CN102295699B

CN102295699B - 一种细胞色素c的纯化工艺

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Publication number: CN102295699B
Application number: CN 201110268301
Authority: CN
Inventors: 王超展; 樊花; 陈湘琴
Original assignee: Northwest University
Current assignee: Northwest University
Priority date: 2011-09-13
Filing date: 2011-09-13
Publication date: 2013-02-20
Anticipated expiration: 2031-09-13
Also published as: CN102295699A

Abstract

本发明公开了一种细胞色素C的纯化新工艺，包括以下步骤：（1）从动物脏器或者酵母中提取得到细胞色素C的粗提液；（2）向粗提液中加入无机盐进行盐析，静置离心弃去沉淀的杂蛋白，收集上清液；（3）加缓冲液调节上清液中无机盐浓度至20%~35%，再用前沿疏水色谱法对其进行纯化，即将所得溶液连续上样于预先用20%~35%的无机盐溶液平衡过的疏水色谱柱中，收集穿透液；（4）用20%~35%无机盐溶液冲洗色谱柱至吸光度达到稳定，收集色谱流出液，与穿透液合并，即为纯化后的细胞色素C。本发明操作简便，分离纯化效果好，效率高，成本低。

Description

一种细胞色素C的纯化工艺

技术领域

本发明涉及一种细胞色素C的纯化工艺，具体涉及采用前沿疏水色谱法纯化细胞色素C的工艺，属于生化分离技术领域。

背景技术

细胞色素（cytochrome）是各种生物体中都很常见的蛋白质，它是一类含有铁卟啉基团的电子传递蛋白，只存在于需氧细胞中，广泛存在于真核生物的线粒体内膜和内质网中，植物的叶绿体中，以及光合成微生物和细菌中。细胞色素在线粒体内膜上起传递电子的作用。细胞色C (cytochrome c) 是细胞色素的一种，它在线粒体呼吸链上位于细胞色素B 和细胞色素氧化酶之间，是呼吸链的一个重要组成部分。每分子细胞色素C含有一个血红素和一条多肽链。细胞色素C是一种稳定的可溶性蛋白，它易溶于水及酸性溶液，故常用酸性缓冲液提取。它对热比较稳定，不易变性，对酸碱也较稳定，可抵抗0.3 mol/L氢氧化钾溶液的长时间处理。

在酶存在的情况下，细胞色素C对组织的氧化、还原有迅速的酶促作用。通常外源性细胞色素C不能进入健康细胞，但在缺氧时，细胞膜的通透性增加，细胞色素C便有可能进入细胞及线粒体内，增强细胞氧化，提高氧的利用。细胞色素C可用于组织缺氧的急救和辅助用药，如一氧化碳中毒、催眠药中毒、新生儿窒息、严重休克缺氧、麻醉及肺部疾病引起的呼吸困难、高山缺氧、脑缺氧、心脏疾病引起的缺氧等。

目前临床上应用的细胞色素C主要是从猪心中分离纯化的制品。其技术路线为：将新鲜猪心搅碎后得心肌碎肉，用稀硫酸溶液提取，用稀氨水中和，将所得提取液吸附于人造沸石，用低浓度的硫酸铵溶液进行洗脱，再依次用硫酸铵沉淀法和三氯乙酸沉淀法对洗脱液进一步纯化，将所得沉淀溶解后对蒸馏水进行透析，然后再用弱阳离子交换树脂对其进行精纯化。目前工业上主要采用这一工艺路线制备细胞色素C。这种工艺路线繁琐、步骤多、耗时长，每公斤猪心仅可得约200 mg细胞色素C。

近年来，一些研究人员对此路线进行了一些改进。其中结果较好的是李宝珠等（李宝珠, 赵丽哲, 宁晓玲，中国生化药物杂志，1995, 16, 221-223）用凝胶过滤色谱法，以葡聚糖凝胶Sephadex G-200为分离介质，代替了上述传统技术路线中的弱阳离子交换色谱，使得细胞色素C的产率提高到340 mg/kg猪心；然而，凝胶过滤色谱法的样品负载量低，不利于大规模成产，而且凝胶过滤法分离速度很低，导致该方法比广泛采用的传统方法更加耗时。美国Amberlite IRC-50阳离子交换树脂是目前细胞色素C纯化中应用最为广泛的树脂，价格很高，虽然有人尝试用国产的树脂代替它，但效果均不理想（何献君, 陈红, 陈雅惠, 等, 中国生化药物杂志, 2008, 29(5): 324-326）。上述方法不但繁琐耗时，而且无一例外都采用了三氯乙酸沉淀对细胞色素C进行纯化，三氯乙酸极易引起细胞色素C的变性聚合和脱酰胺（李宝珠, 赵丽哲, 宁晓玲，中国生化药物杂志，1995, 16, 221-223）。

姚从等（姚从, 柯从玉, 白泉, 等，色谱，2004, 22: 399-402）采用疏水色谱法一步从猪心提取液中获得了高纯度的细胞色素C，这种方法虽然简单方便，但由于未经过硫酸铵或三氯乙酸沉淀等前处理，杂蛋白含量太多，使得色谱柱上绝大部分吸附位点被杂蛋白所占据，蛋白纯化效率低，只适合实验室规模的分离纯化，不适用于大规模的生产。为了提高色谱柱的利用效率，将猪心细胞色素C的粗提液首先用硫酸铵沉淀，然后将细胞色素C和剩余杂蛋白同时吸附在疏水色谱柱上，然后再用疏水色谱法在洗脱模式下对其进行分离（姚从，西北大学硕士学位论文，西安，2004），使得细胞色素C的上样量和色谱柱的利用效率得到了较大程度的提高。然而，柱填料利用率和生产效率仍然比较低。

发明内容

本发明的目的是提供一种细胞色素C的纯化工艺，以克服现有技术纯化步骤多、色谱填料利用率低、生产效率低等不足。

一种细胞色素C的纯化工艺，包括以下步骤：

（1）从动物脏器或者酵母中提取得到细胞色素C的粗提液；

（2）向粗提液中加入无机盐进行盐析，静置离心弃去沉淀的杂蛋白，收集上清液；

（3）加缓冲液调节上清液中无机盐浓度至20% ~ 35%，再用前沿疏水色谱法对其进行纯化，即将所得溶液连续上样于预先用20% ~ 35%的无机盐溶液平衡过的疏水色谱柱中，收集穿透液；

（4）用20% ~ 35%无机盐溶液冲洗色谱柱至吸光度达到稳定，收集色谱流出液，与穿透液合并，即为纯化后的细胞色素C。

所述动物脏器是猪、牛、羊、马或狗的心脏、肝脏、肾脏。

上述步骤（1）中，用pH值3 ~ 5的稀硫酸溶液进行提取，然后用稀氨水调节pH至6 ~ 8。

步骤（2）中，加入无机盐后的无机盐终浓度为35% ~ 70%，所述的无机盐是碱金属、碱土金属或NH₄ ⁺的磷酸盐、硫酸盐、盐酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐。

步骤（3）中，缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、TES缓冲液、BES缓冲液或MOPS缓冲液。

所述疏水色谱柱中填料是以硅胶、有机高分子聚合物或多糖聚合物为基质，以苯基、醚基、C1 ~ C4烷基、邻二醇基为配基。

本发明的优点与积极效果：细胞色素C粗提液经过盐析处理后，样品溶液中残留的杂蛋白的疏水性比细胞色素C的疏水性强得多，使用前沿疏水色谱法纯化细胞色素C，使经过盐析处理后的细胞色素C溶液连续流过疏水色谱柱，可使疏水性较弱的细胞色素C在疏水色谱柱上不保留，而使杂蛋白吸附在疏水色谱柱上，该工艺可以大大地提高色谱柱的利用效率和生产效率，降低纯化成本。与工业上最常用的经典工艺路线相比，本发明的生产效率可以提高25倍；与采用疏水色谱法在洗脱模式下纯化猪心中细胞色素C的方法（姚从，西北大学硕士学位论文，西安，2004）相比，本发明的生产效率可以提高9.2倍。本发明具有工艺简便、纯化效果好、柱填料利用率高、生产效率高、成本低等优点，具有较高的推广应用价值。

附图说明

图1为实施例提纯得到的细胞色素C的电泳图，其中a, 标准细胞色素C；b, 细胞色素C粗提液；c, 纯化后的细胞色素C；

图2为用前沿疏水色谱法纯化细胞色素C的色谱图。

具体实施方式

实施例1：用前沿疏水色谱法分离纯化猪心中的细胞色素C

（1）猪心中细胞色素C的提取

取新鲜猪心l kg，去脂肪结缔组织，绞成肉糜，加400 mL水，用1.0 mol/L硫酸调pH至4.0，室温搅拌2 h，用纱布压滤除去残渣，为了提取充分，将残渣按上述条件重提取1 h。除去残渣并合并两次提取液，然后用1.0 mol/L氨水调pH至7.0，在4℃条件下静置，最后离心，收集上清液，过滤即得到约760 mL粗提溶液。附图1中条带b为细胞色素C粗提液的SDS-PAGE图。

（2）硫酸铵沉淀法粗纯化猪心中的细胞色素C

向所得的粗提液中加入固体硫酸铵，使其浓度为50%。沉降4小时后离心弃去沉淀，收集上层红色清液。

（3）前沿疏水色谱法分离纯化猪心中的细胞色素C

向120 mL（2）中所得上清液中加入一定体积的50 mmol/L PBS缓冲液（pH 7.0），将溶液中硫酸铵的终浓度调节至30.5%，再以含50 mmol/L PBS缓冲液（pH 7.0）的30.5%硫酸铵溶液平衡装有PEG600固定相的疏水色谱柱（10 × 0.46 cm I.D.），并将调整过硫酸铵浓度的细胞色素C溶液在流速1.0 mL/min 下连续上样于已平衡过的疏水色谱柱中，收集穿透液，用30.5%硫酸铵溶液冲洗色谱柱15 min以使吸光度基本达到稳定，并收集该过程中的色谱流出液，与上述穿透液合并，即得到纯化后的细胞色素C。然后在20 min内将硫酸铵浓度降低至0 %以洗脱保留在色谱柱上的杂蛋白，使色谱柱得到再生。附图2为用前沿疏水色谱法纯化细胞色素C 的色谱图，附图1中条带c为经前沿疏水色谱法纯化后的细胞色素C的SDS-PAGE图。经检测，所纯化的细胞色素C的纯度为99.6%，一次纯化可得46 mg高纯度的细胞色素C。该工艺纯化细胞色素C的产率为7.4 mg/(小时.克填料)。经过计算，从1 kg猪心中可得323 mg细胞色素C。

实施例2：用疏水色谱法在洗脱模式下分离纯化猪心中的细胞色素C

用3 mol/L (NH₄)₂SO₄ + 50 mmol/L PBS（pH 7.0）平衡装有PEG600固定相的疏水色谱柱（10 × 0.46 cm I.D.），将实施例1中（2）所得的细胞色素C溶液2 mL进样到平衡好的疏水色谱柱中，以线性梯度洗脱蛋白，使(NH₄)₂SO₄的浓度在30 min内降低到0 mol/L，收集细胞色素C馏分。整个色谱过程中流速为1.0 mL/min，检测波长为280 nm。经检测，所纯化的细胞色素C的纯度为99.4%，一次纯化仅可得0.8 mg高纯度的细胞色素C。该工艺纯化细胞色素C的产率仅为0.8 mg/(小时.克填料)。

实施例3：经典吸附色谱法纯化猪心中的细胞色素C

（1）人造沸石柱吸附洗脱

采用1.0 mL/min的流速，将实施例1中（1）所得的细胞色素C溶液70 mL上样于装填有5 g人造沸石的色谱柱中，使得人造沸石充分吸附细胞色素C提取液后变为鲜红色。然后将人造沸石从柱中取出，分别用蒸馏水、0.2% NaCl和蒸馏水各洗涤三次，每次均为20 min。将洗涤好的人造沸石重新装柱，以2.0 mL/min的流速用25% (NH4)₂SO₄溶液洗脱，收集红色细胞色素C馏分。

（2）用硫酸铵和三氯乙酸沉淀纯化细胞色素C

向（1）中收集的细胞色素C馏分加入一定量的固体硫酸铵，使硫酸铵浓度达到到50%。沉降 4小时后离心除去杂蛋白，收集上层红色清液。搅拌下向上述溶液中滴加0.05倍体积的20%三氯乙酸，离心收集红色细胞色素C沉淀，溶于水中即得粗纯化细胞色素C溶液。

（3）凝胶过滤色谱纯化细胞色素C

将（2）中所得粗纯化的细胞色素C溶液上样于装填20 g Sephadex G-75的凝胶过滤色谱柱中，用0.4 mol/L NaCl + 0.060 mol/L PBS (pH 7.0)溶液洗脱，收集细胞色素C馏分，得精纯化细胞色素C溶液。

整个纯化过程需耗时12小时。经检测，所纯化的细胞色素C的纯度为99.5%，一次纯化可得19 mg高纯度的细胞色素C。该工艺纯化细胞色素C的产率仅仅为0.3 mg/(小时.克填料)，效率很低。经过计算，采用该工艺从1 kg猪心中可得206 mg细胞色素C。

实施例4：用前沿疏水色谱法分离纯化牛心中的细胞色素C

（1）牛心中细胞色素C的提取

取新鲜牛心l kg，去除脂肪和韧带等结缔组织，用生理盐水漂洗除去血污，绞成肉糜，加400 mL水，用2.0 mol/L硫酸调pH至3.4，室温搅拌3 h，用纱布压滤除去残渣，为了提取充分，将残渣按上述条件再提取1 h。除去残渣并合并两次提取液，然后用2.0 mol/L氨水调pH至7.5，在4℃条件下静置，最后离心，收集上清液，过滤即得到约750 mL粗提溶液。

（2）硫酸铵沉淀法粗纯化牛心中的细胞色素C

向所得的牛心细胞色素C粗提液中加入一定量的固体硫酸铵，使其浓度为60%。沉降3小时后离心弃去沉淀，收集上层红色清液。

（3）前沿疏水色谱法分离纯化猪心中的细胞色素C

向180 mL（2）中所得上清液中加入一定体积的50 mmol/L PBS缓冲液（pH 7.0），将溶液中硫酸铵的终浓度调节至32%，再以含50 mmol/L Tris缓冲液（pH 7.5）的32%硫酸铵溶液平衡装有苯基固定相的疏水色谱柱（10 × 0.46 cm I.D.），并将所得样品溶液在流速1.0 mL/min 下连续上样于已平衡过的疏水色谱柱中，收集穿透液，用32%硫酸铵溶液冲洗色谱柱15 min以使吸光度基本达到稳定，并收集该过程中的色谱流出液，与上述穿透液合并，即得到纯化后的细胞色素C。然后在10 min内将硫酸铵浓度降低至0%以洗脱保留在色谱柱上的杂蛋白，使色谱柱得到再生。经纯化后所得细胞色素C的纯度为99%，一次纯化可得40 mg高纯度的细胞色素C。经过计算，从1 kg牛心中可得168 mg细胞色素C。

实施例5：在不同硫酸铵浓度下，用前沿疏水色谱法纯化猪心中的细胞色素C

（1）硫酸铵浓度为33%

向120 mL（2）中所得上清液中加入一定体积的50 mmol/L PBS缓冲液（pH 7.0），将溶液中硫酸铵的终浓度调节至33%，再以含50 mmol/L PBS缓冲液（pH 7.0）的33%硫酸铵溶液平衡装有PEG600固定相的疏水色谱柱（10 × 0.46 cm I.D.），并将调整硫酸铵浓度后的细胞色素C样品溶液在流速1.0 mL/min 下连续上样于已平衡过的疏水色谱柱中，收集穿透液，用33%硫酸铵溶液冲洗色谱柱15 min以使吸光度基本达到稳定，并收集该过程中的色谱流出液，与上述穿透液合并，即得到纯化后的细胞色素C。然后在20 min内将硫酸铵浓度降低至0%以洗脱保留在色谱柱上的杂蛋白，使色谱柱得到再生。经检测，所纯化的细胞色素C的纯度为99.8%，一次纯化可得43 mg细胞色素C。

（2）硫酸铵浓度为27.7%

向120 mL（2）中所得上清液中加入一定体积的50 mmol/L PBS缓冲液（pH 7.0），将溶液中硫酸铵的终浓度调节至27.7%，再以含50 mmol/L PBS缓冲液（pH 7.0）的27.7%硫酸铵溶液平衡装有PEG600固定相的疏水色谱柱（10 × 0.46 cm I.D.），并将调整硫酸铵浓度后的细胞色素C样品溶液在流速1.0 mL/min 下连续上样于已平衡过的疏水色谱柱中，收集穿透液，用27.7%硫酸铵溶液冲洗色谱柱15 min以使吸光度基本达到稳定，并收集该过程中的色谱流出液，与上述穿透液合并，即得到纯化后的细胞色素C。然后在20 min内将硫酸铵浓度降低至0 mol/L以洗脱保留在色谱柱上的杂蛋白，使色谱柱得到再生。经检测，所纯化的细胞色素C的纯度为89%，一次纯化可得51 mg细胞色素C。

Claims

1.一种细胞色素C的纯化工艺，包括以下步骤：

（1）猪心中细胞色素C的提取

取新鲜猪心l kg，去脂肪结缔组织，绞成肉糜，加400 mL水，用1.0 mol/L硫酸调pH至4.0，室温搅拌2 h，用纱布压滤除去残渣，为了提取充分，将残渣按上述条件重提取1 h；除去残渣并合并两次提取液，然后用1.0 mol/L氨水调pH至7.0，在4℃条件下静置，最后离心，收集上清液，过滤即得到760 mL粗提溶液；

（2）硫酸铵沉淀法粗纯化猪心中的细胞色素C

向所得的粗提液中加入固体硫酸铵，使其浓度为50%，沉降4小时后离心弃去沉淀，收集上层红色清液；

（3）前沿疏水色谱法分离纯化猪心中的细胞色素C

向120 mL步骤（2）中所得上清液中加入一定体积的pH 7.0的50 mmol/L PBS缓冲液，将溶液中硫酸铵的终浓度调节至30.5%，再以pH 7.0的含50 mmol/L PBS缓冲液的30.5%硫酸铵溶液平衡装有PEG600固定相的规格为10 × 0.46 cm I.D.的疏水色谱柱，并将调整过硫酸铵浓度的细胞色素C溶液在流速1.0 mL/min 下连续上样于已平衡过的疏水色谱柱中，收集穿透液，用30.5%硫酸铵溶液冲洗色谱柱15 min以使吸光度达到稳定，并收集该过程中的色谱流出液，与上述穿透液合并，即得到纯化后的细胞色素C。

2.一种细胞色素C的纯化工艺，包括以下步骤：

（1）牛心中细胞色素C的提取

取新鲜牛心l kg，去除脂肪和韧带等结缔组织，用生理盐水漂洗除去血污，绞成肉糜，加400 mL水，用2.0 mol/L硫酸调pH至3.4，室温搅拌3 h，用纱布压滤除去残渣，为了提取充分，将残渣按上述条件再提取1 h，除去残渣并合并两次提取液，然后用2.0 mol/L氨水调pH至7.5，在4℃条件下静置，最后离心，收集上清液，过滤即得到750 mL粗提溶液；

（2）硫酸铵沉淀法粗纯化牛心中的细胞色素C

向所得的牛心细胞色素C粗提液中加入一定量的固体硫酸铵，使其浓度为60%，沉降3小时后离心弃去沉淀，收集上层红色清液；

（3）前沿疏水色谱法分离纯化猪心中的细胞色素C

向180 mL步骤（2）中所得上清液中加入一定体积的pH 7.0的50 mmol/L PBS缓冲液，将溶液中硫酸铵的终浓度调节至32%，再以pH 7.5的含50 mmol/L Tris缓冲液的32%硫酸铵溶液平衡装有苯基固定相的规格为10 × 0.46 cm I.D.的疏水色谱柱，并将所得样品溶液在流速1.0 mL/min 下连续上样于已平衡过的疏水色谱柱中，收集穿透液，用32%硫酸铵溶液冲洗色谱柱15 min以使吸光度达到稳定，并收集该过程中的色谱流出液，与上述穿透液合并，即得到纯化后的细胞色素C。