CN102337354B - 一种疱疹病毒ⅱ型pcr荧光定量快速检测试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明目的是提供一种疱疹病毒II型PCR荧光定量快速检测试剂盒，包括DNA提取液，PCR反应液，DNA聚合酶，阳性质控品，弱阳性质控品，阴性质控品，定量参比品，所述PCR反应液包括引物和荧光探针。本发明的有益效果为本发明试剂盒使用了阳性对照和阴性对照增加了试剂盒的准确性，并且含量低至5×10²基因拷贝/mL的核酸DNA也可以检出。核酸扩增的方法敏感性高、特异性强而且重复性好。本发明还使用了拟南芥内参照系统，它在单纯疱疹病毒II型基因组和人类基因组中均无同源基因，因此可作为内参照以检测每次PCR反应中是否有PCR抑制物存在，从而确保PCR结果的准确性。

Description

一种疱疹病毒Ⅱ型PCR荧光定量快速检测试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及一种疾病病原体基因检测技术，尤其涉及一种疱疹病毒II型PCR荧光定量快速检测试剂盒及方法。

背景技术

单纯疱疹病毒(herpess implex virus)属于疱疹病毒科α病毒亚科，病毒质粒大小约180纳米。人类单纯疱疹病毒分为两型，即单纯疱疹病毒I型(HSV-I)和单纯疱疹病毒II型(HSV-II)。单纯疱疹病毒感染是由于人与人的接触。可引起疱疹性角膜炎、疱疹性皮肤炎、生殖器疱疹等，胎儿HSV感染发生率为0.4％～1.0％，即可引起胎儿宫内感染，诱发胎儿流产、早产、死胎和畸形，又可以感染新生儿。单纯疱疹病毒II型可引起疱疹性角膜炎、疱疹性皮肤炎、生殖器疱疹等，I型主要引起生殖器以外的皮肤、粘膜(口腔粘膜)和器官(脑)的感染。新生儿单纯疱疹病毒感染的发病率和死亡率都很高，发病率估计为活产婴儿的1/3000-1/20000，80％的病例为单纯疱疹病毒II型。HSV-II阳性的生殖器疱疹溃疡是易感染HIV的危险因素之一。有免疫功能缺陷的患者，尤其是AIDS，生殖器疱疹严重且持久，易产生广泛而持续的直肠生殖器损害。

单纯疱疹病毒侵入宿主细胞后，病毒DNA进入细胞核内复制，与此同时，病毒DNA转录物进入胞质，指导病毒结构蛋白在细胞质内的合成；随后，子代病毒DNA回到胞质内装配为具有感染性的成熟病毒颗粒。单纯疱疹病毒入侵后，可在入侵局部造成感染；但一般情况下，病毒沿该局部的神经末梢上行，传入至神经节内，经2～3天短暂时间的复制后，病毒进入潜伏感染状态健康搜索。在适当条件下，单纯疱疹病毒可被激活而大量复制，再沿该神经节的神经分支下行播散到外周支配区域组织的细胞内，导致疱疹发作。局部感染较重时，病毒可沿淋巴管上行扩散导致淋巴结炎；在机体免疫功能低下时，可形成病毒血症，发生全身播散性感染。其感染的重要特点是，病毒可长期潜伏于体内，其间可因受激惹而反复发作。

目前，HSV常用的检查有培养法、PCR试验、血清学检查及其他抗原试验等多种选择。培养法仅能检查症状的患者，在检查无症状患者样本时，其敏感度仅有20％～50％，这使得80％以上的HSV感染者直接被漏检。同时培养法也非常耗时，且需要专门的设备。由于以上问题和具有很高的特异性，培养法一般用于HSV的确诊和法医学鉴定。在细胞学检查中，可检出HSV感染特征性的多核巨细胞内的嗜酸性包涵体，但不能区别HSV感染或水痘-带状疱疹病毒感染，敏感性仅为病毒分离的60％。另外，免疫酶方法(ELISA)是一种将抗原的特异性和酶的生物学放大作用有机结合在一起的特异而敏感的免疫学检测方法，但在快速和定量检测自动化上仍有较多工作做。免疫荧光法(IFA)在检查无症状患者样本时，其敏感度可达到35％～70％，且可以在几个小时内出报告。但该方法目前的主要问题是其结果判断的经验依赖性较高。乳胶凝集试验(LA)是将特异性的抗体与乳胶颗粒结合成复合物，当有HSVAg存在时，就会形成抗原-抗体-胶乳聚合物，出现肉眼可见的凝集，问题是敏感性较差。

实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对模板进行定量分析的方法。随着荧光PCR技术与相关PCR仪的出现，彻底改变了以往利用末端法对基因进行定量的方法。

实时荧光PCR的优点是显而易见的，由于省去了PCR后处理的过程，不仅大大提高了样品的分析速度，降低了扩增产物污染的可能性(这一点对经常进行重复测定的临检部门尤其重要)，又避免了PCR后处理过程引入的误差，代表了PCR测定技术的发展趋势，无疑也是临床诊断的理想选择。

常规PCR法虽然有简便、快速、灵敏的优势，但是有不能精确定量和PCR后处理产生污染导致的假阳性等问题，因此有必要开发一种精确、灵敏快速、稳定的临床检验方法。

发明内容

本发明目的是提供一种疱疹病毒II型PCR荧光定量快速检测试剂盒，包括DNA提取液，PCR反应液，DNA聚合酶，阳性质控品，弱阳性质控品，阴性质控品，定量参比品，，所述PCR反应液包括引物和荧光探针，所述引物分为上游引物和下游引物；

上游引物：5′-CCCAAGCTCCCGCTAAGG-3′；

下游引物：5′-CGCCTTGGCAGCACAACT-3′；

荧光探针：5′-FAM-CCTGCTCTAGATATCCT-TAMRA-3′。

作为本发明的进一步设置，引入了一个人工构建的内参照系统用于避免检测结果假阴性，内参照系统包括内参探针、引物和内参DNA，所述内参照系统为拟南芥内参照系统，所述内参照系统包括上游引物序列：SEQ ID NO.5、下游引物序列：SEQ ID NO.6和探针序列：SEQ ID NO.7。

作为本发明的进一步设置，所述阳性质控品浓度为10倍梯度106copies/mL-10⁷copies/m，所述弱阳性质控品浓度为103copies/mL-10⁴copies/mL。

作为本发明的进一步设置，所述DNA聚合酶包括tap酶、UNG酶。

本发明的另一个技术方案为提供一种疱疹病毒II型PCR荧光定量快速检测方法，其中PCR扩增的靶序列为SEQ ID NO.4，PCR扩增所用引物为：上游引物序列如：SEQ ID NO.1，下游引物序列如：SEQ ID NO.2，荧光探针序列如：SEQ ID NO.3。

作为本发明的进一步设置，所述荧光探针5’端标记FAM荧光基团，3’端标记TAMRA淬灭基团。

本发明的有益效果为本发明试剂盒使用了阳性对照和阴性对照增加了试剂盒的准确性，并且含量低至5×10²基因拷贝/mL的核酸DNA也可以检出。本试剂盒敏感性高、特异性强而且重复性好。本发明还使用了拟南芥内参照系统，它在单纯疱疹病毒II型基因组和人类基因组中均无同源基因，因此可作为内参照以检测每次PCR反应中是否有PCR抑制物存在，从而确保PCR结果的可信性。

附图说明

图1：灵敏度参比品检测结果图；

图2：标准曲线1e4-1e7参比品检测结果图；

图3：标准曲线1e4-1e7；

图4：HSV II特异性结果图。

具体实施方式

本发明应用荧光PCR技术检测单纯疱疹病毒II型的试剂盒，即通过检测临床采集的标本中是否存在单纯疱疹病毒II型，从而指导临床医生对单纯疱疹病毒II型感染的病人用药，帮助预后判断。

单纯疱疹病毒II型检测试剂盒是采用聚合酶链式反应(PCR)及荧光标记探针技术，检测临床样品中单纯疱疹病毒II型特有的核酸序列，从而达到快速判断单纯疱疹病毒II型存在的目的。试验过程包括了两部分：待检物标本制备和PCR检测。

Taqman探针机理：针对HSV-II保守序列分别设计特异引物，对待测样品进行检测，只有存在HSV-II DNA的样品能被顺利扩增出双链DNA产物，该产物才能与Taqman探针结合，发出荧光信号从而被检测到，因此可以确切指示出样品中是否含有HSV-II DNA。本试剂盒对样品中含量低至5×10²基因拷贝/mL的核酸DNA就可以检出。核酸扩增的方法敏感性高、特异性强而且重复性好。

本发明试剂盒设置了内参照基因，即拟南芥基因。它在单纯疱疹病毒II型基因组和人类基因组中均无同源基因，因此可作为内参照以检测每次PCR反应中是否有PCR抑制物存在，从而确保PCR结果的可信性。当内参照结果为阳时，表示PCR反应体系以及操作正常；因此当目的基因结果为阴时，内参照结果为阳就显得十分重要了。但当目的基因结果为阳时，内参照的扩增曲线较目的基因扩增曲线要推迟，或是内参照结果为阴都是正常的。但是目的基因和内参照基因结果都为阴时，该试验视为无效，需再重复。

阳性对照和阴性对照原理：阳性对照结果为阳，表明对靶基因的检测系统是正常的；而当结果为阴时，表明该次实验无效，需重复。

为证明有否污染存在，每次试验也需同时做阴性对照。阴性对照结果为阴，表明本次试验无污染；如结果为阳，则表明该次实验无效，需重复。

实用一试剂盒的准备

1、试剂盒组成原料

本试剂盒中主要原材料均从国际知名的分子生物学试剂公司订购，因此其来源可靠、安全且质量稳定，可作为试剂盒的稳定原材料来源(详见下表)。

表1试剂盒主要原材料信息表

Tris：分析纯，有合格资质的供应厂商的产品，含量99.7％，红外合格，pH(5％水)10.3-10.9，水0.3％，熔点167-171℃，吸收系统合格，杂质最高含量合格。

NaOH：分析纯，北京化学试剂厂产品或有合格资质的供应厂商的产品。

TritonX100：棕色油状液体，能溶于冷水，并有强烈的起泡性能。

EDTA：分析纯，有合格资质的供应厂商的产品，为白色结晶状粉末，溶于水，溶液呈酸性，难溶于醇，含量不少于99.5％，水溶液反应合格，络合力试验合格，杂质最高含量合格。

纯化水：使用泰普生物科学有限公司纯净水，然后经Millipore公司的Milli-Q Biocel型纯水机处理，电阻率16～18MΩ。

靶序列扩增片段SEQ ID NO.4如下：(5′-3′)

CCCAAGCTCCCGCTAAGGACATGCCCTCGGGCCCCACACCCCAACACATCCCCCTGTTCTGGTTCCTAACGGCCTCCCCTGCTCTAGATATCCTCTTTATCATCAGCACCACCATCCACACGGCGGCGTTCGTTT GTCTGGTCGC CTTGGCAGCACAACT。

引物序列如下：

表2：本试剂盒引物序列

引物名称	序列
		HSV II-F	5′-CCCAAGCTCCCGCTAAGG-3′
HSV II-R	5′-CGCCTTGGCAGCACAACT-3′
		Suc-F	5′-TCATCGTCGCTGGAGCTGGTT-3′
Suc-R	5′-CGGCGGTTTGTCAAGCTGAT-3′

表3：引物质量标准

探针：检测探针为指定碱基序列的寡聚核苷酸，可检测HSV II目的基因，内参照探针可以检测内参照模板核酸序列。检测探针的5’端用FAM标记，3’端TAMRA标记。由上海英骏生物技术有限公司或大连宝生物有限公司(TAKARA)按要求合成，HPLC纯化，核对合成报告应与合成要求(序列)一致。

表4：探针名称及序列

表5：探针质量标准

dNTPs：dATP、dCTP、dGTP、dUTP购自上海宏谊公司，或其他有合格资质的供应商，并经出厂检测合格；按照本公司相应的质量标准进行检测合格后使用。

Taq酶：本试剂盒在研制开发及生产过程中，所应用的Taq酶购自大连TaKaRa公司，或其他有合格资质的供应商，按照本公司相应的质量标准进行检测合格后使用。

Taq DNA多聚酶(含10×PCR buffer、MgCl2)：浓度5U/μl，含10×PCR Buffer、25mmol/LMgCl₂，购自宝生物公司(Takara)根据供应商质量标准：本品具有DNA聚合酶活性，无3’→5’核酸外切酶活性及核酸内切酶活性；具热稳定性，94℃保温1小时后仍保持50％活性。-20±5℃保存。

UNG酶：本试剂盒在研制开发及生产过程中，所应用的UNG酶购自Promega公司或其他有合格资质的供应商，按照本公司相应的质量标准进行检测合格后使用。基础试剂配制：10mmol/L Tris-HCl溶液的配制：在生产区试剂配制间，称取0.12114g的Tris，加入已含60mL蒸馏水的100mL烧杯中，振摇使之充分溶解，移入100mL的容量瓶中，用10mL蒸馏水洗涤烧杯3次并移入容量瓶中，用HCl调pH值为8.3，最后用蒸馏水定容到100mL，翻转容量瓶使之充分混匀。移入试剂瓶并标记名称、浓度、配置时间。

dNTPs的配制：将购买的100mM的dATP、dUTP、dGTP、dCTP，按照1∶1.5∶1∶1(体积比)混合，混合液各成分浓度分别为：10mM、15mM、10mM、10mM取0.5mL离心管，分装成每管100μL dN(U)TP的母液。

引物和探针的稀释：将合成的引物13000rpm离心1min，加入适量纯水(根据合成量计算)将引物溶解成100μM，取0.5mL离心管，分装成每管100μL的引物母液。进行生产前需加入适量纯水配制成10μM使用液。

将合成的探针13000rpm离心1min，加入适量纯水(根据合成量计算)将探针溶解成100μM，取0.5mL离心管，分装成每管100μL的探针母液。进行生产前需加入适量纯水配制成10μM使用液。质控品的制备方法及溯源情况：

内参照：组成为10³copies/mL含内参照基因质粒；领用经分光光度计精确定量的含内参照基因的高浓度质粒，用1×TE作10倍梯度稀释至10³copies/mL作为内参照，1mL/管分装。

阳性质控品：组成为10⁶copies/mL-10⁷copies/mL含目的片段质粒；领用经紫外分光光度计精确定量的含目的片段的高浓度质粒，用预先配制好的1×TE作10倍梯度稀释至10⁶copies/mL-10⁷copies/mL作为阳性对照，1mL/管分装。

弱阳性质控品：组成为10⁴copies/mL-10³copies/mL含目的片段质粒；领用经紫外分光光度计精确定量的含目的片段的高浓度质粒，用预先配制好的1×TE作10倍梯度稀释至10⁴copies/mL-10³copies/mL作为阳性对照，1mL/管分装。

阴性质控品照：组成为1×TE；

2、本试剂盒组成：

表5：本试剂盒组成配方

2.1PCR反应液的制备

2.1.1配液前准备

(1)引物

将合成的引物13000rpm离心1min，加入适量纯水(根据合成量计算)将引物溶解成100μM，取0.5mL离心管，分装成每管100μL的引物母液。进行生产前需加入适量纯水配制成10μM使用液。

(2)探针

将合成的探针13000rpm离心1min，加入适量纯水(根据合成量计算)将探针溶解成100μM，取0.5mL离心管，分装成每管100μL的探针母液。进行生产前需加入适量纯水配制成10μM使用液。

2.1.2PCR反应液配液

取一配液瓶，按配液单上每种成份的量乘以配制人份数，分别下述成份，混合均匀。

表6：HSV II-PCR反应液配方

2.1.3PCR反应液分装

将上述PCR反应液按每管1056μL分装于1.5mL的离心管中，作好标识，-18℃以下冰箱中保存，待试剂盒包装后，送质检部进行成品质检。

2.1.4DNA聚合酶体系配置

购买的Taq DNA聚合酶(5U/μL)和UNG酶(1U/μL)，按照1∶1(体积比)混合，每10μL混合液中加入1μL10⁵copies/mL suc II质粒混匀后分装为24μL/管，作好标识，-18℃以下冰箱中保存，待试剂盒包装后，送质检部进行质检。

2.2阳性质控品和阴性质控品的制备

2.2.1阳性质控品

用经紫外分光光度计精确定量的含目的片段的高浓度质粒，用预先配制好的1×TE作10倍梯度稀释至10⁶copies/mL-10⁷copies/mL作为阳性质控品，200μL/管进行分装。

2.2.2弱阳性质控品

用经紫外分光光度计精确定量的含目的片段的高浓度质粒，用预先配制好的1×TE作10倍梯度稀释至10⁴copies/mL-10³copies/mL作为阳性质控品，200μL/管进行分装。

2.2.3阴性质控品

为1×TE，200μL/管进行分装。

2.3HSV II DNA提取液的制备

HSV II DNA提取液：根据生产量用纯水配制终浓度为10mMTris-HCl、25mMNaOH、1％Triton-100(v/v)、1％(v/v)NP-40、0.1mM EDTA、5％(w/v)chelex-100溶液，以1mL/管分装于2mL冻存管中，贴上标签。

每生产1000ml HSV II DNA提取液，按照下表用灭菌纯水配制：以1.2mL/管分装，贴上标签，2-8℃贮存。

表7：HSV II DNA提取液配方

组分成分	每1000ml
		NaOH	1g
1mol/L Tris-Cl pH 8.3	10ml
		NP 40	10ml
Triton X100	10ml
		Chelex 100	20g
0.5mol/L EDTA pH 8.0	0.2ml
		灭菌纯化水	定容至1000ml

1mol/L Tris-HCl(pH 8.3)的配制：电子天平称取Tris碱，用纯化水溶解，放置溶液使其冷却至室温。滴加浓HCl，用精密pH计调节pH。

0.5mol/L EDTA(pH8.0)的配制：电子天平称取EDTA-Na₂·2H₂O，用纯化水溶解，称取NaOH加入，用精密pH计调节pH，定容、灭菌，室温冷却后2-8℃贮存。

DNA提取液的配制：依次加入NaOH、Chelex 100、1mol/L Tris-Cl(pH8.3)、Triton X100、NP 40和0.5mol/L EDTA(pH8.0)，定容后2-8℃贮存。

3半成品检定

3.1外观

试剂瓶和试剂管均完整无破裂、无挤压或开盖现象。试剂瓶和试剂管均贴有标签，且标签字迹清晰。

PCR反应液、阳性质控品、弱阳性质控品、阴性质控品、定量参比品应为无色透明液体，无沉淀物或絮状物；DNA提取液无色透明，含有白色颗粒状沉淀物。

3.2性能检测

最低检出量5.0×10²copies/mL的参考品全部检出。

4.分装和包装

半成品检定合格后进行包装。将分装后的DNA提取液、PCR反应液、DNA聚合酶、阳性质控品、阴性质控品和弱阳性质控品和定量参比品放入试剂包装盒中，外包装标明试剂盒名称、规格、批号、有效期等信息，保存于-18℃以下冰箱中。分装后包装成成品试剂盒。

5.3工作参比品简要说明

表7：参比品简要说明

实验二本试剂盒的使用

标本

1.适用标本类型：生殖道、尿道分泌物拭子，尿道口或患病部位刮片等。

2.标本采集：

2.1.男性尿道样本：用无菌拭子插入尿道约2cm处旋转，静止数秒钟后取得分泌物标本，放回管中密闭送检。

2.2.女性尿道样本：先用无菌生理盐水清洗尿道口，再用无菌拭子插入尿道约2cm处旋转取得分泌物标本，放回管中密闭送检。

2.3.女性生殖道样本：先用无菌生理盐水擦去阴道内过多的分泌物，再将无菌拭子放置于生殖道低位1/3处轻轻旋转取得粘膜分泌物标本，放回管中密闭送检。

2.4.尿道口或患病部位刮片：用刮片刮取病灶处脱落细胞，置入无菌玻璃管，密闭送检。

3.标本保存和送检：标本可立刻送检，在4-25℃保存不应超过6天，非液体性标本也可在-20℃保存6个月。标本长途送检时应使用冰袋。

检测方法

一、试剂准备(试剂准备区)

1.取出DNA提取液，备用。

2.确定需要进行的反应管数n(标本数+阴性+强阳性质控品+弱阳性质控品+4个定量参比品)后，取出HSV-II-PCR反应液，将n×44μlHSV-II-PCR反应液，n×1μl DNA聚合酶系加入一个离心管中并震荡混匀，瞬时离心后，向每一个PCR反应管中分装45μl，盖上管盖后转移到加样区，避光放4℃冰箱备用。

3.将对照品和定量参比品转移到样品处理区，放于4℃冰箱中备用。

二、样本处理(样本处理区)

1.待测样本处理：

1.1.生殖泌尿道分泌物拭子

1.1.1.向拭子管中加入1ml灭菌生理盐水，高速震荡1min，挤干拭子；

1.1.2将1.1处理后的全部液体转移到1.5ml离心管中(如分泌物过多，只取200μl)，10000rpm离心5分钟；

1.1.3.去上清，向沉淀中加入1ml灭菌生理盐水，充分混匀，10000rpm离心5分钟；

1.1.4.去上清，向沉淀中加入50μlDNA提取液，充分混匀，100℃恒温处理10分钟；

1.1.5.10000rpm离心5分钟，上清液用于PCR反应。

1.2.尿道口或患病部位刮片部位刮片

1.2.1.向玻璃管中加入1ml灭菌生理盐水，充分振荡，尽可能将细胞洗脱；

1.2.2.将1.1处理后的全部液体转移到1.5ml离心管中，10000rpm离心5分钟；

1.2.3.去上清，向沉淀中加入1ml灭菌生理盐水，充分混匀，10000rpm离心5分钟；

1.2.4.去上清，向沉淀中加入50μlDNA提取液(提取液内含不溶于水的物质，应充分混匀后吸取)，充分混匀，100℃恒温处理10分钟；

1.2.5.10000rpm离心5分钟，上清液用于PCR反应。

2阴性质控品样本处理

2.1取出阴性质控品，瞬时离心，取50μl到1.5ml离心管中，加入50μlDNA提取液(提取液内含不溶于水的物质，应充分混匀后吸取)，充分混匀，100℃恒温处理10分钟；

2.2.13000/rpm离心5分钟，上清液用于PCR反应。

3.阳性质控品样本处理：(同阴性质控品)

4.弱阳性质控品样本处理：(同阴性质控品)

5.定量参比品处理：瞬时离心，备用

三、PCR反应

1.加样(样品处理区或者加样区)

向准备好的PCR反应液管中分别加入处理好的待测样品、阴性质控品样本、阳性质控品、弱阳性质控品样本，上清液5μl。或直接加入定量参比品5μl，盖紧管盖后瞬时低速离心。

2.PCR扩增(检测区)

将准备好的PCR反应管放置于PCR仪上，编辑样本信息并按下列循环参数进行扩增反应：

HSV-II-PCR反应体系中包括：HSV-II检测和内参照。

利用仪器配套软件进行自动分析，得到各样品Ct值和C值

结果分析条件设定：

1.ABI 7500基线(baseline)设定：取2个到样品阈值(threshold)前3个循环值作为基线。阈值(threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性质控品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点，即Ct_{阴性质控品}＝40或者“Unde t.”为准。

2.STRATAGENE Mx3000P基线设定：选择“适合基线(Adaptivebaseline)”设定时的荧光信号。阈值(threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性质控品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点，即Ct阴性质控品＝40或者“No Ct”为准。

本试剂盒阴、阳性质控品应同时满足以下条件，否则视为本次实验无效：

1.阴性质控品：HSV-II(FAM)Ct值＝40或“No Ct”(Mx3000P)或者“Undet.”(ABI 7500)，内参照(HEX)Ct值＜40，且有较好的对数增长曲线。

2.阳性质控品：HSV-II(FAM)有较好的对数增长曲线。定量参考值在1.0×10⁶copies/ml-1.0×10⁷copies/ml。

3.弱阳性质控品：HSV-II(FAM)有较好的对数增长曲线。定量参考值在1.0×10³copies/ml-1.0×10⁴copies/ml。

结果判定：

1.HSV-II Ct值＝40或“No Ct”(Mx3000P)或者“Undet.”(ABI7500)；且内参照(HEX)通道Ct值＜40，且有较好的对数增长曲线，则HSV-II的DNA含量小于检测下限。

2.HSV-II Ct值＜40，且有较好的对数增长曲线，则按以下方法判读：

2.1样本C＜5.00E+002，HSV-II的DNA含量＝C基因拷贝(仅供参考，建议复检，若仍有较好的对数增长曲线，则为阳性。)

2.2样本1.00E+002≤C≤5.00E+008，则HSV-II的DNA含量＝C基因拷贝

2.3样本HSV-II的DNA含量＞5.0×10⁸copies/ml，如需定量可将样本稀释至线性范围内再重新测定。

3.HSV-II Ct值＝40或“No Ct”(Mx3000P)或者“Undet.”(ABI7500)；且内参照(HEX)Ct值＝40或“No Ct”(Mx3000P)或者“Undet.”(ABI 7500)，则扩增失败，请重新测定。

试剂盒检定

1.外观

试剂盒外观完整，试剂瓶和试剂管均完整无破裂、无挤压或开盖现象。试剂瓶和试剂管均贴有标签，且标签字迹清晰。PCR反应液、阳性质控品、弱阳性质控品、阴性质控品、定量参比品应为无色透明液体，无沉淀物或絮状物；DNA提取液无色透明，含有白色颗粒状沉淀物。

2.性能检测

2.1.最低检出量

合理使用情况下，对企业工作参比品：S1-S4进行检测，S1-S3检出结果均为阳性，S 3浓度5.0×10²copies/mL为本试剂盒的最低检出量。

2.2.特异性

对企业特异性参比品(T1-T10)进行检测，检测结果均为阴性。

2.3.阴阳性符合率

对企业阳性参比品(Z1-Z5)和阴性参比品(Z6-Z10)进行检测，阴阳性符合率应为100％。

2.4.精密度

2.4.1.批内精密度

用同一批次的试剂盒，对精密度参考品(P1-P4)进行检测，CV≤10％(n＝5)。

5.2.4.2.批间精密度

用三个不同批次的试剂盒，对精密度参考品(P1-P4)进行检测，CV≤10％(n＝15)。

5.2.5.稳定性

产品有效期为6个月，在有效期内产品性能稳定。

请参阅图1、图2、图3、图4，通过对本产品准确性、特异性、重复性、稳定性、灵敏度和精密度进行研究，显示其具备以下性能：

图1为灵敏度参比品检测结果图，所测浓度依次为5.0×104copies/ml、5.0×103copies/ml、5.0×102copies/ml、5.0×101copies/ml。最低检出限为5.0×10²copies/mL。

图2：标准曲线1e4-1e7参比品检测结果图，图3为以图2结果制作的标准曲线。

图4：HSV1特异性结果图，依次为T1EB病毒、T2水疱带状疱疹病毒、T3人巨细胞病毒、T4人疱疹病毒6型、T5人疱疹病毒5型、T6人疱疹病毒8型、T7解脲脲原体、T8沙眼衣原体、T9单纯疱疹病毒II型、T10表皮葡萄球菌，以及阳性对照、弱阳性对照。检测企业内控参比品T1-T10样本结果全部为阴性。

综上，与实验室普通PCR定量检测相比，本产品准确性高、特异性强，而且在重复性、稳定性、灵敏度和精密度都有了很大的改进，提高，产品有效期为6个月，在有效期内产品性能稳定。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (1)

1.一种疱疹病毒Ⅱ型PCR荧光定量快速检测试剂盒，其特征在于，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括引物和荧光探针，所述引物分为上游引物和下游引物：

上游引物：5′-CCCAAGCTCCCGCTAAGG-3′；

下游引物：5′-CGCCTTGGCAGCACAACT-3′；

荧光探针：5′-FAM-CCTGCTCTAGATATCCT-TAMRA-3′;

所述试剂盒还包括DNA提取液，DNA聚合酶，阳性质控品，弱阳性质控品，阴性质控品，定量参比品；所述DNA聚合酶包括taq酶和UNG酶；

所述PCR反应液还包括拟南芥内参照系统，所述内参照系统包括上游引物序列：SEQ ID NO.5、下游引物序列：SEQ ID NO.6和探针序列：SEQ ID NO.7。

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