CN102335414B - 一种大米醇溶蛋白胆汁酸吸附剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种大米醇溶蛋白胆汁酸吸附剂的制备方法，它涉及一种胆汁酸吸附剂的制备方法。本发明解决了现有的胆汁酸吸附剂有毒副作用的技术问题。本发明的大米醇溶蛋白胆汁酸吸附剂是从大米中提取的分子量为13.0kDa和/或16.0kDa的醇溶蛋白。方法：将大米粉用甲醇和乙醚的混合溶剂浸提，脱脂，然后再用磷酸缓冲液浸提三次，离心得到的沉淀物用质量百分比浓度为55％的正丙醇浸提，得到上清液，再将上清液浓缩、冷冻干燥，得到大米醇溶蛋白胆汁酸吸附剂。本发明的大米醇溶蛋白胆汁酸吸附剂，不溶于水，具有不易被消化，可吸附胆汁酸，本发明的大米醇溶蛋白胆汁酸吸附剂可用于防止冠状动脉硬化及预防心血管疾病。
Description
技术领域
本发明涉及一种胆汁酸吸附剂的制备方法。
背景技术
胆汁酸是机体胆固醇的代谢产物，利用胆汁酸吸附剂可以促进胆汁酸排泄，抑制胆固醇合成与吸收，有效降低人体血清及肝脏中的胆固醇水平，从而能防止冠状动脉硬化及预防心血管疾病。现有的胆汁酸吸附剂多为化学合成物质，如公开号为CN1849649A发明名称为壳聚糖季铵盐吸附胆汁酸的应用公开的一种胆汁酸吸附剂，其包括碘化N-三甲基壳聚糖、氯化N-三甲基壳聚糖和羟丙基三甲基壳聚糖；公开号为CN1891303A的发明名称为β-环糊精聚合物的胆酸吸附剂的制备方法，公开了一种吸附剂的制备方法，将β-环糊精与交联剂环氧氯丙烷、1，2-乙二醇二缩水甘油醚或1，2-丁二醇二缩水甘油醚浊合后，再加入浓酸，反应后制得。这些胆汁酸吸附剂均为化学合成物质，有毒副作用。迄今为止，尚缺乏以食物天然成分为主的胆汁酸吸附剂。
发明内容
本发明旨在解决现有的胆汁酸吸附剂有毒副作用的技术问题，进而提供一种大米醇溶蛋白胆汁酸吸附剂的制备方法。
本发明的一种大米醇溶蛋白胆汁酸吸附剂是从大米中提取的分子量为13.0kDa和/或16.0kDa的醇溶蛋白。
本发明的一种大米醇溶蛋白胆汁酸吸附剂的制备方法按以下步骤进行：一、按甲醇与乙醚的体积比为1∶1～1.5量取甲醇和乙醚并混合均匀，得到混合溶剂；二、将大米粉碎，然后将大米粉加入到步骤一得到的混合溶剂中，浸泡6h～8h，然后过滤，得到脱脂大米粉；三、将步骤二得到的脱脂大米粉用pH为6.5的磷酸缓冲液浸提三次，再离心处理，得到沉淀物；四、将步骤三得到的沉淀物加入到质量百分比浓度为55％的正丙醇中，在室温下搅拌3h～5h，再经离心后，上清液浓缩后真空冷冻干燥，得到大米醇溶蛋白胆汁酸吸附剂。
步骤三中的浸提为在室温下搅拌1.5h～3h，然后静置1.5h～3h。
本发明先将大米粉用甲醇和乙醚的混合溶剂脱脂，经磷酸缓冲液彻底去除清蛋白及球蛋白后，用55％的正丙醇浸提，将醇溶蛋白溶入正丙醇中，经浓缩、冷冻干燥后，得到大米醇溶蛋白胆汁酸吸附剂。
大米中的蛋白主要为醇溶蛋白(prolamin)及谷蛋白(glutelin)，其中醇溶蛋白仅为5-10％左右。本发明的大米醇溶蛋白胆汁酸吸附剂中的醇溶蛋白含有大量的疏水氨基酸及较多的含硫氨基酸，不溶于水，具有不易被消化、类似于食物纤维的“抗性蛋白(resistantprotein)”特性，能够有效吸附胆汁酸、阻碍胆汁酸的肝肠循环、促进胆固醇排出体外，从而有效防治冠状动脉硬化及预防心血管等疾病。
胆汁酸是机体胆固醇的代谢产物，增强胆汁酸的吸附效率是机体排除胆固醇、降低机体胆固醇水平的最佳代谢途径之一。但是，长期以来，有效降低血脂水平的胆汁酸吸附剂多为药物，亟待应用食物蛋白等膳食成分进行吸附胆汁酸、进而降低机体的血脂水平。本发明的大米醇溶蛋白胆汁酸吸附剂对胆汁酸吸附效率为47％～50％；本发明的大米醇溶蛋白胆汁酸吸附剂是从大米中提取的大米固有的贮藏蛋白，没有任何毒副作用，为天然、绿色的功能性成分，适宜于有效调控心血管等生活习惯性疾病的功能性食品的开发。
本发明的大米醇溶蛋白胆汁酸吸附剂可用于防止冠状动脉硬化及预防心血管疾病。
附图说明
图1是试验一制备的大米醇溶蛋白胆汁酸吸附剂的SDS-PAGE电泳图谱图；图2是试验一中胆汁酸吸附效率图；其中□为试验一制备的大米醇溶蛋白胆汁酸吸附剂的胆汁酸吸附效率，
为大米全蛋白的胆汁酸吸附效率，■为酪蛋白的胆汁酸吸附效率。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式的一种大米醇溶蛋白胆汁酸吸附剂是从大米中提取的分子量为13.0kDa和/或16.0kDa的醇溶蛋白。
本实施方式的大米醇溶蛋白胆汁酸吸附剂中的醇溶蛋白含有大量的疏水氨基酸及较多的含硫氨基酸，不溶于水，具有不易被消化、类似于食物纤维的“抗性蛋白(resistantprotein)”特性，能够有效吸附胆汁酸、阻碍胆汁酸的肝肠循环、促进胆固醇排出体外，从而有效防治冠状动脉硬化及预防心血管等疾病。
具体实施方式二：本实施方式的一种大米醇溶蛋白胆汁酸吸附剂的制备方法按以下步骤进行：一、按甲醇与乙醚的体积比为1∶1～1.5量取甲醇和乙醚并混合均匀，得到混合溶剂；二、将大米粉碎，然后将大米粉加入到步骤一得到的混合溶剂中，浸泡6h～8h，然后过滤，得到脱脂大米粉；三、将步骤二得到的脱脂大米粉用pH为6.5的磷酸缓冲液浸提三次，再离心处理，得到沉淀物；四、将步骤三得到的沉淀物加入到质量百分比浓度为55％的正丙醇中，在室温下搅拌3h～5h，再经离心后，上清液浓缩后真空冷冻干燥，得到大米醇溶蛋白胆汁酸吸附剂。
本实施方式制备的大米醇溶蛋白胆汁酸吸附剂中的醇溶蛋白含有大量的疏水氨基酸及较多的含硫氨基酸，不溶于水，具有不易被消化、类似于食物纤维的“抗性蛋白(resistantprotein)”特性，能够有效吸附胆汁酸、阻碍胆汁酸的肝肠循环、促进胆固醇排出体外，从而有效防治冠状动脉硬化及预防心血管等疾病。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤二中大米粉与步骤一得到的混合溶剂的质量体积比为1g∶8mL～15mL。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是步骤三中大米粉与pH为6.5的磷酸缓冲液的质量体积比为1g∶8mL～15mL。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是步骤三中的pH为6.5的磷酸缓冲液中磷酸根离子的摩尔浓度为40mmol/L～60mmol/L。其它与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是步骤四中大米粉与与质量百分比浓度为55％的正丙醇的质量体积比为1g∶8mL～15mL。其它与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是步骤三中的离心处理是在向心加速度为5000×g的条件下离心5min～15min。其它与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是步骤四中的浓缩操作是用旋转蒸发仪在水浴温度为50℃～60℃；转速为100转/分～150转/分进行浓缩。其它与具体实施方式一至六之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是步骤四中真空冷冻干燥的条件为：真空度≤15Pa、温度为-50℃～-60℃、冻干时间为12h～20h。其它与具体实施方式一至七之一相同。
用以下试验验证本发明的效果：
试验一：本试验的一种大米醇溶蛋白胆汁酸吸附剂的制备方法按以下步骤进行：一、量取50mL甲醇和50mL乙醚并混合均匀，得到混合溶剂；二、将大米粉碎至60目，称取10g大米粉，溶于步骤一得到的混合溶剂中浸泡8h进行脱脂，然后过滤，得到脱脂大米粉；三、将步骤二所得脱脂大米粉加入到100mL浓度为50mmol/L pH＝6.5的磷酸缓冲液中，在室温下搅拌2h，再静置2h，然后在向心加速度为5000g的条件下离心处理10min，所得沉淀再加入到100mL浓度为50mmol/L pH＝6.5的磷酸缓冲液中，重复搅拌、静置和离心的操作3次，得到沉淀物；此步骤目的在于彻底去除清蛋白及球蛋白；四、将步骤三得到的沉淀物加入到100mL质量百分比浓度为55％的正丙醇中，室温下搅拌4h进行浸提，然后在向心加速度为5000g的条件下离心处理10min，收集上清液，离心得到的沉淀物再加入到100mL质量百分比浓度为55％的正丙醇中，重复搅拌浸提和离心操作3次，合并上清液；五、将步骤四所得的上清液加入到旋转蒸发仪中，在水浴温度为55℃、转速为120转/分的条件下浓缩，得到浓缩液，再将浓缩液放入真空冷冻干燥机中，在真空度为15Pa、温度为-50℃的条件下冻干16h，得到大米醇溶蛋白胆汁酸吸附剂。
本试验步骤二中的大米为龙粳水稻(Oryza sativa L.cv.Longjing)由黑龙江农科院佳木斯水稻研究所提供。
步骤五中所述的旋转蒸发仪为上海亚荣生化仪器厂生产的RE-2000旋转蒸发仪。
步骤五中所述的真空冷冻干燥机为北京松源华兴科技发展有限公司的LGJ-12冷冻干燥机。
本试验制备的大米醇溶蛋白胆汁酸吸附剂通过SDS-PAGE电泳进行蛋白组分分析。将本试验制备的大米醇溶蛋白胆汁酸吸附剂溶于上样缓冲液中，然后在100℃的水浴中保持3min后进行SDS-PAGE电泳，凝胶浓度选取15％。其中上样缓冲液中Tris-HCl的浓度为0.125mol/L、SDS质量百分比浓度为4％、2-巯基乙醇的体积百分比浓度为5％、尿素的摩尔浓度为8mol/L，缓冲液的pH＝6.8。
SDS-PAGE电泳图谱如图1所示，从图1可以看出55％正丙醇能够较为完全、彻底地提取醇溶蛋白，是较佳的大米醇溶蛋白提取剂，其醇溶蛋白的主要组成为13kDa和16kDa的醇溶蛋白分子。
本试验制备的大米醇溶蛋白胆汁酸吸附剂中的蛋白质含量依据凯氏定氮法测定(N×5.95)。并按大米醇溶蛋白胆汁酸吸附剂的提取率(％)＝冻干样品的蛋白含量×100/大米粉中的蛋白含量。经计算本试验中大米醇溶蛋白提取率为9.38％。
本试验得到的大米醇溶蛋白胆汁酸吸附剂是从10g大米粉中提取出来的，其蛋白质含量用Lowry法测定，为8.87±0.57mg/g，表明55％正丙醇提取大米醇溶蛋白较为完全、彻底。
将本试验制备的大米醇溶蛋白胆汁酸吸附剂进行胆汁酸吸附效率的测定：
a、称取100mg本试验制备的大米醇溶蛋白胆汁酸吸附剂，溶于20mL去离子水，添加1mg胃蛋白酶(pepsin)，震荡混匀后，以1N稀HCL溶液调至pH 2.0，37℃水浴处理2h。
b、经胃蛋白酶水浴处理2h后，调pH至6.8后，添加4mg胰酶(pancreatin)得模拟肠液后，添加20mL浓度为1.35μmol/L的胆汁酸溶液，37℃水浴处理4h。c、在向心加速度为12,000g的条件下离心处理10min，得到上清液，采用3α-类固醇脱氢酶法测定胆汁酸含量。
胆汁酸吸附率(％)＝(总胆汁酸量-上清胆汁酸含量)×100/总胆汁酸量计算胆汁酸吸附率
以酪蛋白和大米全蛋白做为对比，进行大米醇溶蛋白胆汁酸吸附剂、酪蛋白和大米全蛋白的胆汁酸吸附效率的比较研究。所得胆汁酸吸附效率如图2所示，其中□为本试验一制备的大米醇溶蛋白胆汁酸吸附剂的胆汁酸吸附效率，
为大米全蛋白的胆汁酸吸附效率，■为酪蛋白的胆汁酸吸附效率。从图2可以看出，本试验的大米醇溶蛋白胆汁酸吸附剂的胆汁酸吸附效率为49.7％，大米粉全蛋白的胆汁酸吸附效率28.93％，酪蛋白的胆汁酸吸附效率1.09％。从a，b，c可知，大米醇溶蛋白吸附胆汁酸效率与酪蛋白、大米全蛋白具有显著性差异，P＜0.05。
本试验的大米醇溶蛋白胆汁酸吸附剂的胆汁酸吸附效率显著高于酪蛋白及大米全蛋白(P＜0.05)。数据显示，本试验的大米醇溶蛋白胆汁酸吸附剂吸附胆汁酸效率是酪蛋白45.60倍(P＜0.05)。对照大米全蛋白，本试验的大米醇溶蛋白胆汁酸吸附剂则显著提高了71.79％的胆汁酸吸附效率(P＜0.05)。
这一实验结果表明本试验所得的大米醇溶蛋白胆汁酸吸附剂能够有效地吸附胆汁酸、能够有效阻碍胆汁酸的肝肠循环，是大米蛋白有效降低机体胆固醇水平的主要功能性成分之一。
Claims (5)
1.一种大米醇溶蛋白胆汁酸吸附剂的制备方法，其特征在于大米醇溶蛋白胆汁酸吸附剂的制备方法按以下步骤进行：一、按甲醇与乙醚的体积比为1∶1～1.5量取甲醇和乙醚并混合均匀，得到混合溶剂；二、将大米粉碎，然后将大米粉加入到步骤一得到的混合溶剂中，浸泡6h～8h，然后过滤，得到脱脂大米粉；三、将步骤二得到的脱脂大米粉用pH为6.5的磷酸缓冲液浸提三次，再离心处理，得到沉淀物；四、将步骤三得到的沉淀物加入到质量百分比浓度为55％的正丙醇中，在室温下搅拌3h～5h，再经离心后，上清液浓缩后真空冷冻干燥，得到大米醇溶蛋白胆汁酸吸附剂；其中步骤二中大米粉与步骤一得到的混合溶剂的质量体积比为1g∶8mL～15mL，步骤三中大米粉与pH为6.5的磷酸缓冲液的质量体积比为1g∶8mL～15mL，步骤四中大米粉与与质量百分比浓度为55％的正丙醇的质量体积比为1g∶8mL～15mL；所述的大米醇溶蛋白胆汁酸吸附剂是从大米中提取的分子量为13.0kDa和/或16.0kDa的醇溶蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种大米醇溶蛋白胆汁酸吸附剂的制备方法，其特征在于步骤三中的pH为6.5的磷酸缓冲液中磷酸根离子的摩尔浓度为40mmol/L～60mmol/L。
3.根据权利要求1所述的一种大米醇溶蛋白胆汁酸吸附剂的制备方法，其特征在于步骤三中的离心处理是在向心加速度为5000×g的条件下离心5min～15min。
4.根据权利要求1所述的一种大米醇溶蛋白胆汁酸吸附剂的制备方法，其特征在于步骤四中的浓缩操作是用旋转蒸发仪在水浴温度为50℃～60℃；转速为100转/分～150转/分进行浓缩。
5.根据权利要求1所述的一种大米醇溶蛋白胆汁酸吸附剂的制备方法，其特征在于步骤四中真空冷冻干燥的条件为：真空度≤15Pa、温度为-50℃～-60℃、冻干时间为12h～20h。
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