CN102337329A - 半巢式聚合酶链反应酶切分型快速检测军团菌及其应用 - Google Patents

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朱庆义
胡朝晖
詹晓勇
刘洋敏
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Abstract

本发明公开了一种半巢式聚合酶链反应酶切分型快速检测军团菌及其应用。检测方法是：首先，增加一对引物Leg 226F和Leg 226R；接着，以386bp扩增片段为模板，进行第二次PCR扩增，得226bp片段产物；最后，对226bp的PCR扩增产物作琼脂糖凝胶电泳分析，选阳性者用FastDigestTaa I核酸内切酶作酶切分型，观察酶切分型结果。该检测方法可用于临床痰液标本的军团菌快速检测与分型，也可用于环境水样本的军团菌快速检测与分型，还可用于临床标本如支气管灌洗液的军团菌快速检测与分型。本发明半巢式PCR-酶切分型检测军团菌的方法具有简便、快速，敏感性和特异性高，可直接用于临床标本检测。

Description

半巢式聚合酶链反应酶切分型快速检测军团菌及其应用
技术领域
本发明涉及军团菌检测和分型方法的技术领域，具体为一种不仅能检测军团菌，而且可以将军团菌分为嗜肺军团菌与非嗜肺军团菌的快速检测与分型方法。
背景技术
军团菌是一种兼性胞内寄生菌，在环境水源中分布甚广，是引起人类军团菌病的重要病原体。近年来，军团菌病在世界各地时有爆发流行，被我国例入14种新发传染病之一。该病由军团菌感染引起，临床类型分肺炎型与庞蒂阿克热型，主要通过气溶胶吸入呼吸道传播。据国外报道，院内不明原因肺炎感染有10％是由军团菌引起。目前已知军团菌属有52个种，70多个血清型。嗜肺军团菌是其中之一，临床上80％以上军团菌感染是由该菌引起。因此，军团菌属及嗜肺军团菌种的早期检测对于军团菌病临床诊断具有重大价值。
目前军团菌的检验方法主要有军团菌分离培养、血清抗体检测、尿可溶性抗原检测等。但直接分离培养，所需时间长达3-10天，阳性率低，培养基配置复杂，价格昂贵；尿抗原检测仅对嗜肺军团菌血清型1型具有特异性(嗜肺军团菌共包括15个血清型)。由于军团菌病与临床上其他病原体引起的肺炎鉴别诊断困难，而治疗方案又完全不同。因此，用分子生物学方法快速检测军团菌并对军团菌进行分型具有很重要的现实意义。
军团菌分子分型检测技术主要包括扩增片段长度多态性分析(AFLP)、限制性片段长度多态性分析(RFLP)、随机扩增多态性分析(RAPD)、脉冲场凝胶电泳分析(PFGE)、限制性酶切分析(Restriction analysis)、DNA测序分析和荧光定量PCR等。这些方法在很大程度上提高了军团菌检测的敏感性和特异性，但仍然存在各自的缺点，如DNA测序是最为准确的军团菌种鉴定方法，但耗时较长，分析困难，不能适应临床上的快速要求；荧光定量PCR技术耗时短，操作方便，且污染小，但该法对仪器设备要求较高。
发明内容
本发明是对原有专利技术军团菌快速检测与分型方法的改进，建立了一种半巢式PCR方法，提供了一种更敏感、更特异的军团菌鉴定方法，将军团菌分型为嗜肺军团菌与非嗜肺军团菌，并可直接用来检测临床标本和环境水样中的军团菌。
为了实现以上目的，本发明是这样实现的：1.一种半巢式聚合酶链反应酶切分型快速检测军团菌，首先，增加一对引物Leg 226F和Leg 226R；接着，以386bp扩增片段为模板，进行第二次PCR扩增，得226bp片段产物；最后，对226bp的PCR扩增产物作琼脂糖凝胶电泳分析，选阳性者用FastDigestTaa I核酸内切酶作酶切分型，观察酶切分型结果。
进一步地，所述酶切反应使用的限制性内切酶是识别位点为“ACNGT”的FastDigest Taa I。
再进一步地，利用军团菌16S rRNA基因序列中386bp片段，设计两对引物，通过半巢氏PCR和Taa I核酸内切酶酶切分析，将军团菌分型为嗜肺军团菌与非嗜肺军团菌。
一种半巢式聚合酶链反应酶切分型快速检测军团菌的应用，它可用于临床痰液标本的军团菌快速检测与分型，也可用于环境水样本的军团菌快速检测与分型，还可用于临床标本如支气管灌洗液的军团菌快速检测与分型。
与现有技术相比，本发明半巢式聚合酶链反应酶切分型快速检测军团菌方法的有益效果是：
1、本发明第一次PCR反应是被国内外广泛认可和使用的军团菌检测方法，是已被临床和环境样本证明的具有很好特异性的一种检测方法，在此基础上的第二次PCR扩增(半巢式PCR)，增强了反应的敏感性和特异性；
2、本发明通过建立半巢氏PCR反应，大大提高了检测的敏感性；与常规PCR反应相比，该半巢氏PCR反应的敏感性提高约10-100倍，能检测出约10fg的军团菌DNA，大大提高了检测的敏感性和特异性；
3、本发明使用限制性内切酶FastDigest Taa I代替HpyCH4III，酶切反应时间由原来1h缩短为5min；
4、本发明方法可直接用于临床标本的检测，经济实用，解决了军团菌含量较低的临床标本检测的难题。
总之，本发明所描述的半巢式PCR-酶切分型检测军团菌的方法具有简便、快速，敏感性和特异性高，可直接用于临床标本检测，只需PCR仪和65℃水浴箱，4-5小时即可完成等优点。
附图说明
图1：第一次PCR扩增军团菌的16S rRNA 386bp基因片段电泳图。
图2：第二次半巢氏PCR扩增军团菌的226bp基因片段电泳图。
图3：不同类型军团菌各自的酶切分型电泳图；图3a：嗜肺军团菌酶切分型电泳图；图3b：非嗜肺军团菌中的菲氏军团菌、昆氏军团菌等酶切分型电泳图；图3c：其他类型非嗜肺军团菌酶切分型电泳图。
图4：不同类型军团菌的酶切分型电泳图(实例分析)。
图4中，M：100-bp DNA Marker，从上到下依次为600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp；
1，2，3，7，8，10和11：不同菌株酶切结果；
4，戈氏军团菌L.gormanii(ATCC 33342)；
5，橡树岭军团菌L.oakridgensis(ATCC 33761)；
6，长滩军团菌L.longbeachae(ATCC 33462)；
9，嗜肺军团菌L.pneumophila(ATCC33152)；
12，菲氏军团菌L.feeleii(ATCC 35072)。
具体实施方式
本发明半巢式聚合酶链反应酶切分型快速检测军团菌方法是一个完整的整体。利用军团菌16S rRNA基因序列中386bp片段和其中嗜肺军团菌特有的226bp核酸内切酶位点，设计两对引物，通过半巢氏PCR和Taa I核酸内切酶酶切分析，可以将军团菌分型为嗜肺军团菌与非嗜肺军团菌，如图4所示。
本发明半巢式聚合酶链反应酶切分型快速检测军团菌方法，包括如下步骤：
(1)提取待检标本的基因组DNA；
(2)以基因组DNA为模板，Leg 386F和Leg 386R引物(表1)，按表2反应体系及表3反应条件进行第一次PCR扩增，得386bp片段产物，如图1；
表1半巢式PCR引物序列
Figure BSA00000497262000041
表2PCR反应体系
  反应体系组成   体积(微升)
  2×PCR Master Mix   12.5μl
  Leg 386F/226F(10μmol/L)   0.9μl
  Leg 386R/226R(10μmol/L)   0.9μl
  dd H2O   5.7μl
  基因组DNA   5.0μl
  总体积   25μl
注：两次PCR反应体系除引物和模板外均一致。
表3PCR反应条件
Figure BSA00000497262000042
Figure BSA00000497262000051
注：两次PCR反应条件一致。
(3)以386bp扩增片段为模板，Leg 226F和Leg 226R引物，按表2反应体系及表3反应条件，进行第二次半巢式PCR扩增，得226bp片段产物；
(4)对226bp PCR产物作琼脂糖凝胶电泳分析，若电泳条带中出现226bp条带，则认为检测结果呈阳性，如图2。
(5)对阳性结果226bp PCR产物作酶切分型：将226bp扩增产物(若条带清晰、特异，可省去纯化步骤)，用FastDigest Taa I核酸内切酶按表4反应体系及条件作酶切分析，酶切反应产物经琼脂糖凝胶电泳分析，观察酶切分型结果。如图3所示，若被酶切成约为180bp和46bp两个条带，说明被检测标本为嗜肺军团菌(L.pneumophila)阳性，如图3a；若被酶切成约为153bp和73bp两个条带，说明被检测标本为非嗜肺军团菌中的菲氏军团菌(L.feeleii)、昆氏军团菌(L.quinlivanii)、水手军团菌(L.nautarum)和伯明翰军团菌(L.birminghamiensis)等，如图3b；若扩增产物不被酶切仍为226bp条带，说明被检测标本为其他类型非嗜肺军团菌，如图3c。若出现上述条带的合集则说明检出的军团菌中可能同时存在嗜肺军团菌和非嗜肺军团菌。
表4酶切反应体系及反应条件
Figure BSA00000497262000052

Claims (6)

1.一种半巢式聚合酶链反应酶切分型快速检测军团菌，其特征在于：
首先，增加一对引物Leg 226F和Leg 226R；
接着，以386bp扩增片段为模板，进行第二次PCR扩增，得226bp片段产物；
最后，对226bp的PCR扩增产物作琼脂糖凝胶电泳分析，选阳性者用FastDigestTaa I核酸内切酶作酶切分型，观察酶切分型结果。
2.权利要求书1所述的半巢式聚合酶链反应酶切分型快速检测军团菌，其特征在于，所述酶切反应使用的限制性内切酶是识别位点为“ACNGT”的FastDigest Taa I。
3.权利要求书2所述的半巢式聚合酶链反应酶切分型快速检测军团菌，其特征在于，利用军团菌16S rRNA基因序列中386bp片段，设计两对引物，通过半巢氏PCR和Taa I核酸内切酶酶切分析，将军团菌分型为嗜肺军团菌与非嗜肺军团菌。
4.一种如权利要求1至3任一项所述的半巢式聚合酶链反应酶切分型快速检测军团菌的应用，其特征在于，用于临床痰液标本的军团菌快速检测与分型。
5.一种如权利要求1至3任一项所述的半巢式聚合酶链反应酶切分型快速检测军团菌的应用，其特征在于，用于环境水样本的军团菌快速检测与分型。
6.一种如权利要求1至3任一项所述的半巢式聚合酶链反应酶切分型快速检测军团菌的应用，其特征在于，用于支气管灌洗液的军团菌快速检测与分型。 
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