CN102307890A - 丙型肝炎病毒抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本文公开了具有通式(I)的丙型肝炎病毒抑制剂。也公开包含该化合物的组合物和使用该化合物抑制HCV的方法。

Description

丙型肝炎病毒抑制剂
相关申请的交互参考 
本申请要求2008年12月4日提交的美国临时申请序号61/119,859的权益。 
本公开总的来讲涉及抗病毒化合物，更准确地讲涉及抑制由丙型肝炎病毒(HCV)编码的NS3蛋白酶(本文中亦称“丝氨酸蛋白酶”)功能的化合物、包含这类化合物的组合物和用于抑制NS3蛋白酶功能的方法。 
HCV是一种主要的人类病原体，估计感染全球1.7亿人--大约为人免疫缺陷病毒1型感染人数的5倍。这些HCV感染个体当中的相当一部分会发展成严重的进行性肝病，包括肝硬化和肝细胞癌。 
目前，最有效的HCV疗法采用α-干扰素和利巴韦林的组合，在40％患者中产生持续功效。最新临床结果表明，作为单一疗法时聚乙二醇化α-干扰素优于未修饰的α-干扰素。然而，即使是使用包括聚乙二醇化α-干扰素和利巴韦林组合的实验性治疗方案，相当一部分患者的病毒负荷未有持续降低。因此存在开发用于治疗HCV感染的有效治疗药的明显和长期的需求。 
HCV是一种正链RNA病毒。根据对推导出的氨基酸序列和5’非翻译区广泛相似性的比较，HCV被归类到黄病毒科(Flaviviridae family)单独的一个属内。黄病毒科的所有成员都是含有正链RNA基因组的有包膜病毒粒子，该基因组通过单个不间断可读框的翻译，编码所有已知的病毒特异性蛋白。 
在整个HCV基因组的核苷酸和所编码的氨基酸序列内发现相当多的异质性。已经表征了6个主要的基因型，并且描述了50个以上的亚型。HCV的主要基因型在全球的分布不同，虽然进行了基因型对 发病机制和疗法的可能作用的大量研究，但仍不清楚HCV遗传异质性的临床意义。 
单链HCV RNA基因组的长度约为9500个核苷酸并具有一个编码约3000个氨基酸的单一大的多聚蛋白的单一可读框(ORF)。在感染细胞中，该多聚蛋白在多个位点上被细胞蛋白酶和病毒蛋白酶切割，产生结构蛋白和非结构(NS)蛋白。就HCV而言，成熟的非结构蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)的生成是通过两种病毒蛋白酶实现的。第一种在NS2-NS3接点进行切割；第二种是包含在NS3N末端区内的丝氨酸蛋白酶并且介导NS3下游所有的后续切割，两者在NS3-NS4A切割位点为顺式，在其余NS4A-NS4B、NS4B-NS5A、NS5A-NS5B位点则为反式。NS4A蛋白似乎有多种功能，起NS3蛋白酶辅因子的作用，并可能协助NS3和其它病毒复制酶组分进行膜定位。NS3蛋白与NS4A复合物的形成对有效多聚蛋白加工、在所有位点上提高蛋白酶剪切效率是必需的。NS3蛋白还显示出核苷三磷酸酶和RNA解旋酶活性。NS5B是参与HCV复制的依赖于RNA的RNA聚合酶。 
本公开提供可以抑制NS3蛋白酶功能的肽化合物，例如与NS4A蛋白酶组合。此外，本公开描述了给予患者联合疗法，其中有效抑制HCV NS3蛋白酶的本公开化合物可以与具有抗HCV活性的另外的化合物一起给予。 
本公开的第一个方面提供式(I)化合物 
或其药学上可接受的盐，其中 
n是0、1、2、3或4； 
R1选自羟基和-NHSO2R4； 
R2选自氢、烷氧基、烷基硫基、烷基磺酰基、烷基亚磺酰基和羟基； 
每个R3独立选自烷氧基、烷基、氰基、二烷基氨基、卤代、卤代烷基、卤代烷氧基、单环杂环、羟基和苯基；其中的单环杂环和苯基各自任选被独立选自烷氧基、烷基、二烷基氨基、卤代、卤代烷氧基和卤代烷基的一个、二个、三个、四个或五个取代基取代； 
R4选自烷基、芳基、芳烷基、环烷基、(环烷基)烷基、杂环基和-NRaRb；其中的烷基和环烷基各自任选被选自烷基、烷氧基、卤代、卤代烷基、氰基、氰基烷基和卤代烷氧基的一个基团取代； 
R5和R6独立选自氢、C1-3烷氧基、C1-3卤代烷氧基和任选被卤代取代的C1-3烷基， 
Ra和Rb独立选自氢、烷氧基、烷基、芳基、芳烷基、环烷基、(环烷基)烷基、卤代烷基、杂环基和杂环基烷基； 
Q是任选含一个氧原子的C4-8饱和的或不饱和的链，其中所述链任选被独立选自烷基、卤代和卤代烷基的一个、二个、三个或四个基团取代，其中所述烷基和卤代烷基可任选与它们相连的碳原子形成3-7元环； 
Q’是任选含一个选自氮、氧和硫的杂原子的C4-8饱和的或不饱和的链；其中所述链任选被独立选自烷基和卤代的一个、二个、三个或四个基团取代； 
Z选自CH2、O和NRz；其中Rz选自氢和烷基。 
在第一方面的第一个实施方案中，本公开提供式(I)化合物或其药学上可接受的盐，其中R1是-NHSO2R4。 
在第一方面的第二个实施方案中，本公开提供式(I)化合物或其药学上可接受的盐，其中R1是-NHSO2R4和其中n是1。 
在第一方面的第三个实施方案中，本公开提供式(I)化合物或其药学上可接受的盐，其中R1是-NHSO2R4，n是1，Q是任选被两个烷基取代的C4-6饱和的或不饱和的链和Z是O。 
在第一方面的第四个实施方案中，本公开提供式(I)化合物或其药学上可接受的盐，其中R1是-NHSO2R4，n是1，Q是任选被两个烷基取代的C4-6饱和的或不饱和的链，Z是O和R3是烷氧基。 
在第一方面的第五个实施方案中，本公开提供式(I)化合物或其药学上可接受的盐，其中R1是-NHSO2R4，n是1，Q是任选被两个烷基取代的C4-6饱和的或不饱和的链，Z是O，R3是烷氧基和R2是烷氧基。 
在第一方面的第六个实施方案中，本公开提供式(I)化合物或其药学上可接受的盐，其中R1是-NHSO2R4，n是1，Q是任选被两个烷基取代的C4-6饱和的或不饱和的链，Z是O，R3是烷氧基、R2是烷氧基和Q’是C6-8饱和的或不饱和的链。 
在第一方面的第七个实施方案中，本公开提供式(I)化合物或其药学上可接受的盐，其中R1是-NHSO2R4；R2是烷氧基；R4是环烷基；以及R5和R6是氢。 
在第一方面的第八个实施方案中，本公开提供式(I)化合物或其药学上可接受的盐，其中n是1；R1是-NHSO2R4；其中R4是环烷基；R2是烷氧基；R3是烷氧基；R4和R5是氢，Q是任选被两个烷基取代的C4-6饱和的链或未取代的链；Q’是任选被两个烷基取代的C4-6饱和 的链或未取代的链；和Z是O。 
在本公开的第二方面，提供包含式(I)化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体的组合物。在第二方面的第一个实施方案中，组合物还包含至少一种具有抗-HCV活性的另外的化合物。在第二方面的第二个实施方案中，另外的化合物中的至少一种是干扰素或利巴韦林。在第二方面的第三个实施方案中，干扰素选自干扰素α2B、聚乙二醇化干扰素α、复合干扰素、干扰素α2A和类淋巴母细胞干扰素τ。 
在第二方面的第四个实施方案中，本公开提供包含式(I)化合物或其药学上可接受的盐、药学上可接受的载体和至少一种具有抗-HCV活性的另外的化合物的组合物，其中另外的化合物中的至少一种选自白介素2、白介素6、白介素12、促进产生1型辅助性T细胞应答的化合物、干扰RNA、反义RNA、咪喹莫德、利巴韦林、肌苷5′-一磷酸脱氢酶抑制剂、金刚烷胺和金刚乙胺。 
在第二个方面的第五个实施方案中，本公开提供一种组合物，所述组合物包含式(I)化合物或其药学上可接受的盐、药学上可接受的载体及至少一种具有抗HCV活性的另外的化合物，其中所述另外的化合物中的至少一种有效抑制选自以下靶标的功能以治疗HCV感染：HCV金属蛋白酶、HCV丝氨酸蛋白酶、HCV聚合酶、HCV解旋酶、HCV NS4B蛋白、HCV进入、HCV装配、HCV脱出、HCV NS5A蛋白和IMPDH。 
本公开的第三个方面提供一种组合物，所述组合物包含式(I)化合物或其药学上可接受的盐，一种、两种、三种、四种或五种具有抗HCV活性的另外的化合物，及药学上可接受的载体。在第三个方面的第一个实施方案中，所述组合物包含三种或四种具有抗HCV活性的另外的化合物。在第三个方面的第二个实施方案中，所述组合物包含一种或两种具有抗HCV活性的另外的化合物。 
在第四个方面，本公开提供一种治疗患者的HCV感染的方法， 所述方法包括给予患者治疗有效量的式(I)或其药学上可接受的盐。在第四个方面的第一个实施方案中，所述方法还包括在给予式(I)化合物或其药学上可接受的盐之前、之后或同时给予至少一种具有抗HCV活性的另外的化合物。在第四个方面的第二个实施方案中，所述另外的化合物中的至少一种为干扰素或利巴韦林。在第四个方面的第三个实施方案中，所述干扰素选自干扰素α2B、聚乙二醇化干扰素α、复合α干扰素、干扰素α2A和类淋巴母细胞干扰素τ。 
在第四个方面的第四个实施方案中，本公开提供一种治疗患者的HCV感染的方法，所述方法包括在给予患者式(I)化合物或其药学上可接受的盐之前、之后或同时给予治疗有效量的式(I)或其药学上可接受的盐及至少一种具有抗HCV活性的另外的化合物，其中所述另外的化合物中的至少一种选自白介素2、白介素6、白介素12、促进产生1型辅助性T细胞应答的化合物、干扰RNA、反义RNA、咪喹莫德(Imiqimod)、利巴韦林、肌苷5′-一磷酸脱氢酶抑制剂、金刚烷胺和金刚乙胺。 
在第四个方面的第五个实施方案中，本公开提供一种治疗患者的HCV感染的方法，所述方法包括在给予患者式(I)化合物或其药学上可接受的盐之前、之后或同时给予治疗有效量的式(I)或其药学上可接受的盐及至少一种具有抗HCV活性的另外的化合物，其中所述另外的化合物中的至少一种有效抑制选自以下靶标的功能以治疗HCV感染：HCV金属蛋白酶、HCV丝氨酸蛋白酶、HCV聚合酶、HCV解旋酶、HCV NS4B蛋白、HCV进入、HCV装配、HCV脱出、HCV NS5A蛋白和IMPDH。 
本公开的第五个方面提供一种治疗患者的HCV感染的方法，所述方法包括在给予患者式(I)化合物或其药学上可接受的盐之前、之后或同时给予治疗有效量的式(I)化合物或其药学上可接受的盐及一种、两种、三种、四种或五种具有抗HCV活性的另外的化合物。在第五个方面的第一个实施方案中，所述方法包括给予三种或四种具有抗 HCV活性的另外的化合物。在第五个方面的第二个实施方案中，所述方法包括给予一种或两种具有抗HCV活性的另外的化合物。 
本公开的其它方面可包括本文公开的各实施方案的适当组合。 
又一些其它方面和实施方案可以在本文提供的描述中找到。 
本公开在本文中的描述应当解释为与化学成键的定律和原则一致。在某些情况下，为了在任何给定位置容纳取代基，可能必需去掉氢原子。 
应该理解，本公开所包括的化合物为用作药物的适当稳定的化合物。 
意欲使在分子中特定位置上的任何取代基或变量的定义独立于该分子在其它位置上的定义。例如，当n为2时，两个R4基团的每一个可以相同或者不同。 
本说明书中所引用的所有专利、专利申请和文献参考资料都通过引用其全部结合到本文中。在不一致的情况下，以本公开(包括定义)为准。 
本文所用的术语前未加数词修饰时的单数形式(“a”、“an”和“the”)包括复数形式，除非文中另有明确说明。 
本文所用的术语“烯基”是指含有至少一个碳-碳双键的2-10个碳原子的直链或支链基团。 
本文所用的术语“烷氧基”是指通过氧原子与母体分子部分连接的烷基。 
本文所用的术语“烷基”是指衍生自含有1-10个碳原子的直链或支链饱和烃的基团。 
本文所用的术语“烷基硫基”是指通过硫原子与母体分子部分连接的烷基。 
本文所用的术语“烷基磺酰基”是指通过磺酰基与母体分子部分连接的烷基。 
本文所用的术语“烷基亚磺酰基”是指通过亚磺酰基与母体分子 部分连接的烷基。 
本文所用的术语“芳基”是指苯基或双环稠合环系，其中环的一个或两个为苯基。双环稠合环系由与4-6元芳族或非芳族碳环稠合的苯基组成。本发明的芳基可以通过基团中任何可被取代的碳原子与母体分子部分连接。芳基的代表性实例包括但不限于茚满基、茚基、萘基、苯基和四氢萘基。 
本文所用的术语“芳基烷基”是指被1、2或3个芳基取代的烷基。 
本文所用的术语“氰基”是指-CN。 
本文所用的术语“氰基烷基”是指被1、2或3个氰基取代的烷基。 
本文所用的术语“环烷基”是指具有3-7个碳原子和0个杂原子的饱和单环或双环烃环系。环烷基的代表性实例包括但不限于环丙基、环丁基和环戊基。 
本文所用的术语“(环烷基)烷基”是指被1、2或3个环烷基取代的烷基。 
本文所用的术语“二烷基氨基”是指-NRpRq，其中Rp和Rq为烷基。所述烷基可以相同或不同。 
本文所用的术语“卤代”和“卤素”是指F、Cl、Br和I。 
本文所用的术语“卤代烷氧基”是指通过氧原子与母体分子部分连接的卤代烷基。 
本文所用的术语“卤代烷基”是指被1、2、3或4个卤原子取代的烷基。 
本文所用的术语“杂环基”是指含有1、2、3或4个独立选自氮、氧和硫的杂原子的5、6或7元环。所述5元环有0-2个双键，所述6元环和7元环有0-3个双键。术语“杂环基”还包括双环基团，其中所述杂环基环与苯基、单环环烯基、单环环烷基或另一单环杂环基稠合；以及三环基团，其中双环系与苯基、单环环烯基、单环环烷基或 另一单环杂环基稠合。本发明的杂环基可通过基团中的碳原子或氮原子与母体分子部分连接。杂环基的实例包括但不限于苯并噻吩基、呋喃基、咪唑基、二氢吲哚基、吲哚基、异噻唑基、异 
Figure DEST_PATH_GSB00000668293100091
唑基、吗啉基、 
Figure DEST_PATH_GSB00000668293100092
唑基、哌嗪基、哌啶基、吡唑基、吡啶基、吡咯烷基、吡咯并吡啶基、吡咯基、噻唑基、噻吩基和硫代吗啉基。 
本文所用的术语“杂环基烷基”是指被1、2或3个杂环基取代的烷基。 
本文所用的术语“羟基”是指-OH。 
本文所用的术语“-NRaRb”是指Ra和Rb两个基团通过氮原子与母体分子部分连接。Ra和Rb独立选自氢、烷氧基、烷基、芳基、芳基烷基、环烷基、(环烷基)烷基、卤代烷基、杂环基和杂环基烷基。 
本公开意欲包括存在于本化合物中的原子的所有同位素。同位素包括那些具有相同原子数但不同质子数的原子。一般的实例且不加限制，氢的同位素包括氘和氚。碳的同位素包括13C和14C。一般可通过本领域技术人员已知的常规技术或类似于本文描述的那些方法，采用适当的同位素标记的试剂替代在别处使用的未标记的试剂，制备本发明的同位素标记的化合物。这样的化合物可具有多种潜在用途，例如，作为标准品和试剂测定生物活性。在稳定的同位素的情况下，这样的化合物可具有顺利地改变生物学、药理学或药动学特性的潜力。 
本公开的化合物可作为药学上可接受的盐存在。本文所用的术语“药学上可接受的盐”代表本公开的化合物的盐或两性离子形式，它们是水溶性或油溶性的，或是可分散的，它们在合理的医学判断范围内，适用于与患者组织接触而无过度毒性、刺激性、变态反应或者其它问题或并发症，此与合理的利益/风险比相称，并有效用于其既定用途。可在化合物最终的分离和纯化期间制备其盐，或者可单独使合适的碱性官能团与合适的酸反应来制备化合物的盐。代表性的酸加成盐包括乙酸盐、己二酸盐、海藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐；二葡糖 酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐(hemisulfate)、庚酸盐、己酸盐、甲酸盐、富马酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、均三甲基苯磺酸盐(mesitylenesulfonate)、甲磺酸盐、亚萘基磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、扑酸盐(palmoate)、果胶酸盐(pectinate)、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、三氯乙酸盐、三氟乙酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。可用于形成药学上可接受的加成盐的酸的实例包括无机酸及有机酸，无机酸有例如盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸，有机酸有例如草酸、马来酸、琥珀酸和柠檬酸。 
可以在化合物最终的分离和纯化期间通过使酸性基团与合适的碱(例如金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐)反应或者与氨或有机伯胺、仲胺或叔胺反应来制备碱加成盐。药学上可接受的盐的阳离子包括锂、钠、钾、钙、镁和铝，以及无毒的季铵阳离子例如铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、二乙胺、乙胺、三丁胺、吡啶、N，N-二甲基苯胺、N-甲基哌啶、N-甲基吗啉、二环己胺、普鲁卡因、二苄胺、N，N-二苄基苯乙胺和N，N’-二苄基乙二胺。用于形成碱加成盐的其它代表性的有机胺包括乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶和哌嗪。 
本文所用的术语“抗HCV活性”是指化合物对治疗HCV病毒是有效的。 
术语“本公开的化合物”和等同表述意指包括式(I)化合物及其药学上可接受的对映体、非对映体和盐。同样地，提及中间体时意指包括本文允许的中间体的盐。 
术语“患者”包括人和其它哺乳动物两者。 
术语“药物组合物”是指包含本公开的化合物以及至少一种另外的药用载体的组合的组合物，所述药用载体即辅料、赋形剂或溶媒，例如稀释剂、防腐剂、填充剂、流动调节剂(flow regulating agents)、崩解剂、润湿剂、乳化剂、助悬剂、甜味剂、矫味剂、香味剂、抗细 菌剂、抗真菌剂、润滑剂和分散剂，取决于给药方式和剂型的性质。举例来说，可以使用以下文献中列举出的成分：Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing Company，Easton，PA(1999)。 
本文所用的短语“药学上可接受的”是指这样的化合物、原料、组合物和/或剂型，它们在合理医学判断的范围内，适用于与患者组织接触而无过度毒性、刺激性、变态反应或其它问题或并发症，此与合理的风险/利益比相称。 
本文所用的术语“磺酰基”是指-SO2-。 
本文所用的术语“亚磺酰基(sulfoxyl)”是指-S(O)-。 
术语“治疗有效量”是指足以显示出有意义的患者益处(例如病毒负荷持续减少)的各活性组分的总量。当用于单独的活性成分单独给药时，该术语仅指该成分。当组合应用时，该术语则是指不论依次还是同时联合给药，都引起治疗效果的活性成分的合并量。 
术语“治疗”和“处理”是指：(i)在可易患疾病、障碍和/或病症但尚未被确诊患有疾病、障碍和/或病症的患者中防止疾病、障碍或病症的发生；(ii)抑制疾病、障碍或病症，即阻止其发展；和/或(iii)缓解疾病、障碍或病症，即使疾病、障碍和/或病症消退。 
当用于给本公开的化合物命名时，把本文所用的符号P1’、P1、P2、P2*、P3和P4绘制在蛋白酶抑制剂结合相对于天然肽切割(cleavage)底物结合的氨基酸残基的相对位置。切割发生在P1和P1’之间的天然底物上，其中无撇号位置(nonprime positions)是指从肽天然切割位点的C-末端开始向N-末端延伸的氨基酸；而有撇号位置(prime positions)是从切割位点符号的N-末端发出，并向C-末端延伸。例如，P1’是指远离切割位点C-末端的右手末端的第一个位置(即N-末端第一个位置)；而P1是从C-末端切割位点的左手侧开始编号，P2：自C-末端的第二个位置，依此类推)。(参见Berger A.和Schechter I.，Transactions of the Royal Society London series(1970)，B257，249-264]。 
本公开的化合物中存在多个不对称中心。例如，所述化合物可包括下式的P1环丙基元素： 
Figure DEST_PATH_GSB00000668293100121
其中C1和C2各自代表环丙基环位置1和2上的不对称碳原子。 
Figure DEST_PATH_GSB00000668293100122
(1R，2S)                                (1S，2R) 
R2与羰基同侧                            R2与羰基同侧 
Figure DEST_PATH_GSB00000668293100123
(1R，2R)                                (1S，2S) 
R2与酰胺同侧                            R2与酰胺同侧 
应当理解，本公开包括所有的立体化学形式或其混合物，它们都具有抑制HCV蛋白酶的能力。 
本公开的某些化合物也可以不同的稳定构象形式存在，这些形式是可以分离的。由于环绕不对称单键的阻碍旋转(restricted rotation)(例如，因为位阻或环张力)引起的扭转不对称，可以允许不同构象异构体(conformers)被分离。本公开包括这些化合物的每种构象的异构体(conformational isomer)及其混合物。 
本公开的某些化合物也可以两性离子形式存在，且本公开包括这些化合物的每种两性离子形式及其混合物。 
当可用于治疗时，治疗有效量的式(I)化合物及其药学上可接受的盐可作为未加工的化学药品给予，还可作为药物组合物的活性成分提供。因此，本公开还提供药物组合物，该药物组合物包括治疗有效量的式(I)化合物或其药学上可接受的盐及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。式(I)化合物及其药学上可接受的盐如上所述。载体、稀释剂或赋形剂在其与制剂其它成分相容以及对其接受者无害的意义上来讲，必需是可接受的。根据本公开的另一个方面，还提供用于制备药物制剂的方法，该方法包括将式(I)化合物或其药学上可接受的盐与一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合。 
药物制剂可呈单位剂型，每个单位剂量含有预定量的活性成分。本公开的化合物的剂量水平介于约0.01-约150毫克/千克(″mg/kg″)体重/天之间，优选介于约0.05-约100mg/kg体重/天之间，常常以单一疗法用于预防或治疗HCV介导的疾病。本公开的药物组合物通常将按每天约1次至约5次或者作为连续输注给予。这类给药法可用作长期或短期疗法。可与载体材料混合以制备单一剂型的活性成分的量将根据待治疗的疾病、病情的严重程度、给药时间、给药途径、所用化合物的排泄速率、疗程和患者年龄、性别、体重和身体状况而改变。优选的单位剂型制剂是含有本文上述活性成分的日剂量或分剂量或其适宜分数的单位剂型制剂。一般来说，治疗可用明 显低于化合物最佳剂量的小剂量开始。此后，以较小的增量来加大剂量直到在这类情况下达到最佳效果。一般而言，最理想地给予化合物的浓度水平是通常可在抗病毒方面提供有效结果而又不致于引起任何有害或有毒的副作用。 
当本公开组合物包含本公开化合物和一种或多种其它治疗和/或预防药的组合时，化合物和其它药物都可以少于或等于单一治疗方案中通常给予的剂量呈现。本公开的组合物可与一种或多种其它治疗或预防药共同配制，例如，单片和/或双/多层片剂形式，或者可将各治疗剂或预防剂分开给予。 
药物制剂可适合于通过任何合适的途径给药，例如通过口服(包括口颊或舌下含服)、直肠、鼻、局部(包括口颊、舌下或经皮)、阴道或胃肠外(包括皮下、皮内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内(intralesional)、静脉内或者真皮内注射或输注)途径。这类制剂可按药剂学领域的任何已知方法制备，例如通过将活性成分与载体或赋形剂混合。 
适合于口服给药的药物制剂可按独立的单位提供，例如胶囊剂或片剂；散剂或颗粒剂；水性或非水性液体中的溶液剂或混悬剂；可食用泡沫制剂或起泡制剂(Whips)；或水包油乳液剂或油包水乳液剂。 
举例来说，对于以片剂或胶囊剂形式的口服给药，活性药物组分可与药学上可接受的口服无毒惰性载体(例如乙醇、甘油、水等)相混合。通过将化合物粉碎成合适的微细尺寸，并与被同样粉碎的药用载体(例如淀粉或甘露醇等可食用的碳水化合物)混匀来制备散剂。还可存在矫味剂、防腐剂、分散剂和着色剂。 
通过制备如上所述的粉状混合物，并装填到成形的明胶壳内，来制备胶囊剂。在装填操作之前，可将助流剂和润滑剂(例如胶态二氧化硅、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸钙或固态聚乙二醇)加到粉状混合物中。还可加入崩解剂或增溶剂(例如琼脂、碳酸钙或碳酸钠)以改善胶囊剂摄入后的药物利用度。 
此外，需要或必需时，也可将合适的粘合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂掺到混合物中。合适的粘合剂包括淀粉、明胶、天然糖(例如葡萄糖或β-乳糖)、玉米甜味剂、天然和合成树胶(例如阿拉伯树胶、西黄蓍胶或藻酸钠)、羧甲基纤维素、聚乙二醇等。用于这些剂型的润滑剂包括油酸钠、氯化钠等。崩解剂包括但不限于淀粉、甲基纤维素、琼脂、皂土、黄原胶等。例如，通过制成粉状混合物，制粒或预压片(slugging)，添加润滑剂和崩解剂，压制成片，从而制成片剂。将适当粉碎的化合物与如上所述的稀释剂或基料，并任选与粘合剂(例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶或聚乙烯吡咯烷酮)、溶液阻滞剂(例如石蜡)、吸收加速剂(例如季盐)和/或吸收剂(例如皂土、高岭土或磷酸二钙)混合，来制备粉状混合物。可用粘合剂(例如糖浆、淀粉浆、阿拉伯胶浆(acadia mucilage)或者纤维素材料或聚合材料溶液)润湿后加压过筛，将粉状混合物制粒。制粒的一个替代方法是，可将粉状混合物通过压片机，结果是将成形不佳的团块再击碎制成颗粒。可通过添加硬脂酸、硬脂酸盐、滑石粉或矿物油使颗粒润滑以防止粘到片剂成形冲模上。然后将经润滑的混合物压制成片剂。本公开的化合物还可与自由流动的惰性载体混合，无需通过制粒或预压片步骤便可直接压制成片剂。可提供透明或不透明的由虫胶密封衣、糖衣或聚合材料衣和蜡质抛光衣(polish coating of wax)组成的保护性包衣材料。可将染料加到这些包衣材料中以区别不同的单位剂量。 
口服液体例如溶液剂、糖浆剂和酏剂可以剂量单位形式制备，从而使给定量中含有预定量的化合物。糖浆剂可通过将化合物溶于适当调味的含水溶液中来制备，而酏剂可通过使用无毒溶媒制备。还可加入增溶剂和乳化剂(例如乙氧基化异硬脂醇和聚氧乙烯山梨醇醚)、防腐剂、矫味添加剂(例如薄荷油或天然甜味剂或糖精或其它人造甜味剂)等。 
如果适当的话，可将用于口服给药的剂量单位制剂微胶囊化。也可将制剂制成延时或持续释放，例如通过将微粒材料包衣或包埋在聚 合物、蜡等中。 
式(I)化合物及其药学上可接受的盐还可以脂质体递药系统给予，例如小单层脂质体、大单层脂质体和多层脂质体。脂质体可由多种磷脂(例如胆固醇、十八烷基胺或磷脂酰胆碱)构成。 
式(I)化合物及其药学上可接受的盐也可通过使用单克隆抗体作为单独的载体(化合物分子与之偶联)递药。化合物也可与作为可靶向药物载体的可溶性聚合物偶联。这类聚合物可包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟丙基甲基丙烯酰胺苯酚、聚羟乙基天冬酰胺苯酚或被棕榈酰残基取代的聚氧化乙烯聚赖氨酸。此外，化合物可与一类生物可降解的聚合物偶联，用于达到药物的控释，这类聚合物为例如聚乳酸、聚ε-己内酯(polepsilon caprolactone)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯和水凝胶的交联共聚物或两亲性嵌段共聚物。 
适于经皮给药的药物制剂可作为离散的贴剂(discrete patches)存在，以在长时间段内保持与接受者表皮密切接触。例如，活性成分可由贴剂通过离子电渗疗法传递，一般如在Pharmaceutical Research，3(6)，318(1986)中所述。 
适合于局部给药的药物制剂可制成软膏剂、乳膏剂、混悬剂、洗剂、散剂、溶液剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂或油剂。 
为了治疗眼或其它外部组织(例如口和皮肤)，所述制剂优选作为局部软膏剂或乳膏剂来使用。当配制成软膏剂时，活性成分可以与石蜡族或水可混溶的软膏剂基料一起使用。或者，活性成分可以与水包油乳膏剂基料或油包水基料一起制成乳膏剂。 
适合于眼局部给药的药物制剂包括滴眼剂，其中活性成分溶解或悬浮于合适的载体、尤其是水性溶剂中。 
适合于口腔内局部给药的药物制剂包括糖锭剂、软锭剂和漱口剂。 
适合于直肠给药的药物制剂可作为栓剂或作为灌肠剂呈现。 
适合于经鼻给药的药物制剂(其中载体为固体)包括粗粉剂，其通过以鼻吸入方式给药，即通过从接近鼻子的粉剂容器中通过鼻通道快速吸入。用于作为鼻腔喷雾剂或滴鼻剂给药的合适制剂(其中载体为液体)包括活性成分的水性溶液剂或油性溶液剂。 
适合于通过吸入给药的药物制剂包括微细粒子粉剂(dusts)或细雾剂(mists)，其可用不同类型计量的剂量压缩气溶胶、雾化吸入器或吹入器制备。 
适合于阴道给药的药物制剂可以阴道栓、阴道塞、乳膏剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾剂提供。 
适于胃肠外给药的药物制剂包括水性和非水性无菌注射溶液剂及水性和非水性无菌混悬剂，水性和非水性无菌注射溶液剂可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂，并使制剂与待接受者血液等渗的溶质；水性和非水性无菌混悬剂可包括悬浮剂和增稠剂。制剂可以单位剂量或多剂量容器提供，例如密封的安瓿和小瓶，并可保存在冷冻-干燥(冻干)条件下，只需在临用前即刻加入无菌液体载体例如注射用水。临用时配制的注射溶液剂和混悬剂可由无菌粉针剂、颗粒剂和片剂制备。 
应该理解，除了以上特别提到的成分以外，制剂还可包括与所述制剂类型有关的本领域常用的其它成分，例如适合于口服给药的这类制剂可包括矫味剂 
下表1中列出了一些可与本公开的化合物一起给药的示例性化合物的实例。在联合疗法中，本公开的化合物可与其它抗HCV活性化合物共同或分开给药，或者将化合物掺到组合物中。 
表1 
Figure DEST_PATH_GSB00000668293100171
Figure DEST_PATH_GSB00000668293100201
Figure DEST_PATH_GSB00000668293100211
本公开的化合物还可用作实验室试剂。化合物可在为设计病毒复制实验、验证动物实验系统和结构生物学研究提供研究工具方面发挥作用，以进一步加深对HCV疾病机制的认识。此外，本公开的化合物可用于通过例如竞争性抑制来建立或确定其它抗病毒化合物的结合位点。 
本公开的化合物还可用来处理或防止病毒污染材料，从而降低接触这类材料的实验室人员或医务人员或患者感染病毒的风险，所述材 料为例如血液、组织、手术器械和衣物、实验室仪器和衣物及采血或输血设备和材料。 
当通过合成方法制备，或者通过代谢过程(包括发生在人或动物身体内(体内)的那些过程)或者体外发生过程产生时，本公开意欲包括具有式(I)的化合物。 
现在结合某些实施方案，对本公开进行描述，所述实施方案并不限制本公开的范围。相反，本公开涵盖所有可包括在权利要求书范围内的替代、修改和等同内容。因此，下列实施例，包括具体实施方案，将说明本公开的一种实践，要了解的是，实施例的目的是用于说明某些实施方案，并相信是以最有用和最易理解的方式对其方法和构思方面进行描述。 
用于本申请的缩写，包括特别在下列示例性流程和实施例中的缩写为本领域技术人员所熟知。所使用的一些缩写如下：r.t.，rt或RT表示保留时间或室温(上下文将指明)；sat.表示饱和的；Me表示甲基；DIBAL-H表示氢化二异丁基铝；DCM表示二氯甲烷；Ph表示苯基；Ph3PmeBr表示甲基三苯基溴化 
Figure DEST_PATH_GSB00000668293100221
THF表示四氢呋喃；Et表示乙基；EtOAc表示乙酸乙酯；Et3N表示三乙胺；TMS表示三甲基甲硅烷基；DMSO表示N，N-二甲亚砜；DMF表示N，N-二甲基甲酰胺；TAS-F表示三(二甲基氨基)硫(三甲基甲硅烷基)二氟化物；TFA表示三氟乙酸；HATU表示O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲 磷酸盐；MeOH表示甲醇；DIEA表示二异丙基乙胺；DCE表示1，2-二氯乙烷；pTSA表示对-甲苯磺酸；和DBU表示1，8-二氮杂双环十一-7-烯。 
用于合成本公开的化合物的原料是本领域技术人员已知的并可以容易地制得或者是市售的。 
提供下文描述的以下方法是为了说明目的，而不是意欲限制权利要求的范围。应当理解，为了制备这样的化合物，这样做可能是必需的，其中功能基团使用常规保护基保护起来，然后脱去保护基得到本公开的化合物。关于根据本公开内容来使用保护基的细节对于本领域 技术人员来说是已知的。 
中间体1的制备：6-溴代-2-甲氧基-3-乙烯基萘 
6-溴代-2-甲氧基-3-乙烯基萘 
Figure DEST_PATH_GSB00000668293100232
步骤1： 
在-40℃(乙腈/干冰)下，将二异丁基氢化铝(1.0M的己烷溶液)(112mL，112mmol)慢慢加到7-溴-3-甲氧基-2-萘甲酸甲酯(由3-羟基-2-萘甲酸分3个步骤制得，根据参考文献：J.Med.Chem.1990，33，171)(11g，37.3mmol)的THF(300mL)溶液中。在加入之后，将反应物搅拌3小时，然后加入EtOAc(100mL)，移开冰浴。在5分钟之后，加入1.0MHCl溶液(200mL)并搅拌10分钟。有机物用1.0M HCl溶液和盐水洗涤，然后用MgSO4干燥，过滤后浓缩，得到(7-溴-3-甲氧基萘-2-基)甲醇，为淡黄色固体。1H NMR(500MHz，氯仿-d)δppm 2.34(t，J＝6.56Hz，1H)，3.98(s，3H)，4.83(d，J＝6.41Hz，2H)，7.11(s，1H)，7.51(dd，J＝8.70，1.98Hz，1H)，7.61(d，J＝8.85Hz，1H)，7.66(s，1H)，7.93(d，J＝1.83Hz，1H)。 
步骤2： 
将二氧化锰(32.5g，374mmo1)加到(7-溴-3-甲氧基萘-2-基)甲醇(10g，37.3mmol)的DCM(400mL)溶液中并在室温下搅拌7天。反应物通过硅藻土 过滤后浓缩，得到7-溴-3-甲氧基-2-萘甲醛(9.2g，93％，对于2个步骤)，为黄色固体。1H NMR(500MHz，氯仿-d)δppm4.02(s，3H)，7.16(s，1H)，7.55-7.65(m，2H)，8.01(s，1H)，8.24(s，1H)，10.57(s，1H)。 
步骤3： 
在0℃，将氢化钠(60％的油分散体)(5.55g，139mmol)加到溴化甲基三苯基 
Figure DEST_PATH_GSB00000668293100242
(24.79g，69.4mmol)的THF(100mL)溶液中并搅拌30分钟。加入7-溴-3-甲氧基-2-萘甲醛(9.2g，34.7mmol)的THF(100mL)溶液，使反应物升温至室温过夜。反应物用乙醚稀释后，通过硅藻土 
Figure DEST_PATH_GSB00000668293100243
过滤。滤液浓缩后在Biotage上用快速色谱法纯化(1-5％EtOAc/己烷中)，得到6-溴-2-甲氧基-3-乙烯基萘(3.2g，35％)，为白色固体。1H NMR(500MHz，氯仿-d)δppm 3.96(s，3H)，5.40(dd，J＝10.99，1.53Hz，1H)，5.90(dd，J＝17.55，1.37Hz，1H)，7.07(s，1H)，7.13(dd，J＝17.55，11.44Hz，1H)，7.47(dd，J＝8.70，1.98Hz，1H)，7.58(d，J＝8.85Hz，1H)，7.79(s，1H)，7.92(d，J＝1.83Hz，1H)。 
中间体2的制备：(S)-2-甲基1-(2-(三甲基甲硅烷基)乙基)4-氧代吡咯烷-1，2-二羧酸酯 
(S)-2-甲基1-(2-(三甲基甲硅烷基)乙基)4-氧代吡咯烷-1，2-二羧酸酯 
步骤1： 
将碳酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(2.5g，9.64mmol)加到(2S，4R)-4-羟基吡咯烷-2-甲酸甲酯，HCl盐(2.10g，11.6mmol)和三乙胺(4.0mL，28.9mmol)的乙腈(20mL)溶液中并在室温下搅拌过夜。反应物用水和乙醚猝灭。有机层依次用1.0M HCl(2次)和盐水洗涤，然后用MgSO4干燥，过滤后浓缩，得到粗制(2S，4R)-4-羟基吡咯烷-2-甲酸甲酯1-甲酸(2-(三甲基甲硅烷基)乙酯)，其可直接用于下一步骤。 
步骤2： 
在-78℃，向二甲亚砜(3.5mL，48.7mmol)的DCM(100mL)溶液中滴加草酰氯(2.3mL，24.3mmol)。将所形成的溶液在此温度下搅拌30分钟。在-78℃加入(2S，4R)-4-羟基吡咯烷-2-甲酸甲酯1-甲酸(2-(三甲基甲硅烷基)乙酯)(3.2g，11.6mmol)的DCM(10mL)溶液。在滴加Hunig氏碱(9.6mL，55.3mmol)之前，将所形成的浆状物在-78℃下搅拌1小时。将该溶液在室温下搅拌30分钟，然后用1M HCl和盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤后浓缩。残留的浅褐色油状物在Biotage上用快速色谱法纯化(20-33％EtOAc/己烷)，得到(S)-4-氧代吡咯烷-2-甲酸甲酯1- 甲酸(2-(三甲基甲硅烷基)乙酯)(2.4g，76％)，为淡黄色油状物。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 0.03(s，9H)，0.81-1.05(m，2H)，2.52-2.73(m，1H)，2.99-3.25(m，1H)，3.66(s，3H)，3.68-3.79(m，1H)，3.81-3.98(m，1H)，4.05-4.22(m，2H)，4.62-4.80(m，1H)。 
中间体3的制备：(2S，4R)-4-甲氧基-4-(6-甲氧基-7-乙烯基萘-2-基)吡咯烷-2-羧酸甲酯 
Figure DEST_PATH_GSB00000668293100261
(2S，4R)-4-甲氧基-4-(6-甲氧基-7-乙烯基萘-2-基)吡咯烷-2-羧酸甲酯 
Figure DEST_PATH_GSB00000668293100262
步骤1： 
将镁(0.443g，18.24mmol)在圆底烧瓶中在氮气下搅拌过夜(ovenight)。将THF(4mL)以及1滴1，2-二溴乙烷加到该镁中。将这种溶液加热至60℃，并在此温度下10分钟之后，在30分钟内加入6-溴-2-甲氧基-3-乙烯基萘(中间体1)(3.2g，12.16mmol)的THF(20mL)溶液，在 加入之后，反应液变成浅褐色并在70℃继续搅拌2小时。在0℃，将格氏(Grignard)溶液(20.8mL，10.40mmol)加到(S)-4-氧代吡咯烷-2-甲酸甲酯1-甲酸(2-(三甲基甲硅烷基)乙酯)(中间体2)(2.3g，8.00mmol)的甲苯(40mL)溶液中并搅拌1小时，然后用饱和NH4Cl溶液猝灭。水层用DCM萃取，合并的有机物经MgSO4干燥，过滤后浓缩，得到粗物质。该粗物质在Biotage上用快速色谱法纯化(20-40％EtOAc/己烷)，得到(2S，4R)-4-羟基-4-(6-甲氧基-7-乙烯基萘-2-基)吡咯烷-2-甲酸甲酯1-甲酸(2-(三甲基甲硅烷基)乙酯)(1.41g，37％)，为白色固体。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm 0.05(s，9H)，0.95-1.09(m，2H)，2.36-2.55(m，1H)，2.67-2.83(m，1H)，3.79-3.87(m，4H)，3.90-4.04(m，4H)，4.16-4.30(m，2H)，4.49-4.68(m，1H)，5.38(dd，J＝11.04，1.51Hz，1H)，5.89(dd，J＝17.82，1.51Hz，1H)，7.08(s，1H)，7.14(dd，J＝17.69，11.17Hz，1H)，7.47(d，J＝8.53Hz，1H)，7.70(d，J＝8.53Hz，1H)，7.88(s，2H)。 
步骤2： 
在0℃，将NaH(60％的油溶液)(0.229g，5.72mmol)加到(2S，4R)-4-羟基-4-(6-甲氧基-7-乙烯基萘-2-基)吡咯烷-2-甲酸甲酯1-甲酸(2-(三甲基甲硅烷基)乙酯)(1.5g，3.18mmol)和甲基碘(0.36mL，5.72mmol)的DMF(30mL)溶液中并在此温度下搅拌3小时。然后，反应物用饱和NH4Cl溶液和乙醚猝灭。乙醚层用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤后浓缩，得到粗物质。该粗物质在Biotage上用快速色谱法纯化(20-40％EtOAc/己烷)，得到(2S，4R)-4-甲氧基-4-(6-甲氧基-7-乙烯基萘-2-基)吡咯烷-2-甲酸甲酯1-甲酸(2-(三甲基甲硅烷基)乙酯)(1.1g，71％)，为白色泡沫状物。LCMS：r.t.＝1.956分钟，[M+Na]+＝508Phenomenex Luna C1810u(3x50mm)；溶剂A＝10％乙腈-90％水-0.1％TFA，溶剂B＝90％乙腈-10％水-0.1％TFA；梯度＝0％～100％溶剂B，历经2分钟，接着保持1分钟；4mL/min；注射体积＝5uL；波长＝220nm。 
步骤3： 
在0℃，将二氟(三甲基甲硅烷基)三(二甲基氨基)硫(2.27g，8.24mmol)加到(2S，4R)-4-甲氧基-4-(6-甲氧基-7-乙烯基萘-2-基)吡咯烷-2-甲酸甲酯1-甲酸(2-(三甲基甲硅烷基)乙酯)(1g，2.06mmol)的DMF(10mL)溶液中，然后使其升温至室温过夜。将反应物倒入饱和NaHCO3溶液中，依次用乙醚和DCM萃取。合并的有机物用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤后浓缩，得到(2S，4R)-4-甲氧基-4-(6-甲氧基-7-乙烯基萘-2-基)吡咯烷-2-甲酸甲酯(520mg，74％)，为白色泡沫状物。1H NMR(500MHz，氯仿-d)δppm 2.49(dd，J＝13.43，9.77Hz，1H)，2.69(d，J＝13.43Hz，1H)，2.81(s，3H)，3.04(d，J＝11.90Hz，1H)，3.53(d，J＝12.21Hz，1H)，3.75(s，3H)，3.89(s，3H)，3.90-3.95(m，1H)，5.31(d，J＝11.29Hz，1H)，5.84(d，J＝17.70Hz，1H)，7.04(s，1H)，7.08(dd，J＝17.70，10.99Hz，1H)，7.35(d，J＝8.24Hz，1H)，7.59-7.68(m，2H)，7.83(s，1H)，7.94(s，1H)。 
实施例1：化合物1的制备 
Figure DEST_PATH_GSB00000668293100291
化合物1 
Figure DEST_PATH_GSB00000668293100292
步骤1： 
将HATU(200mg，0.527mmol)加至(2S，4R)-4-甲氧基-4-(6-甲氧基-7-乙烯基萘-2-基)吡咯烷-2-羧酸甲酯(中间体3，150mg，0.439mmol)、(S)-2-((2，2-二甲基戊-4-烯基氧基)羰基氨基)壬-8-烯酸(205mg，0.659mmol)和Hunig′s碱(0.23mL，1.32mmol)的DCM(6mL)溶液中并于r.t.搅拌过夜。反应物经浓缩和经快速色谱法于Biotage(10-40％EtOAc的己烷溶液)纯化，得到无色油样(2S，4R)-1-((S)-2-((2，2-二甲基戊-4-烯基氧基)羰基氨基)壬-8-烯酰基(non-8-enoyl))-4-甲氧基-4-(6-甲氧基-7-乙烯基萘-2-基)吡咯烷-2-羧酸甲酯(170mg，61％)。LCMS：r.t.＝2.09分 钟，[M+Na]+＝657Phenomenex Luna C1810u(3x 50mm)；溶剂A＝10％乙腈-90％水-0.1％TFA，溶剂B＝90％乙腈-10％水-0.1％TFA；梯度＝0％至100％溶剂B，历经2分钟，然后维持1分钟；4mL/min；inj.vol.＝5μL；波长＝220nm。 
步骤2： 
将2.0M LiOH(0.67mL，1.34mmol)加至(2S，4R)-1-((S)-2-((2，2-二甲基戊-4-烯基氧基)羰基氨基)壬-8-烯酰基)-4-甲氧基-4-(6-甲氧基-7-乙烯基萘-2-基)吡咯烷-2-羧酸甲酯(170mg，0.268mmol)的THF(1mL)和MeOH(1mL)溶液中并于r.t.搅拌过夜。加入乙醚和饱和氯化铵溶液和将醚层分离、干燥、过滤和浓缩，以得到粗的(2S，4R)-1-((S)-2-((2，2-二甲基戊-4-烯基氧基)羰基氨基)壬-8-烯酰基)-4-甲氧基-4-(6-甲氧基-7-乙烯基萘-2-基)吡咯烷-2-羧酸(152mg，91％)。LCMS：r.t.＝1.93分钟，[M+Na]+＝643Phenomenex Luna C1810u(3x50mm)；溶剂A＝10％乙腈-90％水-0.1％TFA，溶剂B＝90％乙腈-10％水-0.1％TFA；梯度＝0％至100％溶剂B，历经2分钟，然后维持1分钟；4mL/min；inj.vol.＝5μL；波长＝220nm。 
步骤3： 
将HATU(102mg，0.269mmol)加至(1R，2S)-1-氨基-N-(环丙基磺酰基)-2-乙烯基环丙烷甲酰胺、pTSA盐(148mg，0.367mmol)、(2S，4R)-1-((S)-2-((2，2-二甲基戊-4-烯基氧基)羰基氨基)壬-8-烯酰基)-4-甲氧基-4-(6-甲氧基-7-乙烯基萘-2-基)吡咯烷-2-羧酸(152mg，0.245mmol)和Hunig′s碱(0.13mL，0.74mmol)的DCM(3mL)溶液中并于r.t.搅拌过夜。将反应物浓缩，然后经快速色谱法于Biotage(20-100％EtOAc的己烷中)纯化，以得到无色油样(S)-1-((2S，4R)-2-((1R，2S)-1-(环丙基磺酰基氨基甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨基甲酰基)-4-甲氧基-4-(6-甲氧基-7-乙烯基萘-2-基)吡咯烷-1-基)-1-氧代壬-8-烯-2-基氨基甲酸 2，2-二甲基戊-4-烯基酯(60mg，29％)。LCMS：r.t.＝2.08分钟，[M+Na]+＝855Phenomenex Luna C1810u(3x 50mm)；溶剂A＝10％乙腈-90％水-0.1％TFA，溶剂B＝90％乙腈-10％水-0.1％TFA；梯度＝0％至100％溶剂B，历经2分钟，然后维持1分钟；4mL/min；inj.vol.＝5μL；波长＝220nm。 
步骤4： 
用氮喷射(S)-1-((2S，4R)-2-((1R，2S)-1-(环丙基磺酰基氨基甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨基甲酰基)-4-甲氧基-4-(6-甲氧基-7-乙烯基萘-2-基)吡咯烷-1-基)-1-氧代壬-8-烯-2-基氨基甲酸2，2-二甲基戊-4-烯基酯(60mg，0.072mmol)的DCE(20mL)溶液30分钟，然后加入Hoveyda-Grubbs第二代催化剂(9mg，0.014mmol)和将反应物密封并加热至80℃计3天。浓缩反应物，以得到粗物质。该粗物质经prep.HPLC(Sunfire C1810u(30x 100mm)；流速＝42mL/min；溶剂梯度＝95∶5至5∶95水/乙腈(含10mM乙酸铵))纯化，以得到化合物的混合物。将溶于DCE(20mL)中的该混合物用氮喷射30分钟，然后加入Hoveyda-Grubbs第二代催化剂(11mg，0.018mmol)和将反应物密封并加热至80℃过夜。浓缩反应物和该粗物质经prep.HPLC(Sunfire C1810u(30x100mm)；流速＝42mL/min；溶剂梯度＝95∶5至5∶95水/乙腈(含0.1％TFA))纯化，以得到作为双键异构体的混合物的化合物1(1.5mg，11％)。LCMS：r.t.＝1.83分钟，[M+Na]+＝799Phenomenex Luna C1810u(3x50mm)；溶剂A＝10％乙腈-90％水-0.1％TFA，溶剂B＝90％乙腈-10％水-0.1％TFA；梯度＝0％至100％溶剂B，历经2分钟，然后维持1分钟；4mL/min；inj.vol.＝5μL；波长＝220nm。 
实施例2：化合物2的制备 
Figure DEST_PATH_GSB00000668293100321
化合物2 
Figure DEST_PATH_GSB00000668293100322
步骤1： 
将HATU(200mg，0.527mmol)加至(2S，4R)-4-甲氧基-4-(6-甲氧基-7-乙烯基萘-2-基)吡咯烷-2-羧酸甲酯(150mg，0.439mmol)、(S)-2-((己-5-烯基氧基)羰基氨基)壬-8-烯酸(196mg，0.659mmol)和Hunig′s碱(0.230mL，1.318mmol)的DCM(5mL)溶液中并于r.t.搅拌过夜。反应物 经浓缩和经快速色谱法于Biotage(10-40％EtOAc的己烷中)纯化，以得到白色泡沫样产物(160mg，59％)。LCMS：r.t.＝2.00分钟，[M+Na]+＝643Phenomenex Luna C1810u(3x 50mm)；溶剂A＝10％乙腈-90％水-0.1％TFA，溶剂B＝90％乙腈-10％水-0.1％TFA；梯度＝0％至100％溶剂B，历经2分钟，然后维持1分钟；4mL/min；inj.vol.＝5μL；波长＝220nm。 
步骤2： 
将2.0M LiOH(0.64mL，1.28mmol)加至(2S，4R)-1-((S)-2-((己-5-烯基氧基)羰基氨基)壬-8-烯酰基)-4-甲氧基-4-(6-甲氧基-7-乙烯基萘-2-基)吡咯烷-2-羧酸甲酯(160mg，0.258mmol)的THF(2mL)和MeOH(2mL)溶液中并于r.t.搅拌过夜。用1.0M HCl和乙醚稀释反应。有机层经干燥、过滤和浓缩，以得到白色泡沫样粗产物(145mg，93％)。LCMS：r.t.＝1.84分钟，[M-OMe]+＝575Phenomenex Luna C1810u(3x50mm)；溶剂A＝10％乙腈-90％水-0.1％TFA，溶剂B＝90％乙腈-10％水-0.1％TFA；梯度＝0％至100％溶剂B，历经2分钟，然后维持1分钟；4mL/min；inj.vol.＝5μL；波长＝220nm。 
步骤3： 
将HATU(136mg，0.358mmol)加至(1R，2S)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯、HCl盐(55mg，0.287mmol)、(2S，4R)-1-((S)-2-((己-5-烯基氧基)羰基氨基)壬-8-烯酰基)-4-甲氧基-4-(6-甲氧基-7-乙烯基萘-2-基)吡咯烷-2-羧酸(145mg，0.239mmol)和Hunig′s碱(0.125mL，0.717mmol)的二氯甲烷(5mL)溶液中并于r.t.搅拌4小时。反应物经浓缩，然后经快速色谱法于Biotage(20-50％EtOAc的己烷中)纯化，以得到无色油样产物(120mg，68％)。LCMS：r.t.＝2.04分钟，[M+Na]+＝766Phenomenex Luna C1810u(3x 50mm)；溶剂A＝10％乙腈-90％水-0.1％TFA，溶剂B＝90％乙腈-10％水-0.1％TFA；梯度＝0％至100％溶剂B，历经2 分钟，然后维持1分钟；4mL/min；inj.vol.＝5μL；波长＝220nm。 
步骤4： 
用氮喷射(1R，2S)-1-((2S，4R)-1-((S)-2-((己-5-烯基氧基)羰基氨基)壬-8-烯酰基)-4-甲氧基-4-(6-甲氧基-7-乙烯基萘-2-基)吡咯烷-2-甲酰胺基)-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(120mg，0.161mmol)的DCE(50mL)溶液30分钟，然后加入Hoveyda-Grubbs催化剂(第二代)(20mg，0.032mmol)和将反应物密封并加热至80℃过夜。浓缩反应物，以得到粗物质。该粗物质经prep.HPLC(X-bridge C1810u(30x 100mm)；流速＝42mL/min；溶剂梯度＝95∶5至5∶95水/乙腈(含0.1％TFA))纯化，得到两个异构体的产物(于苯乙烯基(styrenyl)烯烃的双键异构体)(合计40mg，36％)。LCMS：r.t.＝1.70和1.77分钟，[M+Na]+＝710Phenomenex Luna C1810u(3x 50mm)；溶剂A＝10％乙腈-90％水-0.1％TFA，溶剂B＝90％乙腈-10％水-0.1％TFA；梯度＝0％至100％溶剂B，历经2分钟，然后维持1分钟；4mL/min；inj.vol.＝5μL；波长＝220nm。 
步骤5： 
将于碳上的5wt.％硫化的铂(22mg，5.82μmol)，加至自步骤4得到的产物(40mg，0.058mmol)的EtOAc(5mL)溶液中并于氢气氛下搅拌4小时。通过尼龙玻璃料(nylon frit)过滤反应物以去除催化剂。有机层浓缩和该粗物质经prep.HPLC(Sunfire C1810u(30x 100mm)；流速＝42mL/min；溶剂梯度＝95∶5至5∶95水/乙腈(含0.1％TFA))纯化，以得到白色固体样产物(24mg，60％)。1H NMR(500MHz，CHLOROFORM-d)δppm 1.16-1.57(m，21H)，1.58-1.69(m，2H)，1.71-1.86(m，4H)，1.97-2.06(m，1H)，2.43(dd，J＝12.82，8.24Hz，1H)，2.55-2.67(m，1H)，2.89-3.02(m，2H)，3.15(s，3H)，3.81(d，J＝10.68Hz，1H)，3.89-3.97(m，1H)，3.93(s，3H)，4.05-4.15(m，2H)，4.16-4.25(m，1H)，4.30(t，J＝8.85Hz，1H)，4.73(td，J＝9.61，3.05Hz，1H)，4.88(d，J＝10.38Hz，1H)，5.49(d，J＝9.46Hz，1H)，7.07(s，1H)，7.17(br.s.，1H)，7.40(s， 1H)，7.41(s，1H)，7.52(dd，J＝8.55，1.53Hz，1H)，7.73(d，J＝8.55Hz，1H)。LCMS：r.t.＝1.90分钟，[M+Na]+＝714Phenomenex Luna C1810u(3x 50mm)；溶剂A＝10％乙腈-90％水-0.1％TFA，溶剂B＝90％乙腈-10％水-0.1％TFA；梯度＝0％至100％溶剂B，历经2分钟，然后维持1分钟；4mL/min；inj.vol.＝5μL；波长＝220nm。 
步骤6： 
将2.0M LiOH(0.087mL，0.173mmol)加至自步骤5得到的产物(24mg，0.035mmol)的THF(1mL)和MeOH(1mL)溶液中并于r.t.搅拌3小时。用1.0M HCl猝灭反应并用乙醚稀释。有机层经干燥、过滤和浓缩，以得到粗产物(16mg，70％)。LCMS：r.t.＝1.66分钟，[M+Na]+＝686Phenomenex Luna C1810u(3x 50mm)；溶剂A＝10％乙腈-90％水-0.1％TFA，溶剂B＝90％乙腈-10％水-0.1％TFA；梯度＝0％至100％溶剂B，历经2分钟，然后维持1分钟；4mL/min；inj.vol.＝5μL；波长＝220nm。 
步骤7： 
将自步骤6的产物(16mg，0.024mmol)和1，1′-羰基二咪唑(5mg，0.031mmol)的THF(1mL)溶液加热至回流计1小时。去除加热浴液并在反应冷却至r.t.时加入环丙磺酰胺(5mg，0.041mmol)和1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯(8μL，0.048mmol)。于r.t.搅拌反应物3小时。反应物经用乙腈稀释和经prep.HPLC(X-bridge C1810u(30x 100mm)；流速＝42mL/min；溶剂梯度＝95∶5至5∶95水/乙腈(含10mM乙酸铵))纯化。浓缩产物部分，得到白色固体样化合物2(2mg，11％)。1H NMR(500MHz，CHLOROFORM-d)δppm 0.95-1.03(m，1H)，1.05-1.17(m，3H)，1.21-1.32(m，5H)，1.32-1.40(m，2H)，1.41-1.53(m，5H)，1.58(dd，J＝8.55，5.49Hz，2H)，1.61-1.72(m，5H)，1.73-1.92(m，5H)，2.38(dd，J＝11.75，6.56Hz，1H)，2.65(t，J＝11.44Hz，1H)，2.69-2.78(m，1H)，2.82-2.90(m，1H)，2.92-3.00(m，1H)，3.13(s，3H)，3.75-3.85(m，1H)，3.88 -3.97(m，5H)，4.30-4.42(m，1H)，4.60-4.69(m，1H)，5.05(d，J＝10.38Hz，1H)，5.39(d，J＝8.55Hz，1H)，6.24(s，1H)，7.07(s，1H)，7.42-7.50(m，2H)，7.61(s，1H)，7.69(d，J＝8.55Hz，1H)。LCMS：r.t.＝1.87分钟，[M+Na]+＝789Phenomenex Luna C1810u(3x 50mm)；溶剂A＝10％乙腈-90％水-0.1％TFA，溶剂B＝90％乙腈-10％水-0.1％TFA；梯度＝0％至100％溶剂B，历经2分钟，然后维持1分钟；4mL/min；inj.vol.＝5μL；波长＝220nm。 
实施例3：化合物3的制备 
Figure DEST_PATH_GSB00000668293100361
化合物3 
Figure DEST_PATH_GSB00000668293100371
步骤1： 
将HATU(668mg，1.757mmol)加至(2S，4R)-4-甲氧基-4-(6-甲氧基-7-乙烯基萘-2-基)吡咯烷-2-羧酸甲酯(500mg，1.465mmol)、(S)-2-((3，3-二甲基己-5-烯基氧基)羰基氨基)壬-8-烯酸(620mg，1.904mmol)和Hunig′s碱(0.767mL，4.39mmol)的DCM(10mL)溶液中并于r.t.搅拌过夜。反应物经浓缩和经快速色谱法于Biotage(5-30％EtOAc的己烷中)纯化，得到厚油样产物(520mg，55％)。LCMS：r.t.＝2.21分钟，[M+Na]+＝671Phenomenex Luna C1810u(3x 50mm)；溶剂A＝10％乙腈-90％水-0.1％TFA，溶剂B＝90％乙腈-10％水-0.1％TFA；梯度＝0％至100％溶剂B，历经2分钟，然后维持1分钟；4mL/min；inj.vol.＝5μL；波长＝220nm。 
步骤2： 
将2.0M LiOH(2.0mL，4.0mmol)加至(2S，4R)-1-((S)-2-((3，3-二甲基己-5-烯基氧基)羰基氨基)壬-8-烯酰基)-4-甲氧基-4-(6-甲氧基-7-乙烯基萘-2-基)吡咯烷-2-羧酸甲酯(520mg，0.801mmol)的THF(4mL)和MeOH(4mL)溶液中并于r.t.搅拌过夜。用EtOAc和1.0M HCl稀释反应。有机层经干燥、过滤和浓缩，得到粗产物(500mg，98％)。LCMS：r.t.＝2.06分钟，[M+Na]+＝657Phenomenex Luna C1810u(3x 50mm)；溶剂A＝10％乙腈-90％水-0.1％TFA，溶剂B＝90％乙腈-10％水-0.1％TFA；梯度＝0％至100％溶剂B，历经2分钟，然后维持1分钟；4mL/min；inj.vol.＝5μL；波长＝220nm。 
步骤3： 
将HATU(359mg，0.945mmol)加至(1R，2S)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯，HCl盐(181mg，0.945mmol)、(2S，4R)-1-((S)-2-((3，3-二甲基己-5-烯基氧基)羰基氨基)壬-8-烯酰基)-4-甲氧基-4-(6-甲氧基-7-乙烯基萘-2-基)吡咯烷-2-羧酸(500mg，0.788mmol)和Hunig′s碱(0.413mL，2.363mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液中并于r.t.搅拌4小时。反应物经浓缩，然后经快速色谱法于Biotage(20-50％EtOAc的己烷中)纯化，得到无色油样产物(360mg，59％)。LCMS：r.t.＝2.23分钟，[M+Na]+＝794Phenomenex Luna C1810u(3x 50mm)；溶剂A＝10％乙腈-90％水-0.1％TFA，溶剂B＝90％乙腈-10％水-0.1％TFA；梯度＝0％至100％溶剂B，历经2分钟，然后维持1分钟；4mL/min；inj.vol.＝5μL；波长＝220nm。 
步骤4： 
用氮喷射(1R，2S)-1-((2S，4R)-1-((S)-2-((3，3-二甲基己-5-烯基氧基)羰基氨基)壬-8-烯酰基)-4-甲氧基-4-(6-甲氧基-7-乙烯基萘-2-基)吡咯烷-2-甲酰胺基)-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(360mg，0.466mmol)的DCE (100mL)溶液30分钟，然后加入Hoveyda-Grubbs催化剂(第二代)(59mg，0.093mmol)和将反应物密封并加热至80℃过夜。反应物经浓缩和经快速色谱法于Biotage(20-60％EtOAc的己烷中)纯化，得到浅色泡沫样产物(125mg，37％)。LCMS：r.t.＝2.01分钟，[M+Na]+＝738Phenomenex Luna C1810u(3x 50mm)；溶剂A＝10％乙腈-90％水-0.1％TFA，溶剂B＝90％乙腈-10％水-0.1％TFA；梯度＝0％至100％溶剂B，历经2分钟，然后维持1分钟；4mL/min；inj.vol.＝5μL；波长＝220nm。 
步骤5： 
将于碳上的5wt.％硫化的铂(131mg，0.034mmol)，加至自步骤4得到的产物(240mg，0.335mmol)的EtOAc(5mL)溶液中并于氢气氛下搅拌过夜。通过尼龙玻璃料过滤反应物以去除催化剂。有机层浓缩和该粗物质经快速色谱法于Biotage(20-60％EtOAc的己烷中)纯化，以得到白色泡沫样纯化的产物(120mg，50％)。LCMS：r.t.＝2.16分钟，[M+Na]+＝742Phenomenex Luna C1810u(3x 50mm)；溶剂A＝10％乙腈-90％水-0.1％TFA，溶剂B＝90％乙腈-10％水-0.1％TFA；梯度＝0％至100％溶剂B，历经2分钟，然后维持1分钟；4mL/min；inj.vol.＝5μL；波长＝220nm。 
步骤6： 
将2.0M LiOH(0.417mL，0.833mmol)加至自步骤5的得到的产物(120mg，0.167mmol)的THF(1.5mL)和MeOH(1.5mL)溶液中并于r.t.搅拌4天。用EtOAc和1.0M HCl猝灭反应。合并的有机层经用硫酸镁干燥、过滤和浓缩，以得到玻璃固体样粗产物(75mg，65％)。LCMS：r.t.＝1.98分钟，[M-H]-＝690Phenomenex Luna C1810u(3x 50mm)；溶剂A＝10％甲醇-90％水-10mM乙酸铵，溶剂B＝90％甲醇-10％水-10mM乙酸铵；梯度＝0％至100％溶剂B，历经2分钟，然后维持1分钟； 4mL/min；inj.vol.＝5μL；波长＝220nm。 
步骤7： 
将自步骤6的得到的产物(75mg，0.108mmol)和二(1H-咪唑-1-基)甲酮(26mg，0.163mmol)的THF(2mL)混合物回流2小时。然后使其冷却至rt和加入环丙磺酰胺(21mg，0.173mmol)，随后加入DBU(0.026mL，0.173mmol)。然后于r.t.搅拌过夜。用水猝灭反应和用EtOAc提取。有机层经用硫酸镁干燥、过滤和浓缩，以得到粗产物。该粗物质经快速色谱法于Biotage(20-40％丙酮的己烷中)纯化，以得到白色固体样纯化的产物(33mg，36％)。1H NMR(400MHz，CHLOROFORM-d)δppm0.81-1.11(m，5H)，0.90(s，3H)，0.98(s，3H)，1.11-1.51(m，12H)，1.52-1.89(m，10H)，2.33(dd，J＝11.80，6.78Hz，1H)，2.54-2.67(m，1H)，2.70-2.85(m，2H)，2.85-2.97(m，1H)，3.10(s，3H)，3.65(dd，J＝10.16，6.90Hz，1H)，3.89(d，J＝9.79Hz，1H)，3.94(s，3H)，4.00-4.12(m，1H)，4.43(td，J＝10.98，5.14Hz，1H)，4.49-4.59(m，1H)，5.14(d，J＝9.54Hz，1H)，5.40(d，J＝8.03Hz，1H)，6.39(br.s.，1H)，7.03(s，1H)，7.37(dd，J＝8.53，1.25Hz，1H)，7.54(d，J＝8.78Hz，1H)，7.68(s，1H)，7.83(s，1H)，10.29(br.s.，1H)。LCMS：r.t.＝2.03分钟，[M-H]-＝793Phenomenex Luna C1810u(3x 50mm)；溶剂A＝10％甲醇-90％水-10mM乙酸铵，溶剂B＝90％甲醇-10％水-10mM乙酸铵；梯度＝0％至100％溶剂B，历经2分钟，然后维持1分钟；4mL/min；inj.vol.＝5μL；波长＝220nm。 
生物学研究 
HCV NS3/4A蛋白酶复合物酶试验和基于细胞的HCV复制子试验被利用于本公开并被制备、处理和验证如下： 
重组HCV NS3/4A蛋白酶复合物的生成 
如下述般制备衍生自BMS毒株、H77毒株或J4L6S毒株的HCVNS3蛋白酶复合物。产生这些经纯化的重组蛋白以用于同类试验 (homogeneous assay)(参见下文)，以提供本公开化合物在抑制HCV NS3蛋白水解活性如何有效的指标。 
来自HCV-感染的患者的血清得自旧金山(San Francisco)医院的Dr.T.Wright。工程改造的HCV基因组(BMS毒株)的全长cDNA(互补脱氧核糖核酸)模板由通过血清RNA(核糖核酸)的逆转录-PCR(RT-PCR)和采用根据其它基因型各1a毒株之间的同源性所选择的引物所得到的DNA片段构建。根据Simmonds等的分类(参见P Simmonds、KA Rose、S Graham、SW Chan、F McOmish、BC Dow、EA Follett、PL Yap和H Marsden，J.Clin.Microbiol.，31(6)，1493-1503(1993))，根据对整体基因组序列的确定，将基因型1a与HCV分离株进行了对比。表明非结构区NS2-5B的氨基酸序列与HCV基因型1a(H77)的同一性为＞97％，而与基因型1b(J4L6S)的的同一性为87％。感染性克隆H77(1a基因型)和J4L6S(1b基因型)得自R.Purcell(NIH)和序列发表于Genbank(AAB67036，参见Yanagi，M.，Purcell，R.H.，Emerson，S.U.和Bukh，J.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94(16)，8738-8743(1997)；AF054247，参见Yanagi，M.，St Claire，M.，Shapiro，M.，Emerson，S.U.，Purcell，R.H.和Bukh，J.，Virology 244(1)，161-172.(1998))。 
H77和J4L6S毒株用来产生重组NS3/4A蛋白酶复合物。针对这些毒株，如P.Gallinari等(参见Gallinari P，Paolini C，Brennan D，Nardi C，Steinkuhler C，De Francesco R.Biochemistry.38(17)：5620-32，(1999))描述的那样进行DNA编码重组HCV NS3/4A蛋白酶复合物(氨基酸1027-1711)。简单地说，在NS4A编码区的3′-端添加3个赖氨酸的增溶尾。NS4A-NS4B裂解位点的P1位中的半胱氨酸(氨基酸1711)被改变为甘氨酸，以避免赖氨酸标签的蛋白水解。此外，半胱氨酸向丝氨酸的突变被氨基酸位1454的PCR介导，以避免在NS3解旋酶结构域的自溶裂解。按照经修饰的P.Gallinari等描述的方案(参见Gallinari P，Brennan D，Nardi C，Brunetti M，Tomei L，Steinkuhler C，De Francesco R.，J Virol.72(8)：6758-69(1998))，在pET21b细菌表达载体(Novagen) 中克隆变异体DNA片段，而NS3/4A复合物表达于大肠杆菌株BL21(DE3)(Invitrogen)。简单地说，20℃下，用0.5毫摩尔(mM)异丙基β-D-1-硫代吡喃型半乳糖苷(thiogalactopyranoside，IPTG)诱导NS3/4A蛋白酶复合物表达22小时(h)。典型的发酵(1升(L))产生约10克(g)湿细胞浆状物。4℃下，使细胞再悬浮于由25mM N-(2-羟基乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)(HEPES)、pH 7.5，20％甘油、500mM氯化钠(NaCl)、0.5％Triton X-100、1微克/毫升(″μg/mL″)溶菌酶、5mM氯化镁(MgCl2)、1μg/ml DnaseI、5mM β-巯基乙醇(βME)、无蛋白酶抑制剂-乙二胺四乙酸(EDTA)(Roche)组成的细胞溶解缓冲液(10mL/g)中，匀化并孵化20分钟(min)。于4℃下，匀浆经超声处理并经235000g下超速离心澄清1小时。将咪唑加至上清液中，使最终浓度为15mM，并调节pH至8.0。将粗蛋白提取物装至用缓冲液B(25mM HEPES，pH 8.0，20％甘油，500mM NaCl，0.5％Triton X-100，15mM咪唑，5mM βME)预平衡过的镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)柱上。以1mL/min的流速装载样品。用15个柱体积的缓冲液C(除含有0.2％Triton X-100外，与缓冲液B相同)洗涤柱。用5个柱体积的缓冲液D(除含有200mM咪唑外与缓冲液C相同)洗脱蛋白。 
合并含有NS3/4A蛋白酶复合物的各流分并装载于用缓冲液D(25mM HEPES，pH 7.5，20％甘油，300mM NaCl，0.2％Triton X-100，10mM βME)预平衡过的脱盐柱Superdex-S200。以1mL/min的流速装载样品。合并含有NS3/4A蛋白酶复合物的各流分并浓缩至约0.5mg/ml。用SDS-PAGE和质谱分析判断衍生自BMS、H77和J4L6S毒株的NS3/4A蛋白酶复合物的纯度大于90％。将酶贮存于-80℃，在用于试验缓冲液前在冰上解冻并稀释。 
监测HCV NS3/4A蛋白水解活性的FRET肽试验 
如上所述，该体外试验的目的是测量衍生自BMS毒株、H77毒株或J4L6S毒株的HCV NS3蛋白酶复合物受到本公开化合物的抑制 作用。该试验提供本公开化合物在抑制HCV NS3蛋白水解活性方面将是如何有效的指标。 
为监测HCV NS3/4A蛋白酶活性，采用NS3/4A肽底物。底物是Taliani等在Anal.Biochem.240(2)：60-67(1996)中描述的RET S1(能量共振转移酯肽底物；AnaSpec，Inc.分类号22991)(FRET肽)。该肽的序列并不严格地基于针对HCV NS3蛋白酶的NS4A/NS4B天然裂解位点，除非在裂解位点存在酯键连接而不是酰胺键。肽还含有邻接肽的一端的萤光供体EDANS和邻接另一端的受体DABCYL。肽的萤光被供体和受体之间的分子间共振能量转移(RET)猝灭，但由于NS3蛋白酶裂解肽，从RET猝灭中释放产物，供体的萤光变得明显。 
本公开化合物不存在或存在的情况下，用三种重组NS3/4A蛋白酶复合物之一孵化肽底物。通过采用Cytofluor Series 4000实时监测萤光反应产物的形成，确定化合物的抑制作用。 
各试剂如下：HEPES和甘油(Ultrapure)得自GIBCO-BRL。二甲亚砜(DMSO)得自Sigma。β-巯基乙醇得自Bio Rad。 
试验缓冲液：50mM HEPES，pH 7.5；0.15M NaCl；0.1％Triton；15％甘油；10mM βME。底物：2μM最终浓度(来自-20℃下贮存的2mM DMSO贮存溶液)。HCV NS3/4A蛋白酶型1a(1b)，2-3nM最终浓度(来自5μM的在25mM HEPES中的贮存溶液，pH 7.5，20％甘油，300mM NaCl，0.2％Triton-X100，10mM βME)。针对具有达到试验界限的效力的化合物，通过向试验缓冲液加入50μg/ml牛血清白蛋白(Sigma)并降低最终蛋白酶浓度至300pM，使试验更灵敏。 
在来自Falcon的96孔聚苯乙烯黑色板中进行试验。各孔含有在试验缓冲液中的25μl NS3/4A蛋白酶复合物、10％DMSO/试验缓冲液中的50μl本公开化合物和试验缓冲液中的25μl底物。也在相同的试验板中制备对照物(无化合物)。在通过加入底物启动酶反应之前，使酶复合物与化合物或对照溶液混合1min。立即用Cytofluor Series 4000(Perspective Biosystems)对试验板读数。将仪器设定为在25℃下，于 340nm发射和490nm激发波长下读数。反应通常进行约15min。 
用以下方程式计算抑制百分率： 
100-[(δFinh/δFcon)x 100] 
其中δF为整个曲线的线性范围的萤光变化。对抑制-浓度数据进行非线性曲线拟合，通过采用应用方程式y＝A+((B-A)/(1+((C/x)^D)))的Excel XL拟合软件计算50％有效浓度(IC50)。 
发现针对不止一种类型的NS3/4A复合物进行试验的本公开化合物具有类似的抑制性质，尽管与对1a毒株相比，化合物对1b毒株一律表现出更大的效能。 
特异性试验 
进行特异性试验，以表明与其它丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶相比，本公开的化合物在抑制HCV NS3/4A蛋白酶复合物方面的体外选择性。 
针对多种丝氨酸蛋白酶：人嗜中性细胞弹性蛋白酶(HNE)、猪胰弹性蛋白酶(PPE)和人胰腺糜蛋白酶和一种半胱氨酸蛋白酶：人肝组织蛋白酶B，确定本公开化合物的特异性。在所有情况下，如先前所描述(PCT专利申请号WO 00/09543)的那样，对丝氨酸蛋白酶试验作某些修饰，采用具体针对各种酶的采用萤光测量的氨基-甲基-香豆素(AMC)底物的96孔板格式方案。所有酶购自Sigma、EMDbiosciences，而底物来自Bachem、Sigma和EMDbiosciences。 
根据其效力，化合物浓度为100-0.4μM不等。通过室温下将底物加至酶抑制剂中预孵化10min，并水解至如用cytofluor测定的15％转换率，各自启动酶试验。 
各试验的最终条件如下： 
50mM三(羟基甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)pH 8，0.5M硫酸钠(Na2SO4)，50mM NaCl，0.1mM EDTA，3％DMSO，含5μM LLVY-AMC的0.01％Tween-20和1nM糜蛋白酶。 
50M Tris-HCl，pH 8.0，50mM NaCl，0.1mM EDTA，3％DMSO，0.02％吐温-20，5μM succ-AAPV-AMC和20nM HNE或8nM PPE；100mM NaOAC(醋酸钠)pH 5.5，3％DMSO，1mM TCEP(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)，5nM组织蛋白酶B(使用前，酶贮液在含有20mM TCEP的缓冲液中活化)和稀释于H2O的2μM Z-FR-AMC。 
用下式计算抑制百分率： 
[1-((UVinh-UV空白)/(UVctl-UV空白))]x100 
将非线性曲线拟合应用于抑制-浓度数据，并采用Excel XL拟合软件计算50％有效浓度(IC50)。 
HCV复制子的生成 
如Lohmann V，Korner F，Koch J，Herian U，Theilmann L，Bartenschlager R.，Science 285(5424)：110-3(1999)描述的那样，确立HCV复制子全细胞系统。该系统使我们可以评价我们的HCV蛋白酶化合物对HCV RNA复制的作用。简单地说，采用在Lohmann论文(Assession number：AJ238799)中描述的HCV毒株1b序列，通过Operon Technologies，Inc.(Alameda，CA)合成HCV cDNA，再采用标准分子生物学技术将全长复制子装配于质粒pGem9zf(+)(Promega，Madison，WI)中。复制子由以下成分组成：(i)HCV 5’UTR融合至(fused to)衣壳蛋白的前12个氨基酸，(ii)新霉素磷酸转移酶基因(neo)，(iii)来自脑心肌炎病毒(EMCV)的IRES和(iv)HCV NS3至NS5B基因和HCV 3’UTR。用ScaI线性化质粒DNAs，采用T7MegaScript转录试剂盒(Ambion，Austin，TX)，按照厂商的指示，体外合成RNA转录物。将cDNA转录物体外转染进人肝细胞瘤细胞系HUH-7。在可选择标记新霉素(G418)的存在下，对组成性表达HCV复制子的细胞进行选择。随着时间的过去，所生成的细胞系以正和负链RNA生成和蛋白生成为特征。 
HCV复制子FRET试验
开发HCV复制子FRET试验以监测本公开中所述的化合物对HCV病毒复制的抑制作用。组成性表达HCV复制子的HUH-7细胞在含有10％胎牛血清(FCS)(Sigma)和1mg/ml G418(Gibco-BRL)的Dulbecco′s改良Eagle培养基(Dulbecco′s Modified Eagle Media，DMEM)(Gibco-BRL)中生长。前晚在96-孔组织培养无菌皿中种植细胞(1.5x104个细胞/孔)。在含有4％FCS、1∶100青霉素/链霉素(Gibco-BRL)、1∶100L-谷氨酰胺和5％DMSO的DMEM中，在稀释板(试验中0.5％DMSO最终浓度)中制备化合物和无化合物的对照物。将化合物/DMSO混合物加至细胞中并于37℃下培养4天。4天后，首先用alamar蓝(Trek Diagnotstic Systems)的CC50读数评价细胞的细胞毒性。通过将第1/10(1/10th)的体积的alamar蓝加至培养基培养的细胞中，测定化合物的毒性(CC50)。4h后，用Cytofluor Series 4000(Perspective Biosystems)以530nm激发波长和580nm发射波长读出来自各孔的萤光信号。然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)彻底漂洗各板(3次150μl)。用含有用蒸馏水稀释到1X的HCV蛋白酶底物(5X细胞萤光素酶细胞培养溶解试剂(Promega#E153A)的25μl细胞溶解试验试剂溶解细胞，加入NaCl至最终150mM，将FRET肽底物(如对以上酶试验所述的那样)在100％DMSO中从2mM原料稀释至最终10μM。再将板放入Cytofluor 4000仪器中，该仪器已经被设置为340nm激发/490nm发射，对21个循环的自动模式，以动力模式阅读板。如对IC50的测定所述，确定EC50。 
HCV复制子萤光素酶报道基因试验 
作为第二个试验，在复制子萤光素酶报道基因试验证实从复制子FRET试验确认的EC50测定值。复制子萤光素酶报道基因试验的采用首先由Krieger等描述(Krieger N、Lohmann V和Bartenschlager R，J.Virol.75(10)：4614-4624(2001))。通过插入cDNA编码的Renilla萤光 素酶基因的人源化形式和直接融合至萤光素酶基因的3’-端的接头序列，修饰针对我们FRET试验所述的复制子组成。采用定位在核中的Asc1限制位点，新霉素标记基因的直接上游，将该插入物引入复制子组成。还引入在1179位的适合的突变(丝氨酸成异亮氨酸)(Blight KJ，Kolykhalov，AA，Rice，CM，Science 290(5498)：1972-1974)。如上所述，产生稳定细胞系组成性表达的该HCV复制子组成。如针对HCV复制子FRET试验所述，用以下修饰进行萤光素酶报道基因试验。在37℃/5％CO2孵化器中4天后，采用Promega Dual-Glo萤光素酶试验系统分析细胞的Renilla萤光素酶活性。自包含细胞的各孔除去培养基(100μl)。向保留的50μl培养基中加入50μl Dual-Glo萤光素酶试剂，室温下晃动各板10min至2h。再向各孔加入Dual-Glo Stop&Glo试剂(50μl)，再于室温下另外再晃动各板10min至2h。采用发光程序用Packard TopCount NXT读出各板。 
采用下式计算抑制百分率： 
％对照＝在实验孔中的平均萤光素酶信号(+化合物)
在DMSO对照孔中的平均萤光素酶信号(-化合物)以各值绘图，并用XL拟合(XLfit)分析，得到EC50值。 
对本公开的化合物进行了试验，并发现都具有活性，其活性如下： 
化合物1：IC50：1nM EC50：9.8nM； 
化合物2：IC50：5nM 
化合物3：IC50：1nM 
在1b萤光素酶试验中的效力 
化合物1：1.6nM； 
化合物2：3.9nM 
化合物3：2.7nM 
对于本领域技术人员显而易见的是，本公开并不限于前述说明性实施例，而且可以体现在其它具体形式中而又不偏离其实质特性。因此，预期各实施例在所有方面都被视作说明性的而非限制性的，应参照所附权利要求书，而不是前述实施例，因此，落入所附权利要求书等同内容的含义和范围内的所有变化都意欲包括在本文中。 

Claims (22)

1.一种式(I)化合物
Figure FPA00001417921200011
或其药学上可接受的盐，其中
n是0、1、2、3或4；
R1选自羟基和-NHSO2R4；
R2选自氢、烷氧基、烷基硫基、烷基磺酰基、烷基亚磺酰基和羟基；
每个R3独立选自烷氧基、烷基、氰基、二烷基氨基、卤代、卤代烷基、卤代烷氧基、单环杂环、羟基和苯基；其中的单环杂环和苯基各自任选被独立选自烷氧基、烷基、二烷基氨基、卤代、卤代烷氧基和卤代烷基的一个、二个、三个、四个或五个取代基取代；
R4选自烷基、芳基、芳烷基、环烷基、(环烷基)烷基、杂环基和-NRaRb；其中的烷基和环烷基各自任选被选自烷基、烷氧基、卤代、卤代烷基、氰基、氰基烷基和卤代烷氧基的一个基团取代；
R5和R6独立选自氢、C1-3烷氧基、C1-3卤代烷氧基和任选被卤代取代的C1-3烷基，
Ra和Rb独立选自氢、烷氧基、烷基、芳基、芳烷基、环烷基、(环烷基)烷基、卤代烷基、杂环基和杂环基烷基；
Q是任选含一个氧原子的C4-8饱和的或不饱和的链，其中所述链任选被独立选自烷基、卤代和卤代烷基的一个、二个、三个或四个基团取代，其中所述烷基和卤代烷基可任选与它们相连的碳原子形成3-7元环；
Q’是任选含一个选自氮、氧和硫的杂原子的C4-8饱和的或不饱和的链；其中所述链任选被独立选自烷基和卤代的一个、二个、三个或四个基团取代；
Z选自CH2、O和NRz；其中Rz选自氢和烷基。
2.权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1是-NHSO2R4。
3.权利要求2的化合物或其药学上可接受的盐，其中n是1。
4.权利要求3的化合物或其药学上可接受的盐，其中Q是任选被两个烷基取代的C4-6饱和的或不饱和的链和Z是O。
5.权利要求4的化合物或其药学上可接受的盐，其中R3是烷氧基。
6.权利要求5化合物或其药学上可接受的盐，其中R2是烷氧基。
7.权利要求6化合物或其药学上可接受的盐，其中Q’是C6-8饱和的或不饱和的链。
8.权利要求1化合物或其药学上可接受的盐，其中
R1是-NHSO2R4；
R2是烷氧基；
R4是环烷基；和
R5和R6是氢。
9.权利要求1化合物或其药学上可接受的盐，其中
n是1；
R1是-NHSO2R4；其中R4是环烷基；
R2是烷氧基；
R3是烷氧基；
R5和R6各为氢；
Q是任选被两个烷基取代的C4-6饱和的链或未取代的链；
Q’是任选被两个烷基取代的C4-6饱和的链或未取代的链；
Z是O。
10.一种选自下式的化合物
Figure FPA00001417921200031
或其药学上可接受的盐。
11.一种组合物，其包含权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。
12.权利要求11的组合物，其还包含至少一种具有抗-HCV活性的另外的化合物。
13.权利要求12的组合物，其中所述另外的化合物中的至少一种是干扰素或利巴韦林。
14.权利要求13的组合物，其中的干扰素选自干扰素α2B、聚乙二醇化干扰素α、复合干扰素、干扰素α2A和类淋巴母细胞干扰素τ。
15.权利要求12的组合物，其中所述另外的化合物中的至少一种选自白介素2、白介素6、白介素12、促进产生1型辅助性T细胞应答的化合物、干扰RNA、反义RNA、咪喹莫德、利巴韦林、肌苷5′-一磷酸脱氢酶抑制剂、金刚烷胺和金刚乙胺。
16.权利要求12的组合物，其中所述另外的化合物中的至少一种有效抑制选自以下靶标的功能以治疗HCV感染：HCV金属蛋白酶、HCV丝氨酸蛋白酶、HCV聚合酶、HCV解旋酶、HCV NS4B蛋白、HCV进入、HCV装配、HCV脱出、HCV NS5A蛋白和IMPDH。
17.一种在患者中治疗HCV感染的方法，该方法包括给予患者有效治疗量的权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐。
18.权利要求17的方法，其还包括给予权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐之前、之后或同时，给予至少一种具有抗-HCV活性的另外的化合物。
19.权利要求18的方法，其中另外的化合物中的至少一种是干扰素或利巴韦林。
20.权利要求19的方法，其中的干扰素选自干扰素α2B、聚乙二醇化干扰素α、复合干扰素、干扰素α2A和类淋巴母细胞干扰素τ。
21.权利要求18的方法，其中另外的化合物中的至少一种选自白介素2、白介素6、白介素12、促进产生1型辅助性T细胞应答的化合物、干扰RNA、反义RNA、咪喹莫德、利巴韦林、肌苷5′-一磷酸脱氢酶抑制剂、金刚烷胺和金刚乙胺。
22.权利要求18的方法，其中所述另外的化合物中的至少一种有效抑制选自以下靶标的功能以治疗HCV感染：HCV金属蛋白酶、HCV丝氨酸蛋白酶、HCV聚合酶、HCV解旋酶、HCV NS4B蛋白、HCV进入、HCV装配、HCV脱出、HCV NS5A蛋白和IMPDH。
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