CN102309522B - 猪血去蛋白提取物口腔膏及其制备工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种猪血去蛋白提取物，尤其涉及一种猪血去蛋白提取物口腔膏，以及该猪血去蛋白提取物口腔膏的制备工艺，是用于治疗口腔粘膜、牙龈及嘴唇的损伤、炎症或溃疡、假牙托压疮等疾病的药物，属于生物制药技术领域。一种猪血去蛋白提取物口腔膏，它是由下述原料按所述重量份数比制备而成：猪血去蛋白提取物粉末0.1-0.3份，果胶15-20份，甘油5.5-10.5份，二甲基硅油9.1-19.35份，白凡士林30-40份，液体石蜡20-30份，尼泊金甲乙酯0.05-0.1份。本发明是治疗口腔粘膜、牙龈及嘴唇的损伤、炎症或溃疡、假牙托压疮等的药物，它可以替代牛血为来源的同类生物制品，药物安全性高，治疗效果明显优于小牛血去蛋白口腔膏。

Description

猪血去蛋白提取物口腔膏及其制备工艺

技术领域

本发明涉及一种猪血去蛋白提取物，尤其涉及一种猪血去蛋白提取物口腔膏，以及该猪血去蛋白提取物口腔膏的制备工艺。它是猪血去蛋白提取物的一种新剂型，本发明的猪血去蛋白提取物口腔膏剂是治疗口腔粘膜、牙龈及嘴唇的损伤、炎症或溃疡、假牙托压疮等的药物，属于生物制药技术领域。

背景技术

口腔溃疡以口腔的唇、颊、软腭或齿龈等处的粘膜多见，发生单个或者多个大小不等的圆形或椭圆形溃疡，表面覆盖灰白或黄色假膜，中央凹陷，边界清楚，周围粘膜红而微肿，溃疡局部灼痛明显，具有周期性、复发性、自限性的特征。多数学者认为口腔溃疡的发生是多种因素综合作用的结果。免疫、遗传和环境可能是口腔溃疡发病的“三联因素”，即遗传背景与适当的环境因素，包括精神神经体质、心理行为状态、生活工作和社会环境等，可引发异常的免疫反应而出现口腔溃疡特征性病损。目前仍无根治的特效方法，治疗原则是消除病因、增强体质、对症治疗，以减少复发次数，延长间隙期，减轻疼痛，促进愈合。

中国专利，专利号为ZL200510132478.0，专利名称“小牛血清去蛋白口腔膏及其制备方法”中公开了小牛血清去蛋白口腔膏，它提供了一种治疗上述疾病的药物，但此技术是以小牛血为原料的去蛋白提取物药物制剂，受疯牛病检测方法的局限性、疯牛病病毒灭活的限制性等因素，使得药物效果不理想，由于辅料等的选择，此药物起效慢，疗程长，在临床应用上受到广泛的限制。

虽然猪血去蛋白提取物具有促进细胞对氧和葡萄糖的摄取等作用，但不能直接用于患者临床应用，并且此提取物是水溶液，储存条件困难，只能冷冻保存，不仅耗电量大，一旦停电将直接影响其质量。并且现有的猪血去蛋白提取物为注射制剂，其注射剂主要为治疗脑血管疾病，并无口腔损伤、溃疡治疗研究的报道。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种猪血去蛋白提取物口腔膏及其制备工艺，其具有起效快、疗程短、治疗效果好、安全性高、易于储存的特点。

为了解决上述技术问题，本发明是通过下述技术方案实现的：

一种猪血去蛋白提取物口腔膏，它是由下述原料按所述重量份数比制备而成：猪血去蛋白提取物粉末0.1-0.3份，果胶15-20份，甘油5.5-10.5份，二甲基硅油9.1-19.35份，白凡士林30-40份，液体石蜡20-30份，尼泊金甲乙酯0.05-0.1份。

上述猪血去蛋白提取物口腔膏的最佳重量份数比为猪血去蛋白提取物粉末0.2份，果胶17.5份，甘油7.22份，二甲基硅油15份，白凡士林35份，液体石蜡25份，尼泊金甲乙酯0.08份。

上述猪血去蛋白提取物口腔膏的制备工艺，取符合所述重量份数的果胶、甘油、二甲基硅油、白凡士林、液体石蜡和尼泊金甲乙酯混合均匀，115-121℃条件下高压灭菌25-35分钟，压力为67kPa-97kPa，得基质混合物，将符合所述重量份数的猪血去蛋白提取物粉末加入到基质混合物中，混合均匀后，分装，即得猪血去蛋白提取物口腔膏。

上述的猪血去蛋白提取物粉末的制备工艺如下：取非传染区经检验合格的健康猪，采用无菌采血，去纤维蛋白，反复冻融，匀浆，分别用100000D、30000D、10000、6000D的中空纤维超滤柱依次进行四级超滤，将最终超滤液装入减压浓缩罐，在55℃下采用射流真空泵抽真空进行减压浓缩至总固体含量40mg/ml以上，得猪血去蛋白提取物溶液，猪血去蛋白提取物溶液在温度115-125℃、风速2.5m/s的条件下进行喷雾干燥，喷雾干燥后45-55℃真空干燥24小时，80目过筛，即得猪血去蛋白提取物粉末。

所述的分装是分装至药用聚乙烯复合软管中。

由于采用上述技术方案使得本发明具有如下优点和效果：

猪血去蛋白提取物是细胞代谢促进剂，能增进受损细胞对氧和葡萄糖的摄取和利用，促进纤维母细胞的生长，抑制细胞的损失，激发毛细血管形成，改善微循环，加速组织细胞的修复，提升机体免疫力，促进受损粘膜与溃疡愈合，使纤维重组，减少或避免瘢痕形成。此提取物是水溶性，储存条件困难，只能冷冻保存，由于猪血去蛋白提取物直接用于患者临床应用，不易被受损表皮吸收，将其制成口腔膏剂可以局部给药，迅速起效，控制溃疡面积及其程度，预防溃疡反复发作，易于储存，给药方便。

本发明涉及的猪血去蛋白提取物口腔膏与专利号ZL200510132478.0，专利名称“小牛血清去蛋白口腔膏及其制备方法”的制备的小牛血清去蛋白口腔膏相比较，能缩小溃疡面积，加速伤口愈合，显著减轻溃疡充血，对口腔粘膜溃疡有较好的治疗效果，本发明药物治疗效果明显优于小牛血清去蛋白口腔膏。本发明未引入有机溶剂，保证药物质量。同时以小牛血为原料的去蛋白提取物，受疯牛病检测方法的局限性、疯牛病病毒灭活的限制性等因素，影响了药物效果，在临床应用上受到广泛的限制。

与以小牛血为来源的生物制品比较，以猪血为来源的生物制品其原料易得、成本低、高安全性、高生物活性等优势，弥补牛血制品存在的潜在风险，本发明猪血去蛋白提取物口腔膏的安全性和治疗效果明显高于小牛血清去蛋白口腔膏。

本发明采用药用聚乙烯复合软管避免了普通铝管易染菌、加剧溃疡损伤的缺点，保证产品不染菌，增加使用安全性。

除了本发明采用了猪血去蛋白提取物外，其它原料与小牛血清去蛋白口腔膏的原料也不同，本发明经过大量实验筛选得出果胶、甘油、二甲基硅油、白凡士林、液体石蜡、尼泊金甲乙酯混合作为基质，由实验数据可以看出，果胶、甘油、二甲基硅油、白凡士林、液体石蜡、尼泊金甲乙酯这几种原料不仅起到了基质的作用，同时与猪血去蛋白提取物产生了协同作用，进而提高了药物的治疗效果，稳定性好。

具体实施方式

 下面结合实施例多本发明做进一步详细说明，但本发明的保护范围不受实施例所限。

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述的实施例中的百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1：

制备猪血去蛋白提取物粉末的制备：

按照专利号为ZL200510046289.1，发明名称为“从猪血中提取具有刺激细胞呼吸活性作用物质的方法”中描述的制备方法：取非传染区经检验合格的健康猪，采用无菌采血，去纤维蛋白，得去纤维蛋白血10L，反复冻融（-20℃～40℃）2-4次；于2-8℃条件下在胶体磨中匀浆2分钟，重复3次；取匀浆液于4000转/分钟离心20分钟后，弃去沉淀；取上清液，分别用100000D、30000D、10000、6000D的中空纤维超滤柱依次进行四级超滤，得滤液7.2L；将最终超滤液装入减压浓缩罐，在55℃下采用射流真空泵抽真空进行减压浓缩至总固体含量40mg/ml以上，得猪血去蛋白提取物溶液1.2L；将猪血去蛋白提取物溶液在温度120℃，风速2.5m/s条件下进行喷雾干燥，45-55℃真空干燥24小时，80目过筛，得猪血去蛋白提取物粉末48g。

实施例2：

猪血去蛋白提取物口腔膏的制备（含猪血去蛋白提取物粉末0.1%，相当于猪血去蛋白提取物溶液2.5%）

1、基质的制备

取果胶750g，甘油275g，二甲基硅油967.5g，白凡士林2000g，液体石蜡1000g，尼泊金甲乙酯2.5g，搅拌混匀，在115℃下高压灭菌（67kPa）30分钟。

2、猪血去蛋白提取物口腔膏分装

取实施例1方法制备的猪血去蛋白提取物粉末5g与上述灭菌基质混合均匀后，制成5000g口腔膏，用填充器分装，分装至中，每支5g，即得1000支猪血去蛋白提取物口腔膏。

实施例3：

猪血去蛋白提取物口腔膏的制备（含猪血去蛋白提取物粉末0.15%，相当于猪血去蛋白提取物溶液3.75%）

1、基质的制备

取果胶800g，甘油325g，二甲基硅油864.5g，白凡士林1875g，液体石蜡1125g，尼泊金甲乙酯3.25g，搅拌混匀，在120℃下高压灭菌（75kPa）25分钟。

2、猪血去蛋白提取物口腔膏分装

取实施例1方法制备的猪血去蛋白提取物粉末7.5g与上述灭菌基质混合均匀后，制成5000g口腔膏，用填充器分装，分装至药用聚乙烯复合软管中，每支5g，即得1000支猪血去蛋白提取物口腔膏。

实施例4：

猪血去蛋白提取物口腔膏的制备（含猪血去蛋白提取物粉末0.2%，相当于猪血去蛋白提取物溶液5%）

1、基质的制备

取果胶875g，甘油361g，二甲基硅油750g，白凡士林1750g，液体石蜡1250g，尼泊金甲乙酯4g，搅拌混匀，在115℃下高压灭菌（67kPa）30分钟。

2、猪血去蛋白提取物口腔膏的分装

取实施例1方法制备的猪血去蛋白提取物粉末10g与上述灭菌基质混合均匀后，制成5000g口腔膏，用填充器分装，分装至药用聚乙烯复合软管中，每支5g，即得1000支猪血去蛋白提取物口腔膏。

实施例5：

猪血去蛋白提取物口腔膏的制备（含猪血去蛋白提取物粉末0.25%，相当于猪血去蛋白提取物溶液6.25%）

1、基质的制备

取果胶925g，甘油450g，二甲基硅油608g，白凡士林1625g，液体石蜡1375g，尼泊金甲乙酯4.5g，搅拌混匀，在115℃下高压灭菌（97kPa）25分钟。

2、猪血去蛋白提取物口腔膏的分装

取实施例1方法制备的猪血去蛋白提取物粉末12.5g与上述灭菌基质混合均匀后，制成5000g口腔膏，用填充器分装，分装至药用聚乙烯复合软管中，每支5g，即得1000支猪血去蛋白提取物口腔膏。

实施例6：

猪血去蛋白提取物口腔膏的制备（含猪血去蛋白提取物粉末0.3%，相当于猪血去蛋白提取物溶液7.5%）

1、基质的制备

取果胶1000g，甘油525g，二甲基硅油455g，白凡士林1500g，液体石蜡1500g，尼泊金甲乙酯5g，搅拌混匀，在121℃下高压灭菌（75kPa）35分钟。

2、猪血去蛋白提取物口腔膏的分装

取实施例1方法制备的猪血去蛋白提取物粉末15g与上述灭菌基质混合均匀后，制成5000g口腔膏，用填充器分装，分装至药用聚乙烯复合软管中，每支5g，即得1000支猪血去蛋白提取物口腔膏。

实施例7：

猪血去蛋白提取物口腔膏的制备（含猪血去蛋白提取物粉末0.2%，相当于猪血去蛋白提取物溶液5%）

猪血去蛋白提取物粉末为实施例1方法制得，用此猪血去蛋白提取物粉末替代小牛血去蛋白提取物，并按照专利号ZL200510132478.0，专利名称“小牛血清去蛋白口腔膏及其制备方法”中描述的方法制备，制成1000支猪血去蛋白提取物口腔膏，每支5g。

实施例8：

猪血去蛋白提取物口腔膏对豚鼠肝细胞呼吸活性的影响试验：

样品制备：

试验药制备：猪血去蛋白提取物口腔膏分别按实施例2、3、4、5、6、7的方法制得。

对照药制备：按照专利号ZL200510132478.0，专利名称“小牛血清去蛋白口腔膏及其制备方法”的制备方法制备。

肝细胞分离：断头处死豚鼠，取肝重2g，于冷生理盐水中剥除血管等纤维成分，置于Hank’s液中漂洗1~2次，置1:10的Hank’s液中，反复吹打制成细胞悬液。将悬液注入离心管，室温放置5~10分钟，吸去上层脂肪等杂物，反复三次，200目纱网过滤即得肝细胞悬液，备用。

检测：采用瓦氏微量呼吸检压仪方法。

反应瓶中先加入Soerensen缓冲液1.1ml，加供试品0.2ml，然后加肝匀浆液1.0ml，加10%氢氧化钠溶液0.2ml于具一小滤纸条的反应瓶中间小杯。由于肝匀浆本身有耗氧作用，故实验时以Soerensen缓冲液0.2ml代替供试品，其余试剂同样品管，作为空白管。将装好的反应瓶按管号与测压计相连，置37℃恒温水浴中。开动振荡器振摇10分钟（75次/分）使反应瓶内外温度一致。将测压计右侧柱液面调至150mm，记下左侧液面初读数（A），然后关闭三向活塞，开始计时，反应30分钟记时后将测压计右侧柱液面再调至150mm，记下左侧液面读数（B）。打开三向活塞，重复上述过程，进行下一个30分钟的反应并记下左侧液面初读数（C）及30分钟后的液面读数（D）。实验过程中必须附加一套供校正用的温压计，在反应瓶中加2.5ml的Soerensen缓冲液，使其在与试验管完全相同的条件下试验，观察其压力的变化（△C），以消除试验过程中温度及大气压的影响。

计算：

QO₂（μl·O₂/mg·h）=[（A-B+C-D）×K₁-△C×K₂]/G/I（QO₂≥4.0）

式中K1为空白或样品的反应瓶常数，K2为温压计的反应瓶常数，G为每1ml肝匀浆的干重（mg），G=△W/2-9.3，9.3为Soerensen缓冲液的干重（mg），I为反应时间（小时）。

刺激指数（SI）=供试品QO₂/空白QO₂（SI≥2.5）

表1  各组药物对豚鼠肝细胞呼吸活性的影响实验结果（                                                

±s）

组别	呼吸活力QO2(μl·O2/(mg·h)	刺激指数SI
			空白对照组	1.58	1.00
对照药组	3.91	2.47
			实施例2组	4.18	2.65
实施例3组	4.20	2.66
			实施例4组	4.63	2.93
实施例5组	4.22	2.67
			实施例6组	4.21	2.67
实施例7组	3.89	2.46

由呼吸活力测定结果表明，猪血去蛋白提取物口腔膏除实施例7组外，其他各组药组QO₂值和 SI值均到达标准要求，说明本发明的猪血去蛋白提取物口腔膏可影响细胞内线粒体有氧呼吸链式反应，影响氧化还原酶活性，且作用相同，同时实施例4采用最佳配比的治疗效果最好。对照药小牛血清去蛋白口腔膏对细胞的刺激作用也未达到标准要求。

实施例9：

猪血去蛋白提取物口腔膏对创伤性口腔溃疡的作用试验：

试验药制备：同实施例8。

对照药制备：同实施例8。

取家兔80只，随机分为8组，即模型组、对照药组、猪血去蛋白提取物口腔膏实施例2组、实施例3组、实施例4组、实施例5组、实施例6组、实施例7组，每组10只。用一内径0.6cm，长3cm的玻璃管垂直固定于家兔口腔黏膜表面，向管内注入体积分数为30%的冰醋酸0.2ml，30s后用棉签蘸出冰醋酸。24h后，测定无水肿黏膜溃疡面积和观察炎症充血情况。分别给予小牛血清去蛋白口腔膏和猪血去蛋白提取物口腔膏，每日4次，直至溃疡愈合。

分级标准：0级：溃疡周围无红晕，无水肿，0分；

1级：溃疡周围稍有红晕，1分；

2级：溃疡周围有红晕，无水肿，2分；

3级：溃疡周围有红晕，有水肿，3分。

各组数据均用

±s表示，用t检验进行统计分析。

表2  各组药物对家兔口腔黏膜溃疡炎症充血的影响

 

注：与模型组比较，*P﹤0.05，**P﹤0.01

表3  各组药物对家兔口腔黏膜溃疡面积的影响（mm，

±s）

组别	治疗前	治疗第3天	治疗第5天	治疗第7天	治疗第9天
						模型组	50.14±1.23	58.92±2.01	53.86±1.63	38.75±2.14	20.45±1.74
对照药组	51.20±1.41	54.29±1.87	48.74±1.51	35.64±1.66	13.88±1.10
						实施例2组	49.76±1.84	32.75±1.34*	13.54±1.02**	5.66±0.81**	1.03±0.48**
实施例3组	50.52±2.43	31.21±2.04*	13.04±1.50**	5.25±1.24**	1.00±0.54**
						实施例4组	51.09±1.82	32.11±1.42*	13.12±1.23**	5.45±1.10**	1.01±0.63**
实施例5组	50.44±2.41	30.97±1.39*	12.47±1.34**	5.11±1.07**	1.05±0.48**
						实施例6组	50.33±1.51	30.58±1.77*	12.77±1.10**	5.08±1.01**	1.09±0.71**
实施例7组	50.64±1.33	52.98±1.67	43.77±1.32	27.88±1.55*	9.43±0.60*

注：与模型组比较，*P﹤0.05，**P﹤0.01

实验结果显示，治疗后猪血去蛋白提取物口腔膏除实施例7组外，其他各组均能将治疗前溃疡炎症充血情况缓解治愈，降低溃疡评分，缩小溃疡面积，加速伤口愈合，与模型组比较有显著差异，并且随着治疗时间的延长，溃疡面积显著缩小，直至治疗第9天，口腔溃疡基本治愈。对于口腔充血炎症和溃疡愈合方面，最佳配比组（实施例4）效果尤为显著。猪血去蛋白提取物口腔膏实施例7组作用缓慢，直至治疗第7天才有轻微治疗效果。而小牛血清去蛋白口腔膏组治愈效果缓慢，治疗第9天时溃疡面仍未完全愈合。通过实验比较说明，本发明的猪血去蛋白提取物口腔膏能显著减轻溃疡充血，缩小口腔溃疡面积，对口腔溃疡有较好的治疗效果，优于小牛血清去蛋白口腔膏。

实施例10：

猪血去蛋白提取物口腔膏对细菌感染诱导口腔溃疡的作用试验：

试验药：同实施例8。

对照药：同实施例8。

取家兔80只，体重为2~2.5kg，随机分8组，即模型组、对照药组、实施例2组、实施例3组、实施例4组、实施例5组、实施例6组、实施例7组，每组10只。每天仅给予30g/kg淀粉饼饮食，连续7天后，在其右侧下牙床后半部用镊子夹起粘膜造成0.3~0.5cm³的创面，再用滴管滴一滴2000个/ml金黄色葡萄球菌溶液于创面上，从第2天起即用被上述菌液污染的镊子刺激创面，直至该部位出现0.3~0.5cm³溃疡面（白色或淡黄色假膜覆盖）。分别给予各组药物，每日4次，直至溃疡愈合。记录溃疡面积和愈合时间。

表4  各组药物对家兔口腔黏膜溃疡面积的影响（mm，

±s）

组别	治疗前	治疗第1天	治疗第3天	治疗第6天
					模型组	59.36±2.51	56.77±3.47	48.25±3.27	30.79±2.07
对照药组	60.37±2.84	45.17±2.66	40.98±3.15	24.56±3.08
					实施例2组	58.99±3.04	31.33±4.17*	19.74±2.07**	7.88±2.00**
实施例3组	60.35±4.82	33.24±4.67*	18.65±3.14**	8.18±2.14**
					实施例4组	59.31±3.22	32.65±3.11*	17.09±3.17**	7.56±1.08**
实施例5组	58.66±5.92	32.20±5.24*	18.00±2.86**	8.42±1.85**
					实施例6组	61.29±2.94	34.34±3.30*	18.99±2.95**	9.07±1.61**
实施例7组	60.86±2.75	44.14±2.81	38.70±2.13*	19.11±1.45*

注：与模型组比较，*P﹤0.05，**P﹤0.01

表5  各组药物对家兔口腔黏膜溃疡愈合时间的影响（

±s）

 

实验结果显示，治疗后猪血去蛋白提取物口腔膏除实施例7组外，其他各组均能有效减小由细菌诱导的溃疡面积，与模型组比较，有显著统计学差异（P﹤0.01），基本治疗第7天溃疡面已全部愈合，显效迅速，最佳配比组（实施例4）愈合天数最短。猪血去蛋白提取物口腔膏实施例7组治疗周期较长，起效较慢，治疗效果没有猪血去蛋白提取物口腔膏其他各组好。对照药组虽然也能减轻溃疡程度，但进程缓慢，治疗第8天才能改善溃疡损伤，治疗效果低于猪血去蛋白提取物口腔膏。

实施例11：猪血去蛋白提取物口腔膏稳定性数据：

1、样品制备：分别按照实施例4、实施例7的方法制备猪血去蛋白提取物口腔膏；按照专利号ZL200510132478.0，专利名称“小牛血清去蛋白口腔膏及其制备方法”的制备方法制备对照药。

2、样品检验项目

2.1 高分子量物质：采用高效液相色谱法（《中国药典》2010年版三部附录Ⅲ B）试验，使用TSK-G2000SW柱，以乙腈－三氟醋酸－水(40:0.1:60)为流动相，流速为1ml/min，检测波长为214nm。

称取胰岛素（M.W＝5800）适量，用流动相配成浓度为2.5mg/ml的溶液作为对照品溶液。

取本品适量加乙腈10ml溶解，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

取对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。将先于胰岛素峰保留时间的峰视为高分子物质，如有高分子量物质存在，按面积归一化法计算，高分子量物质含量不得过2.0%，并确定高分子量物质最大分子量，最大分子量限度不大于10000Da。

    2.2 呼吸活性测定：

    2.2.1 肝匀浆液的制备：取体重200—300g的雄性豚鼠一只，颈部打击处死（处死前需禁食至少24小时），立即切断颈动脉放血，打开腹腔取出肝脏，置冰水浴中的Soerensen缓冲液中（注意：不要损伤胆囊或胆管）。称取5.5g的肝脏，并切割为大小相同的7块，每块用7ml的Soerensen缓冲液匀浆（注意：以上操作必须在冰水浴中进行）。

2.2.2 测定法：预先把测压计反应瓶洗净并干燥，备用；装好测压液于测压管内，调节液面至150mm；反应瓶中先加入Soerensen缓冲液1.1ml，加供试品0.2ml，然后加肝匀浆液1.0ml；加10%氢氧化钠溶液0.2ml于具一小滤纸条的反应瓶中间小杯；由于肝匀浆本身有耗氧作用，故实验时以Soerensen缓冲液0.2ml代替供试品，其余试剂同样品管，作为空白管；将装好的反应瓶按管号与测压计相连（注意密闭，勿使漏气），置37℃恒温水浴中；开动振荡器振摇10分钟（75次/分）使反应瓶内外温度一致。将测压计右侧柱液面调至150mm，记下左侧液面初读数（A），然后关闭三向活塞，开始计时，反应30分钟记时后将测压计右侧柱液面再调至150mm，记下左侧液面读数（B）。打开三向活塞，重复上述过程，进行下一个30分钟的反应并记下左侧液面初读数（C）及30分钟后的液面读数（D）；实验过程中必须附加一套供校正用的温压计，在反应瓶中加2.5ml的Soerensen缓冲液，使其在与试验管完全相同的条件下试验，观察其压力的变化（△C），以消除试验过程中温度及大气压的影响；取2.0ml肝匀浆，置恒重的装有海沙的称量瓶中，110℃干燥至恒重，计算两次的重量差△W（mg）。

2.2.3 计算：

QO₂（μl·O₂/mg·h）=[（A-B+C-D）×K1-△C×K2]/G/I （QO₂≥ 4.0μl·O₂/mg·h）

刺激指数（SI）=供试品QO₂/空白QO₂  （SI≥2.5）

式中K1为空白或样品的反应瓶常数；K2为温压计的反应瓶常数；G为每1ml肝匀浆的干重（mg），G=△W/2-9.3，9.3为Soerensen缓冲液的干重（mg）；I为反应时间（小时）。

2.3 多肽测定：

2.3.1 标准曲线的制备：取带塞试管6支，按顺序精密加入牛血清白蛋白标准液0.00，0.50，0.70，0.90，1.10，1.30ml，再依次加水1.60，1.10，0.90，0.70，0.50，0.30ml，再精密加碱性铜试液4.0ml摇匀，室温放置10分钟，依次精密加入福林试液0.4ml摇匀，加塞，于30℃恒温水浴保温30分钟，冷却后，在660nm的波长处测定吸收度，以吸收度A为纵坐标，牛血清白蛋白标准溶液浓度C为横坐标，绘制C-A曲线，或用最小二乘法回归，求得回归方程。

2.3.2 供试品测定：取猪血去蛋白提取物口腔膏适量，精密称定，加水10ml溶解，滤过，取续滤液作为供试品溶液。精密量取供试品溶液0.80ml，以下照标准曲线制备，自“再依次精密加碱性铜试液……”起，同法操作，测定吸收度，自标准曲线或回归方程求得供试液的mg数。每支含多肽不低于0.5mg。

2.4 氨基酸测定：

    2.4.1 色谱条件：高效液相色谱仪（岛津LC-10ATvp）；流动相A：称取22.5g醋酸钠，加水1900ml，溶解后用冰醋酸调pH6.0，加乙腈100ml，混匀，用0.45μm滤膜过滤；流动相B：70%乙腈；流速：0.8ml/min；检测波长：254nm；柱温：40℃；

表6  梯度条件

时间（min）	流速(ml/min)	缓冲液A（%）	缓冲液B（%）
				0.01	0.8	100	0
4	0.8	97	3
				12	0.8	80	20
20	0.8	74	26
				28	0.8	70	30
31	0.8	50	50
				35	0.8	30	70
38	0.8	0	100
				40	0.8	100	0

2.4.2 氨基酸标准品的配制：分别取氨基酸标准品各约25.0mg，精密称定，于50ml量瓶中，用0.1mol/L的HCl溶液溶解，并定容至刻度，配成浓度均为0.5mg/ml的氨基酸标准品溶液。

正亮氨酸内标溶液：称取正亮氨酸约10mg，加0.1mol/L盐酸溶液10ml溶解，混匀。

精密吸取氨基酸标准品溶液200μl，分别置1ml离心管中，每个离心管中精密加入正亮氨酸内标溶液20μl， 0.5mol/L三乙胺乙腈液80μl，50mmol/L异硫氰酸苯酯乙腈液80μl，摇匀，室温放置1小时，加正己烷320μl，振摇后放置10分钟，取下层溶液，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。

2.4.3 供试品制备：精密吸取猪血去蛋白提取物口腔膏适量，精密测定，加水10ml溶解，滤过，滤液分别置1ml离心管中，按前述“衍生方法”操作，制得猪血去蛋白提取物注射液的衍生物溶液。

2.4.4 测定：取氨基酸标准品衍生物溶液和供试品各2μl进样，记录色谱图。每支含氨基酸不低于0.5mg。

3、加速试验测定

在温度40℃±2℃、相对湿度75%±5%的条件下放置6个月，在试验期间第1个月、2个月、3个月、6个月末分别取样一次，考察样品高分子量物质、呼吸活性、多肽、氨基酸测定。

    4、各试验测定结果

表7  加速试验结果表

 

由各试验数据结果可知，本发明所设计的最佳处方长期加速放置6个月均不影响产品的活性和质量，临床使用不会产生过敏等不良反应。猪血去蛋白提取物采用小牛血清去蛋白口腔膏的制剂辅料和工艺进行，不但不能达到本发明处方的疗效，还随着时间的推移，各项指标呈下降趋势。

按照专利号ZL200510132478.0，专利名称“小牛血清去蛋白口腔膏及其制备方法”的制备方法制备的小牛血清去蛋白口腔膏在放置1个月除QO₂和SI外，其他基本合格，但到第6个月时，出现影响质量的高分子量物质，并且各项指标有所下降。

本次试验结果说明本发明所选用的辅料与猪血去蛋白提取物有较好的协同作用，并不影响药物效果。小牛血去蛋白口腔膏所含有的指标性成分较少，直接影响产品的疗效，不及猪血去蛋白提取物口腔膏。 

Claims (4)

1.猪血去蛋白提取物口腔膏，其特征在于它是由下述原料按所述重量份数比制备而成：猪血去蛋白提取物粉末0.1-0.3份，果胶15-20份，甘油5.5-10.5份，二甲基硅油9.1-19.35份，白凡士林30-40份，液体石蜡20-30份，尼泊金甲乙酯0.05-0.1份；所述的猪血去蛋白提取物粉末的制备方法如下：取非传染区经检验合格的健康猪，采用无菌采血，去纤维蛋白，反复冻融，匀浆，分别用100000D、30000D、10000D、6000D的中空纤维超滤柱依次进行四级超滤，将最终超滤液装入减压浓缩罐，在55℃下采用射流真空泵抽真空进行减压浓缩至总固体含量40mg/ml以上，得猪血去蛋白提取物溶液，猪血去蛋白提取物溶液在进口温度120℃、出口温度65℃、风速2.5m/s的条件下进行喷雾干燥，喷雾干燥后45-55℃真空干燥24小时，80目过筛，即得猪血去蛋白提取物粉末。

2.根据权利要求1所述的猪血去蛋白提取物口腔膏，其特征在于它是由下述原料按所述重量份数比制备而成：猪血去蛋白提取物粉末0.2份，果胶17.5份，甘油7.22份，二甲基硅油15份，白凡士林35份，液体石蜡25份，尼泊金甲乙酯0.08份。

3.一种权利要求1所述的猪血去蛋白提取物口腔膏的制备工艺，其特征在于取符合所述重量份数的果胶、甘油、二甲基硅油、白凡士林、液体石蜡和尼泊金甲乙酯混合均匀，在115-121℃条件下高压灭菌25-35分钟，压力为67kPa-97kPa，得基质混合物，将符合所述重量份数的猪血去蛋白提取物粉末加入到基质混合物中，混合均匀后，分装，即得猪血去蛋白提取物口腔膏；所述的猪血去蛋白提取物粉末的制备方法如下：取非传染区经检验合格的健康猪，采用无菌采血，去纤维蛋白，反复冻融，匀浆，分别用100000D、30000D、10000D、6000D的中空纤维超滤柱依次进行四级超滤，将最终超滤液装入减压浓缩罐，在55℃下采用射流真空泵抽真空进行减压浓缩至总固体含量40mg/ml以上，得猪血去蛋白提取物溶液，猪血去蛋白提取物溶液在进口温度120℃、出口温度65℃、风速2.5m/s的条件下进行喷雾干燥，喷雾干燥后45-55℃真空干燥24小时，80目过筛，即得猪血去蛋白提取物粉末。

4.根据权利要求3所述的猪血去蛋白提取物口腔膏的制备工艺，其特征在于所述的分装是分装至药用聚乙烯复合软管中。