CN102321602A - β-内酰胺酶促进功能蛋白折叠的用途及融合蛋白的制备 - Google Patents

Abstract

本发明提供了β-内酰胺酶(BL)或与β-内酰胺酶氨基酸序列同一性至少为20％的肽段在作为前导肽促进功能蛋白折叠中的用途。本发明使用的前导序列中的一个或多个可切除氨基酸残基与隔离前导序列和待折叠蛋白前体的一个或多个可切除氨基酸残基相同，这有利于在折叠后将前导序列片段去除，从而简化下游的纯化步骤。并且本发明前导蛋白可以促进功能蛋白的折叠。

Description

β-内酰胺酶促进功能蛋白折叠的用途及融合蛋白的制备

技术领域

本发明涉及一种β-内酰胺酶的新用途，具体地说是β-内酰胺酶作为前导蛋白促进功能蛋白折叠的新用途，及由该前导蛋白制备得到的融合蛋白。

发明背景

很多蛋白质的前导序列对其完成正确折叠与成熟是不可或缺的。这种依赖于前导序列的蛋白质折叠现象最早是1987年Ikemura等在研究枯草杆菌蛋白酶时发现的。枯草杆菌蛋白酶是一类来自枯草杆菌的碱性丝氨酸蛋白酶，其酶原的N端为77个氨基酸残基组成的前导序列。枯草杆菌蛋白酶很好的证明了蛋白的折叠是被一个前导序列所调节的，“枯草杆菌蛋白酶”家族包括了原核生物、真核生物及拱形生物来源的酶。前导序列对体内和体外产生活性枯草杆菌蛋白酶都十分重要，作为前导序列，它的功能是促进蛋白酶结构域的正确折叠。

前导序列的特性包括：

a)前导序列与目标蛋白利用一个肽键形成单一多肽而互相连接；

b)前导序列对目标蛋白的活性构象形成而言是绝对必需的，但它不是目标蛋白的功能所必需的；

c)一旦蛋白折叠完成，前导序列即自动去除或由其它肽链内切酶切除；

d)前导序列不具有催化剂作用，即一分子前导序列只能使一分子目标蛋白再折叠；

e)前导序列是一种只对目标蛋白才发挥作用的具有高度特异性的特制多肽。

带有前导序列的点突变会影响蛋白酶的折叠功能，使得相同的氨基酸顺序会得到不同的结构和活性，基于前导序列指导酶的空间结构的特异性折叠，从而引入了″记忆蛋白″的概念。已经发现很多蛋白折的叠机制被前导序列所调节，包括蛋白酶，激素，生长因子，神经肽和血浆蛋白等均需要的前导序列列来帮助正确折叠。在利用基因工程法生产这些蛋白质的过程中，包涵体复性时，蛋白质的正确折叠往往是最关键的问题。采用合适的前导序列可以帮助蛋白质实现正确的折叠。

发明内容

本发明目的是提供一种β-内酰胺酶的新用途。

本发明的另一目的在于提供由β-内酰胺酶作为前导蛋白制备得到的融合蛋白。

本发明的再一目的在于提供一种促进所述融合蛋白中功能蛋白正确折叠的方法。

本发明的发明思路为：β-内酰胺酶是由革兰阴性菌产生的，能够降解β-内酰胺类抗生素的酶。目前该领域还没有提出β-内酰胺酶或其任何部分可具有前导序列的作用。我们首次发现β-内酰胺酶(BL)或其一部分与功能蛋白通过一定氨基酸序列的肽段连接后，在水溶性环境中加入一种变性剂后可以促进该功能蛋白的正确折叠。

本发明采用如下具体技术方案：

β-内酰胺酶(BL)或与β-内酰胺酶氨基酸序列同一性至少为20％的肽段在作为前导肽促进功能蛋白折叠中的用途。

所述功能蛋白为胰蛋白酶原、胰岛素原或胰岛素原类似物。

所述前导肽为β-内酰胺酶或与β-内酰胺酶氨基酸序列同一性至少为20％的肽段。

所述前导蛋白序列如SEQ ID No.1或2所示。

一种融合蛋白，该融合蛋白自N端至C端由β-内酰胺酶或与β-内酰胺酶氨基酸序列同一性至少为20％的肽段作为前导肽通过一个精氨酸、赖氨酸或一种C端为精氨酸或赖氨酸的二肽-六肽与功能蛋白前体的氨基酸序列连接而成。

所述前导肽序列如SEQ ID No.1或2所示。

所述功能蛋白为胰蛋白酶原、胰岛素原或胰岛素原类似物。

所述融合蛋白序列如SEQ ID No.5或6所示。

一种促进功能蛋白质折叠的方法，将上述的融合蛋白溶于含有巯基乙醇的脲溶液中，融合蛋白终浓度为5～35mg/ml。

所述脲溶液为含有1.5～6.5mM巯基乙醇的8M脲溶液。

所述脲溶液pH为10.5。

本发明的有益效果：

本发明使用的前导序列可促进待复性功能蛋白的折叠，正确折叠率远高于没有前导序列存在时的情况。将功能蛋白序列非正确折叠的融合蛋白与变性剂相接触时，功能蛋白序列正确折叠的融合蛋白的产量要高于将不含有所述前导序列的非正确折叠功能蛋白序列与同样的变性接触时的正确折叠功能蛋白序列的产量。该方法所需步骤少，适合于工业化规模。

本发明使用的前导序列中的一个或多个可切除氨基酸残基与隔离前导序列和待折叠蛋白前体的一个或多个可切除氨基酸残基相同，这有利于在折叠后将前导序列片段去除，从而简化下游的纯化步骤。

本发明的可实施性和突出实质性特点以及积极效果可通过以下实例得以体现，但不限制其范围。

具体实施方式

实施例1编码融合蛋白SEQ ID No.5DNA序列的合成

(1)基因的设计

采用计算机辅助进行设计，结构基因均选用大肠杆菌偏爱的密码子，按SEQ ID No.5氨基酸序列进行设计，经PC-GENE软件检索，对个别密码子进行调整以消除任何正、逆向重复序列和不适当酶切位点。在结构基因的5′-端增加了起始密码子ATG，3′-端增加了终止密码子TAA，TGA及适合完整蛋白表达的核糖体结合位点。

(2)寡聚核苷酸片段的化学合成

SEQ ID No.5基因分成30个30～40mers的寡聚核苷酸片段，在ABI381A型DNA合成仪上采用固相亚磷酸胺法分别合成。然后，进行末端标记，放射自显影方法检查片段的纯度。

(3)基因的拼接和PCR扩增

除两个5′-端片段外，其余片段各取0.2OD，混合后在含10mM ATP，20uKinase的激酶反应体系中进行5′-端磷酰化，灭活Kinase后，加入两个5′-端片段并加NaCl至终浓度为0.1M，先从95℃缓慢退火至65℃，再从65℃退火至25℃。然后，转换成连接酶反应体系，加入80u ligase于16℃连接过夜。连接结果用5％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。再以连接产物作模板，以两个5′-端片段作引物，进行PCR扩增。扩增产物经5％聚丙烯酰胺凝胶电泳，溴乙锭染色后，在长波紫外下对照分子量标准切下全长基因的凝胶条带，用“压碎浸泡”法回收DNA。

(4)克隆和测序

PCR所得的基因经KpnI，BamHI双酶切后与同样酶切的M13mp 18RFDNA以5∶1摩尔比混合后，加入ligase 80u于16℃连接过夜。转化至大肠杆菌JM109感受态细胞。对重组的白色噬菌斑进一步用PCR方法加以筛选。凡能用两个5′-端片段扩增出SEQ ID No.5全长基因的克隆，再用碱法小量制备其RF DNA，进一步酶切分析，然后抽提酶切正确的重组克隆的单链DNA，用ABI373A型DNA自动测序仪作序列分析。

实施例2编码融合蛋白SEQ ID No.6DNA序列的合成

(1)基因的设计

采用计算机辅助进行设计，结构基因均选用大肠杆菌偏爱的密码子，按SEQID No.6氨基酸序列进行设计，经PC-GENE软件检索，对个别密码子进行调整以消除任何正、逆向重复序列和不适当酶切位点。在结构基因的5′-端增加了起始密码子ATG，3′-端增加了终止密码子TAA，TGA及适合完整蛋白表达的核糖体结合位点。

(2)寡聚核苷酸片段的化学合成

SEQ ID No.6基因分成10个28～35mers的寡聚核苷酸片段，在ABI381A型DNA合成仪上采用固相亚磷酸胺法分别合成。然后，进行末端标记，放射自显影方法检查片段的纯度。

(3)基因的拼接和PCR扩增

除两个5′-端片段外，其余片段各取0.2OD，混合后在含10mM ATP，20uKinase的激酶反应体系中进行5′-端磷酰化，灭活Kinase后，加入两个5′-端片段并加NaCl至终浓度为0.1M，先从95℃缓慢退火至65℃，再从65℃退火至25℃。然后，转换成连接酶反应体系，加入80u ligase于16℃连接过夜。连接结果用5％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。再以连接产物作模板，以两个5′-端片段作引物，进行PCR扩增。扩增产物经5％聚丙烯酰胺凝胶电泳，溴乙锭染色后，在长波紫外下对照分子量标准切下全长基因的凝胶条带，用“压碎浸泡”法回收DNA。

(4)克隆和测序

PCR所得的基因经KpnI，BamHI双酶切后与同样酶切的M13mp 18RFDNA以5∶1摩尔比混合后，加入ligase 80u于16℃连接过夜。转化至大肠杆菌JM109感受态细胞。对重组的白色噬菌斑进一步用PCR方法加以筛选。凡能用两个5′-端片段扩增出SEQ ID No.6全长基因的克隆，再用碱法小量制备其RF DNA，进一步酶切分析，然后抽提酶切正确的重组克隆的单链DNA，用ABI373A型DNA自动测序仪作序列分析。

实施例3前导序列存在下胰蛋白酶原的制备

(1)DNA的获得及细菌表达载体的构建

采用固相亚磷酸胺法化学合成编码含有SEQ ID No.5的氨基酸序列的DNA片段(具体方法见实施例1)。合成的DNA片段包含一个5′端Cla I到3′端Kpn I的片段和一段由5′端Kpn I到3′端Hind III的片段并分别克隆到pUC的载体中，其中Kpn I可切割编码SEQ ID No.5的51位和52位氨基酸残基的核酸序列。然后将编码SEQ ID No.5的完整的氨基酸序列的DNA片段亚克隆到修饰的p ATH2载体中，以使融合蛋白的表达受到Trp启动子和SD序列的调控。所得载体pTRY-1则用于BL-胰蛋白酶原融合蛋白的表达。

(2)BL-胰蛋白酶原融合蛋白的表达

将BL-胰蛋白酶原融合蛋白的表达载体转化到大肠杆菌菌株RR1或K12W3110中。将转化的大肠杆菌细胞培养于含有微量元素的M9-CA培养基中。对BL-胰蛋白酶原融合蛋白在摇瓶和发酵罐中的表达水平均进行检测。在这两种情况下均可观察到相当于大肠杆菌总蛋白的8～15％的高水平表达。

(3)BL-胰蛋白酶原融合蛋白的重折叠

BL-胰蛋白酶原融合蛋白是以不可溶的“包涵体”形式表达，为释放包涵体，在900巴的高压匀浆器中将大肠杆菌细胞破碎。通过11000g离心去除细胞碎片和可溶性大肠杆菌蛋白。用水将含有BL-胰蛋白酶原融合蛋白的包涵体清洗三次。所得包涵体沉淀用作折叠的原材料，其中的BL-胰蛋白酶原融合蛋白约为90％的纯度。将包涵体溶于pH10.5并含有1.5～6.5mM巯基乙醇的8M脲中，使BL-胰蛋白酶原融合蛋白的浓度为5～20mg/ml。离心去除不溶性物质，用低浓度的脲将上清稀释10倍，使脲的终浓度为2.5～6.5M，pH为8.5～10.5，巯基乙醇的终浓度则为0.15～0.65mM。在4℃和3.0M脲浓度，pH 9.0的条件下进行常规折叠。在这样的条件下，正确折叠的BL-胰蛋白酶原的停留时间约为52min。折叠可在24h内完成。再折叠率约为45％。

利用10K超滤系统将滤出液组分中正确折叠的BL-胰蛋白酶原融合蛋白浓缩。在pH 3.5下用水去除脲。超滤步骤的产率超过85％。

(4)正确折叠的BL-胰蛋白酶原的胰蛋白酶裂解

胰蛋白酶裂解时，正确折叠的BL-胰蛋白酶原融合蛋白的浓度约为9.5～12.5mg/ml，优选的为10.5mg/ml。胰蛋白酶与BL-胰蛋白酶原融合蛋白的比例范围约为1∶600-1∶2500，优选的为1∶1500。pH值约维持在9.5-11.5，优选的为10.5。于4℃下将裂解进行约1～5h，优选的为3.6h。

(5)胰蛋白酶原的纯化

用溶于10mM柠檬酸缓冲液的NaCl作为洗脱液，由阳离子交换层析将胰蛋白酶纯化。纯化的胰蛋白酶原具有高于90％的纯度。

(6)纯化胰蛋白酶的活性鉴定

1)胰蛋白酶浓度及活性的测定：

①胰蛋白酶浓度的测定：

在比色皿中将样品用0.001mol/L HCl稀释成适当浓度(OD280值在0.3～0.7之间为宜)，在280nm处测其OD值，平行测3个样，然后根据以下公式计算出胰蛋白酶的浓度：

胰蛋白酶浓度(mg/ml)＝A280×0.7×稀释倍数

②胰蛋白酶活性的测定：

A)将分光光度计的波长调为247nm，用pipette吸取已配好的pH值为8.1的缓冲液2.6ml，放入3ml的比色皿中，再加入0.3ml 0.01mol/L TAME，用此液作空白。再加入已稀释的酶0.1ml混匀，立即放入分光光度计中，每隔30秒记数，至3分钟为止，其线性增长区间必须在3分钟以上。

活性单位的计算：选择图谱中的线性部分，计算公式如下：

$U/\mathrm{mg}=\frac{\mathrm{\ΔA}247/\min \×1000\×3}{540\×\mathrm{mgTrylp}\sin \mathrm{inreactionmixture}}$

B)标准规定：胰蛋白酶的活性≥130.0U/mg

实施例4无前导序列、有变性剂条件下胰蛋白酶原的折叠

(1)DNA的获得及细菌表达载体的构建

采用固相亚磷酸胺法化学合成编码含有SEQ ID No.3的氨基酸序列的DNA片段(具体方法参考实施例1)。细菌表达载体的构建方法与实施例3细菌表达载体的构建方法相同。

(2)胰蛋白酶原融合蛋白的表达

将胰蛋白酶原的表达载体转化到大肠杆菌菌株RR1或K12W3110中。将转化的大肠杆菌细胞培养于含有微量元素的M9-CA培养基中。对胰蛋白酶原在摇瓶和发酵罐中的表达水平均进行检测。在这两种情况下均可观察到相当于大肠杆菌总蛋白的8～15％的高水平表达。

(3)胰蛋白酶原融合蛋白的重折叠

胰蛋白酶原是以不可溶的“包涵体”形式表达，为释放包涵体，在900巴的高压匀浆器中将大肠杆菌细胞破碎。通过11000g离心去除细胞碎片和可溶性大肠杆菌蛋白。用水将含有胰蛋白酶原的包涵体清洗三次。所得包涵体沉淀用作折叠的原材料，其中的胰蛋白酶原约为90％的纯度。将包涵体溶于pH10.4并含有1.2～6.0mM巯基乙醇的7.5M脲中，使胰蛋白酶原的浓度为5-25mg/ml。离心去除不溶性物质，用低浓度的脲将上清稀释10倍，使脲的终浓度为2.5～6.5M，pH为8.0～10.0，巯基乙醇的终浓度则为0.12～0.60mM。在4℃和3.0M脲浓度，pH 9.4的条件下进行常规折叠。在这样的条件下，正确折叠的胰蛋白酶原的停留时间约为75min。折叠可在48h内完成。再折叠率约为5％。

实施例5无变性剂、有前导序列条件下胰蛋白酶原的折叠

(1)DNA的获得及细菌表达载体的构建

采用固相亚磷酸胺法化学合成编码含有SEQ ID No.5的氨基酸序列的DNA片段(具体方法见实施例1)。细菌表达载体的构建方法与实施例3细菌表达载体的构建方法相同。

(2)BL-胰蛋白酶原融合蛋白的表达

将BL-胰蛋白酶原融合蛋白的表达载体转化到大肠杆菌菌株RR1或K12W3110中。将转化的大肠杆菌细胞培养于含有微量元素的M9-CA培养基中。对BL-胰蛋白酶原融合蛋白在摇瓶和发酵罐中的表达水平均进行检测。在这两种情况下均可观察到相当于大肠杆菌总蛋白的8-15％的高水平表达。

(3)BL-胰蛋白酶原融合蛋白的重折叠

BL-胰蛋白酶原融合蛋白是以不可溶的“包涵体”形式表达，为释放包涵体，在900巴的高压匀浆器中将大肠杆菌细胞破碎。通过11000g离心去除细胞碎片和可溶性大肠杆菌蛋白。用水将含有BL-胰蛋白酶原融合蛋白的包涵体清洗三次。所得包涵体沉淀用作折叠的原材料，其中的BL-胰蛋白酶原融合蛋白约为90％的纯度。将包涵体溶于pH10.3的磷酸钾缓冲液中，使BL-胰蛋白酶原融合蛋白的浓度为5～25mg/ml。离心去除不溶性物质，用蒸馏水稀释10倍。在4℃，pH 9.3的条件下进行常规折叠。在这样的条件下，正确折叠的胰蛋白酶原的停留时间约为75min。折叠可在48h内完成。再折叠率约为20％。

实施例6前导序列存在下微小胰岛素原胰蛋白酶原的制备

(1)DNA的获得及细菌表达载体的构建

采用固相亚磷酸胺法化学合成编码含有SEQ ID No.6的氨基酸序列的DNA片段(具体方法见实施例2)。合成的DNA片段包含一个5′端Cla I到3′端KpnI的片段和一段由5′端Kpn I到3′端Hind III的片段并分别克隆到pUC的载体中，其中Kpn I可切割编码SEQ ID No.6的51位和52位氨基酸残基的核酸序列。然后将编码SEQ ID No.6的完整的氨基酸序列的DNA片段亚克隆到修饰的pATH2载体中，以使BL-微小胰岛素原的表达受到Trp启动子和SD序列的调控。所得载体p HIN-1则用于BL-微小胰岛素原融合蛋白的表达。

(2)BL-微小胰岛素原融合蛋白的表达

将BL-微小胰岛素原融合蛋白的表达载体转化到大肠杆菌菌株RR1或K12W3110中。将转化的大肠杆菌细胞培养于含有微量元素的M9-CA培养基中。对BL-微小胰岛素原融合蛋白在摇瓶和发酵罐中的表达水平均进行检测。在这两种情况下均可观察到相当于大肠杆菌总蛋白的15～25％的高水平表达。

(3)BL-微小胰岛素原融合蛋白的重折叠

BL-微小胰岛素原融合蛋白是以不可溶的“包涵体”形式表达，为释放包涵体，在900巴的高压匀浆器中将大肠杆菌细胞破碎。通过11000g离心去除细胞碎片和可溶性大肠杆菌蛋白。用水将含有BL-微小胰岛素原融合蛋白的包涵体清洗三次。所得包涵体沉淀用作折叠的原材料，其中的BL-微小胰岛素原融合蛋白约为90％的纯度。将包涵体溶于pH 10.5并含有1.5～5.5mM巯基乙醇的8M脲中，使BL-微小胰岛素原融合蛋白的浓度为15-35mg/ml。离心去除不溶性物质，用低浓度的脲将上清稀释10倍，使脲的终浓度为2.5～6.5M，pH为8.5～10.5，巯基乙醇的终浓度则为0.15～0.55mM。在4℃和3.5M脲浓度，pH 9.5的条件下进行常规折叠。在这样的条件下，正确折叠的BL-微小胰岛素原的停留时间约为33min。折叠可在24h内完成。再折叠率约为70％。

利用10K超滤系统将滤出液组分中正确折叠的BL-微小胰岛素原融合蛋白浓缩。在pH 3.5下用水去除脲。超滤步骤的产率超过85％。

(4)正确折叠的BL-微小胰岛素原的胰蛋白酶裂解

胰蛋白酶裂解时，正确折叠的BL-微小胰岛素原融合蛋白的浓度约为10.5～12.5mg/ml，优选的为11mg/ml。胰蛋白酶与BL-微小胰岛素原融合蛋白的比例范围约为1∶60～1∶250，优选的为1∶100。pH值约维持在10～11，优选的为10.5。于4℃下将裂解进行约1～5h，优选的为3.5h。用盐酸缓冲液将pH值调为3.0以终止裂解反应。反相HPLC分析结果表明，该裂解步骤的产量高于95％，在高于10的pH下，胰蛋白酶可作用于精氨酸：胰岛素原B链和A链之间的Arg残基，BL片段与微小胰岛素原片段之间的Arg残基、BL内的Arg残基。BL片段经胰蛋白酶消化产生几个小片段和一个B链的C端带有一个额外Arg的人胰岛素，该胰岛素被命名为Arg(B31)-人胰岛素。

用溶于10mM柠檬酸缓冲液的NaCl作为洗脱液，由阳离子交换层析将Arg(B31)-人胰岛素纯化。纯化的Arg(B31)-人胰岛素具有高于90％的纯度。

(5)Arg(B31)-人胰岛素转化为人胰岛素

用羧肽酶B去除Arg(B31)-人胰岛素的C端Arg。正确折叠的Arg(B31)-人胰岛素的所用浓度约为10mg/ml.羧肽酶B与Arg(B31)-人胰岛素的比例约维持在1∶1000。37℃下于50mM Tris-HCL缓冲液pH 8.0中将裂解进行约1h。用磷酸缓冲液将pH值调为3.4以终止反应。人胰岛素的产率高于99％。

(6)人胰岛素的纯化

将羧肽酶B消化产生的人胰岛素上样到已用pH 3.0的0.1％TFA缓冲液平衡的C8反相HPLC柱上。利用含有0.1％TFA缓冲液的17～35％的乙腈梯度洗脱人胰岛素。收集胰岛素组分，并加入浓度为0.125～0.2M的乙酸，PH值为6.0。4℃下将如此产生的胰岛素结晶。人胰岛素的纯度高于99％。

(7)纯化人胰岛素的特性

利用标准Edman降解法测定纯化人胰岛素和WHO标准人胰岛素的N端前15个氨基酸。纯化人胰岛素A链和B链的N端序列均与WHO标准人胰岛素相同。

利用VGPlatform质谱分析法确定纯化人胰岛素与WHO标准人胰岛素的分子量。两者的M/Z均为5807.7.

用V8蛋白酶消化纯化人胰岛素和WHO标准人胰岛素。用C18反相HPLC分析消化片段。两者的肽图模式完全相同。

实施例7无前导序列条件下微小胰岛素原胰蛋白酶原的折叠

(1)DNA的获得及细菌表达载体的构建

采用固相亚磷酸胺法化学合成编码含有SEQ ID No.4的氨基酸序列的DNA片段(具体方法参考实施例2)。细菌表达载体的构建方法与实施例3细菌载体构建方法相同。

(2)微小胰岛素原的表达

将微小胰岛素原的表达载体转化到大肠杆菌菌株RR1或K12W3110中。将转化的大肠杆菌细胞培养于含有微量元素的M9-CA培养基中。对微小胰岛素原在摇瓶和发酵罐中的表达水平均进行检测。在这两种情况下均可观察到相当于大肠杆菌总蛋白的15-25％的高水平表达。

(3)微小胰岛素原的重折叠

微小胰岛素原是以不可溶的“包涵体”形式表达，为释放包涵体，在900巴的高压匀浆器中将大肠杆菌细胞破碎。通过11000g离心去除细胞碎片和可溶性大肠杆菌蛋白。用水将含有微小胰岛素原的包涵体清洗三次。所得包涵体沉淀用作折叠的原材料，其中的微小胰岛素原约为90％的纯度。将包涵体溶于pH10.3并含有1.2～5.8mM巯基乙醇的8M脲中，使微小胰岛素原的浓度为15～35mg/ml。离心去除不溶性物质，用低浓度的脲将上清稀释10倍，使脲的终浓度为2.5～6.5M，pH为8.5～10.5，巯基乙醇的终浓度则为0.12～0.58mM。在4℃和3.5M脲浓度，pH 9.8的条件下进行常规折叠。在这样的条件下，正确折叠的微小胰岛素原的停留时间约为55min。折叠可在48h内完成。再折叠率约为12％。

实施例8有前导序列、无变性剂条件下微小胰岛素原胰蛋白酶原的折叠

(1)DNA的获得及细菌表达载体的构建

采用固相亚磷酸胺法化学合成编码含有SEQ ID No.6的氨基酸序列的DNA片段(具体方法见实施例2)。细菌表达载体的构建方法与实施例3细菌载体构建方法相同。

(2)BL-微小胰岛素原融合蛋白的表达

将BL-微小胰岛素原融合蛋白的表达载体转化到大肠杆菌菌株RR1或K12W3110中。将转化的大肠杆菌细胞培养于含有微量元素的M9-CA培养基中。对BL-微小胰岛素原融合蛋白在摇瓶和发酵罐中的表达水平均进行检测。在这两种情况下均可观察到相当于大肠杆菌总蛋白的15-25％的高水平表达。

(3)BL-微小胰岛素原融合蛋白的重折叠

BL-微小胰岛素原融合蛋白是以不可溶的“包涵体”形式表达，为释放包涵体，在900巴的高压匀浆器中将大肠杆菌细胞破碎。通过11000g离心去除细胞碎片和可溶性大肠杆菌蛋白。用水将含有BL-微小胰岛素原融合蛋白的包涵体清洗三次。所得包涵体沉淀用作折叠的原材料，其中的BL-微小胰岛素原融合蛋白约为90％的纯度。将包涵体溶于pH 10.5的磷酸钾缓冲液中使BL-微小胰岛素原融合蛋白的浓度为15～35mg/ml。离心去除不溶性物质，用蒸馏水将上清稀释10倍。在4℃pH 9.5的条件下进行常规折叠。在这样的条件下，正确折叠的BL-微小胰岛素原的停留时间约为60min。折叠可在48h内完成。再折叠率约为25％。

Claims (10)

1.β-内酰胺酶或与β-内酰胺酶同一性至少为20％的氨基酸在作为前导蛋白促进功能蛋白折叠中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述功能蛋白为胰蛋白酶原、胰岛素原或胰岛素原类似物。

3.一种可促进促进功能蛋白折叠的前导蛋白，其特征在于，所述前导蛋白为β-内酰胺酶或与β-内酰胺酶同一性至少为20％的氨基酸。

4.根据权利要求3所述的前导蛋白，其特征在于，所述前导蛋白序列如SEQ ID No.1或2所示。

5.一种融合蛋白，其特征在于，该融合蛋白自N端至C端由β-内酰胺酶或与β-内酰胺酶同一性至少为20％的氨基酸作为前导蛋白通过一个精氨酸、赖氨酸或一种N末端为精氨酸或赖氨酸的二肽-六肽与功能蛋白前体的氨基酸序列连接而成。

6.根据权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于，所述前导蛋白序列如SEQ ID No.1或2所示。

7.根据权利要求6所述的融合蛋白，其特征在于，所述功能蛋白为胰蛋白酶原、胰岛素原或胰岛素原类似物。

8.根据权利要求7所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白序列如SEQ ID No.5或6所示。

9.一种促进功能蛋白质折叠的方法，其特征在于，将权利要求5至8中任意一项所述的融合蛋白溶于含有巯基乙醇的脲溶液中，融合蛋白终浓度为5～35mg/ml。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述脲溶液为含有1.5～6.5mM巯基乙醇的8M脲溶液；所述脲溶液pH为10.5。