CN102331474A - 寻找发酵用原料玉米浆的质量控制指标的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了寻找发酵用原料玉米浆的质量控制指标的方法，包括下述步骤：对玉米浆的化学成分的测定：①样品的制备：②气相色谱-飞行时间质谱联用仪测定方法：(2)偏最小二乘判别分析法①将方法(1)获得的数据进行标准化和预处理；②用SIMCA-P 11.5软件对预处理后的数据进行偏最小二乘法判别分析，得到用于表达样本相似性和差异性的得分图、载荷图和VIP图；本发明采用高通量高分辨率的检测技术，可以同时测得玉米浆中的多种化学成分，方法简便，经过多批原料验证，重复性好。本发明的方法分辨率和灵敏度高，具有良好的重现性和稳定性，是对现行玉米浆质量检查的一个补充。
Description
技术领域
本发明属于工业发酵原料分析领域，涉及一种寻找发酵用原料玉米浆的质量控制指标的方法。
背景技术
玉米浆是生产玉米淀粉过程中在浸渍玉米时得到的副产品。它含有氨基酸、有机酸、可溶性糖、维生素和金属盐类等多种营养物质，是生产抗生素等培养基中的重要原料，为微生物生长提供天然的有机氮源。由于其价格低廉、营养丰富，在工业微生物发酵中得到广泛地应用。
玉米浆现有的技术质量检测方法由各生产厂商自行规定，并无国家统一标准。现行的质量检查规定外观浓稠、不透明；色泽棕色到棕褐色；无腐臭等异味；及规定干重、蛋白质、酸度、亚硫酸和灰分的含量标准。这些检查不能科学准确地判定原料的质量，不同批次的原料对发酵产品的效价有很大的影响，为了全面准确地控制原料的质量，保证高效价发酵产品，提高产率，避免浪费，故有必要对其质量控制指标进行研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种寻找发酵用原料玉米浆的质量控制指标的方法。
本发明的技术方案概述如下：
寻找发酵用原料玉米浆的质量控制指标的方法，其特征是包括下述步骤：
(1)对玉米浆的化学成分的测定：
①样品的制备：
将0.5-2g均匀的发酵用原料玉米浆置于离心管中，离心收集上清；将获得的上清液用超纯水稀释10-40体积倍，取10-40μL置于另一离心管中，加入30-50μL的0.040mg/mL氘标记的琥珀酸甲醇溶液为内标；冷冻干燥后，加入50-100μL浓度为20mg/mL的甲氧基胺盐酸盐的吡啶溶液于30℃-40℃水浴中肟化反应60-120min；再加入60-100μLN-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺于35℃-40℃水浴进行硅烷化反应20-50min；
②气相色谱-飞行时间质谱联用仪测定方法：
将1μl步骤①获得的样品进到气相色谱中，色谱柱为DB-5MS，所述色谱柱的规格为30m×0.25mm i.d.，进样口温度250℃-280℃，载气为高纯氦气，流速0.6-0.8ml/min，分流比30∶1-10∶1，柱温箱升温程序为：初始50℃-80℃保持2-5min，以4℃/min-8℃/min的速度升到250℃-300℃，保持8-10min，使用EI电离源，源温230℃-280℃，检测器电压2300V-2700V，电离电压60eV-80eV，电流30μA-50μA；质谱检测范围50-800m/z；成分的鉴定使用NIST数据库，质谱数据的处理和成分相对含量的测定使用Masslynx 4.1软件；并通过对色谱峰面积积分处理，并与内标物的峰面积对照，得到发酵用原料玉米浆中化学成分的相对含量；
(2)偏最小二乘判别分析法
①将方法(1)获得的数据进行标准化和预处理；
②用SIMCA-P 11.5软件对预处理后的数据进行偏最小二乘法判别分析，得到用于表达样本相似性和差异性的得分图、载荷图和VIP图；在得分图中，样品点相互之间距离越近，说明样本的相似度越大，距离越远，说明样本差异越大，可用来寻找不同批次玉米浆中各物质的相似和差异；在载荷图中，每个点表示每个物质，距离中心点距离越远的物质，其在不同批次的含量差异越大，便可作为玉米浆的质量控制指标；VIP表示每个物质对区分样本的贡献大小，VIP＞1可以认为是对玉米浆质量影响最为显著的指标。
本发明采用高通量高分辨率的检测技术，可以同时测得玉米浆中的多种化学成分，方法简便，经过多批原料验证，重复性好。本发明的方法分辨率和灵敏度高，具有良好的重现性和稳定性，采用的偏最小二乘判别分析法可以迅速有效地从高通量数据中筛选到区别不同批次原料的化学物质，发现玉米浆中九种化学物质葡萄糖、乳酸、脯氨酸、磷酸、半乳糖、丙氨酸、果糖、5-酮脯氨酸、甘氨酸可以考虑作为玉米浆的质量控制指标，是对现行玉米浆质量检查的一个补充。
附图说明
图1为不同批次玉米浆的偏最小二乘法判别分析得分图，1-1为不同批次玉米浆主成分分析t[1]-t[2]图；1-2图不同批次玉米浆主成分分析t[1]-u[1]图。
图2为不同批次玉米浆的偏最小二乘判别分析载荷图，2-1为不同批次玉米浆w*c[1]-w*c[2]散点图；2-2为不同批次玉米浆第一主成分的p-p(corr)S图。
图3为不同批次玉米浆的偏最小二乘判别分析VIP图(VIP.＞1)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明：
本发明所用原料玉米浆是指质量浓度大于40％的玉米浆。
实施例1
寻找发酵用原料玉米浆的质量控制指标的方法，包括下述步骤：
(1)对11批不同的玉米浆进行化学成分测定：
①样品的制备：
将1g均匀的玉米浆样品置于离心管中，离心收集上清；将获得的上清液用超纯水稀释20倍，取20μL置于另一离心管中，加入30μL的0.040mg/mL氘标记的琥珀酸甲醇溶液为内标。冷冻干燥后，加入50μL浓度为20mg/mL甲氧基胺盐酸盐的吡啶溶于30℃水浴中肟化反应90min。反应结束后再加入80μL N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺于37℃水浴进行硅烷化反应30min；
②气相色谱-飞行时间质谱联用仪测定方法：
将1μl步骤①获得的样品进到气相色谱中，色谱柱为DB-5MS，所述色谱柱的规格为30m×0.25mm i.d.，进样口温度250℃，载气为高纯氦气，流速0.6ml/min，分流比20∶1，柱温箱升温程序为：初始70℃保持2min，以5℃/min的速度升到290℃，保持10min，使用EI电离源，源温280℃，检测器电压2500V，电离电压80eV，电流50μA；质谱检测范围50-800m/z；成分的鉴定使用NIST数据库，质谱数据的处理和成分相对含量的测定使用Masslynx 4.1软件；并通过对色谱峰面积积分处理，并与内标物的峰面积对照，得到发酵用原料玉米浆中成分的相对含量；一共检测到80多种化合物，其中能鉴定到58种，见表1。
(2)偏最小二乘法判别分析：
①将步骤(1)获得的数据进行标准化和Pareto预处理，以消除同一样品中不同成分含量的较大差异对偏最小二乘判别分析结果的影响。
②用SIMCA-P 11.5软件对预处理后的数据进行偏最小二乘判别分析，得到用于表达样本相似性和差异性的得分图、载荷图和VIP图；在得分图中，样品点相互之间距离越近，说明样本的相似度越大，距离越远，说明样本差异越大，可用来寻找不同批次玉米浆中各物质的相似和差异；在载荷图中，每个点表示每个物质，距离中心点距离越远的物质，其在不同批次的含量差异越大，便可作为玉米浆的质量控制指标；VIP表示每个物质的对区分样本的贡献大小，VIP＞1可以认为是对玉米浆的质量影响最为显著的指标。
从图1-1(不同批次玉米浆主成分分析t[1]-t[2]图)中可以得到：11批玉米浆可以被明显区分为三类，即批次1和2聚在一起，批次3、4和11聚在一起，其余批次聚为一类。由图1-2(不同批次玉米浆主成分分析t[1]-u[1]图)可知，批次1和2的u[1]值最大，批次3、4和11的u[1]值最小，其余批次的u[1]值在原点附近，由此分为三类。这就表明即使玉米浆检测符合现行的质量检查，但不同批次的玉米浆依然存在较大的差异，对发酵有较大的影响。
从图2中可以找到区分不同批次玉米浆的质量的物质，在图2-1(不同批次玉米浆w*c[1]-w*c[2]散点图)根据距离中心点越远，物质的含量差异越大的原则，可以初步筛选不同批次玉米浆含量差异较大的物质；在图2-2(不同批次玉米浆第一主成分的p-p(corr)S图)根据|corr|.＞0.5的原则，进一步筛选可以区分不同批次玉米浆的物质，p(corr)＞0.5表明该物质对图1中聚类正半轴影响较大，p(corr)＜-0.5表明该物质对图1中聚类负半轴影响较大；根据图3来确定各物质的贡献大小，VIP值越大表示各物质对聚类分析的贡献也越大，一般以VIP＞1为原则选择标志物。综合三张图的分析，从而最终可以确定区别不同批次玉米浆质量的主要物质有16个，依次为葡萄糖、乳酸、脯氨酸、磷酸、半乳糖、丙氨酸、果糖、5-酮脯氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、柠檬酸、谷氨酸和赖氨酸。进一步分析发现，乳酸和磷酸含量差异主要由玉米浸渍中微生物发酵引起的，是不同厂家玉米浆工艺差异而造成的；脯氨酸是玉米中的主要氨基酸成分，其差异可能由于不同厂家使用的玉米产地或季节不同而造成的；这些质量差异标志物主要是为微生物提供营养物质的，另外脯氨酸和甘氨酸在发酵过程中还对微生物的渗透压具有重要影响。由于前九个物质影响尤为显著，因此可以考虑作为玉米浆的质量控制指标。
表1：实施例1所测得的玉米浆中的化学成分的种类
实施例2
寻找发酵用原料玉米浆的质量控制指标的方法，包括下述步骤：
(1)对11批不同的玉米浆进行化学成分测定：
①样品的制备：
将2g均匀的玉米浆样品置于离心管中，离心收集上清；将获得的上清液用超纯水稀释40倍，取20μL置于另一离心管中，加入40μL的0.040mg/mL氘标记的琥珀酸甲醇溶液为内标。冷冻干燥后，加入50μL 20mg/mL的甲氧基胺盐酸盐的吡啶溶于35℃水浴中肟化反应120min。反应结束后再加入70μL N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺于35℃水浴，进行硅烷化反应50min；
②气相色谱-飞行时间质谱联用仪测定方法：
将1μl步骤①获得的样品进到气相色谱中，色谱柱为DB-5MS，所述色谱柱的规格为30m×0.25mm i.d.，进样口温度280℃，载气为高纯氦气，流速0.6ml/min，分流比30∶1，柱温箱升温程序为：初始80℃保持5min，以8℃/min的速度升到300℃，保持8min，使用EI电离源，源温260℃，检测器电压2700V，电离电压80eV，电流50μA；质谱检测范围50-800m/z；成分的鉴定使用NIST数据库，质谱数据的处理和成分相对含量的测定使用Masslynx 4.1软件；并通过对色谱峰面积积分处理，并与内标物的峰面积对照，得到发酵用原料玉米浆中成分的相对含量。
(2)偏最小二乘判别分析：
①将步骤(1)获得的数据进行标准化和Pareto预处理，以消除同一样品中不同成分含量的较大差异对偏最小二乘判别分析结果的影响。
②用SIMCA-P 11.5软件对预处理后的数据进行偏最小二乘判别分析，得到用于表达样本相似性和差异性的得分图、载荷图和VIP图；在得分图中，样品点相互之间距离越近，说明样本的相似度越大，距离越远，说明样本差异越大，可用来寻找不同批次玉米浆中各物质的相似和差异；在载荷图中，每个点表示每个物质，距离中心点距离越远的物质，其在不同批次的含量差异越大，便可作为玉米浆的质量控制指标；VIP表示每个物质的对区分样本的贡献大小，VIP＞1可以认为是对玉米浆质量影响最为显著的指标。
通过实验证明，本实施例的方法也可以得到与实施例1相似的结果。
实施例3
寻找发酵用原料玉米浆的质量控制指标的方法，包括下述步骤：
(1)对11批不同的玉米浆进行化学成分测定：
①样品的制备：
将0.5g均匀的玉米浆样品置于离心管中，离心收集上清；将获得的上清液用超纯水稀释20倍，取40μL置于另一离心管中，加入30μL的0.040mg/mL氘标记的琥珀酸甲醇溶液为内标。冷冻干燥后，加入70μL浓度为20mg/mL的甲氧基胺盐酸盐的吡啶溶于37℃水浴中肟化反应60min。反应结束后再加入100μL N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺于40℃水浴，进行硅烷化反应20min；
②气相色谱-飞行时间质谱联用仪测定方法：
将1μl步骤①获得的样品进到气相色谱中，色谱柱为DB-5MS，所述色谱柱的规格为30m×0.25mm i.d.，进样口温度270℃，载气为高纯氦气，流速0.7ml/min，分流比20∶1，柱温箱升温程序为：初始70℃保持3min，以4℃/min的速度升到290℃，保持10min，使用EI电离源，源温280℃，检测器电压2500V，电离电压70eV，电流40μA；质谱检测范围50-800m/z；成分的鉴定使用NIST数据库，质谱数据的处理和成分相对含量的测定使用Masslynx 4.1软件；并通过对色谱峰面积积分处理，并与内标物的峰面积对照，得到发酵用原料玉米浆中成分的相对含量。
(2)偏最小二乘判别分析：
①将步骤(1)的数据进行标准化和Pareto预处理，以消除同一样品中不同成分含量的较大差异对偏最小二乘判别分析结果的影响。
②用SIMCA-P 11.5软件对预处理后的数据进行偏最小二乘判别分析，得到用于表达样本相似性和差异性的得分图、载荷图和VIP图；在得分图中，样品点相互之间距离越近，说明样本的相似度越大，距离越远，说明样本差异越大，可用来寻找不同批次玉米浆中各物质的相似和差异；在载荷图中，每个点表示每个物质，距离中心点距离越远的物质，其在不同批次的含量差异越大，便可作为玉米浆的质量控制指标；VIP表示每个物质的对区分样本的贡献大小，VIP＞1可以认为是对玉米浆质量影响最为显著的指标。
通过实验证明，本实施例的方法也可以得到与实施例1相似的结果。
Claims (1)
1.寻找发酵用原料玉米浆的质量控制指标的方法，其特征是包括下述步骤：
(1)对玉米浆的化学成分的测定：
①样品的制备：
将0.5-2g均匀的发酵用原料玉米浆置于离心管中，离心收集上清；将获得的上清液用超纯水稀释10-40体积倍，取10-40μL置于另一离心管中，加入30-50μL的0.040mg/mL氘标记的琥珀酸甲醇溶液为内标；冷冻干燥后，加入50-100μL浓度为20mg/mL的甲氧基胺盐酸盐的吡啶溶液于30℃-40℃水浴中肟化反应60-120min；再加入60-100μL N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺于35℃-40℃水浴进行硅烷化反应20-50min；
②气相色谱-飞行时间质谱联用仪测定方法：
将1μl步骤①获得的样品进到气相色谱中，色谱柱为DB-5MS，所述色谱柱的规格为30m×0.25mm i.d.，进样口温度250℃-280℃，载气为高纯氦气，流速0.6-0.8ml/min，分流比30∶1-10∶1，柱温箱升温程序为：初始50℃-80℃保持2-5min，以4℃/min-8℃/min的速度升到250℃-300℃，保持8-10min，使用EI电离源，源温230℃-280℃，检测器电压2300V-2700V，电离电压60eV-80eV，电流30μA-50μA；质谱检测范围50-800m/z；成分的鉴定使用NIST数据库，质谱数据的处理和成分相对含量的测定使用Masslynx 4.1软件；并通过对色谱峰面积积分处理，并与内标物的峰面积对照，得到发酵用原料玉米浆中化学成分的相对含量；
(2)偏最小二乘判别分析法
①将方法(1)获得的数据进行标准化和预处理；
②用SIMCA-P 11.5软件对预处理后的数据进行偏最小二乘法判别分析，得到用于表达样本相似性和差异性的得分图、载荷图和VIP图；在得分图中，样品点相互之间距离越近，说明样本的相似度越大，距离越远，说明样本差异越大，可用来寻找不同批次玉米浆中各物质的相似和差异；在载荷图中，每个点表示每个物质，距离中心点距离越远的物质，其在不同批次的含量差异越大，便可作为玉米浆的质量控制指标；VIP表示每个物质对区分样本的贡献大小，VIP＞1可以认为是对玉米浆质量影响最为显著的指标。
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