CN102288708B

CN102288708B - 活血止痛胶囊的质量检测方法

Info

Publication number: CN102288708B
Application number: CN 201110227035
Authority: CN
Inventors: 濮存海; 赵开军; 戴瑞; 王波; 徐云辉; 陈磊
Original assignee: NANJING ZHONGSHAN PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: NANJING ZHONGSHAN PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2011-08-09
Filing date: 2011-08-09
Publication date: 2013-05-01
Anticipated expiration: 2031-08-09
Also published as: CN102288708A

Abstract

本发明公开了一种活血止痛胶囊的质量检测方法，该检测方法提供了乳香、三七、冰片的薄层鉴别，土鳖虫的分子鉴定，采用高效液相色谱法对阿魏酸进行含量测定。本发明质量控制方法在进行分离检测时，能够抵抗干扰因素，检测效率高、稳定性好、分析速度快、检验周期短，是控制活血止痛胶囊质量可靠的方法，为活血止痛胶囊的质量检测建立了一个准确可行的控制标准。

Description

活血止痛胶囊的质量检测方法

技术领域

本发明属于中药技术领域，具体涉及一种活血止痛胶囊的质量检测方法。

背景技术

活血止痛胶囊是原国家中药四类新药，国家中药保护品种，处方：当归400g、乳香(制)80g、三七80g、冰片20g、土鳖虫200g、自然铜(煅)120g，收载于《中华人民共和国卫生部药品标准新药转正标准》第十册WS3-084(Z-74)-95(Z)。制法：以上六味，除冰片外，其余当归等五味粉碎成细粉；将冰片研细，与上述粉末配制，过筛，混匀，装胶囊，制成1000粒(0.5g/粒)；或者装胶囊，制成2000粒(0.25g/粒)。即得。

发明人对现行的质量标准进行分析，发现存在以下问题：1)只对当归药材进行薄层鉴别，比较单一，不易准确；2)含量测定方法采用薄层扫描法，重现性较差，受点样环境的影响较大，其薄层展开时受外界温湿度的影响，干扰因素较多；且结构相似的物质较难有效分离，检验周期较长。

因此，发明人对现有质量标准进行了提高，具体表现在：1)增加了乳香、三七、冰片的薄层鉴别；2)采用高效液相色谱法对阿魏酸进行含量测定。3)增加了土鳖虫的分子鉴定方法。该质量控制方法在进行分离检测时，能够抵抗干扰因素，检测效率高、稳定性好、分析速度快、检验周期短，是控制活血止痛胶囊质量可靠的方法，为活血止痛胶囊的质量检测建立了一个准确可行的控制标准。

发明内容

本发明的目的是提供一种能准确、快捷检测活血止痛胶囊质量的检测方法。

本发明的目的是通过以下方式实现的：

一种活血止痛胶囊的质量检测方法，其特征在于该检测方法包括鉴别及含量测定，其中含量测定方法包括以下步骤：

a)供试品溶液的制备：取活血止痛胶囊内容物，研细，取1.9～2.1g，加入5～15％醋酸水溶液50ml，超声提取20～40分钟，放冷，用5～15％醋酸水溶液补足减失的重量，离心，吸取上清液25ml，用醋酸乙酯萃取2～4次，每次10～30ml，合并醋酸乙酯液，减压回收溶剂，残渣加甲醇使溶解并定容至10ml，摇匀，在避光条件下，过微孔滤膜，即得；

b)对照品溶液的制备：取阿魏酸对照品适量，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1ml含10～20μg的溶液，即得；

c)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，即得；

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为26～30∶70～74的甲醇-质量百分比浓度为0.05～0.1％的磷酸水为流动相；检测波长为321nm；理论板数按阿魏酸峰计算应不低于2000。

该方法中含量测定方法具体包括以下步骤：

a)供试品溶液的制备：取活血止痛胶囊内容物，研细，取2.0g，加入10％醋酸水溶液50ml，超声提取30分钟，放冷，用10％醋酸水溶液补足减失的重量，离心，吸取上清液25ml，用醋酸乙酯萃取3次，每次20ml，合并醋酸乙酯液，减压回收溶剂，残渣加甲醇使溶解并定容至10ml，摇匀，在避光条件下，过0.45um微孔滤膜，即得；

c)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10～20ul，注入液相色谱仪，测定，即得；

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为28∶72的甲醇-0.085％磷酸水为流动相；检测波长为321nm；理论板数按阿魏酸峰计算应不低于2000；活血止痛胶囊内容物含当归以阿魏酸计，质量百分含量不得少于0.01％。

所述的鉴别方法中，包括乳香鉴别、三七鉴别、冰片鉴别，具体步骤如下：

a、以乳香对照药材为对照，薄层条件为薄层G板，采用体积比为15～25∶1～3，沸点为30～60℃的石油醚和醋酸乙酯混合溶液为展开剂，10％的硫酸乙醇溶液为显色剂，105℃加热至斑点显色；

b、以三七对照药材为对照，薄层条件为硅胶G薄层板，采用体积比为2～6∶1∶3～8的正丁醇-醋酸乙酯-水混合溶液的上层溶液为展开剂，10％硫酸乙醇溶液为显色剂，105℃加热至斑点显色；

c、以冰片对照药材为对照，薄层条件为硅胶G薄层板，采用体积比为15～25∶1～3，沸点为30～60℃的石油醚和乙酸乙酯混合溶液为展开剂，5％香草醛硫酸溶液为显色剂，在105℃加热至斑点显色。

乳香鉴别方法具体包括以下步骤：

取活血止痛胶囊内容物0.2～0.5g，研细，加乙醚10～40ml，超声处理5～15分钟，滤过，滤液浓缩至1～5ml，作为供试品溶液。另取乳香对照药材0.3～0.8g，同法制成对照药材溶液，照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各1～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为19∶2沸点为30～60℃的石油醚-醋酸乙酯混合溶液为展开剂，展开，展距为6～10cm，取出，晾干，喷以10％的硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

三七鉴别方法具体包括以下步骤：

取活血止痛胶囊内容物0.2～0.5g，研细，加乙醚20～60ml，超声处理5～15分钟，滤过，药渣挥去乙醚，加甲醇20～40ml，超声处理10～20分钟，滤过，滤液蒸干，加水5～20ml溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取2～3次，每次10～20ml，合并正丁醇液，用水洗涤2～3次，每次5～20ml，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；另取三七对照药材1～3g，加甲醇10～50ml，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各1～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为4∶1∶5的正丁醇-醋酸乙酯-水溶液的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

冰片鉴别方法具体包括以下步骤：

取活血止痛胶囊内容物0.5～1.5g，加沸点为30～60℃石油醚5～30ml，超声处理2～5分钟，滤过，滤液挥散至1～5ml，作为供试品溶液，另取冰片对照品，加沸点为30～60℃石油醚制成每1ml含1～5mg的溶液，作为对照品溶液，照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各1～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为19∶2，沸点为30～60℃石油醚-醋酸乙酯混合溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

该检测方法还可包括土鳖虫的分子鉴定，包括(1)活血止痛胶囊中土鳖虫基因组DNA的提取纯化步骤；(2)PCR扩增土鳖虫16SrRNA步骤；(3)扩增产物电泳鉴定和/或测序鉴定步骤；其特征在于：

1)所述的活血止痛胶囊中土鳖虫基因组DNA的提取纯化步骤采用改良蛋白酶K结合吸附柱法：先利用传统的蛋白酶K法初步提取活血止痛胶囊基因组DNA，然后加等体积的饱和酚∶三氯甲烷∶异戊醇抽提至水层与酚层中间无蛋白层，上清加等体积的三氯甲烷∶异戊醇抽提，所得上清转移至胶回收试剂盒的吸附柱中按照传统的吸附柱法纯化DNA；

2)所述的PCR扩增土鳖虫16SrRNA步骤是利用引物16Sra：SEQ ID NO.1和16Srb：SEQ ID NO.2对步骤1)提取纯化的活血止痛胶囊基因组DNA进行扩增；

3)所述的扩增产物电泳鉴定步骤是将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如果能扩增出420bp左右的条带则表示活血止痛胶囊中含有土鳖虫组分。

所述的活血止痛胶囊中土鳖虫基因组DNA的提取具体步骤为：取活血止痛胶囊内容物加匀浆缓冲液，50～60℃水浴4～6h，水浴结束后，冷至室温，加等体积的体积比为25∶24∶1的饱和酚∶三氯甲烷∶异戊醇抽提至水层与酚层中间无蛋白层，上清加等体积的体积比为24∶1的三氯甲烷∶异戊醇抽提一次，上清转移至常规胶回收试剂盒的吸附柱中，按照说明书记载的方法获得纯化的活血止痛胶囊中土鳖虫基因组DNA溶液。

所述的匀浆缓冲液组成：由8份A液，1份B液，1份C液组成，其中A液：pH8.0的Tris 0.05mol·L^-1，NaCl 0.1mol·L^-1，pH8.0的EDTA 0.1mol·L^-1；B液：5％SDS；C液：2mg/mL蛋白酶K；所述的PCR扩增体系为：总体积25μL，10mmol/L dNTPs 2μL，10×Taqbuffer 2.5μL，Taq酶0.6U，5μmol/L引物16Sra和16Srb各1μL，步骤(1)提取纯化的活血止痛胶囊基因组DNA溶液1μL，双蒸水补足体积至25μL，最后加10μL矿物油；反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃复性1min，72℃延伸90s，35个循环后再72℃延伸10min。

与现有技术比较本发明的有益效果：本发明质量控制方法分离效率高、稳定性好、分析速度快，是控制活血止痛胶囊质量可靠的方法，为活血止痛胶囊成品的质量控制建立了一个准确可行的控制标准。将现有标准进行了显著的提升。本发明通过以下试验例进行具体阐述。

试验例1.含量测定方法参数选择实验

活血止痛胶囊中当归为方中君药，其中阿魏酸为其主要活性成分，阿魏酸的结构式如下：

阿魏酸(Ferulic acid)

分子式：C₁₀H₁₀O₄分子量：194.18熔点：174℃

1、仪器与试药：高效液相色谱仪：岛津LC-20AB型高效液相色谱仪；色谱软件系统：岛津LCsolution色谱数据工作站；检测器：SPD检测器。对照品：阿魏酸(中国药品生物制品检定所，供含量测定用，批号：0773-9910)活血止痛胶囊：处方：当归222.2g，三七44.4g，乳香(制)44.4g，冰片11.1g，土鳖虫111.1g，自然铜(煅)66.7g。制法：以上六味，除冰片外，其余当归等五味粉碎成细粉；将冰片研细，与上述粉末配制，过筛，混匀，装胶囊，制成1000粒(0.5g/粒)，即得。批号090601、090602、090603。

2、HPLC条件选择

(1)流动相选择

固定流动相流速为1.0mL/min，柱温为35℃，色谱柱为HYPERSILODS(4.6×200mm，10μm)，汉邦公司，比较不同的系统作为流动相，由实验结果可知，当流动相为甲醇-0.085％磷酸水(28∶72)，保留时间短，分离效果较好。结果见表1、图1-A和图1-B。

表1流动相比例考察结果

发明人尝试甲醇-质量百分比浓度为0.05～0.1％的磷酸水(26～30∶70～74)，此条件下，阿魏酸与其它组分可达到基线分离。根据出峰时间和分离效果优选甲醇-0.085％磷酸水(28∶72)作为流动相，阿魏酸与其它组分达到充分的基线分离。

(2)样品预处理

根据阿魏酸的性质，分别选用不同处理方法对样品进行处理，确定提取方法。试验结果见表2。

表2提取溶剂的确定试验

(3)样品溶液制备方法

取内容物适量，研细，取粉末约1.0g，精密称定，置具塞三角烧瓶中，精密加入10％醋酸水溶液25ml，称定重量，超声提取30分钟，放冷，用10％醋酸水溶液补足减失的重量，滤过，滤渣用少量10％醋酸水溶液洗涤，合并洗涤液及滤液，用醋酸乙酯萃取3次，每次20ml，合并醋酸乙酯液，减压回收溶剂，残渣用甲醇10ml使溶解，摇匀，过0.45um微孔滤膜即得(避光操作)。

(4)专属性考察

取缺当归的处方药材，制成阴性样品，并按照样品溶液制备方法制备阴性样品溶液。精密吸取上述溶液10μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定。结果：在阿魏酸出峰时间处无吸收峰出现，即阴性样品无干扰。

(5)线性关系的考察

精密吸取浓度为103.40ug/ml的对照品储备液0.10、0.25、0.50、1.00、2.00ml置5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得对照品溶液，浓度分别为2.068ug/ml、5.170ug/ml、10.340ug/ml、20.680ug/ml、41.360ug/ml。精密吸取上述对照品溶液10μl注入液相色谱仪，测定。以峰面积值为纵坐标(Y)，以进样浓度为横坐标(X)，绘制标准曲线，经统计学计算，得其线性回归方程为Y＝53321*X-17826，相关系数γ＝0.9999，线性范围为2.068μg/ml-41.360ug/ml。见图2。

(6)精密度试验

精密吸取对照品溶液(10.340ug/ml)10μl，连续进样6次，计算得平均峰面积值为538688.5，其RSD值为0.7％。

(7)重复性试验

取活血止痛胶囊10粒，研细，取粉末约1.0g，6份，精密称定，按“供试品溶液的制备”项下方法依法制备，每份连续进样2次，每次10μl。其RSD值为1.74％，符合试验要求。

(8)稳定性试验

取活血止痛胶囊(批号：090601)10粒，研细，取粉末约1.0g，精密称定，按“供试品溶液的制备”项下方法依法制备，每隔2.5小时进行测定，进样10μl，共计进样5次，测定其稳定性。其RSD值为1.47％，表明样品溶液在12.5小时内稳定。

(9)回收率试验：采用加样回收法

精密称定已知阿魏酸含量的活血止痛胶囊，添加一定量(样品中阿魏酸的80％，100％，120％)的阿魏酸对照品溶液，每个浓度的样品各三份，共9份，按照实施例4所述“供试品溶液的制备”方法依法制备加样样品溶液。按实施例4所述色谱条件，每份连续进样2次，每次10μl。结果表明，本法具有良好的加样回收率，平均回收率为97.2％，RSD为1.17％。结果见表3。

表3加样回收率试验数据表

结果表明，本法具有良好的加样回收率，可用于阿魏酸的含量测定。

(10)样品含量测定

分别取不同批号(090601、090602、090603)的活血止痛胶囊10粒，研细，取粉末适量(约1.0g)，精密称定，按实施例4方法依法制备供试品，按实施例4色谱条件测定。含量测定结果见表4。

表4含量测定试验数据表

由以上试验可见，该方法准确度较高，可用于阿魏酸的含量测定。三批样品阿魏酸平均含量为70.6ug/粒，考虑到生产过程中药材的来源不同，阿魏酸含量的变化，在此基础上下浮30％，为49.42μg/粒，故将成品含量限度确定为：活血止痛胶囊内容物含当归以阿魏酸(C₁₀H₁₀O₄)计，质量百分含量不得少于0.01％。

试验例2：活血止痛胶囊乳香鉴别方法条件的选择：

取本品内容物2.5g，研细，加乙醚30ml，超声处理10分钟，滤过，滤液浓缩至1ml，作为供试品溶液。同时按活血止痛胶囊生产工艺制成缺乳香药材的阴性样品，按上述处理方法制成缺乳香药材的阴性样品溶液。另取乳香对照药材(中国药品生物制品检定所，批号：120970-200403)0.5g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液及阴性样品溶液各2μl，对照药材溶液1μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(30～60℃)-醋酸乙酯(15～25∶1～3)为展开剂，展开，展距为8cm，取出，晾干，喷以10％的硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，而阴性样品在与对照药材色谱相应的位置上无斑点。

以上试验是方中乳香的鉴别试验。是以乳香对照药材为对照的，试验结果表明，该薄层鉴别法适用于乳香药材的鉴别，故增加其作为成品的薄层鉴别，列入质量标准正文。试验过程中我们进行了一些具体的方法摸索，结果见表5。薄层色谱图见图3。

表5乳香的薄层色谱条件选择

附图说明

图1为流动相确定图谱

图中，图1-A为阿魏酸对照品HPLC图谱图1-B为活血止痛胶囊供试品HPLC图谱

图2线性关系图

图3活血止痛胶囊中乳香薄层鉴别图

图中，1：阴性，2：活血止痛胶囊，批号090601，3：活血止痛胶囊，批号090602，4：活血止痛胶囊，批号090603，5：乳香对照药材

图4活血止痛胶囊中三七薄层鉴别图

图中，1：三七对照药材，2：活血止痛胶囊，批号090601，3：活血止痛胶囊，批号090602，4：活血止痛胶囊，批号090603，5：阴性对照

图5活血止痛胶囊中冰片薄层鉴别图

图中，1：冰片对照药材，2：活血止痛胶囊，批号090601，3：活血止痛胶囊，批号090602，4：活血止痛胶囊，批号090603，5：阴性

图6土鳖虫基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图

图中，M：15kb DNAMarker；1：土鳖虫；2：活血止痛胶囊；3：缺土鳖虫的活血止痛胶囊阴性对照。

图7实施例5中各样品16SrRNA扩增PCR产物琼脂糖凝胶电泳图

图中，M：2kb DNAMarker；1：土鳖虫；2：活血止痛胶囊；3：缺土鳖虫的活血止痛胶囊阴性对照。

具体实施方式

所使用的乳香对照药材、当归对照药材、三七对照药材、冰片对照药材、阿魏酸均来自于中国药品生物制品检定所。活血止痛胶囊：处方：当归222.2g，三七44.4g，乳香(制)44.4g，冰片11.1g，土鳖虫111.1g，自然铜(煅)66.7g。制法：以上六味，除冰片外，其余当归等五味粉碎成细粉；将冰片研细，与上述粉末配制，过筛，混匀，装胶囊，制成1000粒(0.5g/粒)；或者装胶囊，制成2000粒(0.25g/粒)。即得。

实施例1乳香的TLC鉴别

取本品内容物2.5g，研细，加乙醚30ml，超声处理10分钟，滤过，滤液浓缩至1ml，作为供试品溶液。同时按活血止痛胶囊制法制成缺乳香药材的阴性样品，按上述处理方法制成缺乳香药材的阴性样品溶液。另取乳香对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液及阴性样品溶液各2μl，对照药材溶液1μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(30～60℃)-醋酸乙酯(19∶2)为展开剂，展开，展距为8cm，取出，晾干，喷以10％的硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，而阴性样品在与对照药材色谱相应的位置上无斑点。该薄层鉴别法适用于乳香药材的鉴别，见图3。

实施例2三七的TLC鉴别

取本品内容物2.5g，研细，加乙醚40ml，超声处理10分钟，滤过，药渣挥去乙醚，加甲醇30ml，超声处理15分钟，滤过，滤液蒸干，加水10ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次15ml，合并正丁醇液，用水洗涤两次，每次10ml，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。同时按活血止痛胶囊制法制成缺三七药材的阴性样品，按上述处理方法制成缺三七药材的阴性样品溶液。另取三七对照药材1g，加甲醇30ml，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VI B)试验，吸取上述三种溶液各1μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-醋酸乙酯-水(4∶1∶5)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，而阴性样品在与对照药材色谱相应的位置上无斑点。该薄层鉴别法适用于三七药材的鉴别，见图4。

实施例3冰片的TLC鉴别

取本品内容物1.0g，加石油醚(30～60℃)15ml，超声处理2～3分钟，滤过，滤液挥散至1ml，作为供试品溶液。同时按活血止痛胶囊制法制成缺冰片药材的样品，按上述处理方法制成缺冰片药材的阴性样品溶液。另取冰片对照品，加石油醚(30～60℃)制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VI B)试验，吸取上述三种溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以加石油醚(30～60℃)-醋酸乙酯(19∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，而阴性样品在与对照品色谱相应的位置上无斑点。该薄层鉴别法适用于冰片药材的鉴别，见图5。

实施例4含量测定

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为28∶72的甲醇-0.085％磷酸水为流动相；检测波长为321nm；理论板数按阿魏酸峰计算应不低于2000；

对照品溶液的制备：取阿魏酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1ml含10～20μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取活血止痛胶囊内容物适量，研细，取2.0g，精密称定，精密加入10％醋酸水溶液50ml，称定重量，超声提取30分钟，放冷，用10％醋酸水溶液补足减失的重量，离心，精密吸取上清液25ml，用醋酸乙酯萃取3次，每次20ml，合并醋酸乙酯液，减压回收溶剂，残渣加甲醇使溶解并定容至10ml，摇匀，在避光条件下，过0.45um微孔滤膜，即得；

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

活血止痛胶囊每粒内容物含当归以阿魏酸计，质量百分含量不少于0.01％。

实施例5

活血止痛胶囊中土鳖虫基因组DNA提取方法：取活血止痛胶囊内容物适量(约0.1g，研磨移入2mL离心管中不超过0.5刻度)，放入研钵，加匀浆缓冲液研磨至成糊状，转入2mL离心管，补加匀浆缓冲液至1mL，混匀。58℃水浴5h，期间每隔半小时轻轻颠倒混匀。水浴结束后，冷至室温。加等体积的饱和酚∶三氯甲烷∶异戊醇(25∶24∶1)，缓慢颠倒混匀，8000r/min离心10min，上清转移至新离心管中。重复该步抽提至水层与酚层中间无蛋白层。上清加等体积的三氯甲烷∶异戊醇(24∶1)，缓慢颠倒混匀，8000r/min离心10min。上清转移至胶回收试剂盒(琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，爱思进生物技术(杭州)有限公司)的吸附柱中，静置3min使充分吸附，12000r/min离心1min，弃滤液。按试剂盒说明书，依次用buffer W1、W2洗涤DNA。将吸附柱置37℃烘箱挥干乙醇，置1.5mL离心管中，加20μL无菌水，静置1min，充分洗脱DNA，12000r/min离心1min，弃吸附柱，即得纯化的活血止痛胶囊中土鳖虫基因组DNA溶液，-20℃保存。

其中土鳖虫是以95％乙醇浸泡3-5min致死，晒干或烘干后入药。

匀浆缓冲液组成：由8份A液，1份B液，1份C液组成(用时新鲜配制)。A液：Tris(pH8.0)0.05mol·L^-1，NaCl 0.1mol·L^-1，EDTA(pH8.0)0.1mol·L^-1；B液：5％SDS；C液：2mg/mL蛋白酶K。

取土鳖虫药材、活血止痛胶囊及缺土鳖虫的活血止痛胶囊阴性对照按照上述方法提取土鳖虫基因组DNA，所得土鳖虫基因组DNA溶液进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果见图6。由图6可见：本发明基因组DNA提取方法可从土鳖虫药材与活血止痛胶囊中成功提取到土鳖虫基因组DNA。

以16Sra(SEQ ID NO.1)和16Srb(SEQ ID NO.2)为引物，分别以上述从土鳖虫药材、活血止痛胶囊及缺土鳖虫的活血止痛胶囊阴性对照中提取的土鳖虫基因组DNA为模板，PCR扩增土鳖虫的16S rRNA。PCR扩增体系为：总体积25μL，dNTPs(10mmol/L)2μL，10*Taq buffer(含Mg²⁺)2.5μL，Taq酶0.6U，引物(5μmol/L)各1μL，DNA模板1μL，双蒸水补足体积，最后加10μL矿物油。反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃复性1min，72℃延伸90s，35个循环后再72℃延伸10min。

PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图7。图7显示从土鳖虫药材及活血止痛胶囊中均能成功获得420bp左右的目的条带，而缺土鳖虫的活血止痛胶囊阴性对照则不能扩增出相应条带。可见本发明方法可用于活血止痛胶囊中土鳖虫的鉴定，还可用于土鳖虫药材的鉴定。

Claims

1.一种活血止痛胶囊的质量检测方法，其特征在于该检测方法包括鉴别及含量测定，其中含量测定方法包括以下步骤：

a)供试品溶液的制备：取活血止痛胶囊内容物，研细，取1.9～2.1g，加入5～15%醋酸水溶液50ml，超声提取20～40分钟，放冷，用5～15%醋酸水溶液补足减失的重量，离心，吸取上清液25ml，用醋酸乙酯萃取2～4次，每次10～30ml，合并醋酸乙酯液，减压回收溶剂，残渣加甲醇使溶解并定容至10ml，摇匀，在避光条件下，过微孔滤膜，即得；

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为26～30：70～74的甲醇-质量百分比浓度为0.05～0.1%的磷酸水为流动相；检测波长为321nm；理论板数按阿魏酸峰计算应不低于2000；

乳香鉴别、三七鉴别、冰片鉴别，具体步骤如下：

a、以乳香对照药材为对照，薄层条件为薄层G板，采用体积比为15～25：1～3，沸点为30～60℃的石油醚和醋酸乙酯混合溶液为展开剂，10%的硫酸乙醇溶液为显色剂，105℃加热至斑点显色；

b、以三七对照药材为对照，薄层条件为硅胶G薄层板，采用体积比为2～6：1：3～8的正丁醇-醋酸乙酯-水混合溶液的上层溶液为展开剂，10%硫酸乙醇溶液为显色剂，105℃加热至斑点显色；

c、以冰片对照药材为对照，薄层条件为硅胶G薄层板，采用体积比为15～25：1～3，沸点为30～60℃的石油醚和乙酸乙酯混合溶液为展开剂，5%香草醛硫酸溶液为显色剂，在105℃加热至斑点显色；

土鳖虫的分子鉴定，包括（1）活血止痛胶囊中土鳖虫基因组DNA的提取纯化步骤；（2）PCR扩增土鳖虫16SrRNA步骤；（3）扩增产物电泳鉴定和/或测序鉴定步骤；

具体为：

1）活血止痛胶囊中土鳖虫基因组DNA的提取纯化步骤采用改良蛋白酶K结合吸附柱法：先利用传统的蛋白酶K法初步提取活血止痛胶囊基因组DNA，然后加等体积的饱和酚∶三氯甲烷∶异戊醇抽提至水层与酚层中间无蛋白层，上清加等体积的三氯甲烷：异戊醇抽提，所得上清转移至胶回收试剂盒的吸附柱中按照传统的吸附柱法纯化DNA；

2）PCR扩增土鳖虫16SrRNA步骤是利用引物16Sra：SEQ ID NO.1和16Srb：SEQ ID NO.2对步骤1）提取纯化的活血止痛胶囊基因组DNA进行扩增；

3）扩增产物电泳鉴定步骤是将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如果能扩增出420 bp左右的条带则表示活血止痛胶囊中含有土鳖虫组分。

2.根据权利要求1所述的活血止痛胶囊的质量检测方法，其特征在于该方法中含量测定方法具体包括以下步骤：

a)供试品溶液的制备：取活血止痛胶囊内容物，研细，取2.0g，加入10%醋酸水溶液50ml，超声提取30分钟，放冷，用10%醋酸水溶液补足减失的重量，离心，吸取上清液25ml，用醋酸乙酯萃取3次，每次20ml，合并醋酸乙酯液，减压回收溶剂，残渣加甲醇使溶解并定容至10ml，摇匀，在避光条件下，过0.45um微孔滤膜，即得；

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为28：72的甲醇-0.085%磷酸水为流动相；检测波长为321nm；理论板数按阿魏酸峰计算应不低于2000。

3.根据权利要求1或2所述的质量检测方法，其特征在于含量测定方法中，活血止痛胶囊内容物含当归以阿魏酸计，质量百分含量不得少于0.01%。

4.根据权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于乳香鉴别方法具体包括以下步骤：

取活血止痛胶囊内容物0.2～0.5g，研细，加乙醚10～40ml，超声处理5～15分钟，滤过，滤液浓缩至1～5ml，作为供试品溶液；另取乳香对照药材0.3～0.8g，同法制成对照药材溶液，照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各1～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为19：2沸点为30～60℃的石油醚-醋酸乙酯混合溶液为展开剂，展开，展距为6～10cm，取出，晾干，喷以10%的硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

5.根据权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于三七鉴别方法具体包括以下步骤：

取活血止痛胶囊内容物0.2～0.5g，研细，加乙醚20～60ml，超声处理5～15分钟，滤过，药渣挥去乙醚，加甲醇20～40ml，超声处理10～20分钟，滤过，滤液蒸干，加水5～20ml溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取2～3次，每次10～20ml，合并正丁醇液，用水洗涤2～3次，每次5～20ml，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；另取三七对照药材1～3g，加甲醇10～50ml，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各1～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为4：1：5的正丁醇-醋酸乙酯-水溶液的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

6.根据权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于冰片鉴别方法具体包括以下步骤：

取活血止痛胶囊内容物0.5～1.5g，加沸点为30～60℃石油醚5～30ml，超声处理2～5分钟，滤过，滤液挥散至1～5ml，作为供试品溶液，另取冰片对照品，加沸点为30～60℃石油醚制成每1ml含1～5mg的溶液，作为对照品溶液，照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各1～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为19：2，沸点为30～60℃石油醚－醋酸乙酯混合溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

7.根据权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于采用的PCR扩增体系为：总体积25 μL，10 mmol/L dNTPs 2 μL，10 ×Taqbuffer 2.5 μL，Taq酶 0.6 U，5 μmol/L引物16Sra和16Srb各1 μL，步骤1）提取纯化的活血止痛胶囊基因组DNA溶液1 μL，双蒸水补足体积至25μL，最后加10 μL矿物油；反应程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，50 ℃复性1 min，72 ℃延伸90 s，35个循环后再72 ℃延伸10 min。

8.根据权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于所述的活血止痛胶囊中土鳖虫基因组DNA的提取具体步骤为：取活血止痛胶囊内容物加匀浆缓冲液，50~60 ℃水浴4~6h，水浴结束后，冷至室温，加等体积的体积比为25∶24∶1的饱和酚∶三氯甲烷∶异戊醇抽提至水层与酚层中间无蛋白层，上清加等体积的体积比为24∶1的三氯甲烷：异戊醇抽提一次，上清转移至常规胶回收试剂盒的吸附柱中，按照试剂盒说明书记载的方法获得纯化的活血止痛胶囊中土鳖虫基因组DNA溶液。

9.根据权利要求8所述的质量检测方法，其特征在于所述的匀浆缓冲液组成：由8份A液，1份B液，1份C液组成，其中A液：pH8.0的Tris 0.05 mol·L^-1, NaCl 0.1 mol·L^-1, pH8.0的EDTA 0.1 mol·L^-1；B液：5% SDS；C液：2 mg/mL 蛋白酶K。