CN102327288B - 一种注射用血小板冻干粉制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种注射用血小板冻干粉制剂及其制备方法。注射用血小板冻干粉制剂由血小板和冷冻保护剂组成，其中冷冻保护剂由非渗透性冷冻保护剂和四氢嘧啶或羟基四氢嘧啶组成。本发明的注射用血小板冻干粉制剂能够显著提高制剂中血小板的稳定性，并维持血小板的生物活性，冻干粉复溶后仍保持较高的生物活性。
Description
技术领域
本发明涉及一种注射用冻干粉制剂，特别涉及一种血小板的注射用冻干粉制剂。
背景技术
血小板是血液的重要成分，人体在大量失血后需要输入血小板，进行化疗和骨髓移植的患者更需要输入大量的血小板。目前常用的血小板保存方法是在20℃~24℃震荡条件下保存，仅能保存5天，之后即会失去活性，且易激活血小板细胞功能和促进微生物生长污染，很难适应临床恶需求。
目前研究认为，采用冻干技术可以延长血小板的保存期，研究中常用的冷冻保护剂等关键辅料包括海藻糖、二甲基亚砜和可逆性激活抑制剂。
海藻糖是一种稳定的非还原性双糖，其羟基能代替水分子同蛋白质表面部分结合，进入细胞后会形成保护层，对细胞形成保护。但只有当海藻糖达到一定浓度并均匀分布在血小板胞膜内外时，才能在冻干过程中对血小板起到相对理想的保护作用。因此，冻干前有效负载海藻糖至胞内是血小板冻干保存成功的主要因素之一。然而血小板胞膜对其具有非渗透性，因此将海藻糖负载进入血小板胞内，需要复杂的工艺过程，耗时长达4小时，并需要引入更多种化学物质。使得工艺问题和安全性问题成为困扰血小板冻干粉应用的难题之一。即使目前认为相对比较简单的液相内吞负载海藻糖的方法也存在工艺耗时长的问题。此外，重复实验证明海藻糖用于血小板冻干粉时，保存的血小板激活率高，体内存活期缩短。
二甲基亚砜可防止冻干过程中形成冰晶对细胞造成损伤。温度接近0℃时，二甲基亚砜使溶液的凝固点下降，无冰晶形成；温度继续降低时，细胞外液中形成冰晶，而血小板内溶液不冻结。血小板胞外水不断形成冰晶，胞外浓度增大，会使细胞内的自由水透过细胞膜渗出到胞外，如果降温速度足够慢，即可使血小板逐渐脱水而不会形成冰晶。但是，二甲基亚砜作为一种化学试剂，对人体具有一定的毒性作用，不适于注射给药，残留的二甲基亚砜可能会在长期输注冻干血小板的患者体内逐渐积累而形成伤害，所以使用前需要反复冲洗，在洗涤过程中，血小板易被激活、损伤而丧失其临床应用价值。
在血小板体外冻干、保存和使用整个过程中，均可引起血小板过度激活，从而使得细胞回收率降低，血小板正常功能降低或丧失。为避免血小板在处理过程中过度激活，需要加入一种或几种可逆性激活抑制剂来保护血小板，使其在应用前处于暂时休眠状态，增强冻干血小板的生存能力，延长其生存时间，并且可以使二甲基亚砜的用量由5%降低至2%。但是，目前所采用的各种血小板可逆性激活抑制剂，如腺苷（adenosine）、前列腺素E1（Prostaglandin E1）、阿米洛利（amiloride）和硝普钠（sodium nitroprusside）等均具有确切并且较强的生物活性，如作为辅料使用，会诱发与治疗目的无关的其他药理或病理现象，不适于作医药用辅料。
目前采用的血小板冻存方法中，以种三种辅料一般同时使用，以提高血小板的稳定性、存活率和回收率。然而，医药界已经认识到，即使同时使用海藻糖、二甲基亚砜和可逆性激活抑制剂制备血小板冻干粉，其回收率仍比较低，大约65%左右。而其体内存活率则更低，甚至低于40%。加之以上三种辅料中，二甲基亚砜和可逆性激活抑制剂均不适于作为药用辅料使用，否则会都人体造成损害。因此，目前研发的各种血小板冻干粉处方和工艺多处于以研究为目的的阶段，而无法投入临床使用。
因此，寻找新的安全性高且能够维持冻存血小板高回收率和高存活率的血小板冻干粉处方和工艺，已成为已成为制约血小板临床使用的关键因素。
四氢嘧啶，化学名为1,4,5,6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸或2-Methyl-1,4,5,6-tetrahydropyri
midine-4-carboxylic acid或(S)-2-methyl-1, 4, 5, 6-tetra-hydropyrimidine-4-carboxylic acid或,4,5,6-tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidine carbonic acid，CAS号为96702-03-3，是1985年从海洋生物体内发现的氨基酸衍生物，具有保湿、防紫外线照射等作用，近年来已被用于化妆品作为保湿性成分或辅料。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的在于提供一种注射用冻干粉制剂，具体的说是一种注射用血小板冻干粉制剂。
另一方面，本发明还提供了一种注射用血小板冻干粉制剂的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种注射用血小板冻干粉制剂，由血小板和冷冻保护剂组成，所述冷冻保护剂由非渗透性冷冻保护剂和四氢嘧啶或羟基四氢嘧啶组成，所述非渗透性冷冻保护剂选自聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖、牛血清白蛋白和海藻糖中的任意一种；所述四氢嘧啶或羟基四氢嘧啶用量为每1012个血小板细胞用5mg-80mg，所述非渗透性冷冻保护剂的用量为每1012个血小板细胞用2mg-50mg。
所述四氢嘧啶或羟基四氢嘧啶的用量为每1012个血小板细胞用10mg-30mg。
所述非渗透性冷冻保护剂的用量为每1012个血小板细胞用2mg-20mg。
所述非渗透性冷冻保护剂为聚乙烯吡咯烷酮。
所述聚乙烯吡咯烷酮的用量为每1012个血小板细胞用2mg-14mg。
所述注射用血小板冻干粉制剂的制备方法，步骤为：
1）配液：
将血小板用生理盐水洗涤2次，用灭菌注射用水配成浓度为2×109细胞/ml的悬液，然后加入非渗透性冷冻保护剂和四氢嘧啶或羟基四氢嘧啶，静置1小时；
2）冻干:
a、预冻：将分装于西林瓶的溶液以10℃/分钟的速度从22℃降至-40℃，维持冷冻2小时； b、一次干燥：抽真空至10Pa-30Pa，然后以5℃/分钟的升温速度升温至-5℃，维持干燥8小时；
c、二次干燥：一次干燥后，以0.1℃/分钟的升温速度升温至22℃,维持干燥5小时，灭菌分装即得。
本发明的技术方案中所述的四氢嘧啶，化学名为2-Methyl-1,4,5,6-tetrahydropyrimidine-4-carboxylic acid或(S)-2-methyl-1, 4, 5, 6-tetra-hydro pyrimidine-4-carboxylic acid或1,4,5,6-tetrahydro-2-methyl-4- pyrimidinecarbonic acid。1,4,5,6-四氢-2-甲基-5-羟基-4-嘧啶羧酸俗称羟基四氢嘧啶，CAS号为96702-03-3，这是本领域技术人员所周知的。
本发明人在实验研究中惊奇的发现，将四氢嘧啶与某些非渗透性冷冻保护剂的混合物，对血小板冻干具有出乎意料的保护作用，血小板与四氢嘧啶及其衍生物和非渗透性冷冻保护剂混合后进行冻干，所得的注射用血小板冻干粉制剂安全性高，稳定性强，回收率、体内存活时间和血小板功能相对较高，冻干对血小板的影响极小，利于血小板的长期贮存和运输。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的解释。应当理解的是，以下实施例仅用于解释本发明，而不是限制本发明的保护范围。
实施例1 注射用血小板冻干粉处方及制备
血小板细胞 2×109细胞/ml 1000ml
四氢嘧啶 12mg
聚乙烯吡咯烷酮 10mg
1）配液：
将血小板用生理盐水洗涤2次，用灭菌注射用水配成浓度为1×109细胞/ml的悬液，然后加入四氢嘧啶和聚乙烯吡咯烷酮，静置1小时；
2）冻干:
a、预冻：将分装于西林瓶的溶液以10℃/分钟的速度从22℃降至-40℃，维持冷冻2小时； b、一次干燥：抽真空至23Pa，然后以5℃/分钟的升温速度升温至-5℃，维持干燥8小时； c、二次干燥：一次干燥后，以0.1℃/分钟的升温速度升温至22℃,维持干燥5小时，灭菌分装即得。
实施例2 注射用血小板冻干粉处方及制备
血小板细胞 2×109细胞/ml 1000ml
羟基四氢嘧啶 20mg
聚乙烯吡咯烷酮 7mg
1）配液：
将血小板用生理盐水洗涤2次，用灭菌注射用水配成浓度为2×109细胞/ml的悬液，然后加入羟基四氢嘧啶和聚乙烯吡咯烷酮，静置1小时；
2）冻干:
a、预冻：将分装于西林瓶的溶液以10℃/分钟的速度从22℃降至-40℃，维持冷冻2小时； b、一次干燥：抽真空至17Pa，然后以5℃/分钟的升温速度升温至-5℃，维持干燥8小时； c、二次干燥：一次干燥后，以0.1℃/分钟的升温速度升温至22℃,维持干燥5小时，灭菌分装即得。
实施例3 注射用血小板冻干粉处方及制备
血小板细胞 2×109细胞/ml 1000ml
羟基四氢嘧啶 30mg
海藻糖 45mg
1）配液：
将血小板用生理盐水洗涤2次，用灭菌注射用水配成浓度为2×109细胞/ml的悬液，然后加入羟基四氢嘧啶和海藻糖，静置1小时；
2）冻干:
a、预冻：将分装于西林瓶的溶液以10℃/分钟的速度从22℃降至-40℃，维持冷冻2小时； b、一次干燥：抽真空至10Pa，然后以5℃/分钟的升温速度升温至-5℃，维持干燥8小时； c、二次干燥：一次干燥后，以0.1℃/分钟的升温速度升温至22℃,维持干燥5小时，灭菌分装即得。
实施例4 注射用血小板冻干粉处方及制备
血小板细胞 2×109细胞/ml 1000ml
羟基四氢嘧啶 42mg
牛血清白蛋白 18mg
1）配液：
将血小板用生理盐水洗涤2次，用灭菌注射用水配成浓度为2×109细胞/ml的悬液，然后加入羟基四氢嘧啶和牛血清白蛋白，静置1小时；
2）冻干:
a、预冻：将分装于西林瓶的溶液以10℃/分钟的速度从22℃降至-40℃，维持冷冻2小时； b、一次干燥：抽真空至7Pa，然后以5℃/分钟的升温速度升温至-5℃，维持干燥8小时； c、二次干燥：一次干燥后，以0.1℃/分钟的升温速度升温至22℃,维持干燥5小时，灭菌分装即得。
实施例5 注射用血小板冻干粉处方及制备
血小板细胞 2×109细胞/ml 1000ml
四氢嘧啶 26mg
葡聚糖 20mg
1）配液：
将血小板用生理盐水洗涤2次，用灭菌注射用水配成浓度为2×109细胞/ml的悬液，然后加入四氢嘧啶和葡聚糖，静置1小时；
2）冻干:
a、预冻：将分装于西林瓶的溶液以10℃/分钟的速度从22℃降至-40℃，维持冷冻2小时； b、一次干燥：抽真空至10Pa，然后以5℃/分钟的升温速度升温至-5℃，维持干燥8小时； c、二次干燥：一次干燥后，以0.1℃/分钟的升温速度升温至22℃,维持干燥5小时，灭菌分装即得。
实施例6 注射用血小板冻干粉处方及制备
血小板细胞 2×109细胞/ml 1000ml
四氢嘧啶 58mg
海藻糖 30mg
1）配液：
将血小板用生理盐水洗涤2次，用灭菌注射用水配成浓度为2×109细胞/ml的悬液，然后加入四氢嘧啶和海藻糖，静置1小时；
2）冻干:
a、预冻：将分装于西林瓶的溶液以10℃/分钟的速度从22℃降至-40℃，维持冷冻2小时； b、一次干燥：抽真空至14Pa，然后以5℃/分钟的升温速度升温至-5℃，维持干燥8小时； c、二次干燥：一次干燥后，以0.1℃/分钟的升温速度升温至22℃,维持干燥5小时，灭菌分装即得。
实施例7 注射用血小板冻干粉处方及制备
血小板细胞 2×109细胞/ml 1000ml
四氢嘧啶 72mg
牛血清白蛋白 8mg
1）配液：
将血小板用生理盐水洗涤2次，用灭菌注射用水配成浓度为2×109细胞/ml的悬液，然后加入四氢嘧啶和牛血清白蛋白，静置1小时；
2）冻干:
a、预冻：将分装于西林瓶的溶液以10℃/分钟的速度从22℃降至-40℃，维持冷冻2小时； b、一次干燥：抽真空至12Pa，然后以5℃/分钟的升温速度升温至-5℃，维持干燥8小时； c、二次干燥：一次干燥后，以0.1℃/分钟的升温速度升温至22℃,维持干燥5小时，灭菌分装即得。
实施例8 注射用血小板冻干粉处方及制备
血小板细胞 2×109细胞/ml 1000ml
四氢嘧啶 60mg
聚乙烯吡咯烷酮 3mg
1）配液：
将血小板用生理盐水洗涤2次，用灭菌注射用水配成浓度为2×109细胞/ml的悬液，然后加入四氢嘧啶和聚乙烯吡咯烷酮，静置1小时；
2）冻干: a、预冻：将分装于西林瓶的溶液以10℃/分钟的速度从22℃降至-40℃，维持冷冻2小时； b、一次干燥：抽真空至12Pa，然后以5℃/分钟的升温速度升温至-5℃，维持干燥8小时； c、二次干燥：一次干燥后，以0.1℃/分钟的升温速度升温至22℃,维持干燥5小时，灭菌分装即得。
实施例9 注射用血小板冻干粉处方及制备
血小板细胞 2×109细胞/ml 1000ml
四氢嘧啶 15mg
聚乙烯吡咯烷酮 12g
1）配液：
将血小板用生理盐水洗涤2次，用灭菌注射用水配成浓度为2×109细胞/ml的悬液，然后加入四氢嘧啶和聚乙烯吡咯烷酮，静置1小时；
2）冻干:
a、预冻：将分装于西林瓶的溶液以10℃/分钟的速度从22℃降至-40℃，维持冷冻2小时； b、一次干燥：抽真空至10Pa，然后以5℃/分钟的升温速度升温至-5℃，维持干燥8小时； c、二次干燥：一次干燥后，以0.1℃/分钟的升温速度升温至22℃,维持干燥5小时，灭菌分装即得。
实施例10 注射用血小板冻干粉处方及制备
血小板细胞 2×109细胞/ml 1000ml
四氢嘧啶 17mg
聚乙烯吡咯烷酮 19mg
1）配液：
将血小板用生理盐水洗涤2次，用灭菌注射用水配成浓度为2×109细胞/ml的悬液，然后加入四氢嘧啶和聚乙烯吡咯烷酮，静置1小时；
2）冻干:
a、预冻：将分装于西林瓶的溶液以10℃/分钟的速度从22℃降至-40℃，维持冷冻2小时； b、一次干燥：抽真空至16Pa，然后以5℃/分钟的升温速度升温至-5℃，维持干燥8小时； c、二次干燥：一次干燥后，以0.1℃/分钟的升温速度升温至22℃,维持干燥5小时，灭菌分装即得。
实施例11 注射用血小板冻干粉处方及制备
血小板细胞 2×109细胞/ml 1000ml
羟基四氢嘧啶 20mg
聚乙烯吡咯烷酮 10mg
1）配液：
将血小板用生理盐水洗涤2次，用灭菌注射用水配成浓度为2×109细胞/ml的悬液，然后加入羟基四氢嘧啶和聚乙烯吡咯烷酮，静置1小时；
2）冻干:
a、预冻：将分装于西林瓶的溶液以10℃/分钟的速度从22℃降至-40℃，维持冷冻2小时； b、一次干燥：抽真空至24Pa，然后以5℃/分钟的升温速度升温至-5℃，维持干燥8小时； c、二次干燥：一次干燥后，以0.1℃/分钟的升温速度升温至22℃,维持干燥5小时，灭菌分装即得。
实施例12 注射用血小板冻干粉处方及制备
血小板细胞 2×109细胞/ml 1000ml
羟基四氢嘧啶 12mg
牛血清白蛋白 5mg
1）配液：
将血小板用生理盐水洗涤2次，用灭菌注射用水配成浓度为2×109细胞/ml的悬液，然后加入羟基四氢嘧啶和牛血清白蛋白，静置1小时；
2）冻干:
a、预冻：将分装于西林瓶的溶液以10℃/分钟的速度从22℃降至-40℃，维持冷冻2小时； b、一次干燥：抽真空至24Pa，然后以5℃/分钟的升温速度升温至-5℃，维持干燥8小时； c、二次干燥：一次干燥后，以0.1℃/分钟的升温速度升温至22℃,维持干燥5小时，灭菌分装即得。
实施例13 注射用血小板冻干粉处方及制备
血小板细胞 2×109细胞/ml 1000ml
四氢嘧啶 18mg
海藻糖 35mg
1）配液：
将血小板用生理盐水洗涤2次，用灭菌注射用水配成浓度为2×109细胞/ml的悬液，然后加入四氢嘧啶和海藻糖，静置1小时；
2）冻干:
a、预冻：将分装于西林瓶的溶液以10℃/分钟的速度从22℃降至-40℃，维持冷冻2小时； b、一次干燥：抽真空至10Pa，然后以5℃/分钟的升温速度升温至-5℃，维持干燥8小时； c、二次干燥：一次干燥后，以0.1℃/分钟的升温速度升温至22℃,维持干燥5小时，灭菌分装即得。
实施例14 注射用血小板冻干粉处方及制备
血小板细胞 2×109细胞/ml 1000ml
四氢嘧啶 11mg
海藻糖 18mg
1）配液：
将血小板用生理盐水洗涤2次，用灭菌注射用水配成浓度为2×109细胞/ml的悬液，然后加入四氢嘧啶和海藻糖，静置1小时；
2）冻干:
a、预冻：将分装于西林瓶的溶液以10℃/分钟的速度从22℃降至-40℃，维持冷冻2小时； b、一次干燥：抽真空至10Pa，然后以5℃/分钟的升温速度升温至-5℃，维持干燥8小时； c、二次干燥：一次干燥后，以0.1℃/分钟的升温速度升温至22℃,维持干燥5小时，灭菌分装即得。
实施例15 注射用血小板冻干粉处方及制备
血小板细胞 2×109细胞/ml 1000ml
四氢嘧啶 11mg
牛血清白蛋白 32mg
1）配液：
将血小板用生理盐水洗涤2次，用灭菌注射用水配成浓度为2×109细胞/ml的悬液，然后加入四氢嘧啶和牛血清白蛋白，静置1小时；
2）冻干:
a、预冻：将分装于西林瓶的溶液以10℃/分钟的速度从22℃降至-40℃，维持冷冻2小时； b、一次干燥：抽真空至7Pa，然后以5℃/分钟的升温速度升温至-5℃，维持干燥8小时； c、二次干燥：一次干燥后，以0.1℃/分钟的升温速度升温至22℃,维持干燥5小时，灭菌分装即得。
实施例16 注射用血小板冻干粉处方及制备
血小板细胞 2×109细胞/ml 1000ml
四氢嘧啶 19mg
葡聚糖 41mg
1）配液：
将血小板用生理盐水洗涤2次，用灭菌注射用水配成浓度为2×109细胞/ml的悬液，然后加入四氢嘧啶和葡聚糖，静置1小时；
2）冻干:
a、预冻：将分装于西林瓶的溶液以10℃/分钟的速度从22℃降至-40℃，维持冷冻2小时； b、一次干燥：抽真空至10Pa，然后以5℃/分钟的升温速度升温至-5℃，维持干燥8小时； c、二次干燥：一次干燥后，以0.1℃/分钟的升温速度升温至22℃,维持干燥5小时，灭菌分装即得。
实施例17 注射用血小板冻干粉制剂的急性毒性实验
SPF级KM小鼠，雌雄各半，体重16g-30g，称重后随机分为17组，一组尾静脉注射给予未冻干的血小板，其余16组分别静脉注射给予实施例1-实施例16所制备的冻干粉（冻干粉用生理盐水复溶），以血小板细胞个数计算给药剂量为1012/只，给药后连续观察14天。观察项目包括毒性反应、体重和组织病理学。
结果表明，小鼠尾静脉注射给予血小板冻干粉，以血小板细胞个数计为1014/只时，无明显毒性反应，给药前后及实验结束时小鼠体重无明显差异，组织病理学观察，未发现显著异常。说明本发明设计的注射用血小板冻干粉制剂安全性良好，单次大剂量给药不会引发不良反应。
实施例18 注射用血小板冻干粉制剂的长期毒性实验
Wister大鼠，雌雄各半，420g-600g，称重后随机分为17组，一组尾静脉注射给予未冻干的血小板，其余16组分别静脉注射给予实施例1至实施例16所制备的冻干粉（冻干粉用生理盐水复溶），以血小板细胞个数计算给药剂量为2×109/只，每两天给药1次，共30天，恢复期为14天。给药期间及恢复期内，观察大鼠给药前及给药后进行大体观察，记录大鼠的一般症状、记录给药前及给药后大鼠的体重，并定期进行血液学、尿液学和血生化检查，记录给药前及给药后大鼠的心电图。
结果显示，各组动物体重与对照组无显著差异，大体观察未发现异常。实验组动物的血液学、尿液学和血生化数据与对照组无显著差异。说明四注射用血小板冻干粉制剂长期给药的安全性良好，耐受性符合临床用药的要求。
实施例19 注射用血小板冻干粉制剂的血小板回收率
体外血小板细胞回收率=(复水后血小板数目／冻干前血小板数目)×100％
将实施例1-实施例16所制备的冻干粉用生理盐水复水，对复水前及复水后各组血小板细胞个数进行计数，计算各组血小板细胞回收率（每组取三份样品测定后取平均值）。 结果表明，各组冻干粉的体外血小板细胞回收率（均值）为81.7%-94.2%，其中实施例1、实施例2、实施例9和实施例11制备的由四氢嘧啶或羟基四氢嘧啶与聚乙烯吡咯烷酮组成的冻干粉的体外血小板细胞回收率集中于85.4%-95.0%，显著高于其他各组。
实施例20 注射用血小板冻干粉制剂的血小板最大聚集率
分别以不同浓度的二磷酸腺苷、凝血酶和瑞斯托霉素作为诱导剂，测定新鲜血小板及实施例1至实施例16制备的冻干血小板，复水后血小板的最大凝集率，并进行比较。 结果见表：新鲜血小板组命名为第0组，实施例1至实施例16组分别命名为第1、2、3、4、5、6、8、8、9、10、11、12、13、14、15和16组。
表1
| 组别 | 最大凝集率（%） |
| 新鲜血小板 | 97.2±5.9 |
| 实施例1冻干血小板复水后 | 91.6±9.5 |
| 实施例2冻干血小板复水后 | 91.0±3.7 |
| 实施例3冻干血小板复水后 | 78.4±4.1 |
| 实施例4冻干血小板复水后 | 81.9±2.4 |
| 实施例5冻干血小板复水后 | 77.8±1.2 |
| 实施例6冻干血小板复水后 | 80.1±6.4 |
| 实施例7冻干血小板复水后 | 84.0±1.7 |
| 实施例8冻干血小板复水后 | 79.6±8.3 |
| 实施例9冻干血小板复水后 | 93.7±5.8 |
| 实施例10冻干血小板复水后 | 77.9±2.9 |
| 实施例11冻干血小板复水后 | 90.6±3.4 |
| 实施例12冻干血小板复水后 | 82.2±4.0 |
| 实施例13冻干血小板复水后 | 75.3±8.1 |
| 实施例14冻干血小板复水后 | 69.5±2.2 |
| 实施例15冻干血小板复水后 | 76.4±9.2 |
| 实施例16冻干血小板复水后 | 84.1±0.9 |
由表1可见，实施例1至实施例16制备的冻干血小板复水后具有良好的凝聚活性，最大凝集率显著高于现有技术。
实施例21 注射用血小板冻干粉制剂的体内药效学实验
雄性BALB/C小鼠,6-8周龄，22g-25g，检疫合格后用环磷酰胺制备血小板减少模型。每只小鼠给予环磷酰胺的方案为，首日静脉注射给予环磷酰胺200mg/kg，然后在后续的6天里，每天腹腔注射环磷酰胺30mg/kg。最后一次注射完环磷酰胺后24小时，取血小板数降至造模前20%-40%的小鼠，随机分为16个实验组和一个对照组。实验组静脉注射给予实施例1至实施例16制备的冻干粉，对照组给予新鲜血小板。各组动物以血小板细胞个数计算给药剂量为2×109/只，每天给药1次，共7天。给药结束后第3天，尾静脉采血，以全血细胞自动分析仪测血小板计数，计算给药后血小板数与造模后血小板数的比值，并测定各组小鼠血小板的最大凝集率。
结果见表2
表2
| 组别 | 血小板计数 | 最大凝集率（%） |
| 新鲜血小板 | 4.93 | 100.0±2.9 |
| 实施例1冻干血小板复水后 | 4.85 | 94.1±1.4 |
| 实施例2冻干血小板复水后 | 4.70 | 94.7±5.7 |
| 实施例3冻干血小板复水后 | 3.61 | 82.3±9.5 |
| 实施例4冻干血小板复水后 | 3.78 | 79.0±6.4 |
| 实施例5冻干血小板复水后 | 3.22 | 82.8±7.9 |
| 实施例6冻干血小板复水后 | 3.43 | 85.1±2.1 |
| 实施例7冻干血小板复水后 | 3.94 | 81.7±8.2 |
| 实施例8冻干血小板复水后 | 3.29 | 76.4±5.7 |
| 实施例9冻干血小板复水后 | 4.57 | 92.9±3.0 |
| 实施例10冻干血小板复水后 | 3.74 | 79.0±8.4 |
| 实施例11冻干血小板复水后 | 4.83 | 96.1±2.9 |
| 实施例12冻干血小板复水后 | 3.79 | 80.5±9.1 |
| 实施例13冻干血小板复水后 | 4.08 | 79.4±6.8 |
| 实施例14冻干血小板复水后 | 3.62 | 79.8±1.6 |
| 实施例15冻干血小板复水后 | 4.15 | 75.7±4.4 |
| 实施例16冻干血小板复水后 | 4.20 | 82.6±7.2 |
表2中血小板计数为给药后血小板数与造模后血小板数的比值。
由表2可见，实施例1至实施例16制备的冻干粉，对小鼠血小板减少模型，具有预想不到的显著疗效，给药后三天，仍可使血小板细胞数目保持在高水平，并且凝聚功能损失较小。给药期间及给药后未发现明显的不良反应。
Claims (2)
1.一种注射用血小板冻干粉制剂，其特征在于：由血小板和冷冻保护剂组成，所述冷冻保护剂由选自四氢嘧啶、羟基四氢嘧啶的任意一种和非渗透性冷冻保护剂组成，所述非渗透性冷冻保护剂选自聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖、人血清白蛋白和海藻糖中的任意一种，所述四氢嘧啶或羟基四氢嘧啶用量为每1012个血小板细胞用10mg-30mg，所述非渗透性冷冻保护剂的用量为每1012个血小板细胞用2mg-20mg；
该注射用血小板冻干粉制剂制备方法步骤为：
1）配液：
将血小板用生理盐水洗涤2次，用灭菌注射用水配成浓度为2×109细胞/ml的悬液，然后加入四氢嘧啶和非渗透性冷冻保护剂，静置1小时；
2）冻干：
a、预冻：将分装于西林瓶的溶液以10℃/分钟的速度从22℃降至-40℃，维持冷冻2小时；
b、一次干燥：抽真空至7Pa～30Pa，然后以5℃/分钟的升温速度升温至-5℃，维持干燥8小时；
c、二次干燥：一次干燥后，以0.1℃/分钟的升温速度升温至22℃,维持干燥5小时，灭菌分装即得。
2.根据权利要求1所述的注射用血小板冻干粉制剂，其特征在于：所述非渗透性冷冻保护剂为聚乙烯吡咯烷酮，所述聚乙烯吡咯烷酮的用量为每1012个血小板细胞用2mg-14mg。
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2011
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