CN102337285A - 一种含HIhh的逆转录病毒载体和病毒颗粒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含HIhh的逆转录病毒载体和病毒颗粒及其应用。所述的含HIhh的逆转录病毒载体是将XhoI与NotI双酶切重组载体pCIG-HIhh-IRES-EGFP获得的含HIhh片段，与XhoI与NotI双酶切逆转录病毒载体pSFG获得的大片段连接，经转化，酶切鉴定，测序制备得到的，所述的含HIhh的逆转录病毒颗粒是通过含HIhh的逆转录病毒载体转染包装细胞系293GPG制备的。本发明还涉及上述逆转录病毒载体和逆转录病毒颗粒在制备治疗骨缺陷药物中的应用。本发明的优点在于为骨组织工程解决早期血管化问题提供了一种新方法，为治疗骨缺陷疾病提供了一种新途径。

Description

一种含HIhh的逆转录病毒载体和病毒颗粒及其应用

技术领域

本发明涉及用于治疗骨缺陷的逆转录病毒载体和病毒颗粒及其应用，具体地说，是一种含HIhh的逆转录病毒载体和病毒颗粒及其应用。

背景技术

目前，骨缺损的治疗是困扰骨科临床的难点，而传统的治疗方法极为困难。骨组织工程作为医学组织工程的重要组成部分，为骨组织的再生与修复提供了突破点，在治疗骨缺陷方面具有很大的发展潜力。种子细胞、细胞载体支架及组织构建的理论和技术路线是骨组织工程程研究的三大要素。近年来的研究证实，骨生成和形态发生的影响因子对组织工程骨的构建起着关键作用，其中，影响骨再生成功与否的决定因素之一是移植物的再血管化。

研究中发现，Indian Hedgehog（Ihh）信号通路不仅参与调节骨的生长发育及骨量平衡，还参与血管形成。Ihh基因对软骨细胞、成骨细胞和破骨细胞均起调节作用，并且对骨组织血管的生成及维持有重要意义。在骨发育方面，Ihh信号通路主要参与促进骨髓间充质干细胞（MSCs细胞）向成骨细胞和软骨细胞分化，阻止其向脂肪细胞分化，例如，Ihh基因参与抑制软骨细胞向肥大的软骨细胞转化。Vortkamp等通过敲除大鼠骺生长板甲状旁腺激素相关肽（Parathyroid Hormone Related peptide，PTHrP）合成基因来研究Ihh基因与PTHrP基因在调节软骨细胞分化方面的关系，发现这两者组成了负反馈调节环。但是Mak等通过进一步研究发现单独的Ihh可以促进软骨肥大而并不依赖于PTHrP，而骨形成蛋白（Bone morphogenetic protein，BMP）和Wnt/β-catenin可能具有参与上调Ihh信号的功能。另外也有研究表明在关节周围Ihh可不依赖PTHrP而刺激软骨细胞早期分化。这就表明Ihh既可以单独作用于软骨分化，又可以协同PTHrP形成负反馈轴机制，从而维持骨的稳定生长。

Ihh促进血管形成的整个过程，包括血管生长、血管成熟。目前，研究的比较透彻的是Shh信号，其在动物缺血模型中可上调血管生长因子如 VEGF 、BMP4、血管形成素等的表达。同时，Ihh信号在血管系统发生过程也有影响，研究证明Ihh缺失会导致血岛无法形成，原始的毛细血管网形成障碍，若Ihh突变也会影响血岛与原始的毛细血管网的正常生长发育。这就表明Ihh在调控血管形成中发挥重要的作用。

鉴于体外培养的骨组织能否适应体内复杂的微环境很大程度上依赖于骨发育中的信号因子的调控，同时影响骨再生成功与否的决定因素之一是移植物的再血管化，因而，诱导种子细胞表达Ihh信号蛋白，并且正确调控Ihh信号就成为了组织工程骨成功构建的重要前提。

目前，逆转录病毒载体因具有运用范围广泛，高效稳定表达外源基因，转染效率高及可携带较大的目的基因等优点，成为基因转导的重要工具。因此，可以构建含有HIhh（Human indian hedgehog）基因的逆转录病毒载体，通过该载体介导HIhh基因转移进人骨细胞，调控Ihh信号通路，为骨组织工程解决早期血管化问题提供了一种新方法，为治疗骨缺陷疾病提供了一种新途径。

专利文献CN 1656223A，公开日2005年8月17日，公开了一种通过基因治疗的骨生成方法，该发明揭示了一种在受低骨量折磨的患者骨缺陷部位形成骨的方法，包括将编码具有骨再生功能蛋白质的基因插入结缔组织细胞，操作性连接于启动子，并将哺乳动物细胞移植入骨缺陷部位，从而使骨缺陷部位形成骨。但是，哺乳动物细胞的移植必将面临移植物的再血管化，如果移植物不能很好地再血管化，则不能和原有骨形成统一的整体，导致骨缺陷治疗的失败。因此，有必要从Ihh信号通路的调控入手，克服影响骨再生成功的关键难点。目前，关于通过逆转录病毒载体调控Ihh的表达来治疗骨缺陷疾病还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种含HIhh的重组载体。

本发明的第二个目的是，提供一种含HIhh的逆转录病毒载体。

本发明的第三个目的是，提供一种含HIhh的逆转录病毒颗粒。

本发明的第四个目的是，提供一种含HIhh的逆转录病毒载体的用途。

本发明的第五个目的是，提供一种含HIhh的逆转录病毒颗粒的用途。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

含HIhh的重组载体，它是由以下方法构建的：HindIII与EcoRⅤ酶切质粒pIND-HIhh-flag-two回收HIhh-flag-two片段，所述HIhh-flag-two片段的粘性末端用Klenow酶补平并用碱性磷酸酶脱磷酸化，EcoRⅤ酶切质粒pCIG-IRES-EGFP回收大片段，并与HIhh-flag-two片段连接，转化，酶切鉴定，获得正确连接的质粒pCIG-HIhh-IRES-EGFP。

所述的碱性磷酸酶是CLAP酶。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

含HIhh的逆转录病毒载体，它是由以下方法构建的：将XhoI与NotI双酶切重组载体pCIG-HIhh-IRES-EGFP获得的含HIhh片段，与XhoI与NotI双酶切逆转录病毒载体pSFG获得的大片段连接，经转化，酶切鉴定，测序，获得含HIhh的逆转录病毒载体pSFG-HIhh-IRES-EGFP。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：

含HIhh的逆转录病毒颗粒，它是由含HIhh的逆转录病毒载体转染包装细胞系得到的。

所述的包装细胞系是293GPG。

为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：

含HIhh的逆转录病毒载体在制备治疗骨缺陷药物中的应用。

所述的骨缺陷为骨折、断裂和/或骨的退变。

为实现上述第五个目的，本发明采取的技术方案是：

含HIhh的逆转录病毒颗粒在制备治疗骨缺陷药物中的应用。

所述的骨缺陷为骨折、断裂和/或骨的退变。

本发明优点在于：

1、本发明的含HIhh的逆转录病毒载体将有助于研究Ihh信号通路与骨发育的分子作用机制，为骨组织工程解决早期血管化问题提供了一种新方法，为治疗骨缺陷疾病提供了一种新途径。

2、本发明所使用的逆转录病毒载体pSFG为自体去活载体，即该病毒基因组整合到细胞基因组后，不会产生新的子代病毒，也降低了对周围基因的意外激活，因此在用于骨疾病治疗方面，具有较强的安全性。

3、本发明采用的标记基因为增强型绿色荧光蛋白基因（EGFP）。EGFP因其不用加任何底物，荧光性质稳定，分子量小，对细胞无毒性，使用方便，可进行活细胞实时定位观察等优点在基因治疗、基因转导等方面已得到广泛应用，是一种很有价值的报告基因。因此，借助标记基因EGFP，可在体内和/或体外对已导入载体的靶细胞进行示踪、富集，更便于对Ihh信号通路与骨发育的分子作用机制的研究。

附图说明

附图1是载体pCIG-IRES-EGFP的物理图谱。

附图2是逆转录病毒载体pSFG的物理图谱。

附图3是质粒载体pIND-HIhh-flag-two的物理图谱。

附图4是含HIhh的重组载体pCIG-HIhh-IRES-EGFP的构建示意图。

附图5是阳性克隆pCIG -HIhh-IRES-EGFP的酶切验证图谱。

附图6是阳性克隆pCIG -HIhh-IRES-EGFP的测序图。

附图7是含HIhh的逆转录病毒载体pSFG-HIhh-IRES-EGFP的构建示意图。

附图8是阳性克隆pSFG-HIhh-IRES-EGFP的酶切验证图谱。

附图9是293GPG细胞培养5天后的形态图（400×）。

附图10是pSFG-HIhh-IRES-EGFP转染293GPG细胞图（48h，100×）。

附图11是稳定转染的293GPG细胞图。

附图12是病毒感染C3H10T1/2细胞图。

附图13是Western blot检测Ihh蛋白的表达图。

附图14是HIhh诱导C3H10T1/2细胞骨活性及血管形成的检测图。

附图15是碱性磷酸酶（ALP）染色检测图（40×）。

附图16是茜素红（Alizarin red）染色检测图（40×）。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

以下实施例使用的实验材料如下：

1 菌株、细胞和质粒载体

大肠杆菌DH5α购于上海生工生物有限公司。

病毒包装细胞系293GPG按照参考文献：Daniel S. Ory, Beverly A. Neugeboren, and Richard C. Mulligan. A stable human-derived packaging cell line for production of high titer retrovirus/vesicular stomatitis virus G pseudotypes [J]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996，93: 11400-11406制备。

质粒载体pCIG购于ATCC公司，载体pCIG-IRES-EGFP（物理图谱如图1所示）按照参考文献：Sean G. Megason and Andrew P. McMahon. A mitogen gradient of dorsal midline Wnts organizes growth in the CNS [J]. Development, 2002, 129: 2087-2098制备。

逆转录病毒载体MFG购于ATCC公司，逆转录病毒载体pSFG（物理图谱如图2所示）按照参考文献：Daniel S. Ory, Beverly A. Neugeboren, and Richard C. Mulligan. A stable human-derived packaging cell line for production of high titer retrovirus/vesicular stomatitis virus G pseudotypes [J]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996，93: 11400-11406制备。

质粒载体pIND购于Invitrogen公司，质粒载体pIND-HIhh-flag-two（物理图谱如图3所示）由载体pIND构建得到，HIhh-flag-two片段的碱基序列如SEQ ID NO.1，该片段中包含1-flag片段 （SEQ ID NO.2）和2-flag片段（SEQ ID NO.3）。

C3H10T1/2细胞购于Promega公司。

2、主要试剂和培养基

LB培养基、氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）购于上海生工生物有限公司；琼脂糖凝胶/PCR产物回收试剂盒、质粒小量DNA抽提试剂盒购于Biomiga公司；质粒大量DNA抽提试剂盒、PCR扩增试剂盒购于天根生化科技有限公司；限制性内切酶购于TaKaRa公司；T4 DNA连接酶购于英国New England Biolabs公司；琼脂糖购于Promega公司；溴化乙锭购于Sigma公司；0.05%胰蛋白酶、磷酸盐缓冲液（PBS）购于美国Hyclone公司；乙醇（分析纯）购于上海凌峰化学试剂有限公司；二甲亚砜DMSO、聚凝胺试剂（Polybrene试剂）购于美国Sigma公司；FuGENE® HD Transfection Reagent购于Roche公司；一抗flag的单克隆抗体购于Stratagen公司；二抗HRP标记的鼠抗羊IgG购于Sigma公司。

293GPG细胞培养基：

IFS（Hyclone）	10%（V/V）
		MEM丙酮酸钠（Gibco）	100×
L-谷氨酰胺（Hyclone）	2mM
		双抗（青霉素与链霉素）	50u/ml
四环素（Sigma）	1ug/ml
		嘌呤霉素（Sigma）	2ug/ml
G418（Sigma）	0.3mg/ml
		DMEM（Gibco）	定容

3、仪器设备

超净台工作台、CO₂细菌培养箱、恒温水浴锅、4℃、-20℃冰箱、压力蒸汽灭菌锅（上海博迅有限公司医疗设备厂）；微量移液器、离心机（Eppendorf，德国）；1.0ml、1.5ml、2ml、5ml离心管（Axygene，美国）；15ml离心管（BD公司，美国）；细菌平板（上海威奥生物有限公司）；培养摇床（上海智城分析仪器制造有限公司）；震荡仪（科尔帕默仪器公司）；制冰机（SANYO，日本）；冷冻离心机、-80℃超低温冰箱（Thermo Forma，美国）；电子小天平、高精度电子天平（上海力衡仪器仪表有限公司）；双蒸水器（Millipore，美国）；凝胶成像分析系统（BioRad，美国）；超微量分光光度计（NanoDrop科技有限责任公司）；细胞培养板（BD公司，美国）；细胞培养箱（Thermo Forma，美国）；光学倒置显微镜、荧光显微镜（OLYMPUS，日本）。

实施例 1

含 HIhh 的逆转录病毒载体 pSFG-HIhh-IRES-EGFP 的构建

1 含HIhh的重组载体pCIG-HIhh-IRES-EGFP的构建

构建过程如图4所示，其中，图中红色箭头为选用的酶切位点，左上角质粒载体为pCIG-IRES-EGFP，右上角为质粒pIND-HIhh-flag-two，下方为新克隆质粒pCIG-HIhh-IRES-EGFP：先将质粒pIND-HIhh-flag-two、pCIG-IRES-EGFP、pSFG经转化扩增，抽提出质粒DNA，然后用限制性内切酶HindIII与EcoRⅤ（平端酶）酶切质粒pIND-HIhh-flag-two，1%的琼脂糖凝胶电泳，回收约1.3kb的目的基因HIhh-flag-two，回收的HIhh-flag-two片段的粘性末端经Klenow酶补平及CLAP酶脱磷酸化反应，用EcoRⅤ（平端酶）酶切质粒pCIG-IRES-EGFP，使其线性化并纯化回收大片段。T4 DNA Ligase酶在22℃连接过夜，转化DH5a大肠杆菌，挑取20个单克隆进行二次酶切电泳鉴定：先使用XhoI与NotI酶切鉴定，结果如图5A所示，表明4、5、7、9-11、15-20均为连接了Ihh基因片段的克隆；再使用EcoRI酶切4、5、7、9-11、15-20鉴定，筛选出连接方向正确的目的基因的克隆，结果如图5B所示，表明5、7、9、11、15、17-19均为Ihh连接方向正确的克隆。需要说明的是，图5中M代表Mark DL15000；N代表未加模板的阴性对照；Mock代表载体pCIG-IRES-EGFP的阳性对照；1-20代表载体pCIG-IRES-EGFP与目的基因HIhh连接后的克隆。将5号阳性克隆送由大连宝生物工程有限公司测序鉴定，其测序峰图如图6所示，其中，图6（A）为上游引物（HIhh-F）测序图谱，图6（B）为下游引物（HIhh-R）测序图谱，图6（C）为HIhh基因测序序列结果。将其序列与SEQ ID NO.1比对，结果完全一致，证明该质粒是连接了正向HIhh的载体，将其转化进大肠杆菌DH5α，摇菌，抽提质粒pCIG-HIhh-IRES-EGFP，保种。

2 含HIhh的逆转录病毒载体pSFG-HIhh-IRES-EGFP的构建

构建过程如图7所示，其中，图中红色箭头为实验中所选用的酶切位点，左上角质粒载体为pSFG，右上角为质粒pCIG-HIhh-IRES-EGFP，下方为新克隆质粒pSFG-HIhh-IRES-EGFP：取步骤1新克隆的质粒pCIG-HIhh-IRES-EGFP及逆转录病毒载体pSFG，用XhoI与NotI双酶切，纯化后同步骤1的克隆步骤，T4 DNA Ligase酶在16℃连接过夜，转化，XhoI与NotI酶切电泳筛选阳性克隆，结果如图8所示，图中M代表Mark DL15000，N代表未加模板的阴性对照；Mock代表载体pSFG的阳性对照；1-9代表载体pSFG与目的基因Hihh-IRES-EGFP连接后的克隆。结果表明1-9均为连接正确的pSFG-HIhh-IRES-EGFP载体。将3号阳性克隆送由大连宝生物工程有限公司测序鉴定，其中，测序引物序列为：上游引物 5’-gccgccaccatgtctcccgcccggctccgg-3’（SEQ ID NO.4），下游引物5’- gtccggggcagggagctga-3’（SEQ ID NO.5）。摇菌、抽提质粒、保种，获得新克隆载体pSFG-HIhh-IRES-EGFP。

实施例 2

含 HIhh 的逆转录病毒载体 pSFG-HIhh-IRES-EGFP 的包装和转导

1 载体pSFG-HIhh-IRES-EGFP转染包装细胞系293GPG细胞

首先按293GPG细胞培养要求配置培养基，复苏、传代、冻存293GPG细胞。在倒置显微镜下观察，结果如图9所示，表明293GPG细胞贴壁生长良好，呈现不规则的多角形胞浆透亮，胞核隐约可见。转染前，用35mm的细胞培养板进行细胞培养，待细胞生长汇合至85%，按4µl:2µg（转染试剂体积:质粒质量）的比率实施转染步骤，按转染试剂要求进行：取出2µg实施例1-2中的3号质粒pSFG-HIhh-IRES-EGFP，用无血清培养基稀释到100µl，即为A液；FµGENE® HD Transfection Reagent在室温混匀后分别取4µl、5µl、6µl，再用无血清培养基稀释到100µl，即为B液；将A、B液混合，混匀，即为C液，室温孵育25min；弃去细胞培养板中的上清，逐滴加入C液，再加入1.8ml无血清培养基/孔。孵育24h后换成无抗生素的培养基，48h后在共聚焦显微镜下观察转染效率（如图10）。收集孵育48h、72h、96h后的病毒上清，2000rpm离心5min，待细胞及碎片沉淀后，小心吸出上清分装，于-80℃保存备用。

瞬时转染后，可挑出稳定转染的293GPG细胞（如图11），扩增培养后收集病毒上清，以提高病毒滴度。

2 含HIhh的逆转录病毒感染C3H10T1/2细胞

取出步骤1收集的病毒上清，加入Polybrene试剂，终浓度为8mg/L，感染C3H10T1/2细胞, 培养48h后，在共聚焦显微镜下观察绿色荧光强度及感染效率，如图12所示，A图为暗场图，B图为明场图，红色箭头为未感染病毒的C3H10T1/2细胞，而感染病毒的C3H10T1/2细胞均带有绿色荧光标记。

实施例 3

含 HIhh 的逆转录病毒载体 pSFG-HIhh-IRES-EGFP 促进骨形成和血管生成的验证

1 Western blot检测HIhh蛋白的表达

在利用含HIhh的逆转录病毒感染C3H10T1/2细胞的同时，通过Western blot检测HIhh蛋白的表达，其中，根据pSFG-HIhh-IRES-EGFP质粒所携带的flag标记，使用抗flag抗体检测感染HIhh病毒的C3H10T1/2细胞，以flag的表达代表HIhh蛋白的表达。结果如图13所示，表明HIhh表达增强。

2 RT-PCR检测转录因子的表达

RT-PCR检测转录因子Gli2及Gli3、VEGF、BMP2、ColⅡ、ColX、Ihh受体Ptc1的表达，同时检测到骨标记骨钙素（Osteocalin，Oc）的表达及血管内皮生长因子受体1（Flk-1）。RT-PCR的引物如表1所示：

表1

结果见图14，从图中可以看出ColⅡ、BMP2、Oc、Ptc1、ColX和Flk-1的表达均有所上调或下调，说明Ihh可调节骨细胞发育和血管的生成。

3 ALP染色检测碱性磷酸酶的表达

ALP染色检测碱性磷酸酶的表达，结果如图15所示，其中，Cont代表对照组（未加病毒上清），Ihh代表加病毒上清的培养物（×40），表明骨细胞的形成十分活跃。

4 茜素红染色检测钙结节的形成

茜素红染色检测钙结节，结果如图16所示，其中，A图为对照（未加Ihh病毒感染组），B图为实验组（加病毒感染组，感染细胞为C3H10T1/2细胞），从图中可以看出，B图中可见红色钙结节，说明含HIhh的逆转录病毒载体pSFG-HIhh-IRES-EGFP的导入可促进骨的生成。

综上所述，通过Ihh重组逆转录病毒感染C3H10T1/2细胞，对Ihh诱导C3H10T1/2细胞进行成骨活性及血管生成的检测，证实Ihh信号通路可调节骨细胞发育，也可调节血管形成，含HIhh的逆转录病毒载体pSFG-HIhh-IRES-EGFP的导入和Ihh基因在治疗骨疾病方面具有一定的作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海交通大学医学院附属仁济医院

<120> 一种含HIhh的逆转录病毒载体和病毒颗粒及其应用

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<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1290

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgtctcccg cccggctccg gccccgactg cacttctgcc tggtcctgtt gctgctgctg 60

gtggtgccgg cggcatgggg ctgcgggccg ggtcgggtgg tgggcgatta caaggatgac 120

gacgataaga tcgatgatta caaggatgac gacgataaga gccgccggcg accgccacgc 180

aaactcgtgc cgctcgccta caagcagttc agccccaatg tgcccgagaa gaccctgggc 240

gccagcggac gctatgaagg caagatcgct cgcagctccg agcgcttcaa ggagctcacc 300

cccaattaca atccagacat catcttcaag gacgaggaga acacaggcgc cgaccgcctc 360

atgacccagc gctgcaagga ccgcctgaac tcgctggcta tctcggtgat gaaccagtgg 420

cccggtgtga agctgcgggt gaccgagggc tgggacgagg acggccacca ctcagaggag 480

tccctgcatt atgagggccg cgcggtggac atcaccacat cagaccgcga ccgcaataag 540

tatggactgc tggcgcgctt ggcagtggag gccggctttg actgggtgta ttacgagtca 600

aaggcccacg tgcattgctc cgtcaagtcc gagcactcgg ccgcagccaa gacgggcggc 660

tgcttccctg ccggagccca ggtacgcctg gagagtgggg cgcgtgtggc cttgtcagcc 720

gtgaggccgg gagaccgtgt gttggccatg ggggaggatg ggagccccac cttcagcgat 780

gtgctcattt tactggaccg cgagccccac aggctgagag ccttccaggt catcgagact 840

caggaccccc cacgccgcct ggcactcaca cccgctcact tgctctttac ggctgacaat 900

cacacggagc cggcagcccg cttccgggcc acatttgcca gccacgtgca gcctggccag 960

tacgtgctgg tggctggggc gccaggcctg cagcctgccc gcgtggcagc tgtctctaca 1020

cacgtggccc tcggggccta cgccccgctc acaaagcatg ggacactggt ggtggaggat 1080

gtggtggcat cctgcttcgc ggccgtggct gaccaccacc tggctcagtt ggccttctgg 1140

cccctgagac tctttcacag cttggcatgg ggcagctgga ccccggggga gggtgtgcat 1200

tggtaccccc agctgctcta ccgcctgggg cgtctcctgc tagaagaggg cagcttccac 1260

ccactgggca tgtccggggc agggagctga 1290

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gattacaagg atgacgacga taag 24

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gccgccacca tgtctcccgc ccggctccgg 30

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catggtatcc ctagctcctc 20

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gatggcatca aagtcaatct 20

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catgaacagc cctttaagac 20

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tgatatgtga ggtagcacca 20

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ctgaaactct gccaccc 17

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ttgctcttgc tgctcc 16

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cgggaacaga tacaggaagc 20

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gctgtttgtg tttggcttga 20

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ctggtggaca tcttccagga g 21

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ctcatctctc ctatgtgctg g 21

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gacaaagcct tcatgtccaa gc 22

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aaagccgagc tgccagagtt tg 22

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aggtggttca tcaaagtgtc 20

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cataggcaag catcagtagg 20

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tctgtggttc tgcgtggaga 20

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gtatcatttc caaccaccct 20

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gagtaaaggg attccagtaa gag 23

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gagagccata tcctgtttcc 20

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gctgtccctg tatgcctct 19

<210> 25

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

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Claims (8)

1.一种含HIhh的重组载体，其特征在于，它是由以下方法构建的：HindIII与EcoRⅤ酶切质粒pIND-HIhh-flag-two回收HIhh-flag-two片段，所述HIhh-flag-two片段的粘性末端用Klenow酶补平并用碱性磷酸酶脱磷酸化，EcoRⅤ酶切质粒pCIG-IRES-EGFP回收大片段，并与HIhh-flag-two片段连接，转化，酶切鉴定，获得正确连接的质粒pCIG-HIhh-IRES-EGFP。

2.根据权利要求1所述的含HIhh的重组载体，其特征在于，所述的碱性磷酸酶是CLAP酶。

3.一种含HIhh的逆转录病毒载体，其特征在于，它是由以下方法构建的：将XhoI与NotI双酶切权利要求1所述的重组载体pCIG-HIhh-IRES-EGFP获得的含HIhh片段，与XhoI与NotI双酶切逆转录病毒载体pSFG获得的大片段连接，经转化，酶切鉴定，测序，获得含HIhh的逆转录病毒载体pSFG-HIhh-IRES-EGFP。

4.一种含HIhh的逆转录病毒颗粒，其特征在于，它是由如权利要求3所述的逆转录病毒载体转染包装细胞系得到的。

5.根据权利要求4所述的逆转录病毒颗粒，其特征在于，所述的包装细胞系是293GPG。

6.根据权利要求3所述的逆转录病毒载体在制备治疗骨缺陷药物中的应用。

7.根据权利要求4所述的逆转录病毒颗粒在制备治疗骨缺陷药物中的应用。

8.根据权利6或7所述的应用，其特征在于，所述的骨缺陷为骨折、断裂和/或骨的退变。

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