离出C-3区域异构体(regioisomer)混合物，并去除手性部分以得到高对映异构纯度的所需式(VI)3-氨基-4-羟基四氢吡喃中间体：
Figure BPA00001434066000102
因此，在另一方面，本发明提供式(IV)化合物或式(IV)化合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：将式(V)化合物在升高的温度(优选在回流条件下)与手性胺前体(例如[(1S)-1-苯基乙基]胺)在C2-4醇(优选仲醇，例如2-丙醇或2-丁醇)中反应。
应认识到，在一些情况中采用保护基团可能是有用的。保护基团和去除它们的方法的实例可参见T.W.Greene的“Protective Groups inOrganic Synthesis(有机合成中的保护基团)”(J.Wiley and Sons，1991)。合适的胺保护基团包括但不限于磺酰基(如甲苯磺酰基)、酰基(如苄氧羰基或叔丁氧羰基)和芳基烷基(如苄基)，其可酌情通过水解或氢解去除。其他合适的胺保护基团包括三氟乙酰基(-C(O)CF3)(其可通过碱催化的水解去除)或者固相树脂结合的苄基，例如Merrifield树脂结合的2，6-二甲氧基苄基(Ellman linker)，其可通过酸催化的水解(使用例如三氟乙酸)去除。
本发明化合物可用作Syk抑制剂，因此潜在地可用于治疗一些癌症治疗(尤其血红素恶性肿瘤)，以及涉及B细胞的炎性病症，还有起因于不当的肥大细胞活化的疾病(例如过敏性疾病和炎性疾病)。
因此，在另一方面，本发明提供用于治疗的式(I)化合物或其药学上可接受的盐。
在另一方面，本发明提供一种方法，包括将有效量的式(I)化合物或其药学上可接受的盐给予有需要的患者以抑制Syk激酶。
Syk抑制剂可以用于癌症治疗，具体为血红素恶性肿瘤，尤其是非何杰金氏淋巴瘤，包括滤泡性淋巴瘤(FL)、套细胞淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤/慢性淋巴细胞性淋巴瘤(SLL/CLL)、伯基特淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。
因此，在另一方面，本发明提供一种用于治疗癌症的方法，所述癌症具体为血红素恶性肿瘤，尤其是非何杰金氏淋巴瘤，包括滤泡性淋巴瘤(FL)、套细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，所述方法包括将有效量的式(I)化合物或其药学上可接受的盐给予有需要的患者。
本发明化合物还可用于与本领域已知的其他类别癌症化疗药物联合的癌症化学治疗。用于针对非何杰金氏淋巴瘤的这种组合的代表性类别药物包括利妥昔单抗(ritaximab)、BEXXAR(托西莫单抗和碘I131托西莫单抗)、匹蒽醌和化学治疗。本发明的化合物组合还可以用于与CHOP药物疗法(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、泼尼松)或CHOP加利妥昔单抗(CHOP+R)联合。
本发明化合物潜在地可用于治疗涉及B细胞和/或巨噬细胞活化的自身免疫性病症，例如全身性红斑狼疮、Sjorgens综合征、韦格纳肉芽肿病(Wegners granulomatosis)、大疱性类天疱疮、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、巨细胞性动脉病、有或没有自身抗体状态的慢性特发性荨麻疹(慢性自身免疫性荨麻疹)(New concepts in chronic urticaria(慢性荨麻疹中的新概念)Current Opinions in Immunology 200820：709-716)、肾小球性肾炎、慢性移植物排斥和类风湿性关节炎。
在另一方面，本发明提供一种治疗涉及B细胞的炎性疾病的方法，所述方法包括将有效量的式(I)化合物或其药学上可接受的盐给予有需要的患者。
本发明化合物潜在地可用于治疗起因于不当肥大细胞活化的疾病，例如过敏性疾病或炎性疾病。
在另一方面，本发明提供一种治疗不当肥大细胞活化的方法，所述方法包括将有效量的式I化合物或其药学上可接受的盐给予有需要的患者。
在另一方面，本发明提供一种治疗炎性疾病的方法，所述方法包括将有效量的式(I)化合物或其药学上可接受的盐给予有需要的患者。
在另一方面，本发明提供一种治疗过敏性病症的方法，所述方法包括将有效量的式(I)化合物或其药学上可接受的盐给予有需要的患者。
被认为是由Syk激酶介导的疾病和病理状况包括涉及肥大细胞活化的炎性病症和过敏性病症，例如慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、哮喘、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病(Crohn’sDisease)、支气管炎、结膜炎、牛皮癣、硬皮病(sclerodoma)、荨麻疹、皮炎和过敏性鼻炎。
本发明化合物还可与本领域已知的其他类别的治疗药联合使用。用于这种联合的代表性类别的药物包括，用于治疗哮喘的抗炎甾体(尤其皮质类固醇)、PDE4抑制剂、IKK2抑制剂、A2a激动剂、β2-肾上腺素受体激动剂(包括短效和长效β2-肾上腺素受体激动剂两者)、α4整联蛋白抑制剂和抗毒蕈碱药，以及用于治疗过敏症的前述药物和组胺受体拮抗剂(包括H1和H1/H3拮抗剂)。在用于治疗重度哮喘的联合治疗中使用的代表性药物包括局部作用p38抑制剂和IKK2抑制剂。
抗炎皮质类固醇在本领域是公知的。代表性实例包括丙酸氟替卡松(例如，参见美国专利4,335,121)、倍氯米松17-丙酸酯、倍氯米松17，21-二丙酸酯、地塞米松或其酯、莫米松或其酯(例如，莫米松糠酸酯)、环索奈德、布地奈德和氟尼缩松。抗炎皮质类固醇的另外的实例参见WO 02/12266 A1(Glaxo Group Ltd)，特别是实施例1的化合物(6α，9α-二氟-17α-[(2-呋喃基羰基)氧基]-11β-羟基-16α-甲基-3-氧代-雄甾-1，4-二烯-17β-硫代羧酸S-氟甲酯)和实施例41的化合物(6α，9α-二氟-11β-羟基-16α-甲基-17α-[(4-甲基-1，3-噻唑-5-羰基)氧基]-3-氧代-雄甾-1，4-二烯-17β-硫代羧酸S-氟甲酯)，或其药学上可接受的盐。
β2-肾上腺素受体激动剂的实例包括沙美特罗(例如，作为外消旋体或诸如R-对映异构体的单一对映异构体)、沙丁胺醇、福莫特罗、沙甲胺醇、非诺特罗或特布他林及它们的盐，例如沙美特罗的昔萘酸盐、沙丁胺醇的硫酸盐或游离碱或者福莫特罗的富马酸盐。优选长效β2-肾上腺素受体激动剂，尤其是具有超过24小时期间的治疗效果的那些，例如沙美特罗或福莫特罗。
抗组胺药的实例包括美沙吡林，或氯雷他定、西替利嗪、地氯雷他定或非索非那定。
抗胆碱能化合物的实例包括毒蕈碱(M)受体拮抗剂，尤其是M1、M2、M1/M2或M3受体拮抗剂，尤其是(选择性)M3受体拮抗剂。抗胆碱能化合物的实例在WO 03/011274 A2和WO 02/069945 A2/US2002/0193393 A1和US 2002/052312 A1中有述。毒蕈碱M3拮抗剂的实例包括异丙托溴铵、氧托溴铵或噻托溴铵。
可与本发明化合物联合使用的代表性的PDE4抑制剂或混合PDE3/4抑制剂包括AWD-12-281(Elbion)、PD-168787(Pfizer)、罗氟司特和西洛司特(GlaxoSmithKline)。PDE4抑制剂另外的实例参见WO2004/103998、WO2005/030212、WO2005/030725、WO2005/058892、WO2005/090348、WO2005/090352、WO2005/090353、WO2005/090354、WO2006/053784、WO2006/097340、WO2006/133942、WO2007/036733、WO2007/036734和WO2007/045861(Glaxo Group Ltd)。
本发明还提供所谓的“三联”治疗，包括式(I)化合物或其药学上可接受的盐连同β2-肾上腺素受体激动剂和抗炎皮质类固醇。优选地，该联合用于治疗和/或预防哮喘、COPD或过敏性鼻炎。β2-肾上腺素受体激动剂和/或抗炎皮质类固醇可为上文描述的和/或在WO 03/030939A1中描述的。这种“三”联的代表性实施例包括式(I)化合物或其药学上可接受的盐、沙美特罗或其药学上可接受的盐(例如，沙美特罗的昔萘酸盐)以及丙酸氟替卡松。
本发明化合物将一般但非必须地在给予患者之前配制成药物组合物。因此，本发明另一方面涉及包含本发明化合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
本发明药物组合物可制备并包装为散装(bulk)形式，其中可提取安全有效量的本发明化合物并然后给予患者，例如以粉末或糖浆形式。备选地，本发明药物组合物可制备并包装在单位剂型中，其中每个物理上离散的单位含有安全有效量的本发明化合物。本发明药物组合物也可以制备并包装在亚单位剂型中，其中两个以上亚单位剂型提供单位剂型。当制备成单位剂型时，本发明药物组合物通常含有约0.1-99.9重量％的本发明的化合物，视制剂性质而定。
此外，本发明药物组合物可任选地还包含一种或多种额外的药学活性化合物。
本文所用“药学上可接受的赋形剂”意指与给予药物组合物形状或一致性有关的药学上可接受的材料、混合物或载体。在混合时，每种赋形剂必须与药物组合物的其他成分相容，从而避免在给予患者时会相当多地降低本发明化合物功效并将导致药学上不可接受的组合物的相互作用。此外，每种赋形剂当然必须有足够高的纯度，以使其是药学上可接受的。
包含本发明化合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂的本发明组合物，通常将提供为适合于通过所需给药途径给予患者的剂型。例如，剂型包括适合于以下给药途径的剂型：(1)吸入，如气雾剂和溶液剂；(2)鼻内给药，如溶液剂或喷雾剂；(3)口服给药，如片剂、胶囊剂、囊片剂、丸剂、含片剂、粉剂、糖浆、酏剂、混悬剂、溶液剂、乳剂、小药囊和扁囊剂；以及(4)胃肠外给药，如无菌溶液剂、混悬剂和用于复溶的粉剂。
应认识到，适合于吸入或口服给药的剂型通常用于治疗COPD；适合于鼻内给药的剂型通常用于治疗过敏性鼻炎；并且适合于口服给药的剂型通常用于治疗类风湿性关节炎和血红素恶性肿瘤。
合适的药学上可接受的赋形剂将视所选具体剂型而不同。此外，可针对它们在组合物中可起到的特定功能来选择合适的药学上可接受的赋形剂。例如，可针对它们有助于生产均一剂型的能力而选择某些药学上可接受的赋形剂。可针对它们有助于生产稳定剂型的能力来选择某些药学上可接受的赋形剂。可针对它们在给予患者时有助于携带或运输本发明化合物从身体的一个器官或部分到身体的另一个器官或部分的能力来选择某些药学上可接受的赋形剂。可针对它们增强患者依从性的能力来选择某些药学上可接受的赋形剂。
合适的药学上可接受的赋形剂包括以下类型的赋形剂：稀释剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、造粒剂、包衣剂、润湿剂、溶剂、共溶剂、助悬剂、乳化剂、甜味料、矫味剂、掩味剂、着色剂、防结块剂、保湿剂、螯合剂、塑化剂、增粘剂、抗氧化剂、防腐剂、稳定剂、表面活性剂和缓冲剂。本领域技术人员将认识到，某些药学上可接受的赋形剂可起到多于一种的功能，并且可起到备选功能，这取决于在制剂中存在多少该赋形剂和制剂中存在何种其他成分。
本领域技术人员掌握本领域的知识和技术，以使得他们能够选择用于本发明的适当量的合适的药学上可接受的赋形剂。此外，存在本领域技术人员可获得的大量资源，它们描述药学上可接受的赋形剂，并且可用于选择合适的药学上可接受的赋形剂。实例包括Remington’sPharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company)、Remington：TheScience and Practice of Pharmacy，(Lippincott Williams & Wilkins)、TheHandbook of Pharmaceutical Additives(Gower Publishing Limited)和The Handbook of Pharmaceutical Excipients(the AmericanPharmaceutical Association and the Pharmaceutical Press)。
本发明药物组合物使用本领域技术人员已知的技术和方法来制备。本领域常用的一些方法参见Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company)。
口服固体剂型(例如片剂)通常包含一种或多种药学上可接受的赋形剂，它们例如可帮助赋予片剂令人满意的加工和压制特性或者为其提供额外的所需物理特性。这样的药学上可接受的赋形剂可选自稀释剂、粘合剂、助流剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、矫味剂、甜味剂、聚合物、蜡或其他溶解度调节材料。
用于胃肠外给药的剂型一般包括流体，尤其是静脉内流体，即简单化学物质(例如糖、氨基酸或电解质)的无菌溶液，其可容易地由循环系统输送和同化。这样的流体通常使用注射用水制备USP。常用于静脉内(IV)应用的流体公开于Remington，The Science and Practice ofPharmacy[前文提供的全文引用]。这样的IV流体的pH可不同，如本领域所知通常为3.5-8。
用于鼻内或吸入给药的剂型可合宜地配制为气雾剂、溶液剂、滴剂、凝胶或干粉。
用于局部给予鼻腔(鼻给药)的剂型包括通过加压泵给予鼻的加压气雾剂制剂和水制剂。非加压且适合于鼻给药的制剂尤其引人关注。为此目的，合适的制剂含有水作为稀释剂或载体。用于给予鼻的水制剂可提供有常规的赋形剂，例如缓冲剂、张力调节剂等。水制剂也可通过雾化给予鼻。
在另一实施方案中，用于鼻给药的剂型提供在计量剂量装置中。剂型可提供为用于从具有分配喷嘴或分配孔口的流体分配器递送的流体制剂，当用户施加的力施加到流体分配器的泵机构时，计量剂量的流体制剂通过分配喷嘴或分配孔口来分配。这样的流体分配器一般提供有容纳多个计量剂量的流体制剂的储罐，剂量可通过连续泵动作分配。可配置分配喷嘴或孔口以插入用户鼻孔中，用于将流体制剂喷射分配到鼻腔中。在一个实施方案中，分配器是WO-A-2005/044354中描述和阐述的一般类型。分配器具有容纳流体排放装置的壳体，流体排放装置具有安装在装纳流体制剂的容器上的加压泵。壳体具有至少一个可手指操作的侧杆，该侧杆可相对于壳体向内移动以用凸轮带动壳体内的容器向上，从而引起泵压缩并将计量剂量的制剂通过壳体的鼻喷嘴泵出泵杆(stem)。尤其优选的流体分配器是在WO-A-2005/044354的图30-40中阐述的一般类型。
对于适合和/或适于吸入给药的组合物，优选式(I)化合物或盐为颗粒尺寸减小的形式，并且更优选尺寸减小的形式通过或可通过微粒化获得。尺寸减小(例如微粒化)化合物或盐或溶剂化物的优选颗粒尺寸由D50值限定为约0.5至约10微米(例如使用激光衍射测量)。
气雾剂组合物(例如用于吸入给药)可包含活性物质在药学上可接受的水溶剂或非水溶剂中的溶液或精细混悬液。气雾剂制剂可以无菌形式的单个剂量或多剂量的量存在于密封容器中，所述密封容器可采取与雾化装置或吸入器一起使用的药筒或替换物形式。或者，密封容器可以是单位分配装置，例如单剂量鼻吸入器或配有计量阀的气雾剂分配器(计量剂量吸入器)，以在容器的内容物用尽时将其丢弃。
如果剂型包含气雾剂分配器，那么其优选地含有受压的合适抛射剂(例如压缩空气、二氧化碳)或有机抛射剂(例如，氢氟碳(HFC))。合适的HFC抛射剂包括1，1，1，2，3，3，3-七氟丙烷和1，1，1，2-四氟乙烷。气雾剂剂型也可以采取泵-雾化器的形式。加压气雾剂可含有活性化合物的溶液或混悬液。这可能需要加入额外的赋形剂，例如共溶剂和/或表面活性剂，以改善混悬液制剂的分散特性和均匀性。溶液制剂也可能需要加入共溶剂，例如乙醇。也可加入其他改性赋形剂，以改进例如制剂的稳定性和/或口味和/或细碎颗粒质量特性(量和/或分布)。
对于适合和/或适于吸入给药的药物组合物，优选药物组合物为干粉可吸入组合物。这样的组合物可包含粉末基质，例如乳糖、葡萄糖、海藻糖、甘露醇或淀粉；式(I)化合物或其盐或溶剂化物(优选为颗粒尺寸减小形式，例如微粒化形式)；和任选的性能调节剂，例如L-亮氨酸或另一种氨基酸、八乙酸纤维二糖酯和/或硬脂酸的金属盐，例如硬脂酸镁或硬脂酸钙。优选地，干粉可吸入组合物包含乳糖与式(I)化合物或其盐的干粉共混物。乳糖优选为乳糖水合物(例如乳糖一水合物)，和/或优选为吸入级和/或精细级乳糖。优选地，乳糖的颗粒尺寸限定为，90％以上(重量或体积)的乳糖颗粒直径小于1000微米(micron/micrometer)(例如10-1000微米，例如30-1000微米)，和/或50％以上的乳糖颗粒直径小于500微米(例如10-500微米)。更优选地，乳糖的颗粒尺寸限定为，90％以上的乳糖颗粒直径小于300微米(例如10-300微米，例如50-300微米)，和/或50％以上的乳糖颗粒直径小于100微米。任选地，乳糖的颗粒尺寸限定为，90％以上的乳糖颗粒直径小于100-200微米，和/或50％以上的乳糖颗粒直径小于40-70微米。最重要地，优选约3-约30％(例如约10％)(重量或体积)的颗粒直径小于50微米或小于20微米。例如，不加限制地，合适的吸入级乳糖是E9334乳糖(10％精细)(Borculo Domo Ingredients，Hanzeplein 25，8017JD Zwolle，Netherlands)。
任选地，尤其对于干粉可吸入组合物，用于吸入给药的药物组合物可加入到多个密封剂量容器(例如含有干粉组合物)中，这些剂量容器纵向安装在合适的吸入装置内部的条或带上。容器在需要时可破裂或可剥开(peel-openable)，并且例如干粉组合物的剂量可借助装置例如GlaxoSmithKline市售的DISKUSTM装置通过吸入给予。DISKUSTM吸入装置例如参见GB 2242134A，在这样的装置中，用于粉末形式的药物组合物的至少一个容器(一个或多个容器优选为纵向安装在条或带上的多个密封剂量容器)被限定在相对彼此可剥离地(peelably)固定的两个部件之间；该装置包括：限定所述一个或多个容器的打开位置的工具；用于在打开位置剥离部件以打开容器的工具；以及与打开的容器连通的出口，用户可通过该出口从打开的容器吸入粉末形式的药物组合物。
对于鼻腔内给药，本发明组合物还可作为干粉制剂适合于通过吹入定量给药。
应认识到，当本发明化合物与通常通过吸入、静脉内、口服或鼻内途径给予的其他治疗药物联合给予时，所得药物组合物可通过相同途径给予。
本发明化合物可合宜地以例如1μg-2g的量给予。当然，精确剂量将取决于患者的年龄和状况以及所选的具体给药途径。
生物测试方法
可依照以下测定测试本发明化合物的体外活性：
基本酶活性
1.Syk酶测定-时间分辨荧光共振能量转移激酶测定
将重组人Syk表达为His-标记蛋白*。Syk活性使用时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)测定来评价。
在16.6mM MgCl2、8.3mM ATP的存在下，于室温预活化Syk 30分钟，然后在40mM Hepes pH7.4、0.01％BSA中稀释到4nM。将3μl底物试剂加入在Greiner低容量384孔黑色板的含有0.1μl不同浓度的化合物或DMSO载体(1.7％终浓度)的孔中，底物试剂在40mM HEPESpH 7.4、0.01％BSA中含有生物素化肽生物素-AAAEEIYGEI(0.5μM终浓度)、ATP(30μM终浓度)和MgCl2(10mM终浓度)。通过加入3μl稀释的Syk(2nM终浓度)开始反应。在室温孵育反应60分钟，然后通过加入3μl读取试剂(read reagent)终止反应，读取试剂在40mM HEPESpH 7.4、0.03％BSA中含有60mM EDTA、150mM NaCl、50nMStreptavidin APC(Prozyme，San Leandro，California，USA)、0.5nM用W-1024铕螯合物标记的抗磷酸酪氨酸抗体(Wallac OY，Turku，Finland)。在室温进一步孵育反应45分钟。生物素-AAAEEIYGEI的磷酸化程度使用BMG Rubystar板读数器(BMG LabTechnologies Ltd，Aylesbury，UK)测量为特定665nm能量转移信号与参比铕620nm信号的比。
式(I)化合物在该测定中具有40nM的IC50值。
*重组人全长脾酪氨酸激酶(Syk)Syk的制备
使用杆状病毒系统(Invitrogen，Paisley，Scotland)表达在N端带有6His标记的全长人Syk。通过dounce匀浆化破坏细胞，通过离心移去碎片并使裂解物与NiNTA Superflow(Qiagen，Crawley，UK)接触。将NiNTA填充到柱中，并使用各10倍柱体积的缓冲剂(20mM TrispH8.0、300mM NaCl、10mM βMcEtOH、10％甘油)、缓冲剂+1M NaCl、缓冲剂+20mM咪唑和缓冲剂+300mM咪唑来洗脱。合并300mM咪唑级分，使用G25M(Amersham Biosciences，Buckinghamshire，UK)将缓冲剂改变为20mM MES pH 6.0、20mM NaCl、10mM βMcEtOH、10％甘油。将缓冲剂改变的6His-Syk上到Source15S柱(AmershamBiosciences，Buckinghamshire，UK)上，并使用NaCl梯度0-500mM将柱洗脱超过50倍柱体积。合并含有6His-Syk的级分，并通过超滤浓缩。6His-Syk特性通过肽质量指纹分析和完整的LC-MS来证实。
激酶选择性
2.Aurora B酶测定-荧光偏振激酶测定
将重组人Aurora B(2-344)表达为Flag-6His-Thr-标记蛋白*。Aurora B活性使用荧光偏振IMAP测定(Molecular Devices，Sunnyvale，US)来评价。
通过在30mM Tris-HCl pH 8.0、0.4mM ATP、2mM MgCl2、0.1mMEGTA、0.1％BME(β巯基乙醇)、0.1mM钒酸钠、10mM DTT中当量浓度的GST-INCENP§于30℃预活化Aurora B(2μM)3小时。然后在4℃，相对于50mM Tris-HCl，pH 7.5、270mM蔗糖、150mM NaCl、0.1mM EDTA、0.1％BME、1mM苄脒和0.2mM PMSF透析该溶液5小时。等分Aurora B/INCENP复合物并冰冻于-80℃。
将最终浓度为2nM的Aurora B/INCENP复合物加入测定缓冲剂(25mM HEPES、25mM NaCl 0.0025％吐温-20、pH 7.2 0.015％BSA、1μM DTT)。将3μl该溶液加入Greiner低容量384孔黑色板的含有0.1μl各个浓度的化合物或DMSO载体的孔中，室温放置30分钟。通过3μl具有1.7％的最终DMSO水平的底物试剂的存在开始反应，底物试剂在测定缓冲剂(25mM HEPES、25mM NaCl 0.0025％吐温-20、pH 7.20.015％BSA、1μM DTT)中含有100nM 5FAM-PKA-tide(GRTGRRNSI-NH2)、2μM ATP和2mM MgCl2。将反应于室温进一步孵育120分钟，然后通过加入6μl制造商缓冲剂A(Part：R7285)和制造商缓冲剂B(part：R7286)中的1∶500稀释Progressive Binding Reagent溶液(Part：R7287)终止，并静置以室温孵育120分钟。5FAM-PKA-tide(GRTGRRNSI-NH2)的磷酸化程度使用激发485nM、发射530nM的Acquest板读数器(Molecular Devices，Sunnyvale，US)和使用505nmM二色透镜来测量。在平行和垂直方向捕获数据，并通过仪器将数据转变为mp。
式(I)化合物在该测定中具有20μM的活性。
*重组人全长Aurora B的制备
使用杆状病毒系统(Invitrogen，Paisley，Scotland)表达在N端区带有6His标记的全长人Aurora B。通过超声处理裂解sf9细胞，通过离心去除碎片并且使裂解物与NiNTA Superflow(Qiagen，Crawley，UK)接触。将NiNTA填充到柱中，并使用1-300mM咪唑梯度洗脱。将300mM咪唑级分合并，并相对于50mM Tris-HCl，pH 8.0、250mM NaCl和2mM DTT透析以除去咪唑。透析后回收约60％的纯蛋白。Aurora B特性通过N-端序列分析和LC-MS来证实。
§人INCENP(826-919)克隆DU930接受自University of Dundee，其为GST N-端标记蛋白。
3.VEGFR2(KDR)酶测定-时间分辨荧光共振能量转移激酶测定
将重组人VEGFR2(KDR)胞内域(包括整个激酶结构域)表达为GST-6His-标记蛋白*。VEGFR2的活性使用时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)测定来评价。将0.1μl的100％DMSO中所需浓度的测试化合物或100％DMSO载体加入Greiner低容量、384-孔、黑色板(#784076)。将板以1000RPM最低限度地离心1分钟，以在加入任何测定试剂前迫使所有液体到达孔的底部。
在100mM HEPES，pH 7.5、10mM MgCl2、100μM ATP、300μMDTT和0.1mg/mL BSA存在下，于室温活化VEGFR2(通常100nM)20分钟。将5μl含有20mM MgCl2、100μM ATP、0.72μM生物素化肽(生物素-氨基己基-EEEEYFELVAKKKK-NH2)的底物溶液加入测定板。将活化的VEGFR2溶液在200mM HEPES，pH 7.5、0.2mg/mL BSA和0.6mM DTT中稀释100倍。通过加入5μl稀释的活化VEGFR2开始VEGFR2催化的反应。最终测定浓度为100mM HEPES，pH 7.5、10mMMgCl2、50μM ATP、0.1mg/mL BSA、300μM DTT、0.36μM生物素化肽底物和0.5nM VEGFR2(VEGFR2的最终测定浓度可视不同批次酶的具体活性而不同)。反应于室温进行90分钟，然后通过加入5μL的150mM EDTA，pH 8来终止。测定的本底信号在这样的孔中确立：在加入底物和酶溶液前改为加入150mM EDTA。加入5μl含有200mMHEPES，pH 7.5、0.1mg/mL BSA、30nM Streptavidin SureLight
Figure BPA00001434066000221
-APC(PerkinElmer，Boston，MA，USA)和4nM LANCE
Figure BPA00001434066000222
铕标记抗磷酸酪氨酸抗体(PerkinElmer，Boston，MA，USA)的HTRF检测溶液。于室温孵育10分钟之后，使用Viewlux 1430 ultraHTS Microplate Imager(PerkinElmer，Turku，Finland)将生物素化肽底物的磷酸化测量为特定665nm能量转移信号与参比铕615nm信号的比。
式(I)化合物在该测定中具有＞7.9μM的IC50值。
*重组GST-6His-VEGFR2的纯化
使用Sf9昆虫细胞中的杆状病毒表达系统过量表达带有N-端GST和6His标签的GST-6His-VEGFR2。于室温将细胞(100-120克)悬浮在50mM HEPES pH 8.0、100mM NaCl和20mM咪唑(5ml/g细胞)中。所有其他纯化步骤在4℃进行。用Branson 450超声波仪(70％功率，一分钟50％循环)裂解细胞，并将细胞裂解物以30,000x g离心30分钟。将上清液过滤通过1.2μm Pall过滤器，然后上(10-20ml/分钟)到用50mM HEPES pH 8.0、100mM NaCl和20mM咪唑平衡的150ml QiagenNi-NTA(QIAGEN Inc.，Valencia，CA，USA)柱上。用50mM HEPES pH8.0、100mM NaCl和20mM咪唑洗涤柱，直到在280nm的吸收小于0.1，然后用5倍柱体积的从50mM HEPES pH 8.0、100mM NaCl、20mM咪唑到50mM HEPES pH 8.0、100mM NaCl、250mM咪唑的梯度洗脱。收集级分(10-30ml)。将所需蛋白级分合并，并上(5ml/分钟)到用50mMHEPES pH 7.5、150mM NaCl和2mM EDTA平衡的25ml谷胱甘肽Sepharose(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)柱上。将柱用50mMHEPES pH 7.5、150mM NaCl和2mM EDTA洗涤，并用3倍柱体积的到50mM HEPES pH 7.5、150mM NaCl、1mM EDTA和20mM谷胱甘肽的梯度洗脱蛋白。收集级分，将所需蛋白级分合并，并用带10,000MWCO膜的Pall Jumbo Sep浓缩器(Pall Corporation，Portsmouth，England)浓缩至约20ml。用20mM HEPES pH 7.5、50mM NaCl、0.1mMEDTA和1mM DTT平衡1800ml Superdex S200柱或23ml G25柱(GEHealthcare，Piscataway，NJ，USA)。将浓缩物以8ml/分钟上到柱上，并用20mM HEPES pH 7.5、50mM NaCl、0.1mM EDTA和1mM DTT洗脱柱。收集蛋白级分(约20ml)，将所需级分合并，并用带10,000MWCO膜的Pall JumboSep浓缩器浓缩。将浓缩蛋白以等分的所需体积存储在-80℃，以便之后用于VEGFR2酶活性测定。GST-6His-VEGFR2特性的证实通过：完整的液相色谱和质谱(LC/MS)，以及蛋白酶解消化之后通过液相色谱和串联质谱(LC/MS/MS)分析所得多肽。
B细胞活性测定
4.Ramos pErk测定
测定原理
使用抗-IgM刺激Ramos B细胞(人伯基特淋巴瘤B细胞)。这造成将Syk募集到B细胞受体。Syk随后的自磷酸化导致开始信号级联放大，造成经由Erk MAP激酶途径的B细胞活化。结果，Erk被磷酸化并在细胞裂解后通过免疫捕获测定检测。
用抗-IgM刺激Ramos细胞
将细胞以5×105/孔的密度铺板到96-V形孔聚丙烯板中的25μl体积的测定培养基(含有10％热灭活胎牛血清、1％L-谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素的RPMI)中。加入25μl适当稀释的化合物溶液，并于37℃、5％CO2条件下孵育板30分钟。在37℃用5μl山羊抗人IgM的Fab′2片段(5μg/ml终浓度)刺激细胞7分钟。通过加入55μL 2x RIPA裂解缓冲液在4℃裂解细胞2h。
pErk MSD测定
将50μl细胞裂解液转移到包被有抗-pErk1/2(Thr/Thy：202/204；185/187)捕获抗体的96孔MSD板，并于4℃孵育16小时。洗涤板，并于室温加入抗-pErk检测抗体(25μl/孔)2h。将其除去，加入150μLMSD读取缓冲剂(read buffer)并测量产生的电化学发光信号。
式(I)化合物在该测定中具有50nM的IC50值。
化合物制备
将化合物制备为在DMSO中的10mM原液，并使用9个连续5倍稀释在DMSO中制备稀释系列。将该稀释系列用测定培养基进一步以1∶100稀释，以得到待测试的5×10-5到2.56×10-11M的浓度范围。使用Biomek 2000和Biomek Nx自动机器人移液系统制备化合物稀释液。
5.CD69 PBMC测定
测定原理
使用抗-IgM先体外后体内刺激外周血B细胞。这造成将Syk募集到B细胞受体。Syk随后的自磷酸化导致开始信号级联放大，造成由细胞表面上活化标记物CD69的表达所表明的B细胞活化。通过流式细胞术检测CD20/CD69+ve全血B细胞。
用抗-IgM刺激外周血B细胞
通过密度梯度离心从肝素化人血制备外周血B细胞。将细胞以1×105/孔的密度铺板到96-V形孔聚丙烯板中的25μl体积的测定培养基(含有10％热灭活胎牛血清、1％L-谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素的RPMI)中。加入25μl适当稀释的化合物溶液，并于37℃、5％CO2条件下孵育板30分钟。在前文所述条件下，用5μl山羊抗人IgM的Fab′2片段(5μg/ml终浓度)刺激B细胞另外的3.5小时。通过加入200μlLyse/Fix缓冲液，室温裂解存在的任何红细胞并固定所有其他细胞10分钟。
CD69测定
使用小鼠抗人CD20 FITC和小鼠抗人CD69APC缀合抗体的混合物对细胞染色。通过流式细胞术检测样品中存在的CD20/CD69+ve B细胞。
化合物制备
将化合物制备为在DMSO中的10mM原液，并使用9个连续的5倍稀释在DMSO中制备稀释系列。将该稀释系列用测定培养基进一步以1∶100稀释，以得到待测试的5×10-5到2.56×10-11M的浓度范围。使用Biomek 2000和Biomek Nx自动机器人移液系统制备化合物稀释液。
6.CD69全血测定
测定原理
使用抗-IgM先体外后体内刺激全血B细胞。这造成将Syk募集到B细胞受体。Syk随后的自磷酸化导致开始信号级联放大，造成由细胞表面上活化标记物CD69的表达所表明的B细胞活化。通过流式细胞术检测CD20/CD69+ve全血B细胞。
用抗-IgM刺激全血B细胞
将100μl肝素化人血加入到含有1μl适当稀释的化合物溶液的5ml聚丙烯管中，并于37℃、5％CO2条件下孵育30分钟。在前文所述条件下，用10μl山羊抗人IgM的Fab′2片段(67.5μg/ml终浓度)刺激B细胞另外的3.5h。通过加入2mlLyse/Fix缓冲液，室温裂解红细胞并固定所有其他细胞10分钟。
CD69测定
使用小鼠抗人CD20 FITC和小鼠抗人CD69APC缀合抗体的混合物对细胞染色。通过流式细胞术检测样品中存在的CD20/CD69+ve B细胞。
化合物制备
将化合物制备为在DMSO中的10mM原液，并使用7个连续的3倍稀释在DMSO中制备稀释系列，以得到待测试的1×10-5到4.5×10-10M的浓度范围。使用Biomek 2000自动机器人移液系统制备化合物稀释液。
肥大细胞活性
7.LAD2测定
测定原理
LAD2是干细胞因子(SCF)-依赖的人肥大细胞系，其由NIH从肥大细胞肉瘤/白血病患者的骨髓抽出物建立。LAD2细胞类似CD34+-衍生的人肥大细胞，并且表达功能性FcεRI。FcεRI在IL-4、SCF和IgE存在下被上调，随后的细胞结合IgE的交联造成脱粒，脱粒可作为己糖胺酶释放测量。
预处理(prime)LAD2细胞以上调FcεRI
将LAD2细胞以1×105/ml重悬到具有额外补充的人重组SCF(100ng/ml；R&D systems)，人重组白介素-4(6ng/ml；R&D Systems)和IgE(100μg/ml；Calbiochem)的完全stem pro-34SFM(含有StemPro-34营养补充物(1∶40)、谷氨酰胺(2mM)、青霉素(100μg/ml)、链霉素(100μg/ml)的Gibco Cat 10640-019培养基)中。然后将细胞于37℃，潮湿气氛的5％CO2中维持5天。
化合物制备
从100％DMSO中的2mM原液滴定化合物，以得到9个连续的1∶3稀释液(V 96孔Nunc；Biomek 2000)。从该母板分配3μl到子板(平的96-孔NuncBiomek Fx)中，然后以1∶40将子板在具有2mM谷氨酰胺的RPMI中稀释，并将20μl稀释的化合物转移到Greiner细胞板。因此，化合物终浓度范围是在恒定0.5％DMSO中的1x10-5M-5x10-10M。对照孔用0.5％DMSO处理。
用抗-IgE活化LAD2细胞
将预处理的LAD2细胞离心(400g，5分钟)，丢弃上清液并将细胞沉淀以1×104细胞/ml重悬到补充有谷氨酰胺(2mM)的RPMI中。在进一步离心(400g，5分钟)之后，将细胞重悬到含谷氨酰胺(2mM)的新鲜RPMI中，调节密度为5.7×105/ml，并移至含有20μl稀释的化合物(按上文详述制备)的无菌V-孔板(70μl/孔；Greiner)中。然后孵育细胞1h(37℃，潮湿气氛中的5％CO2)，之后用次最大浓度的抗-IgE(10μl体积以得到1∶2700的最终测定稀释；Sigma)活化。在40分钟的孵育(37℃，潮湿气氛中的5％CO2)之后，将板离心(1200g，10分钟，4℃)并移去上清液用于己糖胺酶分析。将细胞沉淀于37℃在100μl/孔的triton-X(在RPMI 2mM谷氨酰胺中0.5％)中裂解30分钟。
β-己糖胺酶测定
β-己糖胺酶活性通过4-甲基伞形酮基-N-乙酰-ε-D氨基葡糖苷(Sigma)到荧光产物的转化来测量。
在黑色96孔板(Nunc)中将上清液或裂解物(25μl)与等体积的4-甲基伞形酮基-N-乙酰-ε-D氨基葡糖苷(0.2M柠檬酸钠缓冲液中500μM，pH 4.5)一起于37℃孵育1h。然后通过加入Trizma pH9(90μl)终止反应，并使用激发356nm和发射450nm(Tecan Safire)来测量荧光产物。hERG活性
8.hERG的Cy3B多非利特氟-配体结合测定
通过氟-配体(Cy3b-多非利特)荧光偏振测定确定化合物效能。
将hERG-表达CHO-K1膜*(60μg/ml)与1.0nM氟配体§一起在测定缓冲液(25mM HEPES、1.2mM MgCI2、100mM KCI和0.1％普流罗尼克，用5M KOH调节pH到7.4)中孵育。测定中的钾终浓度是100mM。在室温混合70分钟之后，在暗处将10μl分配到黑色LVGreiner 384-孔板的每个孔中，每个孔中含有0.1μl在DMSO中的测试化合物。将板静置以平衡2h，之后在AcquestTM/AnalystTM成像仪上读数。使用11-点抑制曲线(50μM的最高测定浓度，和1∶3的分级稀释)生成pIC50数据，使用ABase和XC50来实施六参数曲线拟合，以分析数据并生成曲线拟合。
式(I)化合物在该测定中具有25μM的IC50值。
*CHO-K1膜
培养稳定表达人hERG受体的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞至80％融合(conflency)，之后通过胰酶消化和随后的500g离心10分钟来采集。在膜产生之前将细胞沉淀于-80℃冷冻。将冷冻的细胞沉淀在冰上解冻，重悬到10倍体积的膜缓冲液(50mM HEPES，pH 7.4，1mM EDTA，1mM PMSF、2×10-6M胃蛋白酶抑制剂A)中并匀浆化。500g离心膜混悬液20分钟，丢弃细胞沉淀并将上清液以48,000g再次旋转30分钟。在第二次离心之后，将含有膜部分的剩余沉淀重悬到适当体积(每毫升冷冻细胞沉淀4ml)中，并测定蛋白质浓度。
§ 氟-配体(八氢苯并[2″，3″]吲嗪并[8″，7″:5′，6′]吡喃并[3′，2′:3，4]吡啶并 [1，2-a]吲哚-5-鎓-2-磺酸盐
J.M.C.2007，50(13)，2931-2941中描述的TFA盐。
将N-[4-({2-[(6-氨基己基)(2-{4-[(甲基磺酰基)氨基]苯基}乙基)氨基]乙基}氧基)苯基]甲烷磺酰胺(1.508mg)作为乙腈(100μl)中的溶液加入到硅烷化4ml小瓶中的固体Cy3B-ONSu(14-{2-[(2，5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-2-氧代乙基}-16，16，18，18-四甲基-6，7，7a，8a，9，10，16，18-八氢苯并[2″，3″]吲嗪并[8″，7″:5′，6′]吡喃并[3′，2′:3，4]吡啶并[1，2-a]吲哚-5-鎓-2-磺酸盐(1.7mg，WO9931181)。加入第二部分的乙腈(100μl)，随后加入Hunig碱(0.9μl)。加入两部分(2x 50μl)的二甲基甲酰胺，并在减压下浓缩反应混合物。将残留物再溶解于二甲基甲酰胺(200μl)中。加入Hunig碱(0.9μl)，将混合物涡旋混合22h。蒸发反应混合物至干燥，再溶解于乙腈/水/乙酸(5/4/1，约500μl)，过滤，并施用于半制备Spherisorb ODS2 HPLC柱，该柱用以下梯度洗脱(流速＝5ml/分钟，AU5.0，214nm，AU 2，256nm，A＝0.1％TFA/水，B＝90％乙腈/10％水/0.1％TFA)：t＝0分钟：B＝5％；t＝10分钟：B＝5％；t＝30分钟：B＝25％；t＝90分钟：B＝55％；t＝105分钟：B＝100％；t＝120分钟：B＝100％。将在46％和48％B之间洗脱的主要组分收集为一个级分，将该级分蒸发至干燥，并使用甲醇作为溶剂将紫色固体转移到小瓶。减压下去除甲醇并用干醚研制紫色固体。在干燥枪中于1mbar干燥固体过夜，以得到标题化合物(1.2mg)。
N-[4-({2-[(6-氨基己基)(2-{4-[(甲基磺酰基)氨基]苯基}乙基)氨基]乙基} 氧基)苯基]甲烷磺酰胺
将粗制N-[4-({2-[[6-(1，3-二氧代-1，3-二氢-2H-异吲哚-2-基)己基](2-{4-[(甲基磺酰基)氨基]苯基}乙基)氨基]乙基}氧基)苯基]甲烷磺酰胺(142mg)溶于甲胺(乙醇中33％，10ml，0.216)中，并于22℃静置48h。减压下蒸发过量试剂，并将油状残留物与另外两部分的乙醇共沸。将粗制产物溶于乙腈/水/乙酸(5/4/，＜2ml)，一半施用于PhenomenexJupiter C18 HPLC柱，并使用以下梯度洗脱(流速＝10ml/分钟，AU20.0，214nm，AU 10，256nm，A＝0.1％TFA/水，B＝90％乙腈/10％水/0.1％TFA)：t＝0分钟：B＝5％；t＝10分钟：B＝5％；t＝100分钟：B＝35％；t＝115分钟：B＝100％；t＝130分钟：B＝100％。将主要含有较慢洗脱的组分(＞90％)的级分合并，并蒸发以得到标题化合物(14.9mg)。将剩余粗制产物施用于C18柱，但是使用修改的梯度：t＝0分钟：B＝5％；t＝10分钟：B＝5％；t＝15分钟：B＝10％；t＝95分钟：B＝30％；t＝110分钟：B＝100％；t＝125分钟：B＝100％。合并主要含有所需产物的级分，并如前文蒸发以产出标题化合物(21.3mg约80％纯度)。该物质无需进一步纯化而使用。
N-[4-({2-[[6-(1.3-二氧代-1.3-二氢-2H-异吲哚-2-基)己基](2-{4-[(甲基 磺酰基)氨基]苯基}乙基)氨基]乙基}氧基)苯基]甲烷磺酰胺
将2-[6-([2-(4-氨基苯基)乙基]{2-[(4-氨基苯基)氧基]乙基}氨基)己基]-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮(108.3mg)溶于DCM(5ml)中，并在冰浴中冷却至0-4℃。加入Hunig碱(0.227ml)，随后逐滴加入甲磺酰氯(0.051ml)。将反应在0-4℃维持0.5h，然后使其缓慢升温至室温。在3h后，蒸发反应混合物至干燥，并在下一步骤中使用粗制产物。
2-[6-([2-(4-氨基苯基)乙基]{2[(4-氨基苯基)氧基]乙基}氨基)己基]-1H- 异吲哚-1，3(2H)-二酮
将2-[6-([2-(4-硝基苯基)乙基]{2-[(4-硝基苯基)氧基]乙基}氨基)己基]-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮(0.35g)溶于乙醇(40ml)、水(5ml)和乙酸(5ml)的混合物中，并将所得溶液在减压下除气。加入10％钯碳(56％糊状物，0.27g)，并在氢气氛(大气压力)下剧烈搅拌所得混合物12h。将反应混合物过滤通过CeliteTM，并用乙醇洗涤。蒸发滤液和洗涤液至干燥以得到标题化合物(0.313g)，其无需进一步纯化而使用。
2-[6-([2-(4-硝基苯基)乙基]{2-[(4-硝基苯基)氧基]乙基}氨基)己基]-1H- 异吲哚-1，3(2H)-二酮
将[2-(4-硝基苯基)乙基]{2-[(4-硝基苯基)氧基]乙基}胺(253mg)和2-(6-溴己基)-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮(1186mg)溶于DMF(4ml)中，并通过加入DIPEA(0.665ml)碱化。搅拌反应120h。蒸发反应混合物至干燥并将残留物溶于DCM中，将溶液吸收到硅土板(pad of silica)上并在硅土柱(silica cartridge)(12g)上纯化，硅土柱用以下梯度洗脱：(A＝DCM，B＝甲醇)t＝0分钟：B＝10％；t＝7.5分钟：B＝0％；t＝22.5分钟：B＝5％。所需产物在约15％B(等梯度地)洗脱，并蒸发溶液至干燥，得到标题化合物(0.364g)。
[2-(4-硝基苯基)乙基]{2-[(4-硝基苯基)氧基]乙基}胺
将[[2-(4-硝基苯基)乙基]胺(498.9mg)和111-[(2-溴乙基)氧基]-4-硝基苯2-溴乙基-4-硝基苯基醚(513mg)于22℃溶于DMF(5ml)中，并加入DIPEA(0.872ml)。将反应混合物于22℃静置60h，蒸发至干燥并将残留物溶于DCM中。将化合物吸收到硅土上并在硅土柱(12g)上纯化为用甲醇/DCM梯度(0-15％)洗脱的两个批次。将含有纯的产物的级分合并，并在减压下去除溶剂。将所得标题化合物分离为在高真空下部分固化的深黄色油状物(253mg)。
结果
Figure BPA00001434066000311
*排除在括号中数据之外的在＜5和5.2的2个离群数据点
参比实施例1为化合物：
Figure BPA00001434066000321
其在WO9903101073(Yamanouchi Parmaceutical Co Ltd)中作为实施例35描述为消旋混合物。
中间体和实施例
通用
所有温度均为℃。
DBU是指1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯
DCM是指二氯甲烷
DMSO是指二甲亚砜。
DMF是指N，N-二甲基甲酰胺
dppf是指1，1′-双(二苯基膦)二茂铁
醚是指二乙醚
HPLC是指高效液相色谱
IPA是指丙-2-醇
mCPBA是指间氯过苯甲酸
r.t.是指室温
TBME是指甲基叔丁基醚
THF是指四氢呋喃
1H NMR谱使用Bruker DPX 400MHz参比四甲基硅烷来记录。
LC/MS(方法A)于40摄氏度在Acquity UPLC BEH C18柱(50mmx 2.1mm内径1.7μm填充直径)上进行，柱使用用氨溶液调至pH 10的10mM碳酸氢铵水溶液(溶剂A)和乙腈(溶剂B)以1ml/分钟的流速洗脱，并使用以下洗脱梯度0-1.5分钟1-97％B、1.5-1.9分钟97％B、1.9-2.0分钟100％B。UV检测是从波长210nm到350nm的总信号。质谱在Waters ZQ质谱仪上使用交替扫描正负电喷雾(Alternate-scanPositive and Negative Electrospray)来记录。电离数据四舍五入到最接近的整数。
LC/MS(方法B)于40摄氏度在Acquity UPLC BEH C18柱(50mmx 2.1mm内径1.7μm填充直径)上进行，柱使用0.1％v/v的甲酸水溶液(溶剂A)和0.1％v/v的甲酸乙腈溶液(溶剂B)以1ml/分钟的流速洗脱，并使用以下洗脱梯度0-1.5分钟3-100％B、1.5-1.9分钟100％B、1.9-2.0分钟3％B。UV检测是从波长210nm到350nm的总信号。质谱在Waters ZQ质谱仪上使用交替扫描正负电喷雾来记录。电离数据四舍五入到最接近的整数。
硅土色谱(silica chromatography)技术包括在预装填柱(SPE)或手动装填快速柱上的自动(Flashmaster)技术或手动色谱。
当在化合物或试剂名称之后给出供应商的名称时，例如“化合物X(Aldrich)”或“化合物X/Aldrich”，这意味着化合物X可获自某供应商，例如提到的供应商。
类似地，当在化合物名称之后给出文献或专利引用时，例如化合物Y(EP 0 123 456)，这意味着该化合物的制备在提到的引用中有描述。
已使用化合物命名程序“ACD Name Pro 6.02”获得上述实施例的名称。
本发明化合物具有(3R，4R)绝对立体化学。
2，4-二氯-5-嘧啶甲酰氯
Figure BPA00001434066000341
将2，4-二羟基-嘧啶-5-甲酸(50g)和五氯化磷(239g)在氧氯化磷(230ml)中的溶液于115℃搅拌过夜。真空中除去过量的氧氯化磷，并向残留物中加入乙酸乙酯(200ml)。过滤混合物并将滤液浓缩，以得到为粗制2，4-二氯-5-嘧啶甲酰氯的黄色油状物(78g)，其无需进一步纯化而用于下一步骤。
1H NMR(300MHz，D6-DMSO)：δH 9.13(1H，s)。
2，4-二氯-5-嘧啶甲酰胺
Figure BPA00001434066000342
氮气下，将氨(14g)在1，4-二氧六环(500ml)中的溶液逐滴加入到用冰预冷的搅拌过的2，4-二氯-5-嘧啶甲酰氯(78g，粗)在1，4-二氧六环(400ml)中的溶液。除去冰浴，将溶液搅拌30分钟并浓缩。将固体残留物在乙酸乙酯(500ml)和碳酸氢钠饱和水溶液(500ml)之间分配，有机相用碳酸氢钠饱和水溶液(500ml×2)洗涤后用盐水(300ml)洗涤。将有机相干燥(硫酸钠)并浓缩以得到黄色固体。向残留物加入二乙醚(50ml)，并将所得混悬液在超声波下处理8分钟，然后过滤。用乙酸乙酯(50ml)洗涤残留物，以得到呈白色固体的标题化合物(30g)。
MS：MH+ 192
1H NMR(400MHz，D6-DMSO)：δH 8.90(1H，s)，8.19(1H，s)，8.07(1H，s)。
2-氯-4-[(4-甲基苯基)氨基]-5-嘧啶甲酰胺
Figure BPA00001434066000351
伴随冰冷却，将对甲苯胺(46.9g)在DMF(100ml)中的溶液逐滴加入到2，4-二氯-5-嘧啶甲酰胺(80g)和三乙胺(63.9ml)在DMF(300ml)中的溶液中。搅拌混合物2h使其升温到室温，然后将混合物加入水(11)中并搅拌20分钟。过滤浆液并用水洗涤固体。将固体悬浮到甲醇(500ml)和醚(500ml)的混合物中，搅拌20分钟并过滤，以得到呈浅黄色固体的2-氯-4-[(4-甲基苯基)氨基]-5-嘧啶甲酰胺(94.2g)。
LCMS(方法B)：Rt 1.02分钟，MH+263/265。
1H NMR(400MHz，MeOD)：δH 8.63(1H，s)，7.53(2H，d)，7.18(2H，d)，2.33(3H，s)。
3，6-二氢-2H-吡喃
Figure BPA00001434066000352
将氢氧化钠(10N，1745ml)加入到4-溴四氢-2H-吡喃(1133.7g)，伴随搅拌将混合物升温到90℃并在约90℃搅拌27h。使混合物冷却到环境温度，分离1800ml的水相并收集大部分有机相。用水(20ml)洗涤剩余的水相加小体积的有机相以及界面材料，过滤并用氢氧化钠溶液(10N，5ml)洗涤滤液。将有机相分离并加入到大部分的材料，以得到3，6-二氢-2H-吡喃(242.2g)。
1H NMR(400MHz，CDCI3)：δH 5.85(1H，m)，5.72(1H，d)，4.13(2H，m)，3.79(2H，t)，2.14(2H，m)。
3，6-二氢-2H-吡喃
将四氢-4-吡喃醇(1005.2g)、DCM(5530ml)和三乙胺(1640ml)混合并冷却到1℃。以受控方式在约2.5h内将甲磺酰氯(1243.8g)加入冷却且搅拌的混合物，保持温度在15℃以下。用DCM(500ml)将甲磺酰氯洗入，并使反应升温到环境温度过夜。用氯化铵水溶液(约2l，9.8％w/w)处理混合物，搅拌5分钟并分离两相。用氯化铵水溶液(约2l，9.8％w/w)、水(约2l)洗涤有机相，并干燥(硫酸钠)。在真空中(39℃，约15mbar)将有机相浓缩为油状物，其静置时快速固化(1733.9g)。用DBU(约300ml)于52℃缓慢处理该物质，在30分钟内形成溶液，并用DBU(1.7l)处理该溶液，并在1小时内将混合物升温至约100℃(外部温度)，并在该温度保持2h。将温度缓慢升至148℃(外部)并收集蒸馏的3，6-二氢-2H-吡喃(527.5g)。
1H NMR(400MHz，CDCI3)：δH 5.85(1H，m)，5.72(1H，d)，4.13(2H，m)，3.79(2H，t)，2.14(2H，m)。
1，5:3，4-二脱水-2-脱氧戊糖醇
Figure BPA00001434066000362
于13℃在约2小时内向mCPBA(71.1％，1524.2g)在氯仿(4.22l)中的混悬液加入3，6-二氢-2H-吡喃(526.5g)，间隔用部分氯仿(总计约1.5l)将固体从容器颈冲下。加入另外部分的氯仿(0.5l)并于15℃搅拌反应混合物2.25h。在40分钟内将反应混合物升温至20℃，并于20℃搅拌过夜。冷却反应混合物至0℃，过滤并用冷冻的氯仿(3.5℃，1055ml)洗涤固体。用碳酸钠水溶液(20％w/w，1582ml)洗涤合并的滤液和洗涤液，分离两相并用亚硫酸钠(1kg)处理有机相。过滤有机相并在真空中(25℃，150mbar)浓缩，以得到标题化合物(506g)。将真空浓缩的溶剂在真空中再次浓缩，以产出第二部分的标题化合物(41.2g)。
1H NMR(400MHz，D6-DMSO)：δH 3.91(1H，d)，3.77(1H，d)，3.35-3.29(3H，m部分被水模糊(obscure))，3.15(1H，s)，1.87(2H，m)。
1，5-脱水-2，4-二脱氧-2-{[(1S)-1-苯基乙基]氨基}-L-苏式-戊糖醇
方法1
将1，5:3，4-二脱水-2-脱氧戊糖醇(589.2g，92.7％w/w)加入[(1S)-1-苯基乙基]胺(660g)和异丙醇(500ml)。加入另外的异丙醇(2800ml)，将混合物升温至69℃并在该温度维持96h。真空中蒸发溶剂并用TBME(2640ml)浆化粗制产物。过滤混合物，用TBME(660ml)、TBME/庚烷(1∶1，660ml)以及庚烷(2×1320ml)洗涤残留物，并于40℃真空干燥过夜，以得到标题化合物(297.5g)。将TBME和TBME/庚烷洗涤液混合，并在真空下减压至干燥。将残留物加热溶解在TBME(990ml)中，冷却溶液至32℃，并旋转过夜。通过过滤分离固体，用TBME(130ml)、TBME/庚烷(1∶1，130ml)和庚烷(2×260ml)洗涤。在40℃真空干燥固体过夜，以得到第二收得部分的标题化合物(58.69g)。
1H NMR(400MHz，D6-DMSO)：δH 7.34-7.27(4H，m)，7.19(1H，t)，4.87(1H，d)，3.88(1H，m)，3.67(1H，m)，3.35-3.30(2H，m，部分被水模糊)，3.20(1H，t)，2.70(1H，t)，2.25(1H，m)，1.92(1H，s)，1.76(1H，dd)，1.38(1H，m)，1.24(3H，d)。
方法2
将2-丁醇(1.5ml)加入到1，5:3，4-二脱水-2-脱氧戊糖醇(1.68g，90.4％w/w)和[(1S)-1-苯基乙基]胺(2.02g)的混合物，并在氮气下于90℃加热反应20h。将反应冷却到72℃，并在30分钟内逐滴加入庚烷(13.5ml)到反应混合物。停止加热并使反应冷却到34℃，由于没有产生固体而将反应再次升温到40℃，并用1，5-脱水-2，4-二脱氧-2-{[(1S)-1-苯基乙基]氨基}-L-苏式-戊糖醇种晶。于35℃搅拌所得混悬液30分钟，使其在30分钟内冷却到23℃，然后在此温度静置2小时25分钟。通过过滤收集固体，用2-丁醇/庚烷(10％v/v，3ml)和之后用庚烷(2×6ml)洗涤。在35℃真空干燥固体，以得到标题化合物(1.10g)。
1H NMR(400MHz，D6-DMSO)：δH.34-7.27(4H，m)，7.20(1H，t)，4.92(1H，d)，3.88(1H，m)，3.67(1H，m)，3.36-3.29(2H，m，部分被水模糊)，3.19(1H，t)，2.69(1H，t)，2.24(1H，m)，1.94(1H，s)，1.76(1H，dd)，1.36(1H，m)，1.23(3H，d)。
1，5-脱水-2，4-二脱氧-2-{[(1R)-1-苯基乙基]氨基}-L-苏式-戊糖醇
Figure BPA00001434066000381
在30分钟内向于-5至0℃在氮气下搅拌的[(1R)-1-苯基乙基]胺(3.5ml)在DCM(20ml)中的溶液分批加入三甲基铝在甲苯中的溶液(14.6ml)。于＜0℃搅拌反应混合物40分钟，然后在10分钟内加入环氧吡喃(7.7g)在DCM(20ml)中的溶液。伴随冰冷却继续搅拌5h，并使得在15h内升温。将混合物在冰中冷却至2.5℃并加入氟化钠(5g)，随后加入水(3.2ml)，造成温度升至28℃并然后在15分钟内落至5℃。除去冰浴并继续搅拌1h。将混合物过滤通过Celite板，用DCM(3×约30ml)洗涤Celite板。丢弃第三次洗涤液，而将剩余的滤液浓缩以得到无色的油状物(6.05g)，该油状物结晶成蜡状固体。用醚(10ml)研制蜡状固体(5.94g)并静置1h。滤出所得白色固体，用40-60汽油洗涤，并进一步用40-60汽油研制残留物。蒸发滤液以得到胶质物(3.04g)，向该胶质物加入40-60汽油(25ml)，涡混混合物并静置1h。滗析汽油并丢弃。晶体形成，并在3天后将晶体滤出，得到1，5-脱水-2，4-二脱氧-2-{[(1R)-1-苯基乙基]氨基}-L-苏式-戊糖醇(104mg)。
1H NMR(400MHz，D6-DMSO)：δH 7.34-7.28(4H，m)，7.21(1H，m)，4.80(1H，d)，3.87(1H，dd)，3.78(1H，m)，3.70(1H，m)，3.31-3.22(2H，m，部分被水模糊)2.92(1H，m)，2.21(1H，m)，2.06(1H，m)，1.72(1H，m)，1.32-1.20(4H，m)。
2-氨基-1，5-脱水-2，4-二脱氧-L-苏式-戊糖醇
Figure BPA00001434066000391
方法1
将1，5-脱水-2，4-二脱氧-2-{[(1S)-1-苯基乙基]氨基}-L-苏式-戊糖醇(348.6g)和氢氧化钯炭(20％w/w，用约50％水润湿，35g)的混合物悬浮在乙醇(5230ml)中。向反应容器中充入氢(15psi)并排气(×2)，然后于约25℃在15psi氢条件下氢化混合物过夜。用氮(×8)，然后用氢(×1)净化容器，并且在15psi的氢下继续氢化约5h。用氮(×5)，然后用氢(×1)净化容器，并且在15psi的氢下继续氢化约15h。将反应物过滤通过Celite并然后通过1微米Dominick Hunter，之后在真空中蒸发溶剂。将残留物伴随加热溶解在甲醇中，过滤通过Celite，然后通过0.2微米Dominick Hunter，之后在真空中蒸发溶剂以留下标题化合物。该物质无需进一步纯化而使用。
1H NMR(400MHz，D6-DMSO包括)：δH 3.76(1H，d)，3.69(1H，dd)，3.26(1H，t)，3.14(1H，m)，2.85(1H，t)，2.39(1H，m)，1.74(1H，dd)，1.36(1H，m)。
方法2
于室温将1，5-脱水-2，4-二脱氧-2-{[(1S)-1-苯基乙基]氨基}-L-苏式-戊糖醇(25.5g)在乙醇(500ml)中的溶液通过20％氢氧化钯碳(2.5g)氢化18h。通过Celite滤芯(10g)滤出催化剂，并将滤液在真空下减压至干燥，以得到标题化合物(13.26g)。
1H NMR(400MHz，D6-DMSO)：δH 3.74(1H，m)，3.67(1H，m)，3.24，(1H，m)，3.13(1H，m)，2.84(1H，m)，2.38(1H，m)，1.72(1H，m)，1.34(1H，m)。
旋光度：+34.2°，c＝1于24℃甲醇中。
方法3
将1，5-脱水-2，4-二脱氧-2-{[(1R)-1-苯基乙基]氨基}-L-苏式-戊糖醇(80mg)溶解在甲醇(8ml)中。使用H-cubeTM流动氢化(设定：50℃，50bar，1ml/min流速)通过氢氧化钯碳(20％，CatCart 30)氢化反应物。在氮气流下将所得溶液减压至干燥，并真空干燥所得白色固体以得到2-氨基-1，5-脱水-2，4-二脱氧-L-苏式-戊糖醇(21mg)。
1H NMR(400MHz，D6-DMSO包括)：δH 3.76(1H，m)，3.69(1H，m)，3.26(1H，m)，3.15(1H，m)，2.85(1H，m)，2.40(1H，m)，1.74(1H，m)，1.35(1H，m)。
旋光度：+31°，c＝1.016于25.2℃甲醇中。
1，5-脱水-2，4-二脱氧-2-({[(1，1-二甲基乙基)氧基]羰基}氨基)-L-苏式-戊糖醇
Figure BPA00001434066000401
方法1
将在甲醇(1300ml)中的2-氨基-1，5-脱水-2，4-二脱氧-L-苏式-戊糖醇(约184g)用三乙胺(22ml)处理。将溶解在甲醇(530ml)中的二碳酸双(1，1-二甲基乙基)酯(369g)在35分钟内加入到混合物，并用甲醇(30ml)洗入。于20℃搅拌反应约21.5h并在减压下浓缩。将TBME(280ml)和环己烷(2520ml)加入到残留物并于20℃旋转混合物约2.5h。通过过滤分离所得固体，并用环己烷(2×780ml)洗涤。于30-35℃在真空下干燥固体，以得到呈白色固体的标题化合物(325.76g)。
1H NMR(400MHz，D6-DMSO)：δH 6.60(1H，bd)，4.77(1H，d)，3.72(2H，m)，3.39(1H，m)，3.26-3.11(2H，m)，2.89(1H，t)，1.82(1H，m)，1.38(10H，m)。
方法2
将2-氨基-1，5-脱水-2，4-二脱氧-L-苏式-戊糖醇(13.2g)悬浮在TBME(220ml)中。加入三乙胺(1.57ml)和二碳酸双(1，1-二甲基乙基)酯(29.5g)，并在回流下加热混合物过夜。将环己烷(220ml)加入反应，升高浴温至85℃以保持混合物在回流状态。使反应混合物在3小时内缓慢冷却至室温，然后在冰箱中保持2h。滤出晶体，用冷的环己烷/TBME(1∶1，25ml)、环己烷(25ml)洗涤，并于40℃减压干燥，以得到标题化合物(16.44g)。从滤液得到第二收得部分的标题化合物(0.495g)。
1H NMR(400MHz，D6-DMSO)：δH 6.64(1H，d)，4.79(1H，d)，3.75(1H，m)，3.69(1H，dd)，3.38(1H，m)，3.26-3.12(2H，m)，2.88(1H，m)，1.82(1H，m)，1.44-1.35(10H，m)。
旋光度：+31.3°，c＝1于23.7℃甲醇中。
1，5-脱水-2，4-二脱氧-2-({[(1，1-二甲基乙基)氧基]羰基}氨基)-3-O-(甲基磺酰基)-L-苏式-戊糖醇
Figure BPA00001434066000411
将在DCM(100ml)中的甲磺酰氯(30ml)于0℃逐滴加入1，5-脱水-2，4-二脱氧-2-({[(1，1-二甲基乙基)氧基]羰基}氨基)-L-苏式-戊糖醇(75g)和三乙胺(58ml)在DCM(900ml)中的溶液，在加入过程中维持温度低于3℃。搅拌混合物30分钟，升温至25℃并搅拌2h。用水(2×1.4l)洗涤反应混合物，干燥有机相并蒸发溶剂，以得到1，5-脱水-2，4-二脱氧-2-({[(1，1-二甲基乙基)氧基]羰基}氨基)-3-O-(甲基磺酰基)-L-苏式-戊糖醇(103.1g)。
1H NMR(400MHz，CDCI3)：δH 5.02(1H，bd)，4.75(1H，m)，4.01(1H，dd)，3.87(1H，m)，3.70-3.57(2H，m)，3.46(1H，m)，3.10(3H，s)，2.20(1H，m)，1.93(1H，m)，1.45(9H，s)。
[(3R，4R)-4-叠氮基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基甲酸1，1-二甲基乙基酯
Figure BPA00001434066000421
将乙酸钠(129g)、叠氮化钠(102g)和1，5-脱水-2，4-二脱氧-2-({[(1，1-二甲基乙基)氧基]羰基}氨基)-3-O-(甲基磺酰基)-L-苏式-戊糖醇(232g)在DMF(1l)中混合，并于95℃加热6h。加入水(2l)并使混合物彻底混匀，加入乙酸乙酯(1.5l)并搅拌混合物5分钟。分离两相，用乙酸乙酯(1l)萃取水相，用水(2×2l)洗涤合并的有机相，干燥并在真空中减压至干燥，以得到[(3R，4R)-4-叠氮基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基甲酸1，1-二甲基乙基酯(153g)。
1H MR(400MHz，CDCI3)：δH 4.84(1H，bd)，3.92(2H，m)，3.76(1H，m)，3.63(2H，m)，3.52(1H，m)，1.92(2H，m)，1.46(9H，s)。
1，5-脱水-2，4-二脱氧-2-({[(1，1-二甲基乙基)氧基]羰基}氨基)-3-O-(甲基磺酰基)-L-苏式-戊糖醇
Figure BPA00001434066000422
将氧化铂和[(3R，4R)-4-叠氮基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基甲酸1，1-二甲基乙基酯(42g)的混合物用氮净化(×3)并加入乙醇(1l)。将容器净化(×3)，充入氢，并在于20℃冷却的同时以400rpm搅拌并搅拌3小时。将容器用氮净化(×3)，再注入氢，并搅拌另外的3.5小时。将容器净化并再注入15psi的氢并搅拌过夜。将容器净化，再注入，并搅拌1.5小时。将混合物在氮气氛下过滤通过Celite，用乙醇(2×500ml)洗涤滤饼，并在真空中将滤液减压至干燥，以得到[(3R，4R)-4-氨基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基甲酸1，1-二甲基乙基酯(38g)。
1H MR(400MHz，CDCI3)：δH 5.00(1H，d)，3.90(1H，m)，3.81(1H，m)，3.74(1H，m)，3.50(1H，dd)，3.44(1H，m)，3.02(1H，m)，1.71(1H，m)，1.52-1.46(10H，m)。
[(3R，4R)-4-({5-(氨基羰基)-4-[(4-甲基苯基)氨基]-2-嘧啶基}氨基)四氢-2H-吡喃-3-基]氨基甲酸1，1-二甲基乙基酯
于90℃加热并搅拌[(3R，4R)-4-氨基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基甲酸1，1-二甲基乙基酯(38g)、2-氯-4-[(4-甲基苯基)氨基]-5-嘧啶甲酰胺(46.2g)和三乙胺(49.0ml)在DMF(250ml)中的混合物。将混合物加入水(1l)中，并通过过滤收集固体沉淀。用水(2×200ml)洗涤沉淀，并于40℃在真空中干燥过夜。将产物悬浮在乙酸乙酯(600ml)中，并加热至回流30分钟，在冰中冷却至5℃，并通过过滤收集产物。用乙酸乙酯(2×100ml)洗涤产物，并于40℃在真空中干燥，以得到[(3R，4R)-4-({5-(氨基羰基)-4-[(4-甲基苯基)氨基]-2-嘧啶基}氨基)四氢-2H-吡喃-3-基]氨基甲酸1，1-二甲基乙基酯(53.0g)。
LCMS(方法A)：Rt 1.05min，MH+443。
变温1H NMR(400MHz，D6-DMSO，119℃)：δH 11.21(1H，bs)，8.55(1H，s)，7.53(2H，m)，7.14(4H，m)，6.57(1H，d)，6.01(1H，d)，4.21(1H，m)，3.91-3.78(3H，m)，3.51-3.42(2H，m)，2.30(3H，s)，2.00-1.88(1H，m)，1.74-1.62(1H，m)，1.37(9H，s)。
实施例1-2-{[(3R，4R)-3-氨基四氢-2H-吡喃-4-基]氨基}-4-[(4-甲基苯基)氨基]-5-嘧啶甲酰胺
Figure BPA00001434066000441
将[(3R，4R)-4-({5-(氨基羰基)-4-[(4-甲基苯基)氨基]-2-嘧啶基}氨基)四氢-2H-吡喃-3-基]氨基甲酸1，1-二甲基乙基酯(52.2g)加入到氯化氢在异丙醇(5M，300ml)和乙醇(400ml)中的混合物。在搅拌的同时加热混合物至回流，并伴随剧烈搅拌继续加热24小时。使混合物冷却至室温，过滤，用乙醇(100ml)洗涤固体，并在真空中干燥。将粗制产物悬浮在水(900ml)中并加热至回流，得到澄清溶液。将溶液用氢氧化钠溶液(2M，300ml)碱化，并在冰中冷却。通过过滤收集沉淀的产物，用水(2×100ml)洗涤并将米色固体在真空炉中于40℃干燥2h，以得到呈米色固体的2-{[(3R，4R)-3-氨基四氢-2H-吡喃-4-基]氨基}-4-[(4-甲基苯基)氨基]-5-嘧啶甲酰胺(37.8g)。
LCMS(方法A)：Rt 0.85min，MH+343
变温1H NMR(400MHz，D6-DMSO，119℃)：δH 11.22(1H，bs)，8.55(1H，s)，7.54(2H，m)，7.14(4H，m)，6.52(1H，bd)，4.06(1H，m)，3.83(1H，m)，3.70(1H，m)，3.53(1H，d)，3.41(1H，t)，2.96(1H，s)，2.30(3H，s)，1.89-1.65(2H，m)，1.50(2H，s)。
在乙醇(1.2升)中加热2-{[(3R，4R)-3-氨基四氢-2H-吡喃-4-基]氨基}-4-[(4-甲基苯基)氨基]-5-嘧啶甲酰胺(37.8g)至回流。将热溶液过滤通过玻璃烧结(scinter)漏斗，以去除未溶解的沉渣，并使滤液缓慢冷却至室温，然后在冰中冷却至5℃，并通过过滤收集固体结晶产物，以得到呈浅米色结晶固体的2-{[(3R，4R)-3-氨基四氢-2H-吡喃-4-基]氨基}-4-[(4-甲基苯基)氨基]-5-嘧啶甲酰胺(36.6g)。
在配备有X′Celerator检测器的PANalytical X′Pert Pro粉末衍射仪上获得XRPD数据。获得条件为：辐射：Cu Kα，发生器电压：40kV，发生器电流：45mA，起始角度：2.0°2θ，终止角度：40.0°2θ，步长：0.0167°2θ。每步的时间为31.750s。样品通过在Si晶片(零本底)板上安置几毫克样品、得到粉末薄层来制备。如此获得如图1所示的谱图。
Figure BPA00001434066000451
图1-实施例1的化合物的XPRD

Claims (11)

1.式(I)化合物或其盐：
Figure FPA00001434065900011
所述盐优选药学上可接受的盐。
2.权利要求1的式(I)化合物或其盐，所述式(I)化合物为2-{[(3R，4R)-3-氨基四氢-2H-吡喃-4-基]氨基}-4-[(4-甲基苯基)氨基]-5-嘧啶甲酰胺，所述盐优选药学上可接受的盐。
3.一种制备权利要求1或2的式(I)化合物或其盐的方法，所述方法包括将式(II)化合物：
Figure FPA00001434065900012
与式(III)化合物反应：
Figure FPA00001434065900013
其中P是保护基团，例如叔丁氧羰基(Boc)；
以及随后去除所述保护基团。
4.一种药物制剂，包含权利要求1或2的式(I)化合物或其盐和药学上可接受的赋形剂。
5.权利要求1或2的式(I)化合物或其盐，其用于治疗。
6.权利要求1或2的式(I)化合物或其盐在制备抑制Syk激酶的药物中的用途。
7.一种治疗癌症的方法，所述癌症具体为血红素恶性肿瘤，尤其是非何杰金氏淋巴瘤，包括滤泡性淋巴瘤(FL)、套细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，所述方法包括将有效量的权利要求1或2的式(I)化合物或其药学上可接受的盐给予有需要的患者。
8.权利要求1或2的式(I)化合物或其盐在制备用于治疗与不当肥大细胞活化相关联的疾病的药物中的用途。
9.权利要求1或2的式(I)化合物或其盐在制备用于治疗炎性疾病的药物中的用途。
10.权利要求1-7中任一项的式(I)化合物或其盐在制备用于治疗过敏性病症的药物中的用途。
11.权利要求1-7中任一项的式(I)化合物或其盐在制备用于治疗鼻炎的药物中的用途。
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