CN102313755A - 电子衍射断层照相的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及电子衍射断层照相的方法。本发明描述了一种用于透射电子显微镜中的电子衍射断层照相的方法。已知的方法涉及使用扫描透射电子显微镜，且使用用于STEM衍射的扫描束。本发明提出使用具有比晶体稍大的直径的固定束（200）形成衍射图案，其结果是可以使用没有STEM单元的TEM。在TEM模式中完成发现晶体。根据本发明的方法的优点是：可以使用没有扫描单元的TEM，且衍射体积不取决于晶体的取向，因为在获得衍射图案时整个晶体被照射。

Description

电子衍射断层照相的方法
技术领域
本发明涉及使用电子显微镜通过电子衍射断层照相来确定晶体的晶体结构的方法，该电子显微镜装配为使用电子束来照射晶体，该方法包含：
? 提供其中具有一种或更多晶体的样品，
? 识别样品上待分析的晶体，
? 通过重复地执行以下操作来记录晶体的衍射倾斜序列
        ○ 相对于束使样品倾斜到已知倾斜角度，
        ○ 相对于束居中晶体，以及
        ○ 记录处于所述倾斜的晶体的衍射图案，
? 以及通过分析记录的衍射图案来确定晶体结构。
背景技术
该方法从“Towards automated diffraction tomography:Part I-Data acquistion”，U. Kolb等人, Ultramicroscopy 107 (2007) 505-513获知。
在确定诸如催化剂、蛋白质、病毒、DNA和RNA的宏观分子的结构方面存在极大的兴趣。这种知识对于理解蛋白质例如如何操作、例如如何生产更有效的药剂、酶等且例如理解为什么发生某些疾病是十分重要的。
已知为晶体学的一组技术用于确定分子结构，其中X射线晶体学是最公知的。此处，通过X射线束照射晶体来记录大量衍射图案，且记录所述束的衍射图案。X射线晶体学的缺点在于：因为晶体和X射线束之间的相互作用小，所以晶体的尺寸必须相当大，例如为0.1μm或更大。对于许多无机晶体，这是没有问题的，因为这些可以容易地生长到0.1μm或更大的尺寸，但是已经证明，非常难以将例如蛋白质的晶体生长到这种尺寸。X射线衍射因而较不适于确定例如蛋白质的结构。
在如在例如电子显微镜中使用的加速电子束和晶体的原子之间的相互作用远大于当使用X射线时的相互作用。因此，例如可以使用透射电子显微镜（TEM）来记录具有小于1μm下至几nm的直径的纳米晶体的衍射图案。
在U.Kolb描述的已知方法中，通过手动地绕所选晶体轴使晶体倾斜且在各种晶体区域记录衍射图案集（倾斜序列）而收集三维（3D）衍射数据。在第二步骤中，来自这些区域的衍射数据组合成3D数据集且被分析以得出所需结构信息。注意，数据收集可以自动地执行。这涉及用于在绕角度计轴倾斜时实现自动化衍射图案收集的TEM的软件模块。Kolb然后继续描述用于TEM的这种软件模块，将扫描透射电子显微镜（STEM）成像与纳米衍射模式中的衍射图案采集相组合。这允许来自尺寸下至5nm的纳米颗粒的衍射倾斜系列的自动化记录。
在介绍中，Kolb教导了可以通过使用区域选择来照射晶体而记录衍射图案，即所谓的选择区域电子衍射（SAED）技术，其中衍射平面下游的孔口用于限制贡献于衍射图案的样品的部分（区域）。束可以是会聚的聚焦束（CBED）、基本平行束或在其间具有任意会聚角。平行照射可以通过K?hler照射获得。备选地，称为C2孔口的小孔口可以在保持束基本平行的同时用于减小束直径到几个纳米。Kolb继续描述了在使用典型地50nm直径的小束的TEM模式中工作使得几乎不可能在比束大的晶体上以任意精确度定位束。因此，晶体的位置在STEM模式中确定。
注意，Kolb提及，原则上可以使用更多或更少的平行束来记录衍射图案，但是没有给出这的示例。相反，她继续示出会聚束电子衍射，且例如在她的文章的第509页右下角说明衍射图案并不聚焦于后焦面。
所述方法的缺点在于并不是所有TEM都装配有扫描单元，其结果是并不是所有TEM可以在STEM模式中操作。
发明内容
需要一种方法，其可以在没有装配有扫描单元的仪器上执行，从而以STEM模式操作。
本发明旨在提供该需要的解决方案。
为此，根据本发明的方法的特征在于，用于记录衍射图案的束是具有比晶体尺寸大的直径的基本平行束。
通过使用具有比晶体大的直径的束且在记录衍射图案的同时保持该束相对于晶体固定，使用的TEM不需要装配有用于在晶体上扫描束的扫描单元。
因为束的直径比晶体的直径大，还称为衍射体积的相互作用体积或散射体积是晶体本身的体积，且因而对于所有倾斜角度是相同的。这简化了否则当记录衍射图案和/或分析记录的衍射图案时将需要的归一化和后处理。
在根据本发明的方法的实施例中，相对于束的晶体的居中涉及偏移束和/或机械地移动晶体。
通过例如通过应用磁或静电场而在样品上移动束，束可以定位于晶体上。对于大的位移，还可以执行样品的机械移动。
在根据本发明的方法的优选实施例中，用于记录衍射图案的束是基本平行束。
当使样品倾斜时，样品的位置将经常变化，这可以通过偏移束来校正。当使用平行束时，倾斜样品和/或偏移束不偏移衍射图案的原点，也不会使衍射图案失真。
当和U.Kolb描述的工作相比时，这是有利的，在U.Kolb描述的工作中使用会聚束形成衍射图案，导致物镜的后焦面中的圆盘而不是光斑。为了方便稍后阶段的数据处理且更重要地清晰分离每个反射（对于宏观分子晶体，反射可能十分致密且圆盘容易彼此交叠），必须通过以下三种方法中的任意一种采用额外的步骤将圆盘重新聚焦为光斑：
1) 改变物镜的电流；
2) 改变投影系统的电流；
3) 改变FEI显微镜上的被称为衍射透镜的第三透镜的电流。结果是衍射图案将随着束偏移而偏移。这也在U.Kolb的工作中第509和510页中获知。
注意，晶体学的其他方法是已知的，诸如但不限于X射线单晶衍射、X射线粉末衍射、2D电子衍射以及旋进电子衍射。如前面所讨论，X射线单晶衍射方法具有需要大晶体的缺点。
X射线粉末衍射方法具有提供唯一或可靠解决方案的难处，即：难以或不可能确定唯一晶体结构。这是由于作为大量晶体的衍射图案的结果，丢失衍射图案中的旋转信息。
2D电子衍射要求非常难以制作的极其特别类型的晶体（2D单层）。
旋进电子衍射要求能够旋进（呈圆锥体旋转束，圆锥的中心位于晶体上）且在经过晶体之后再次取消束的旋转使得形成固定衍射图案的TEM。这要求特别的TEM。
因此，所有这些其他方法在其方法本身、晶体和使用的仪器的限制方面具有缺点。
在根据本发明的方法的实施例中，晶体具有小于10μm、更具体而言小于1μm，最具体而言小于100nm的最大直径。制备这些小晶体远比制备在例如X射线衍射中需要的典型地具有100μm或更大的尺寸的大晶体容易。对于蛋白质而言，尤其如此。
在根据本发明的方法的另一实施例中，晶体是来自催化剂、蛋白质、病毒、DNA和RNA的组的宏观分子的晶体。
对于工业处理（例如，用于合成酶）和在健康护理（例如合成药物）中二者，例如蛋白质的晶体结构的识别是非常感兴趣的。
在根据本发明的方法的又一实施例中，识别大量晶体，且对于每个倾斜角度记录大量衍射图案，每个衍射图案与晶体之一相关。
由于更好的信噪比，且因为由于晶体中的每一个可能相对于束具有不同取向而更多的晶体方向被探测，使用具有相同晶体结构的上述方法记录多个晶体的衍射图案导致更好的结果。这可以使用一个倾斜系列来实现，且因此使用具有用于使晶体倾斜的有限数目的（机械）步骤来实现。
注意，在该方法中，针对晶体中的每一个，形成且分析一系列衍射图案。因此，该方法不同于分析多晶材料。
还注意，该方法也可以用于从具有不同晶体结构和/或成分的两个或更多晶体获取数据，且单独地分析两个或更多数据集。这导致更高的吞吐量，因为仅形成一个机械倾斜序列，且还可以通过确定一个晶体的位置或一组特征（已知的相互位置）更有效地实现居中，因而，节省获取时间。
在根据本发明的方法的又一实施例中，电子显微镜是冷冻电子显微镜且在样品处于冷冻温度的同时记录衍射图案。
电子显微镜内的环境是具有高水平的辐射和真空的苛刻环境。如本领域技术人员所已知的，在冷冻温度分子的“寿命”远大于在室温下研究分子时。注意，装配为以液氮温度和/或液氦温度操作的TEM容易可用。
在又一实施例中，样品安装在来自单倾斜保持器和双倾斜保持器的组的倾斜保持器上，且倾斜是使该倾斜保持器倾斜的结果。
为了将样品放置在TEM中，样品通常安装在栅格上，例如具有3.05mm直径的铜栅格，且所述栅格进而安装在保持器上。保持器然后被插入到所谓的角度计，该角度计相对于保持器密封，同时实现样品在样品位置的移动。一些保持器实现（与角度计协作）倾斜，一些保持器实现在两个方向中倾斜。而且，实现冷冻用途和/或实现加热等的保持器是已知的。对于此处所需的分析，单倾斜保持器就足够了。注意，使用的保持器典型地是通过所谓的角度计倾斜的侧入刚性保持器。角度计典型地能够在z、y和z方向中偏移保持器且在一个方向中旋转保持器。
还注意通常使用所谓的tomo保持器，其基本是装配为用于大倾斜角度的单倾斜保持器，不触摸显微镜的（磁性）透镜的极片，且具有即使在高倾斜角度（典型地60至80度）不拦截输入和输出电子束的措施。
提及的是，诸如顶部负载保持器或双倾斜保持器的其他类型的保持器以及其中样品的旋转/平移例如通过保持器顶尖的压电马达实现的保持器是已知的。
在又一实施例中，使用物镜形成衍射图案，且在至少部分倾斜位置期间，使用倾斜保持器相对于束和所述物镜的移动模型，晶体的位置相对于束和所述物镜居中，其结果是在晶体的居中期间晶体不暴露于电子。
如果保持器和角度计的位置的精确性/再现性足够，则晶体可以通过‘推算定位’在至少部分时间被定位。这最小化晶体对电子的暴露，且因而最小化晶体居中期间的损害。
在又一实施例中，居中晶体涉及使用电子束对至少部分样品进行成像。
TEM能够高精度地成像样品，且因而可以高精度地相对于束确定晶体的位置。
在又一实施例中，样品的成像涉及对晶体进行成像。
通过通常以限制到晶体的剂量的较低放大率对晶体进行成像，其位置被高精度地记录。注意，每单位面积的电子剂量不需要是大的，且因而晶体暴露于的电子数量可以是低的。
在另一实施例中，在形成倾斜序列之前，确定样品中一个或更多特征相对于晶体的位置，且样品的成像涉及对一个或更多特征进行成像，且特征的位置用于居中晶体。
此处，首先，确定晶体相对于一个或更多特征的位置。在倾斜序列期间，现在可以通过确定一个或更多特征的位置得出晶体的位置。这样，晶体在居中时不暴露于电子。注意：当一个特征用于确定晶体的位置时，优选地感兴趣的晶体和特征二者位于倾斜轴处或其附近；但是当使用两个或更多特征时，特征或晶体均不需要位于倾斜轴上（尽管相对于倾斜轴的位置应当已知以形成描述特征和晶体由于旋转如何移动...的模型。
在又一实施例中，用于居中晶体的束的直径不同于用于记录衍射图案的束的直径。
优选地，用于居中的束直径大于用于衍射的束直径，使得在居中期间，较大的视场可用，而用于记录衍射图案的束仅稍大于晶体。
在又一实施例中，在倾斜序列的记录期间，晶体暴露于小于105电子/nm2的剂量。
通过针对倾斜序列中的所有倾斜位置的总和（在整个序列期间累积的剂量）使晶体暴露于小于105电子/nm2的剂量，对晶体的损害有限。还参见Kolb的出版物。
在又一实施例中，在倾斜序列的记录期间，晶体暴露于小于300电子/(nm2s)的剂量率。
如Kolb所述，剂量率还需要被控制到例如小于300电子/(nm2s)的低值。
附图说明
现在基于附图解释本发明，附图中，相同的参考数字指示相应的元件。
为此:
图1示意性示出用于执行根据本发明的方法的TEM的光学元件，
图2示意性示出衍射模式中的射线，
图3示意衍射图案。
具体实施方式
图1示意性示出用于执行根据本发明的方法的TEM的光学元件。
图1示出用于沿着电子-光学轴104产生例如具有50至400keV的能量的高能电子束102的电子源100。
注意，实际上，束聚焦的位置（示出交叉）不同于绘制的位置——且因而角度和线性放大率不同，但是这些交叉用于限制束直径。
还注意，使用较低和较高束能量的电子显微镜是已知的。注意，可以存在位于电子源和孔口之间的一个或更多透镜以及对准线圈以在轴上居中束。聚光器透镜108和110用于在样品位置112上形成束。样品位置处的束的直径由孔口106支配。安装在样品定位单元即所谓的角度计114上的样品被放置在所述样品位置上，角度计实现沿着轴x、y、z中的任一个在样品位置上定位样品且沿着x轴旋转样品。具有后焦面118的物镜116对样品进行成像，且投影透镜120和122在成像平面124上形成放大图像，该成像平面可以是荧光屏幕或照相机系统所处的平面。
注意，样品可以浸入物镜116的（磁）场。在这种情况中，可以认为物镜分裂成两部分，一个与聚光器透镜106和108协作以照射样品，且第二部分与投影透镜118和120协作以形成图像。
TEM可以以不同方式对样品进行成像。两个重要的模式是：
－衍射模式：在衍射模式中，使用优选平行的电子束照射样品，其结果是衍射图案在物镜的后焦面中形成（所有平行射线聚焦在该平面中，形成焦点的位置仅取决于电子离开样品平面的角度），且投影透镜在图像平面上形成该后焦面的放大图像。
－TEM成像模式：在TEM成像模式中，使用电子束（其可以是平行束）照射样品。投影透镜不是将物镜的后焦面，而是将样品平面成像在成像平面上（例如，荧光屏或照相机）。通过源于在样品中吸收的电子的一部分的强度变化形成图像，且在样品中衍射（散射）的电子干扰无妨碍地经过样品的电子。
注意，扫描透射电子显微镜类似于TEM，但是附加地装配有位于透镜108和样品之间的偏转线圈且把束聚焦在样品上。通过然后使用这些偏转线圈在样品上扫描聚焦束，使用放置在样品下的检测器（从电子源去除的一侧）形成扫描图像。
图2示意性示出衍射模式中样品附近的射线图。
图2示出射到样品204上的平行电子束200。样品包含晶体202，导致束200分裂为非衍射束和衍射束206。物镜116在衍射平面118中聚焦非衍射和衍射束，因为两个束均是平行束。注意，对于完美平行束和没有透镜像差的物镜，在衍射平面118中形成的焦点是点。实际上，由于束会聚/发散，主要作为源的有限直径的结果，光斑具有小但有限的直径。
从图2可以清楚地看出，具有比晶体大的直径的束导致恒定衍射体积：完整晶体的体积。
注意，对于本发明的方法，通常在记录倾斜序列之前做出一些调整。它们是：
? 确定所谓的照相机长度。该参数描述衍射平面到图像平面（照相机或屏幕）的放大率
? 当记录衍射图案时和当成像时，对准束以照射样品上相同的区域
? 必须在每个放大率校正图像/束偏移
? 必须确定该阶段的倾斜轴的位置。
图3示意衍射图案。
很明显，强中央峰以及大量子峰可见。中央峰是无障碍地经过样品的电子的聚焦的结果，且子峰中的每一个对应于相对于入射束以特定角度散射的电子。
晶体越复杂（即，在晶胞中存在的原子越多），则衍射图案越复杂：更多的光斑可见。而且：晶体越复杂，存在越多的弱光斑。
注意，该衍射图案示出环绕中央光斑的对称性，但是对于大多数倾斜角度，衍射图案不显示对称性。
注意，例如，“协作计算机项目No.14”（CCP114）导致一套软件包来分析衍射图案，见CCP 14网站http://www.ccp14.ac.uk/about.htm。这种和其他包对于本领域技术人员是公知的。

Claims (15)

1. 一种使用电子显微镜（100）通过电子衍射断层照相来确定晶体的晶体结构的方法，该电子显微镜装配为使用电子束（200）照射晶体（202），该方法包含：
? 提供其中具有一种或更多晶体（202）的样品（204），
? 识别样品上待分析的晶体，
? 通过重复地执行以下操作来记录晶体的衍射倾斜序列
           ○ 相对于束使样品倾斜到已知倾斜角度，
           ○ 相对于束居中晶体，以及
           ○ 记录在所述倾斜角度处晶体的衍射图案，
? 以及通过分析记录的衍射图案来确定晶体结构，
其特征在于，
? 在记录衍射图像的同时，束相对于晶体保持固定，且束具有比晶体的直径大的直径。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中相对于束居中晶体涉及偏移束和/或机械地移动晶体。
3. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中用于记录衍射图案的束是基本平行束。
4. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中晶体具有小于10μm、更具体而言小于1μm，最具体而言小于100nm的最大直径。
5. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中晶体是来自催化剂、蛋白质、病毒、DNA和RNA的组的宏观分子的晶体。
6. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中识别大量晶体，且对于每个倾斜角度，记录大量衍射图案，每个衍射图案与晶体之一相关。
7. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中电子显微镜是冷冻电子显微镜且在样品处于冷冻温度的同时记录衍射图案。
8. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中样品安装在来自单倾斜保持器和双倾斜保持器的组的倾斜保持器上，且样品的倾斜是使该倾斜保持器倾斜的结果。
9. 根据权利要求8所述的方法，其中使用物镜形成衍射图案，且在至少部分倾斜位置期间，使用倾斜保持器相对于束和所述物镜的移动模型，晶体的位置相对于束和所述物镜居中，其结果是在晶体的居中期间晶体不暴露于电子。
10. 根据权利要求1至8中的任一项所述的方法，其中晶体的居中涉及使用电子束对至少部分样品进行成像。
11. 根据权利要求10所述的方法，其中使用电子束对样品进行成像涉及对晶体进行成像。
12. 根据权利要求10所述的方法，其中在形成倾斜序列之前，确定样品中一个或更多特征相对于晶体位置的位置，且其中使用电子束对样品进行成像涉及对一个或更多特征进行成像，且一个或更多特征的位置用于居中晶体，其结果是在晶体的居中期间晶体不暴露于电子。
13. 根据权利要求10至12中的任一项所述的方法，其中用于居中晶体的束的直径不同于用于记录衍射图案的束的直径。
14. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中在倾斜序列的记录期间，晶体暴露于小于105电子/nm2的剂量。
15. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中在倾斜序列记录期间，晶体暴露于小于300电子/(nm2s)的剂量率。
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