CN102321557A - 芽孢杆菌l型诱导培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种芽孢杆菌L型诱导培养基，其成功率高、诱导快速。本发明芽孢杆菌L型诱导培养基，按照以下步骤制备：每900mL蒸馏水中溶有葡萄糖8-12g，胰蛋白胨8-12g，酵母粉4-6g，牛肉膏4-6g，氯化钠4-6g，琼脂9-10g，蔗糖160-180g，MgCl2 1.7-2.1g，在121℃条件下灭菌10-60min，所得培养基冷却后加入灭活马血清100mL，再加入过滤除菌的溶菌酶使其终浓度为1-5mg/mL，所述灭活马血清为使用前需在56℃灭活0.5小时。

Description

芽孢杆菌L型诱导培养基
技术领域
本发明涉及一种细菌L型的诱导培养基。
背景技术
细菌L型是细菌因变异而产生的细胞壁缺陷型，细菌细胞壁的缺陷可自发形成，也可人工诱导，诱导细菌变为L型的因素很多，如抗生素、中药等。
国内对细菌L型的研究主要集中在医学领域，由于抗生素的大量使用使得病原菌突变形成L型，L型病原菌可以具有致病性，但由于其缺乏细胞壁，青霉素等作用于细胞壁的抗生素对其没有作用，故L型的产生对疾病的治疗提出了新的挑战，因此国内关于L型的研究主要集中在病原菌L型的防治、检测等方面。
但在上世纪90年代，英国阿伯丁大学的研究[Artificially induced symbiotic associations ofL-form bacteria and plants[J].Journal of Applied But Feriology，1984，56(3)：465-477.The L-phaseof Erwinia carotovora var.atroseptica and its possible association with plant tissue[J].Jappl.Bact.，1973，36：729-737.)]表明：L型细菌在植物体内能够与植物形成内共生关系，并成功诱导了这种关系可使植物在受到病原体胁迫时，抗病效果大大提高，这些研究为植物病害的防治和抗病植物的育种提供了新的思路。蜡样芽孢杆菌是植物的一种益生菌，可以促进植物生长，并可以通过拮抗作用、竞争作用、诱导植物抗性等抵御植物病害。陈冲等人的研究(陈冲，王程亮，张潞生.蜡样芽孢杆菌TS-02防治草莓白粉病研究.安徽农业科学.2007，35(11)：3298，3300)表明，蜡样芽孢杆菌可抑制白粉病菌的定殖，从而达到防治草莓白粉病的效果。将蜡样芽孢杆菌诱导为L型，将L型导入植物体形成内共生，可以选育出对白粉病等植物病害具有抗性的新型植物品种。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种成功率高、快速的芽孢杆菌L型诱导培养基。
一种芽孢杆菌L型诱导培养基，按照以下步骤制备：每900mL蒸馏水中溶有葡萄糖8-12g，胰蛋白胨8-12g，酵母粉4-6g，牛肉膏4-6g，氯化钠4-6g，琼脂9-10g，蔗糖160-180g，MgCl2 1.7-2.1g，在121℃条件下灭菌10-60min，所得培养基冷却后加入灭活马血清100mL，再加入过滤除菌的溶菌酶使其终浓度为1-5mg/mL，所述灭活马血清为使用前需在56℃灭活0.5小时。
本发明芽孢杆菌L型诱导培养基，按照以下步骤制备：每900mL蒸馏水中溶有葡萄糖10g，胰蛋白胨10g，酵母粉5g，牛肉膏5g，氯化钠5g，琼脂10g，蔗糖170g，MgCl21.9g，在121℃条件下灭菌10-60min，冷却后加入灭活马血清100mL，再加入过滤除菌的溶菌酶使其终浓度为1-5mg/mL，所述灭活马血清为使用前需在56℃灭活0.5小时。
使用该芽孢杆菌L型的诱导培养基按以下步骤进行诱导：
1、将芽孢杆菌接种于营养肉汤培养基中，28-32℃振荡培养至芽孢杆菌处于对数生长期；
2、取所得芽孢杆菌培养液，离心收集菌体，用高渗液洗涤两次后，将菌体悬浮于高渗液中使细菌浓度为(0.9-1.1)×108CFU/mL，加入刚刚配置的溶菌酶使其终浓度与芽孢杆菌L型诱导培养基中的溶菌酶浓度相等，混匀，置于28-37℃的恒温条件下，当活体染色显示99％以上的菌体变为球形时，终止溶菌酶的作用，1500-2500r/min离心10-20min收集沉淀，用高渗液洗涤两次后，悬浮于悬浮液中使细菌浓度为(0.9-1.1)×108CFU/mL，即得去壁菌悬液；
3、将灭菌后的芽孢杆菌L型诱导培养基冷却后倾倒平板，将去壁菌悬液轻轻的滴加在未凝固的芽孢杆菌L型诱导培养基平板上待平板凝固后，将平板倒置放入烛缸中，用CO2烛缸法培养，在28-32℃的条件下，培养至菌悬液液滴内及液滴的边缘出现直径0.4-0.6mm的颗粒状菌落，验证菌落为L型菌落后，挑取同一菌落接种于新鲜的芽孢杆菌L型诱导培养基平板上，每3天转接一次，每次转接前均要验证所转接的菌落为L型，经过5-10次转接形成稳定的芽孢杆菌L型；
所述营养肉汤培养基的配方为：每1000mL蒸馏水中溶有牛肉膏3g、胰蛋白胨10g、氯化钠5g，用常用酸或碱溶液调节pH至7.0-7.2，121℃灭菌20min。
所述高渗液的配方为：在0.1-0.5mol/L、pH6.0-7.0的磷酸缓冲液中加入0.01-0.03mol/L顺丁烯二酸和0.01-0.03mol/L MgCl2，加入蔗糖使其终浓度为0.4-0.6mol/L，121℃灭菌15-60min。
所述悬浮液的配方为：每1000mL蒸馏水中溶有K2HPO40.3-0.5g，MgSO4·7H2O 0.2-0.4g，酪蛋白5-10g，KH2PO4 0.3-0.5g，CaCl2 0.1-0.5g，MnSO4 0.01-0.05g，FeSO4·7H2O 0.002-0.006g，NaCl 30-60g，用常用酸或碱溶液调节pH6.0-7.0。
所述验证菌落为L型菌落的方法为：挑取菌落经活体染色观察形态和/或渗透压的敏感性试验和/或滤过性试验，其中：
所述活体染色观察菌体形态为：采用高渗美兰活体染色法。由于芽孢杆菌为杆状，而细胞壁去掉之后菌体为球状，所以通过菌体性质即可判断是否是L型。
所述渗透压的敏感性试验为：将细胞放入蒸馏水中，10min后观察，细菌破裂，无完整细胞，说明此细胞对渗透压敏感。原始菌体由于有细胞壁所以对渗透压不敏感，L型没有细胞壁，进入低渗溶液会破裂死亡。
所述滤过性试验为：用高渗液将L型诱导培养基上的菌落洗下，用0.45μm的细菌滤膜过滤，取滤液接种于L型诱导培养基上，32℃培养，接种3天后观察是否有菌落生长。由于有细胞壁的细菌不能通过细菌滤膜，而L型可以，所以用0.45um的滤膜过滤后收集滤液，L型菌液的滤液接种于L型诱导培养基上，会有细菌生长。
所述稳定的L型的鉴定方法：在无溶菌酶的L型诱导培养基中传代3次，采用高渗美兰活体染色法观察菌体形态，菌体为球状，不恢复杆状即认定为稳定的L型。
本发明芽孢杆菌L型诱导培养基中，单个芽孢杆菌L型诱导培养基平板诱导芽孢杆菌L型的成功率可以达到100％，芽孢杆菌L型在L型诱导培养基平板上，通过CO2烛缸法培养生长较快，3天即可转接一次，转接5-10次即可得到稳定的芽孢杆菌L型，诱导周期短。
具体实施方式
实施例1
1、将蜡样芽孢杆菌ATCC 10702菌株接种于营养肉汤培养基中，28℃，振荡培养至蜡样芽孢杆菌处于对数生长期。
2、取所得蜡样芽孢杆菌培养液，离心收集菌体，用高渗液洗涤两次后，将菌体悬浮于高渗液中使细菌浓度约(0.9-1.1)×108CFU/mL，加入刚刚配置的溶菌酶使其终浓度达到1.0mg/mL，混匀，置于28℃的恒温水浴锅中，当高渗美兰活体染色显示99％以上的菌体变为球形时，1500r/min离心20min收集沉淀，用高渗液洗涤两次，悬浮于悬浮液中使细菌浓度为(0.9-1.1)×108CFU/mL，即得去壁菌悬液。
3、将溶菌酶浓度为1.0mg/mL的L型诱导培养基倾倒平板，将去壁菌悬液轻轻的滴加在未凝固的L型诱导培养基上，凝固后将平板倒置放入烛缸中，用CO2烛缸法培养，28℃条件下培养3天左右出现直径0.4-0.6mm的颗粒状菌落，挑取菌落经高渗美兰活体染色观察形态，验证菌落为L型菌落后，挑取同一菌落接种于新鲜的L型诱导培养基平板上，此后3天转接一次，每次转接前均要经高渗美兰活体染色观察形态，验证所转接的菌落为L型，经过10次转接形成稳定的L型，此后不加溶菌酶无返祖现象。
所述营养肉汤培养基的配方为：每1000mL蒸馏水中溶有牛肉膏3g、胰蛋白胨10g、氯化钠5g，用常用酸或碱溶液调节pH至7.0-7.2，121℃灭菌20min。
所述高渗液的配方为：在0.1mol/L、pH6.0的磷酸缓冲液中加入0.01mol/L顺丁烯二酸和0.01mol/L MgCl2，加入蔗糖使其终浓度为0.4mol/L，121℃灭菌15min。
所述悬浮液的配方为：每1000mL蒸馏水中溶有K2HPO4 0.3g，MgSO4·7H2O 0.2g，酪蛋白5g，KH2PO4 0.3g，CaCl2 0.1g，MnSO4 0.01g，FeSO4·7H2O 0.002g，NaCl 30，用常用酸或碱溶液调节pH6.0。
所述L型诱导培养基的配方为：900mL蒸馏水中溶有葡萄糖8g，胰蛋白胨8g，酵母粉4g，牛肉膏4g，氯化钠4g，琼脂9g，蔗糖160g，MgCl2 1.7g，在121℃条件下灭菌10min，冷却后加入灭活马血清100mL，再加入过滤除菌的溶菌酶使其终浓度为1.0mg/mL。
实施例2：
1、将蜡样芽孢杆菌ATCC 10702菌株接种于营养肉汤培养基中，32℃，振荡培养至蜡样芽孢杆菌处于对数生长期。
2、取所得蜡样芽孢杆菌培养液，离心收集菌体，用高渗液洗涤两次后，将菌体悬浮于高渗液中使细菌浓度约(0.9-1.1)×108CFU/mL，加入刚刚配置的溶菌酶使其终浓度达到5.0mg/mL，混匀，置于37℃的恒温水浴锅中，当高渗美兰活体染色显示99％以上的菌体变为球形时，2500r/min离心10min收集沉淀，用高渗液洗涤两次，悬浮于悬浮液中使细菌浓度为(0.9-1.1)×108CFU/mL，即得去壁菌悬液。
3、将溶菌酶浓度为5mg/mL的L型诱导培养基倾倒平板，将去壁菌悬液轻轻的滴加在未凝固的L型诱导培养基上，凝固后将平板倒置放入烛缸中，用CO2烛缸法培养，32℃条件下培养3天左右出现直径0.4-0.6mm的颗粒状菌落，用渗透压的敏感性试验验证菌落为L型菌落后，挑取同一菌落接种于新鲜的L型诱导培养基平板上，此后3天转接一次，每次转接前均要验证所转接的菌落为L型，经过5次转接形成稳定的L型，此后不加溶菌酶无返祖现象。
所述营养肉汤培养基的配方为：每1000mL蒸馏水中溶有牛肉膏3g、胰蛋白胨10g、氯化钠5g，用常用酸或碱溶液调节pH至7.0-7.2，121℃灭菌20min。
所述高渗液的配方为：在0.5mol/L、pH7.0的磷酸缓冲液中加入0.03mol/L顺丁烯二酸和0.03mol/L MgCl2，加入蔗糖使其终浓度为0.6mol/L，121℃灭菌60min。
所述悬浮液的配方为：每1000mL蒸馏水中溶有K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.4g，酪蛋白10g，KH2PO4 0.5g，CaCl2 0.5g，MnSO4 0.05g，FeSO4·7H2O 0.006g，NaCl 60g，用常用酸或碱溶液调节pH 7.0。
所述L型诱导培养基的配方为：900mL蒸馏水中溶有葡萄糖12g，胰蛋白胨12g，酵母粉6g，牛肉膏6g，氯化钠6g，琼脂10g，蔗糖180g，MgCl2 2.1g，在121℃条件下灭菌60min，冷却后加入灭活马血清100mL，再加入过滤除菌的溶菌酶使其终浓度为5mg/mL。
实施例3：
1、将蜡样芽孢杆菌ATCC 10702接种于营养肉汤培养基中，30℃振荡培养至枯草芽孢杆菌处于对数生长期。
2、取所得枯草芽孢杆菌培养液，离心收集菌体，用高渗液洗涤两次后，将菌体悬浮于高渗液中使细菌浓度约(0.9-1.1)×108CFU/mL，加入刚刚配置的溶菌酶使其终浓度达到3mg/mL，混匀，置于32℃的恒温水浴锅中，当高渗美兰活体染色显示99％以上的菌体变为球形时，2000r/min离心15min收集沉淀，用高渗液洗涤两次，悬浮于悬浮液中使细菌浓度为(0.9-1.1)×108CFU/mL，即得去壁菌悬液。
3、将溶菌酶浓度为3mg/mL的L型诱导培养基冷却至40℃倾倒平板，将去壁菌悬液轻轻的滴加在未凝固的L型诱导培养基上，凝固后将平板倒置放入烛缸中，用CO2烛缸法培养，32℃条件下培养3天左右出现直径0.4-0.6mm的颗粒状菌落，用滤过性试验验证菌落为L型菌落后，挑取同一菌落接种于新鲜的L型诱导培养基平板上，此后3天转接一次，每次转接前均要验证所转接的菌落为L型，经过6次转接形成稳定的L型，此后不加溶菌酶无返祖现象。
所述营养肉汤培养基的配方为：每1000mL蒸馏水中溶有牛肉膏3g、胰蛋白胨10g、氯化钠5g，用常用酸或碱溶液调节pH至7.0-7.2，121℃灭菌20min。
所述高渗液的配方为：在0.5mol/L、pH7.0的磷酸缓冲液中加入0.03mol/L顺丁烯二酸和0.03mol/L MgCl2，加入蔗糖使其终浓度为0.6mol/L，121℃灭菌20min。
所述悬浮液的配方为：每1000mL蒸馏水中溶有K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.4g，酪蛋白10g，KH2PO4 0.5g，CaCl2 0.5g，MnSO4 0.05g，FeSO4·7H2O 0.006g，NaCl 60g，用常用酸或碱溶液调节pH 7.0。
所述L型诱导培养基的配方为：900mL蒸馏水中溶有葡萄糖10g，胰蛋白胨10g，酵母粉5g，牛肉膏5g，氯化钠5g，琼脂10g，蔗糖170g，MgCl2 1.9g，在121℃条件下灭菌20min，冷却后加入灭活马血清100mL，再加入过滤除菌的溶菌酶使其终浓度为3mg/mL。
实施例4：
1、将枯草芽孢杆菌ACCC 11060接种于营养肉汤培养基中，30℃振荡培养至枯草芽孢杆菌处于对数生长期。
2、取所得枯草芽孢杆菌培养液，离心收集菌体，用高渗液洗涤两次后，将菌体悬浮于高渗液中使细菌浓度约(0.9-1.1)×108CFU/mL，加入刚刚配置的溶菌酶使其终浓度达到3mg/mL，混匀，置于32℃的恒温水浴锅中，当高渗美兰活体染色显示99％以上的菌体变为球形时，2000r/min离心15min收集沉淀，用高渗液洗涤两次，悬浮于悬浮液中使细菌浓度为(0.9-1.1)×108CFU/mL，即得去壁菌悬液。
3、将溶菌酶浓度为3mg/mL的L型诱导培养基冷却至40℃倾倒平板，将去壁菌悬液轻轻的滴加在未凝固的L型诱导培养基上，凝固后将平板倒置放入烛缸中，用CO2烛缸法培养，32℃条件下培养3天左右出现直径0.4-0.6mm的颗粒状菌落，用滤过性试验验证菌落为L型菌落后，挑取同一菌落接种于新鲜的L型诱导培养基平板上，此后3天转接一次，每次转接前均要验证所转接的菌落为L型，经过7次转接形成稳定的L型，此后不加溶菌酶无返祖现象。
所述营养肉汤培养基的配方为：每1000mL蒸馏水中溶有牛肉膏3g、胰蛋白胨10g、氯化钠5g，用常用酸或碱溶液调节pH至7.0-7.2，121℃灭菌20min。
所述高渗液的配方为：在0.5mol/L、pH7.0的磷酸缓冲液中加入0.03mol/L顺丁烯二酸和0.03mol/L MgCl2，加入蔗糖使其终浓度为0.6mol/L，121℃灭菌20min。
所述悬浮液的配方为：每1000mL蒸馏水中溶有K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.4g，酪蛋白10g，KH2PO4 0.5g，CaCl2 0.5g，MnSO4 0.05g，FeSO4·7H2O 0.006g，NaCl 60g，用常用酸或碱溶液调节pH 7.0。
所述L型诱导培养基的配方为：900mL蒸馏水中溶有葡萄糖10g，胰蛋白胨10g，酵母粉5g，牛肉膏5g，氯化钠5g，琼脂10g，蔗糖170g，MgCl2 1.9g，在121℃条件下灭菌20min，冷却后加入灭活马血清100mL，再加入过滤除菌的溶菌酶使其终浓度为3mg/mL。
实施例5对比试验
将蜡样芽孢杆菌ATCC 10702菌株按照实施例2中的方法诱导成L型，仅改变以下条件：
将芽孢杆菌L型诱导培养基的配方改为：900mL蒸馏水中溶有葡萄糖5g，蛋白胨5g，酵母粉5g，琼脂7.5g，蔗糖200g，MgSO4·7H2O 0.1g，用常用酸或碱溶液调节pH7.0，在121℃条件下灭菌60分钟，冷却后加入灭活马血清100mL，加入过滤除菌的溶菌酶使其终浓度5mg/mL。
结果：两个实施例都能获得稳定的细菌L型。其区别如下表：
Figure BDA0000092720990000071
将上述对比试验中的每个实施例平行做5组，试验结果相同。
结论：改变L型诱导培养基配方，L型细菌生长缓慢，在32℃的培养箱中培养7天左右才能长出菌落，因此7天才可进行一次转接，而采用实施例2中的L型诱导培养基，3天便可以转接一次，L型细菌生长缓慢导致诱导周期变长。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (2)

1.一种芽孢杆菌L型诱导培养基，其特征在于按照以下步骤制备：每900mL蒸馏水中溶有葡萄糖8-12g，胰蛋白胨8-12g，酵母粉4-6g，牛肉膏4-6g，氯化钠4-6g，琼脂9-10g，蔗糖160-180g，MgCl2 1.7-2.1g，在121℃条件下灭菌10-60min，所得培养基冷却后加入灭活马血清100mL，再加入过滤除菌的溶菌酶使其终浓度为1-5mg/mL，所述灭活马血清为使用前需在56℃灭活0.5小时。
2.根据权利要求1所述芽孢杆菌L型诱导培养基，其特征在于按照以下步骤制备：每900mL蒸馏水中溶有葡萄糖10g，胰蛋白胨10g，酵母粉5g，牛肉膏5g，氯化钠5g，琼脂10g，蔗糖170g，MgCl2 1.9g，在121℃条件下灭菌10-60min，冷却后加入灭活马血清100mL，再加入过滤除菌的溶菌酶使其终浓度为1-5mg/mL，所述灭活马血清为使用前需在56℃灭活0.5小时。
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