CN102296061A - 应用免疫胶体金技术从不同消化裂解液中纯化dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种
应用免疫胶体金技术从不同消化裂解液中纯化DNA的方法。该方法是将消化裂解液离心，收集上清液，在上清液（体积1ml以内）中加入5-15μl免疫胶体金（胶体金颗粒直径15-30nm）室温振荡孵育10-45分钟，孵育形成DNA-免疫胶体金颗粒复合物后离心洗脱保留沉淀。沉淀为吸附了DNA的免疫胶体金，加入3%FCS（小牛血清）500-1000μl，混匀悬浮沉淀，用离心方法使免疫胶体金颗粒沉淀，吸弃上清，保留沉淀；加入纯水500-1000μl，混匀悬浮沉淀，用离心方法使免疫胶体金颗粒沉淀，吸弃上清，保留沉淀，得到DNA-免疫胶体金颗粒复合物沉淀。可直接用于PCR反应。本发明可以使DNA提取液从1ml以上大体系浓缩成1-2微升，被浓缩的DNA纯度和产率极高，足以达到超微量分析的标准，便于操作、无环境污染，适用范围广。
Description
技术领域
本发明涉及法庭科学DNA检验领域，具体地说是一种应用免疫胶体金技术从不同消化裂解液中纯化DNA的方法。
背景技术
目前在法庭科学领域，对微量疑难生物检材（微量血痕、唾液斑迹、毛发、骨骼、附有人体脱落细胞的触摸物等）的DNA检测既是行业重点，也是行业难点，有时DNA检测结果直接影响案件侦破进程。而微量疑难生物检材DNA检测成功与否在于是否能获得足够的可用模板DNA,为达到有效制备可用于扩增的核酸的目的，许多学者一直在探索各种DNA的提取方法，已经有许多提取基因组DNA的方法，如传统酚-氯仿抽提法、Chelex-100法、硅珠法、磁珠法等。但是，这些方法在提取微量疑难生物检材都存在如下不足：
1、传统酚-氯仿抽提法属于经典技术，但操作比较繁琐，需要多步转移，转移过程中易造成污染和DNA损耗，尤其是当仅有少量检材分析或样本中DNA含量较低时，传统的DNA提取方法尤其不适用。另外，酚、氯仿等有机溶剂易造成环境污染，有害操作者的健康。
2、Chelex-100法操作简单快速，但提取的DNA纯度低，该法受生物检材本身条件限制较多，不适合微量、疑难生物物证DNA检测。
3、硅珠法是近年来常见的方法，是以二氧化硅在高离子强度、低pH值条件下吸附DNA，用洗涤液洗掉吸附在二氧化硅表面的其它杂质，再用低离子强度、高pH值缓冲液洗脱吸附在二氧化硅表面上的DNA分子，获得模板DNA。这种方法避免了使用酚-氯仿抽提，但需反复的洗涤和洗脱，步骤比较烦琐。DNA在洗脱过程中的损失使获得的DNA量减少，不适用DNA含量较少的检材。
4、磁珠法提取DNA也是近年出现的新方法，利用磁珠吸附DNA后，在磁场作用下分离。此方法可运用磁珠直接吸附DNA，利用磁场分离可以得到较纯的DNA，但DNA在洗脱过程中的损失使获得的DNA量减少，不适用DNA含量较少的检材。
因此，上述方法用于提取微量疑难生物检材的DNA时在纯度、产率、对操作者的健康、易操作性上都存在不足。特别是上述方法获得的用于扩增的DNA都是溶解在液体中的DNA溶液，使本来量少的DNA又进行了稀释。因此，建立一种新的DNA提取纯化方法用于检测微量生物检材很有必要。
发明内容
鉴于上述情况，本发明的目的是提供一种DNA提纯纯度及产率高且便于操作、无环境污染的应用免疫胶体金技术从不同消化裂解液中纯化DNA的方法。
本发明的目的是这样实现的：其特征是：a、首先将不同消化裂解液液体加热后离心，收集上清液，弃沉淀；b、然后将该上清液加入免疫胶体金，室温振荡孵育10-45分钟，当上清液体积在1ml以下，则加入5-15μl免疫胶体金，胶体金颗粒直径15-30nm；c、用离心方法使免疫胶体金颗粒沉淀，吸弃上清，保留沉淀；d、加入3%FCS（小牛血清）500-1000μl，混匀悬浮沉淀，用离心方法使免疫胶体金颗粒沉淀，吸弃上清，保留沉淀；e、加入纯水500-1000μl，混匀悬浮沉淀，用离心方法使免疫胶体金颗粒沉淀，吸弃上清，保留沉淀，此步骤至少１次，得到DNA-免疫胶体金颗粒复合物沉淀。
得到的DNA-免疫胶体金颗粒复合物沉淀加入PCR（聚合酶链式反应）反应液中直接扩增，将PCR产物用于检测。
上述所说的不同消化裂解液包含Chelex法液体、DNA提取缓冲液、CTAB法上清液、市售提取纯化试剂盒中起到消化裂解细胞作用的缓冲液、DNA水溶液、DNA TE缓冲液。
本发明的技术效果是：
1、能够提取高纯度可用于PCR反应的模板DNA。
本发明根据免疫反应所具有的专一性和特异性等特点设计了操作流程，免疫胶体金颗粒只针对消化裂解液中的微量DNA分子具有极高的捕获能力，且捕获的DNA片段在100bp以上。对蛋白质、RNA、严重降解的小片段DNA、色素、细菌等影响PCR反应的抑制剂均不吸附。因此提取的DNA纯度极高。
2、具有无可比拟的超级浓缩能力。
用本发明纯化的用于PCR反应的模板DNA是以DNA-免疫胶体金颗粒复合物沉淀的形式存在。该复合物沉淀可直接用于PCR反应，不需要将DNA从胶体金颗粒上洗脱下来制成DNA溶液。最后一次洗涤离心后，将上清液全部弃去，在实际操作中仅剩余1-2微升水。因此，本发明可以使DNA提取液从1ml以上大体系浓缩成1-2微升，被浓缩的DNA产率极高，足以达到超微量分析的标准。
3、DNA-免疫胶体金颗粒复合物沉淀直接用于PCR反应，创造性的发展了PCR技术，极大的提高了DNA检测灵敏度。
用本发明得到的产物是DNA-免疫胶体金颗粒复合物沉淀。该复合物沉淀加入PCR反应液直接扩增。在进行微量生物检材检测时，可将消化裂解液中的微量DNA最大限度的富集，全部用于PCR反应。实验证明可提高DNA检测灵敏度3-4个数量级，使PCR的敏感性大幅提高。
4、本发明适合多种消化裂解液中DNA的提纯，适用范围广。
针对不同的生物物证采用不同的裂解方法，本方法专门针对不同裂解液建立纯化方法，能有效纯化DNA。因此本法适用各类生物检材的消化裂解液的纯化，适用范围广泛。
5、本发明操作简便、能够快速提纯DNA，易于推广。
传统酚-氯仿抽提法从消化裂解液中提纯DNA需要重复萃取、沉淀、重复洗涤、溶解后制成溶液等4个部分。硅珠法和磁珠法从消化裂解液中提纯DNA需要吸附、重复洗涤、洗脱制成溶液等3个部分。而本发明仅需捕获、重复洗涤后制成沉淀复合物等2个部分即可进行PCR反应。因此本法操作简便，易于掌握，便于推广。并且整个提取过程不需使用有机溶剂，避免了环境污染。
6、本发明使用的免疫胶体金分为两类：抗-DNA单克隆抗体免疫胶体金和抗-DNA多克隆抗体免疫胶体金。研究证明，这两类免疫胶体金在纯化DNA方面无明显差异。抗-DNA单克隆抗体免疫胶体金价格较贵，抗-DNA多克隆抗体免疫胶体金制备简单，价格便宜，这为本发明在全国法庭科学领域大范围推广应用提供了条件。
综上，本发明创造性的发展了利用免疫反应直接捕获人体DNA分子的技术，在实验的基础上建立了从不同消化裂解液中纯化DNA的方法，为微量疑难生物检材DNA检测建立了全新而又简单实用的方法，填补了法庭科学领域的空白。
下面结合实施例对本发明做以详细说明。
具体实施方式
实例1：从Chelex法液体环境下纯化DNA：
一、免疫胶体金的制备
本实施方式以25-30nm大小胶体金颗粒为载体，将抗-DNA单克隆抗体标记到胶体金颗粒上，制备成免疫胶体金。
二、提纯DNA
1、采用中华人民共和国公共安全行业标准-《法庭科学DNA实验室检验规范》（GA/T 383-2002）中“6.2 Chelex法”处理血痕、烟头、人体脱落细胞等生物物证。
2、将上述方法提取液13000rpm离心3min，收集上清液于0.5ml离心管中，弃沉淀。
3、将上清液加入免疫胶体金10μl，室温振荡孵育10分钟。
4、13000rpm离心3min使免疫胶体金颗粒沉淀，吸弃上清，保留沉淀。
5、加入3%FCS（小牛血清）500μl，混匀悬浮沉淀，13000rpm离心3min，吸弃上清，保留沉淀。
6、加入灭菌纯水500μl，混匀悬浮沉淀，13000rpm离心3min，吸弃上清，保留沉淀。
三、检测提纯效果
将沉淀加入PCR反应液中，直接进行扩增（采用AB公司ID试剂盒）。PCR扩增产物用ABI 3100Avant Genetic Analyzer进行毛细管电泳分离,用Genetyper软件进行数据分析和等位基因分型。
实例2：从DNA提取缓冲液中纯化DNA：
一、免疫胶体金的制备
本实施方式以25-30nm大小胶体金颗粒为载体，将抗-DNA单克隆抗体标记到胶体金颗粒上，制备成免疫胶体金。
二、提纯DNA
1、采用中华人民共和国公共安全行业标准-《法庭科学DNA实验室检验规范》（GA/T 383-2002）中“6.1 有机溶剂法”中“6.1.1中f) DNA提取缓冲液”处理血痕、烟头、人体脱落细胞等生物物证。
2、将上述方法提取液加热（100℃，8分钟）后，13000rpm离心3min，收集上清液于0.5ml离心管中，弃沉淀。
3、将上清液加入免疫胶体金10μl，室温振荡孵育10分钟。
4、13000rpm离心3min使免疫胶体金颗粒沉淀，吸弃上清，保留沉淀。
5、加入3%FCS（小牛血清）500μl，混匀悬浮沉淀，13000rpm离心3min，吸弃上清，保留沉淀。
6、加入灭菌纯水500μl，混匀悬浮沉淀，13000rpm离心3min，吸弃上清，保留沉淀。此步骤3次。
三、检测提纯效果
将沉淀加入PCR反应液中，直接进行扩增（采用AB公司ID试剂盒）。PCR扩增产物用ABI 3100Avant Genetic Analyzer进行毛细管电泳分离,用Genetyper软件进行数据分析和等位基因分型。
实例3：从CTAB法上清液中纯化DNA：
一、免疫胶体金的制备
本实施方式以25-30nm大小胶体金颗粒为载体，将抗-DNA单克隆抗体标记到胶体金颗粒上，制备成免疫胶体金。
二、提纯DNA
1、采用中华人民共和国公共安全行业标准-《法庭科学DNA实验室检验规范》（GA/T 383-2002）中“6.4 CTAB法”处理骨骼、牙齿等生物物证。保留此法中“6.4.2.1中b) 上清液”。
2、将上述方法提取液加热（100℃，15分钟）后，10000rpm离心5min，收集上清液于1.5ml离心管中，弃沉淀。
3、将上清液加入免疫胶体金15μl，室温振荡孵育15分钟。
4、13000rpm离心5min使免疫胶体金颗粒沉淀，吸弃上清，保留沉淀。
5、加入3%FCS（小牛血清）1000μl，混匀悬浮沉淀，13000rpm离心5min，吸弃上清，保留沉淀。
6、加入灭菌纯水1000μl，混匀悬浮沉淀，13000rpm离心5min，吸弃上清，保留沉淀。此步骤3次。
三、检测提纯效果
将沉淀加入PCR反应液中，直接进行扩增（采用AB公司ID试剂盒）。PCR扩增产物用ABI 3100Avant Genetic Analyzer进行毛细管电泳分离,用Genetyper软件进行数据分析和等位基因分型。
实例4：从市售提取纯化试剂盒中起到消化裂解细胞作用的缓冲液中纯化DNA：
一、免疫胶体金的制备
本实施方式以25-30nm大小胶体金颗粒为载体，将抗-DNA单克隆抗体标记到胶体金颗粒上，制备成免疫胶体金。
二、提纯DNA
1、采用QIAGEN公司的EZ1 DNA Tissue试剂盒中的G2缓冲液消化裂解血痕、烟头、人体脱落细胞等生物物证。
2、将上述方法提取液加热（100℃，8分钟）后13000rpm离心3min，收集上清液于0.5ml离心管中，弃沉淀。
3、将上清液加入免疫胶体金10μl，室温振荡孵育10分钟。
4、13000rpm离心3min使免疫胶体金颗粒沉淀，吸弃上清，保留沉淀。
5、加入3%FCS（小牛血清）500μl，混匀悬浮沉淀，13000rpm离心3min，吸弃上清，保留沉淀。
6、加入灭菌纯水500μl，混匀悬浮沉淀，13000rpm离心3min，吸弃上清，保留沉淀。
三、检测提纯效果
将沉淀加入PCR反应液中，直接进行扩增（采用AB公司ID试剂盒）。PCR扩增产物用ABI 3100Avant Genetic Analyzer进行毛细管电泳分离,用Genetyper软件进行数据分析和等位基因分型。
实例5：从DNA水溶液中纯化DNA：
一、免疫胶体金的制备
本实施方式以25-30nm大小胶体金颗粒为载体，将抗-DNA单克隆抗体标记到胶体金颗粒上，制备成免疫胶体金。
二、提纯DNA
1、将DNA水溶液13000rpm离心3min，收集上清液于0.5ml离心管中，弃沉淀。
3、将上清液加入免疫胶体金10μl，室温振荡孵育10分钟。
4、13000rpm离心3min使免疫胶体金颗粒沉淀，吸弃上清，保留沉淀。
5、加入3%FCS（小牛血清）500μl，混匀悬浮沉淀，13000rpm离心3min，吸弃上清，保留沉淀。
6、加入灭菌纯水500μl，混匀悬浮沉淀，13000rpm离心3min，吸弃上清，保留沉淀。
三、检测提纯效果
将沉淀加入PCR反应液中，直接进行扩增（采用AB公司ID试剂盒）。PCR扩增产物用ABI 3100Avant Genetic Analyzer进行毛细管电泳分离,用Genetyper软件进行数据分析和等位基因分型。
实例6：从DNA TE缓冲液中纯化DNA：
一、免疫胶体金的制备
本实施方式以25-30nm大小胶体金颗粒为载体，将抗-DNA单克隆抗体标记到胶体金颗粒上，制备成免疫胶体金。
二、提纯DNA
1、采用中华人民共和国公共安全行业标准-《法庭科学DNA实验室检验规范》（GA/T 383-2002）中“TE缓冲液”溶解DNA。
2、将DNA TE溶液13000rpm离心3min，收集上清液于0.5ml离心管中，弃沉淀。
3、将上清液加入免疫胶体金10μl，室温振荡孵育10分钟。
4、13000rpm离心3min使免疫胶体金颗粒沉淀，吸弃上清，保留沉淀。
5、加入3%FCS（小牛血清）500μl，混匀悬浮沉淀，13000rpm离心3min，吸弃上清，保留沉淀。
6、加入灭菌纯水500μl，混匀悬浮沉淀，13000rpm离心3min，吸弃上清，保留沉淀。
三、检测提纯效果
将沉淀加入PCR反应液中，直接进行扩增（采用AB公司ID试剂盒）。PCR扩增产物用ABI 3100Avant Genetic Analyzer进行毛细管电泳分离,用Genetyper软件进行数据分析和等位基因分型。
备注：不同消化裂解液包含Chelex法
［1］
液体、DNA提取缓冲液
［2］
、CTAB法
［3］
上清液、市售提取纯化试剂盒中起到消化裂解细胞作用的缓冲液
［4］
、DNA水溶液
［5］
、DNA TE
［6］
缓冲液。
［1］Chelex法指中华人民共和国公共安全行业标准-《法庭科学DNA实验室检验规范》（GA/T 383-2002）中“6.2 Chelex法”。
［2］指中华人民共和国公共安全行业标准-《法庭科学DNA实验室检验规范》（GA/T 383-2002）中“6.1 有机溶剂法”中“6.1.1中f) DNA提取缓冲液”。
［3］指中华人民共和国公共安全行业标准-《法庭科学DNA实验室检验规范》（GA/T 383-2002）中“6.4 CTAB法”中“6.4.2.1中b) 上清液”。
［4］指市售提取纯化试剂盒中起到消化裂解细胞作用的缓冲液,诸如Promega公司的DNA IQ系统中的裂解缓冲液、QIAGEN公司的EZ1 DNA Tissue试剂盒中的G2缓冲液、等等。
［5］指中华人民共和国公共安全行业标准-《法庭科学DNA实验室检验规范》（GA/T 383-2002）中“双蒸馏水”。
［6］指中华人民共和国公共安全行业标准-《法庭科学DNA实验室检验规范》（GA/T 383-2002）中“TE缓冲液”。
Claims (3)
1.一种应用免疫胶体金技术从不同消化裂解液中纯化DNA的方法，其特征是：a、首先将不同消化裂解液液体加热后离心，收集上清液，弃沉淀；b、然后将该上清液加入免疫胶体金，室温振荡孵育10-45分钟，当上清液体积在1ml以下，则加入5-15μl免疫胶体金，胶体金颗粒直径15-30nm；c、用离心方法使免疫胶体金颗粒沉淀，吸弃上清，保留沉淀；d、加入3%FCS（小牛血清）500-1000μl，混匀悬浮沉淀，用离心方法使免疫胶体金颗粒沉淀，吸弃上清，保留沉淀；e、加入纯水500-1000μl，混匀悬浮沉淀，用离心方法使免疫胶体金颗粒沉淀，吸弃上清，保留沉淀，此步骤至少１次，得到DNA-免疫胶体金颗粒复合物沉淀。
2.如权利要求1所述的应用免疫胶体金技术从不同消化裂解液中纯化DNA的方法，其特征是：上述所说的不同消化裂解液包含Chelex法液体、DNA提取缓冲液、CTAB法上清液、市售提取纯化试剂盒中起到消化裂解细胞作用的缓冲液、DNA水溶液、DNA TE缓冲液。
3.如权利要求1所述的应用免疫胶体金技术从不同消化裂解液中纯化DNA的方法，其特征是：得到的DNA-免疫胶体金颗粒复合物沉淀加入PCR（聚合酶链式反应）反应液中直接扩增，将PCR产物用于检测。
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| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
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