CN102336824A - 与植物种子大小相关的蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与植物种子大小相关的蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，是如下1)或2)的蛋白质：1)由序列表中的序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；2)将序列表中的序列2氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物种子粒型或种子长或种子宽或种子重相关由1)衍生的蛋白质。本发明的实验证明，将来OsFBK12导入水稻中获得过表达水稻；过表达水稻的种子粒长、种子粒宽、种子的百粒重均大于所述目的植物。证实转OsFBK12基因可以控制水稻粒型和粒重的变化，为将来育种提供基础。

Description

与植物种子大小相关的蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种与植物种子大小相关的蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

水稻的粒型和粒重是水稻品质和产量的主要决定因素。最初发现的矮秆突变体d1(dwarf 1)的种子相对野生型显著变小，其千粒重约是野生型的40％。利用图位克隆方法(map-based cloning strategy)和序列测定，发现D1编码G蛋白α亚基，其突变体表型是因该基因有833碱基缺失而造成的隐性突变。表明G蛋白α亚基调控了种子的外形，特别是种子长短的变化。近年来又成功克隆到一个位于水稻第3号染色体着丝粒附近、控制米粒长度/粒重的主效QTL，来源于明恢63中该基因的等位基因在川7的背景下会导致粒长增加1.80mm-3.87mm，千粒重增加1.50g-15.6g。利用川7和明恢63构建的近等基因系，将该QTL/基因(GS3)精细定在7.9kb的物理区间内。对GW2的研究表明，GW2作为一个新的E3泛素连接酶可能参与降解促进细胞分裂的蛋白，从而调控水稻颖壳大小、控制粒重以及产量，在突变体gw2中谷壳的宽度、粒重以及产量都得到了增加。2008年又克隆了一个编码细胞壁蔗糖酶的水稻种子灌浆相关基因GIF1，突变体在形态和结实率上表现正常，但灌浆程度比野生型低、籽粒淀粉粒排列松散、垩白度高，最终的粒重比野生型低24％、直链淀粉和支链淀粉含量也明显比野生型低。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种与植株种子粒型和/或粒重相关的蛋白及其编码基因。

本发明提供的蛋白质，名称为OsFBK12，来源于水稻(Oryza sativa L.cv Zhonghua10)，是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中的序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

2)将序列表中的序列2氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物种子粒型或种子长或种子宽或种子重相关由1)衍生的蛋白质。

上述序列表中的序列2由431个氨基酸残基组成。所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

所述蛋白(OsFBK12)的编码基因也属于本发明的保护范围。

所述蛋白(OsFBK12)的编码基因为如下1)-5)中任一所述的DNA分子：

1)序列表中序列1自5’末端第197-1492位核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表中序列1自5’末端第148-1589位核苷酸所示的DNA分子；

3)序列表中序列1所示的DNA分子；

4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且与植物种子粒型或种子长或种子宽或种子重相关的DNA分子；

5)与1)或2)或3)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且与植物种子粒型或种子长或种子宽或种子重相关的DNA分子。

上述序列表中的序列1由1899个核苷酸组成，其CDS区为自5’末端第197-1492位核苷酸。

所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

含有所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒也是本发明保护的范围。

所述重组载体的启动子为玉米泛素启动子UbiPro。

所述重组载体通过如下步骤获得：

1)将用PstI和BamHI酶切质粒KSP9得到的大小约为2.0kb的小片段插入pUC19的PstI和BamH I识别位点间获得中间载体pUC19+UbiPro；再用SacI和EcoRI酶切pBI221得到的小片段插入中间载体pUC19+UbiPro的SacI和EcoRI识别位点间，获得中间载体pUC19+UbiPro+Noster；再用EcoRI部分酶切和HindIII完全酶切中间载体pUC19+UbiPro+Noster得到的大小约为2.3kb的片段插入pCAMBIA1301的EcoR I和HindIII识别位点间，构成中间载体pUN1301；

2)将OsFBK12蛋白的编码基因插入中间载体pUN1301的KpnI和BamHI识别位点间，获得重组载体。

扩增所述编码基因全长或任一片段的引物对；所述引物对如下所示：一条引物序列如序列表中序列3所示，另一条引物序列如序列表中序列4所示。

本发明的另一个目的是提供一种培育种子粒型改良的转基因植物的方法，是将所述的编码基因导入目的植物得到种子粒型改良的转基因植物。

所述粒型改良为如下1)-3)中的至少一种：

1)所述转基因植物的种子粒长大于所述目的植物；

2)所述转基因植物的种子粒宽大于所述目的植物；

3)所述转基因植物的种子的粒重大于所述目的植物。

所述粒重为百粒重。

所述编码基因是通过所述重组载体导入所述目的植物中。

所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物，所述单子叶植物优选为水稻，所述水稻的品种尤其优选为中花10号。

本发明的实验证明，将粳稻中花10号中克隆到的基因OsFBK12导入水稻中花十号获得过过量表达OsFBK12基因的水稻，同样将基因OsFBK12的正义、反义片段导入水稻中花十号获得转正义、反义OsFBK12水稻，发现过量表达OsFBK12基因的水稻和转正义、反义OsFBK12水稻在种子粒型和粒重上发生明显的改变；过表达水稻的种子粒长、种子粒宽、种子的百粒重均大于所述目的植物。证实OsFBK12基因可以控制水稻粒型和粒重的变化，为将来育种提供基础。

附图说明

图1RT-PCR方法扩增OsFBK12的全长cDNA

图2RT-PCR方法扩增OsFBK12的用于RNAi构建的部分cDNA

图3超表达载体的物理图谱

图4RNAi载体构建部分示意图

图5转基因水稻的荧光实时定量PCR鉴定

图6转基因水稻的表型观察

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、转OsFBK12水稻的获得

1、OsFBK12的克隆

根据数据库分析的结果设计引物，5′端引物；5′-CGG GAT CCT CAG AAG AGC AGG AGGAA-3′(下划线序列为BamHI位点；序列3)，3′端引物：5′-GGG GTA CCG CTA CGG AGCATC AGG A-3′(下划线序列为KpnI位点；序列4)，提取水稻中花十号三叶期幼苗总RNA为模板，采用RT-PCR方法扩增到1296bp片段。具体操作过程如下：

1)植物总RNA的提取：选取三叶期水稻中花十号(Oryza sativa L.cv Zhonghua10)(李梅芳，水稻花培品种-中花10号，农业科技通讯，1998年第1期第26页。公众可从中国科学院植物研究所获得。)的幼苗100mg为材料，在液氮中研磨，将液氮中研碎的冻干粉转入到含1mlTrizol试剂(Invitrogen)的1.5ml离心管中，充分混匀；25℃放置5分钟；每管中加入0.2ml新鲜氯仿，剧烈振摇15秒，25℃温育2-3分钟；12,000rpm，4℃，离心15分钟；把上清的水相0.5ml转移到一个新的1.5ml离心管中，加0.5ml异丙醇，室温放置10分钟使RNA沉淀；12,000rpm，4℃，离心10分钟；去上清，将RNA沉淀用1ml 75％乙醇清洗2次，超净台吹至半干；用50μlDEPC-ddH₂O重悬沉淀，60℃水浴10分钟，以溶解RNA沉淀。将此RNA溶液分装后-70℃保存，备做反转录的模板。

2)RT-PCR：取1μl上述RNA溶液，用DEPC-ddH₂O稀释100倍，利用600nm光吸收在分光光度计测定RNA浓度。参照RT-PCR试剂盒(Promega)说明书，根据RNA的定量结果，取2μg上述RNA溶液，加1.0μg Oligo dT引物，用DEPC-ddH₂O补充至15μl，混匀后70℃变性5分钟，冰浴5分钟。短暂离心后，加入25μl反转录混合物(5μl M-MLV5×Reaction Buffer，6μl dNTP Mixture(2.5mM)，1μl M-MLV Reverse Transcriptase，0.5μl RNase Inhibitor，12.5μl DEPC-ddH₂O)。混匀后，42℃水浴1小时完成反转录过程；75℃水浴10分钟使反转录酶失活，得到含有第一链cDNA的混合物。

取1μl上述第一链cDNA作为PCR的模板，按以下体系进行进行PCR反应：0.2μlLA Taq(5U/μl)、10μl 2×GC buffer，1.8μl dNTPs，0.5μl 5′端引物(10μM，序列3)，0.5μl 3′端引物(10μM，序列4)，加ddH₂O终体积20μl。引物序列如前，PCR程序为：94℃预变性3分钟后进入PCR循环，循环参数为94℃30秒变性→58℃30秒复性→72℃1分钟延伸，30个循环后在72℃继续合成10分钟。

扩增的PCR产物经过0.8％的琼脂糖凝胶电泳分离，结果如图1所示，从图中可以看出，得到分子量大约1.3kb的条带，用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(AxygenBiosciences)回收该片断得到20μl回收产物。进行测序分析，结果为该PCR产物具有序列表中序列1的自5’末端第148-1589位核苷酸序列，序列1的CDS区为序列1自5’末端的第197-1492位核苷酸。该PCR产物的基因命名为OsFBK12，OsFBK12编码的蛋白命名为OsFBK12，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。

2、表达载体pUN-FBK12的获得

1)：含有OsFBK12的cDNA序列的载体pTE-FBK12

取3.5μl上述PCR产物的回收产物，加入1μl(3U/μl)T4-DNA连接酶、5μl 2×连接酶缓冲液、0.5μl(50mg/ml)pGEM-T Easy载体(Promega)4℃连接过夜，得到连接产物，用连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经含羧苄青霉素的抗性平板筛选得到含有重组质粒大肠杆菌菌株。采用碱裂解法从该菌株中分离提取重组质粒，选用pGEM-T Easy载体上的T7和SP6启动子序列为引物测序，测序结果为该重组质粒为将序列1的自5‘末端的第148-1589位核苷酸插入pGEM-T Easy载体得到，将该重组质粒命名为pTE-OsFBK12。

2)、OsFBK12超表达载体的构建

第一步：剪取约0.2g玉米幼苗，置于液氮中研磨；然后加入800μL新配制的提取缓冲液(含0.1M Tris-HCl pH8.0，50mM EDTA，0.5M NaCl，1％SDS和1％β-巯基乙醇)，剧烈振荡使其全部悬浮；65℃水浴30分钟，每5分钟颠倒混匀一次；然后加入250μL预冷的5M乙酸钾，立即颠倒混匀，冰浴5分钟；加入等量酚/氯仿，抽提一次，12000rpm离心5分钟；收集上清，加入0.6倍体积的异丙醇沉淀DNA，室温放置40分钟；4℃12000rpm离心15分钟，弃上清；沉淀用70％、100％乙醇各洗一次；干燥后，溶于20μL含100μg/mL RNaseA的ddH₂O中，得到玉米基因组DNA。

第二步：取上述玉米基因组DNA溶液2μL作为模板，在带有HindIII识别位点的5′引物(GGAAGCTTCTGCAGTGCAGCGTGACCCGG)和带有BamHI识别位点的3′引物(CGGGATCCAAGTAACACCAAACAACAGGG)为引物，进行PCR扩增，PCR反应条件为：先94℃3分钟；再94℃45秒，62℃45秒，72℃2分钟，共35个循环，最后72℃10分钟。反应结束后，对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，表明得到长度为1.98kb的扩增片段，与预期结果相符，回收该PCR产物，再用限制性内切酶Hind III和BamHI双酶切后回收，得到片段经测序，该PCR产物具有序列表中序列5自5’末端的第1-1986位核苷酸，为带有粘性末端的玉米泛素启动子(UbiPro)。(玉米泛素启动子(UbiPro)也可以人工合成获得。)

第三步：用限制性内切酶Sac I和EcoR I将Noster poly A终止序列从质粒载体pBI 121(北京拜尔迪生物技术有限公司产品货号：MP-091)上切下，插入到载体pUC19(北京百泰克生物技术有限公司目录号：DP7801)的Sac I和EcoR I识别位点间，得到重组载体，命名为pUC19-Noster。再用限制性内切酶HindIII和BamHI双酶切pUC19-Noster，琼脂糖凝胶电泳检测后，回收线性化的载体大片段，并将该回收片段与第二步中获得的带有粘性末端的玉米泛素启动子(UbiPro)相连，得到重组载体，命名为pUN19。

第四步：用限制性内切酶EcoRI部分酶切和HindIII完全酶切从第三步购建的重组载体pUN19切下包含UbiPro和Noster的长度约为2.3kb的片段，将该片段克隆入质粒载体pCAMBIA1301(Center for the Application of Molecular Biology toInternational Agriclture，www.cambia.org)的EcoRI和HindIII位点处，得到重组载体，命名为pUN1301。

3)：表达载体pUN-FBK12的获得

用限制性内切酶KpnI和BamHI对B步骤获得的质粒pUN1301进行双酶切，酶切体系为：质粒10μl、10x酶切缓冲液5μl、KpnI 1μl(10U/μl)、BamHI 0.8μl(10U/μl)，加ddH₂O补充反应体系至50μl，37℃酶切4小时。用琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分离，用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(Axygen Biosciences)回收线性化的pUN1301大片段，溶于20μl ddH₂O中。

先用KpnI  酶对上述获得pTE-OsFBK12进行部分酶切，酶切体系为：质粒10μl，酶切缓冲液5μl、KpnI 1μl(10U/μl)、加ddH₂O补充反应体系至50μl，37℃酶切4个小时；再加入BamHI 0.2μl(10U/μl)，37℃酶切20分钟。用琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分离，用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收1300bp的OsFBK12 cDNA片段。

将10μl上述回收的1300bp的OsFBK12cDNA溶液、6μl回收的载体pUN1301大片段溶液，与2μl(3U/μl)T4DNA连接酶和2μl 10x连接酶缓冲液混和，16℃连接16小时，得到的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经含卡那霉素的抗性平板筛选得到阳性克隆。提取阳性克隆中的质粒进行测序鉴定，结果为该质粒为将序列表序列1的自5’末端第148-1589位核苷酸插入到载体pUN1301的KpnI和BamHI的识别位点间得到的，且启动子玉米泛素启动子(UbiPro)、基因和终止子的结构正确，将该质粒命名为pUN-FBK12，构建成功植物表达载体，该表达载体的物理图谱示意图如图3所示。

3、含有OsFBK12正、反义片段的RNAi载体pTCK-FBK12的获得

正反义片段的获得：设计分别含有酶切点的上游引物FBK12F(5′-GG GGT ACC ACT AGT AGT ATG ACA AGC AAA ACA-3，下划线序列为KpnI-SpeI位点)以及含有酶切点的下游引物FBK12R(5′-CG GGA TCC GAG CTC TCA GGA CTG AAG CAA TT-3，下划线序列为BamHI-SacI位点)，提取水稻中花十号(Oryza sativa L.cv Zhonghua 10)的幼苗的RNA反转录获得的第一链cDNA作为PCR的模板，按以下体系进行PCR反应：0.2μl LA Taq，10μl 2×GC buffer，1.8μl dNTP，0.5μl上游引物FBK12F(10μM)，0.5μl下游引物FBK12R(10μM)，加ddH₂O终体积20μl。PCR程序为：94℃预变性3分钟，进入PCR循环，循环参数为94℃30秒变性→58℃30秒复性→72℃1分钟延伸，30个循环后在72℃继续合成10分钟。用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分离，得到376bpPCR产物(图2)，经过测序，该PCR产物具有序列表中序列1自5’末端的第1242-1578位核苷酸。取10μl上述PCR产物通过SpeI/SacI双酶切，获得长度为354bp的正义OsFBK12片段；另取10μl上述PCR产物通过BamH1/KpnI双酶切，获得长度为366bp的反义的OsFBK12片段，将获得的正、反义片段与RNAi载体的连接。

具体方法如下：

以下关于质粒的提取、连接、对大肠杆菌的转化以及阳性克隆的筛选均参照实验2中相应的方法。

RNAi载体的获得：用SpeI/SacI酶切载体质粒pTCK303(A Practical Vector forEfficient Knockdown of Gene Expression in Rice.Wang et al.，2004，Plant MolBiol Rep 22：409-417，公众可从中国科学院植物研究所获得。)，用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收pTCK303载体片段。将上述获得的正义的OsFBK12片段与上述回收的pTCK303载体片段连接，将连接产物转化大肠杆菌得到转化子，将转化子提取的质粒经SpeI/SacI双酶切，获得长度为354bp片段的质粒为含有OsFBK12正义片段的阳性质粒，命名为pTCK303-正义FBK12。将pTCK303-正义FBK12，再经BamHI/KpnI双酶切，将回收片段与上述获得的反义的OsFBK12片段连接，将连接产物转化大肠杆菌得到转化子。提取转化子的质粒为模板，用上游引物FBK12F1(5′-ATG ACA AGC AAA ACA-3′)以及下游引物FBK12R1(5′-TCA GGA CTG AAG CAA TT-3′)为模板，按以下体系进行PCR反应：0.2μl LA Taq，10μl 2×GC buffer，1.8μl dNTP，0.5μl上游引物FBK12F1(10μM)，0.5μl下游引物FBK12R1(10μM)，加ddH₂O终体积20μl。PCR程序为：94℃预变性3分钟，进入PCR循环，循环参数为94℃30秒变性→58℃30秒复性→72℃1分钟延伸，30个循环后在72℃继续合成10分钟。用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分离，得到348bp的片段。

提取转化子的质粒，用限制性内切酶SacI和BamHI进行双酶切，酶切体系为：质粒6μl、10x酶切缓冲液5μl、SacI 1μl(10U/μl)、BamHI 0.8μl(10U/μl)，加ddH₂O补充反应体系至50μl，37℃酶切4小时。用琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分离。得到1200bp的片段。

将上述PCR鉴定得到348bp的片段且酶切鉴定得到1200bp的片段的质粒为阳性质粒，命名为pTCK-FBK12。进一步测序验证pTCK-FBK12，证实pTCK-FBK12的结构是：在pTCK303载体的SpeI/SacI间插入序列表中的序列1自5’末端的第1242-1578位核苷酸和在pTCK303载体的BamHI/KpnI间插入序列表中的序列1自5’末端的第1242-1578位核苷酸的反向互补序列。从该载体的部分结构示意图(见图4)可以看出，在该载体中OsFBK12正、反义片段中间由500bp左右的水稻的内含子序列隔开。

上述验证结果表明，pTCK-FBK12为含有OsFBK12正、反义片段的RNAi载体。

4、转OsFBK12水稻的获得

遗传转化：参照电激仪(EasyJecT Plus电激仪，英国EquiBio公司)操作指南，分别将上述获得的载体pUN-FBK12和pTCK-FBK12分别用电击法转化农杆菌EHA105(Biovector Co.，LTD产品货号Biovec-11)菌株，经含卡那霉素的抗性平板筛选分别得到的超表达工程菌和RNAi工程菌，将超表达工程菌提取质粒，经KpnI和BamHI酶切得到1300bp片段的质粒，其对应的工程菌为阳性的超表达工程菌，命名为EHA105/pUN-FBK12；将RNAi工程菌提取质粒，经SacI和BamHI酶切得到1200bp片段的质粒，其对应的工程菌为阳性RNAi工程菌，命名为EHA105/pTCK-FBK12。

水稻阳性苗的筛选分化：将上述获得的EHA105/pUN-FBK12和EHA105/pTCK-FBK12分别导入中花10号水稻(Oryza sativa L.cv Zhonghua 10)的愈伤组织，再分别将导入EHA105/pUN-FBK12和EHA105/pTCK-FBK12的愈伤组织用含300mg/L头孢霉素的无菌水洗涤4-5遍，无菌滤纸吸干后转至N₆D₂S₁培养基上，筛选一代。两周后，转移至N₆D₂S₂培养基上筛选二代(2周/代)。取出经过3代筛选生长旺盛的抗性愈伤组织，转移至预分化培养基上，在分化培养箱(12小时光周期，白天28℃，夜晚25℃)中培养7天；然后转移至分化培养基上，在分化培养箱中培养至产生再生苗。再生的苗在生根壮苗培养基上生根壮苗。待小苗长至10厘米左右时，打开容器封口膜，炼苗2-3天，然后将小苗移入人工气候室栽培，分别获得15株T0代转pUN-FBK12水稻(即转OsFBK12水稻)和65株T0代转pTCK-FBK12水稻(即转正、反义OsFBK12水稻)。

表1水稻组织培养和转化过程中使用的培养基及其成分

实施例2、转OsFBK12水稻的表型观察

1、转OsFBK12水稻的验证

转基因苗的GUS鉴定：

分别从T0代转OsFBK12水稻和T0代转正、反义OsFBK12水稻上收获T1代转OsFBK12水稻和T1代转正、反义OsFBK12水稻的种子，播种获85株T1代转OsFBK12水稻幼苗和120株T1代转正、反义OsFBK12水稻幼苗。剪取2-3mm的幼苗叶片材料放到GUS染色液中，抽气几分钟，然后置于37℃温育过夜，染色后的组织用70％乙醇脱色。叶片呈蓝色的即为阳性植株，获得63株阳性T1代转OsFBK12水稻和106株阳性T1代转正、反义OsFBK12水稻。GUS染色液(pH 7.0)组分为：100mM Na₃PO₄(pH 7.0)，0.1％Triton X-100，10mM EDTA，0.5mM亚铁氰化钾，0.5mM铁氰化钾，1mg/ml X-Gluc。

转基因植株的定量PCR鉴定：分别提取上述鉴定获得的10株阳性T1代转OsFBK12水稻和15株阳性T1代转正、反义OsFBK12水稻的RNA，并反转录获得第一链cDNA。利用荧光实时定量PCR法，以基因特异序列为引物对转基因植株中OsFBK12的表达丰度进行检测。用于定量分析的试剂为SYBR Green Realtime PCR Master Mix(TOYOBO)。所用仪器为美国Stratagene公司实时荧光定量PCR仪Mx3000P。吸取1μl第一链cDNA溶液，稀释50倍作为模板，按以下体系进行PCR反应：10μl SYBR Green Realtime PCRMaster Mix，4μl模版，1μl 5′端引物(10μM)(5′-CTG TAC AGA TCA CGG CA-3′)，1μl 3′端引物(10μM)(5′-TCT TTC CTC CTG CTC TTC-3′)，加ddH₂O终体积20μl。用Actin作为内参，其5′端引物：5′-ACC ACA GGT ATT GTG TTG GAC TC-3′，3′端引物为：5′-AGA GCA TAT CCT TCA TAG ATG GG-3′。PCR程序为：预变性2分钟，进入PCR循环，循环参数为94℃15秒→58℃15秒→72℃15秒，共40个循环。

以野生型水稻(中花10号，WT)为对照，结果如图5所示，从图中可以看出，在Actin基因作为内参的情况下，阳性T1代转OsFBK12水稻(株系编号为OX9)和阳性T1代转正、反义OsFBK12水稻(株系编号为R4、R10、R12)的表达丰度有了不同程度的上调和下调，说明目的基因OsFBK12已经成功导入水稻，并且发挥了功能。

采用同样的方法分别将空载体pUN1301和pTCK303转入水稻中花十号(Oryzasativa L.cv Zhonghua 10)中分别获得T0代转pUN1301水稻和T0代转pTCK303水稻，从T0代转pUN1301水稻和T0代转pTCK303水稻收获得到T1代转pUN1301水稻和T1代转pTCK303水稻，从T1代转pUN1301水稻和T1代转pTCK303水稻收获得到T2代转pUN1301水稻和T2代转pTCK303水稻

2、转OsFBK12水稻的表型分析

将上述GUS检测后的53株阳性T1代转OsFBK12水稻和90株阳性T1代转正、反义OsFBK12水稻幼苗移栽到网室中种植。自然光周期下生长约五个月后(5月10日一10月20日)，从T1代转OsFBK12水稻和T1代转正、反义OsFBK12水稻上分别收获T2代转OsFBK12水稻种子和T2代转正、反义OsFBK12水稻种子。以T2代转pUN1301水稻、T2代转pTCK303水稻和野生型水稻(中花10号)的种子为对照。

种子表型如图6A所示，从图中显示与野生型水稻相比，T2代转OsFBK12水稻(OX9)种子变大；T2代转正、反义OsFBK12水稻种子(R4、R10、R12)变小。

图6B、6C和6D分别是对种子的粒长、粒宽及百粒重统计图，实验重复三次，结果取平均值。结果表明：野生型水稻(中花10号；WT)粒长、粒宽和百粒重分别是0.503cm、0.269cm和2.249g，T2代转OsFBK12水稻株系OX9种子的粒长是野生型的104％(0.526cm)、粒宽是野生型的102％(0.276cm)、百粒重是野生型的130％(2.93g)；T2代转正、反义OsFBK12水稻株系4号(R4)、10号(R10)和12(R12)号株系种子的粒长分别为野生型84％(0.421cm)、85％(0.427cm)、85％(0.429cm)，它们的粒宽分别为野生型的85％(0.229cm)、86％(0.232cm)、90％(0.242cm)，它们的百粒重分别为野生型的75％(1.686g)、75％(1.68g)、77％(1.736g)。这些变化与其表达量的变化基本吻合。

T2代转pUN1301水稻、T2代转pTCK303水稻和野生型水稻的种子的结果无显著差异。

Claims (10)

1.一种蛋白质，是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中的序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

2)将序列表中的序列2氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物种子粒型或种子长或种子宽或种子重相关由1)衍生的蛋白质。

2.权利要求1所述蛋白质的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为如下1)-5)中任一所述的DNA分子：

1)序列表中序列1自5’末端第197-1492位核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表中序列1自5’末端第148-1589位核苷酸所示的DNA分子；

3)序列表中序列1所示的DNA分子；

4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且与植物种子粒型或种子长或种子宽或种子重相关的DNA分子；

5)与1)或2)或3)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且与植物种子粒型或种子长或种子宽或种子重相关的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒。

5.扩增权利要求2或3所述编码基因全长或任一片段的引物对；所述引物对如下所示：一条引物序列如序列表中序列3所示，另一条引物序列如序列表中序列4所示。

6.一种培育种子粒型改良的转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述的编码基因导入目的植物得到种子粒型改良的转基因植物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述粒型改良为如下1)-3)中的至少一种：

1)所述转基因植物的种子粒长大于所述目的植物；

2)所述转基因植物的种子粒宽大于所述目的植物；

3)所述转基因植物的种子的粒重大于所述目的植物。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述粒重为百粒重。

9.根据权利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述编码基因是通过权利要求4所述重组载体导入所述目的植物中。

10.根据权利要求6-9中任一所述的方法，其特征在于：所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物，所述单子叶植物优选为水稻。

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