CN102321606B - 一种利用大气压冷等离子体提高细胞膜通透性的方法 - Google Patents

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本发明公开一种利用大气压冷等离子体发生器提高细胞膜通透性的方法，属于冷等离子体技术在生物技术领域的应用。本发明采用间距为1～12mm的金属电极，以空气等气体为放电气体，石英板为放电介质，在电压0.5～100kV，频率0～50MHz，温度为15～45℃的条件下，作用10s～25min，对原核细胞和真核细胞进行处理，可高效、方便的提高细胞膜的通透性。利用这种低能耗，无毒性，效率高的大气压冷等离子体的方法来提高微生物细胞膜的通透性，可应用于微生物发酵、分子生物学感受态细胞的制备以及辅助创伤给药治疗等领域。

Description

一种利用大气压冷等离子体提高细胞膜通透性的方法
技术领域
本发明属于冷等离子体技术在生物学领域的应用，特别涉及利用大气压冷等离子体提高细胞膜通透性的应用。
背景技术
等离子体是物质的第四态，放电过程可以产生大量高能电子、离子、分子、中性原子、激发态原子、光子和自由基，具有高度的物理和化学活性。大气压冷等离子体可以在大气压下通过气体放电获得，整个体系温度接近室温，具有作用效果显著、低能耗、无毒性等优点，因而在生物领域具有广泛的应用前景。
细胞膜是包围细胞质的一层半透性薄膜，其主要性状之一是选择通透性。细胞膜通透性的提高有利于细胞与周围环境之间的物质交换、能量转换和信号转导。
通常提高细胞膜通透性的方法包括物理方法(如电处理、超声波、渗透压等)和化学方法(如添加吐温、C16-18饱和脂肪酸、青霉素等)。但是，这些方法往往存在作用效果不明显、成本高、后处理不便等问题。本发明采用大气压冷等离子体这种条件温和且能量密度较高的方法对微生物细胞膜进行处理，可以高效、方便的提高细胞膜的通透性。
发明内容
本发明通过采用大气压冷等离子体中的介质阻挡放电等离子体作用于微生物细胞悬浮液，利用了大气压冷等离子体具有的条件温和且能量密度高的特点，达到了提高细胞膜通透性的目的，其具体操作步骤如下：
将微生物细胞悬浮液载于石英载片上，将载片置于大气压冷等离子体发生器的放电区，放电区金属电极的间距为1～12mm，外加电压0.5～100kV，频率0～50MHz，作用时间为10s～25min，作用温度为15～45℃；其中，放电区的工作气体为下述一种或几种的混合物：空气、氮气、氩气、氦气。
当上述操作条件为下述值时，处理的效果较佳：
当电极间距为3～4mm，外加电压为12kV，频率设定为20MHz，作用时间为30s～240s，作用温度为25℃，工作气体为空气时，提高细胞膜通透性的效果较佳。
当上述电极为下述的一种：铜、铝、不锈钢，尤其是不锈钢的时候，效果较佳。
当上述电极是平板型或同轴型，尤其是平板型的时候，效果较佳。
当上述微生物为原核微生物或真核微生物时，细胞悬浮液中的细胞个数为1×105～1×109个/mL，效果均较佳。
当上述原核微生物为克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，细胞悬浮液中的细胞个数为1×107个/mL时，效果较佳。
当上述真核微生物为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，细胞悬浮液中的细胞个数为5×105个/mL，效果较佳。
当上述细胞悬浮液按下述方法制备时，效果较佳：在无菌条件下，将培养至对数期的菌液收集、8000～10000r/min，0～4℃，离心20～30min后所得沉淀用0.05mol/L的磷酸钾缓冲液洗涤两次后，再用磷酸钾缓冲液稀释制得，其中，所述磷酸钾缓冲液的浓度为0.05mol/L，pH为7.0。
本发明中涉及到的微生物细胞培养及微生物细胞悬浮液的制备方法，均属于本领域普通技术人员根据现有技术和常规实验能够完成的，因此在实现获得培养至对数期微生物并稀释至上述浓度范围的前提下，可通过调节培养基的种类、微生物接种的量、培养温度、或改变其他培养条件来实现。
有益效果：本发明具有操作简单、无毒性、高效性的特点。不会引发微生物细胞完全失活，并可以达到提高微生物细胞膜通透性的效果。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
下述实施例中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得，或可以常规方法制备。
以下结合大气压介质阻挡放电等离子体处理原核微生物克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)以及真核微生物酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
Luria-Bertani(LB)培养基：
胰蛋白胨：10g；酵母粉：5g；氯化钠：10g；加水调至1L并调pH至7.0后，121℃灭菌后冷却备用。LB固体培养基在液体培养基基础上添加15g/L琼脂粉。
酵母浸出粉胨葡萄糖(Yeast Peptone Dextrose，YPD)培养基：
酵母膏：10g；蛋白胨：20g；葡萄糖：20g；溶于1000ml水中，115℃灭菌后冷却备用。YPD固体培养基在液体培养基基础上添加20g/L琼脂粉。
实施例1大气压冷等离子体提高克雷伯氏菌细胞膜的通透性
一.所用菌种：克雷伯氏菌，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，菌种保藏号是1.6366。
二.实验步骤：
1.细胞培养：将克雷伯氏菌接种于Luria-Bertani培养基，接种量为体积百分含量1％，摇床转速为170r/min，温度为37℃，培养时间为10h。
2.细胞悬浮液的制备：将培养至OD值为2.0菌液收集，在无菌条件下8000r/min，4℃，离心30min，沉淀用0.05mol/L、pH 7.0的磷酸钾缓冲液洗涤两次后，再离心，将沉淀制成菌悬液，菌悬液中菌体细胞个数1×107个/mL，4℃保存备用。将微生物细胞悬浮液载于石英载片，然后置于等离子体放电区下电极正中进行处理。
3.根据需要设定大气压介质阻挡放电等离子体发生器的工作气体为空气，工作参数为电极间距为4mm，外加电压12kV，频率20MHz，电极为不锈钢平板电极，作用温度25℃。
4.使用大气压介质阻挡放电等离子体对克雷伯氏菌细胞悬浮液进行处理，处理时间分别为0s，30s，60s，90s，120s。
5.将等离子体处理的菌液用0.05mol/L、pH7.0的磷酸钾缓冲液稀释105～107倍，涂布于LB固体培养基中，37℃培养时间12h，数菌落数，计算存活率。
6.对大气压介质阻挡放电等离子体发生器处理的克雷伯氏菌细胞，根据菌体存活率调整不同处理时间的菌液浓度，使OD值均为2.0，然后检测细胞膜的通透性。
7.对大气压介质阻挡放电等离子体发生器处理的克雷伯氏菌细胞，根据菌体存活率调整不同处理时间的菌液浓度，使OD值均为2.0，然后接种于LB液体培养基，以检测其活性及在生长过程中的细胞膜通透性变化。
8.检测方法如下：
(1)菌液浓度测定：采用分光光度计法在650nm检测吸光值。待测样品浓度均用0.05mol/L、pH 7.0的磷酸钾缓冲液稀释为吸光值为2.0。
(2)细胞膜通透性测定：采用二乙酸荧光素(Fluorescein diacetate，FDA)染色[1]，通过荧光分光光度计检测荧光强度(最大激发光波长269nm，发射光波长517nm)。所得样品荧光强度与对照组荧光强度相比，即为相对荧光强度。
(3)存活率计算：通过平板计数法计数不同处理时间菌体存活个数，根据公式计算菌体存活率：
菌体存活率＝处理菌液存活细胞数/对照组细胞数×100％
对比经过不同时间的大气压介质阻挡放电等离子体处理后的克雷伯氏菌细胞和对照细胞的菌体存活率，如表1所示，随处理时间延长，菌体存活率有轻微的减少，但是60％以上的大部分菌细胞还是处于存活状态。
表1经不同时间大气压冷等离子体处理克雷伯氏菌的存活率
  时间(s)   0   30   60   90   120
  存活率(％)   100   85   80   75   66
对大气压介质阻挡放电等离子体处理的克雷伯氏菌细胞，根据菌体存活率调整不同处理时间的菌液浓度，使OD值均为2.0，然后检测细胞膜的通透性。结果如表2所示，各组细胞OD值均为2.0的条件下，处理120s后的克雷伯氏菌细胞膜通透性比对照组细胞的细胞膜通透性提高了52％，可见细胞膜的通透性得到很大程度的提高。
表2经不同时间大气压冷等离子体处理克雷伯氏菌细胞膜的通透性
  时间(s)   0   30   60   90   120
  相对荧光强度   1   1.21   1.31   1.40   1.52
大气压介质阻挡放电等离子体处理克雷伯氏菌菌液，根据菌体存活率调整不同处理时间的菌液浓度，使OD值均为2.0，然后按照体积百分含量1％接种于100mL LB液体培养基中，分别于发酵8h、12h后检测菌体OD和细胞膜通透性。
发酵8h后检测菌体OD和细胞膜通透性。结果如表3所示，处理不同时间的菌液发酵后OD值均有增长，说明处理后的菌液具有生长活性。其细胞膜的通透性在发酵中期也出现不同程度的提高，和处理前相比，处理120s后的克雷伯氏菌细胞膜通透性比对照组细胞提高2.4倍。
表3发酵8h时克雷伯氏菌的OD值和细胞膜通透性的变化
Figure BDA0000081021100000051
发酵12h后检测细胞膜通透性。结果如表4所示，不同处理时间的菌体细胞膜通透性与对照组细胞无明显差别。通过本发明所述方法处理的细胞在发酵后期，通过OD值可知，其细胞生长能力与对照组细胞生长能力相当；不同处理时间的细胞生长能力在发酵后期也无明显区别。
表4发酵12h时克雷伯氏菌的OD值和细胞膜通透性的变化
Figure BDA0000081021100000052
实施例2大气压冷等离子体提高酿酒酵母细胞膜的通透性
一.所用菌种：酿酒酵母，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，菌种保藏号是2.604。
二.实验步骤：
1.细胞培养：将酿酒酵母接种于酵母浸出粉胨葡萄糖培养基，接种量按体积百分含量1％，摇床转速为170r/min，温度为30℃，培养时间为12h。
2.细胞悬浮液的制备：将培养至OD值为2.0菌液收集，在无菌条件下8000r/min，4℃，离心30min，沉淀用0.05mol/L、pH 7.0的磷酸盐缓冲液洗涤两次后，再离心，将沉淀制成菌悬液，菌悬液中菌体细胞个数5×105个/mL，4℃低温保存备用。将微生物细胞悬浮液载于石英载片，然后置于等离子体放电区下电极正中进行处理。
3.根据需要设定大气压介质阻挡放电等离子体的工作气体为空气，工作参数为电极间距为3mm，外加电压12kV，频率20MHz，电极为不锈钢平板电极，作用温度25℃。
4.使用大气压介质阻挡放电等离子体对酿酒酵母细胞悬浮液进行处理，处理时间分别为0，60s，120s，180s，240s。
5.将等离子体处理的菌液用0.05mol/L、pH 7.0的磷酸盐缓冲液稀释105～107倍，涂布于LB固体培养基中，37℃培养时间12h，数菌落数，计算存活率。
6.对大气压介质阻挡放电等离子体处理的酿酒酵母细胞，根据菌体存活率调整不同处理时间的菌液浓度，使OD值均为2.0，然后检测细胞膜的通透性。
7.大气压介质阻挡放电等离子体处理酿酒酵母菌液，根据菌体存活率调整不同处理时间的菌液浓度，使OD值均为2.0，然后接种于酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基，以检测其活性及在生长过程中的细胞膜通透性变化。
8.检测方法如下：
(1)菌液浓度测定：采用分光光度计法在600nm检测吸光值。待测样品浓度均稀释为吸光值为2.0。
(2)细胞膜通透性测定：采用二乙酸荧光素(FDA)染色[1]，通过荧光分光光度计检测荧光强度(最大激发光波长269nm，发射光波长517nm)。所得样品荧光强度与对照组荧光强度相比，即为相对荧光强度。
(3)存活率计算：通过平板计数法计数不同处理时间菌体存活个数，根据公式计算菌体存活率：
菌体存活率＝处理菌液存活细胞数/对照组细胞数×100％
对比经过不同时间的大气压介质阻挡放电等离子体处理后的酿酒酵母细胞和对照细胞的菌体存活率，如表5所示，随处理时间延长，菌体存活率减少，但是处理240s的菌液仍有30％的细胞存活。
表5经不同时间大气压冷等离子体处理酿酒酵母的存活率
  时间(s)   0   60   120   180   240
  存活率(％)   100   69   38   35   30
对大气压介质阻挡放电等离子体处理的酿酒酵母细胞，根据菌体存活率调整不同处理时间的菌液浓度，使OD值均为2.0，然后检测细胞膜的通透性。结果如表6所示，各组细胞浓度均为2.0的条件下，细胞膜的通透性得到很大程度的提高，结果见表2，和处理前相比，处理120s后的克雷伯氏菌细胞膜通透性比对照提高1.2倍。
表6经不同时间大气压冷等离子体处理酿酒酵母细胞膜的通透性
  时间(s)   0   60   120   180   240
  相对荧光强度   1   1.03   1.12   1.43   2.19
大气压介质阻挡放电等离子体处理酿酒酵母菌液，根据菌体存活率调整不同处理时间的菌液浓度，使OD值均为2.0，然后按照体积百分含量1％接种于100mL YPD液体培养基中，分别于发酵9h、15h后检测菌体OD和细胞膜通透性。
发酵9h后检测菌体OD和细胞膜通透性。结果如表7所示，处理不同时间的菌液发酵后OD值均有增长，说明处理后的菌液具有生长活性。其细胞膜的通透性在发酵中期也出现不同程度的提高，和处理前相比，处理60s后的酿酒酵母在发酵9h时，其细胞膜通透性比对照提高67％。
表7发酵9h时酿酒酵母的OD值和细胞膜通透性的变化
Figure BDA0000081021100000071
发酵15h后检测细胞膜通透性，结果如表8所示，不同处理时间的菌体细胞膜通透性接近对照组。通过本发明所述方法处理的细胞在发酵后期，通过OD值可知，其细胞生长能力与对照组细胞生长能力相当；不同处理时间的细胞生长能力在发酵后期也无明显区别。
表8发酵15h时酿酒酵母的OD值和细胞膜通透性的变化
参考文献
[1]卢群，丘泰球，杨红.Rh123、FDA荧光法测定超声作用对大肠杆菌细胞膜的影响[J].广州药学院学报，2006，22(2)：179-184.

Claims (3)

1.一种利用大气压冷等离子体提高细胞膜通透性的方法，用大气压冷等离子体作用于微生物细胞悬浮液，其特征在于：所述的作用方式为，将微生物细胞悬浮液载于石英载片，置于等离子体放电区，放电区金属电极间距为3~4mm，外加电压12 kV，频率20MHz，作用时间为30s~240 s，作用温度为25℃；其中，放电区的工作气体为空气；
其中，所述微生物细胞悬浮液为1×107个/mL的肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）细胞悬浮液或5×105个/mL的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）细胞悬浮液；其制备方法为，在无菌条件下，将培养至对数期的菌液收集、8000~10000 r/min，0~4 ℃，离心20~30 min、用磷酸钾缓冲液洗涤两次后，用磷酸钾缓冲液稀释制得，其中，所述磷酸钾缓冲液的浓度为0.05 mol/L，pH 为7.0。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述电极是下述的一种：铜、铝、不锈钢。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述电极是平板型或同轴型。
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