CN102286595A - 一种短刺小克银汉霉转化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种短刺小克银汉霉转化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法,包括:向灭菌过的培养液中接入短刺小克银汉霉(Cunninghamella blakesleeana)AS 3.910,得到预培养体系,再加入白桦脂醇溶液和表面活性剂,使白桦脂醇的浓度达到0.01~0.1g/L,于25~30℃转化反应2~6天得到转化液,经分离纯化得到白桦脂酸。本发明方法利用短刺小克银汉霉为载体,以白桦脂醇为底物生物转化合成白桦脂酸,工艺简单,条件温和,转化周期短,产物得率高,环境友好,能获得较高得率的白桦脂酸。
Description
技术领域
本发明属于生物工程和微生物发酵领域,尤其涉及一种短刺小克银汉霉转化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法。
背景技术
最近30~50年中,癌症治疗主要依赖于放疗和化疗,这些治疗方式在抑制癌细胞的同时也损伤了正常的细胞,所以寻找对正常细胞无副作用的癌症治疗药物有非常重要的意义。研究表明,白桦脂醇及其衍生物具有这种潜在的能力,特别是白桦脂酸,在癌症治疗方面表现出巨大的潜能,有实验表明其对小鼠恶性肿瘤有良好的抑制作用,而对正常细胞的毒性却极低,是最有潜力的新型药物制剂,相关研究已成为近年来天然有机药物研究的热点。
微生物转化是指利用微生物代谢过程中某个酶或酶系,对底物进行结构改造或修饰,转化为相关产物的过程。微生物转化反应范围广,几乎包括了所有的有机化学反应类型,如氧化反应、还原反应、水解反应、缩合反应等。微生物转化步骤少,副反应少,周期短,而且往往具有专一性和选择性。目前,制备白桦脂酸主要通过直接提取法或化学合成法,均存在一定的缺陷,而通过微生物转化法合成白桦脂酸目前研究甚少。
公告号为CN101457250B的发明专利公开了一种微生物细胞生物转化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法,包括:向灭菌过的培养液中接入黄绿蜜环菌ZJUQH,得到预反应体系;再加入含有白桦脂醇的底物溶液,于25~30℃转化反应5~7天得到转化后的培养液,经后处理得到白桦脂酸,其中白桦脂醇加入量以每升培养液计为0.01~0.1g。该专利方法白桦脂酸产率仍较低,转化反应时间较长,附加产物较多,且由于转化机理不明确,后续很难进一步提高白桦脂酸产率。
细胞色素P450酶系是一类含高铁血红素的蛋白,在生物界中广泛存在。作为一种末端氧化酶,细胞色素P450主要催化机体内源和外源性物质在体内的氧化反应,参与大部分药物的氧化代谢和杀虫剂、除草剂等外源物的解毒,以及固醇类、萜类、黄酮类等次级天然产物的生物合成,在医学和药学领域受到广泛关注。真菌,尤其是丝状真菌对许多药物的转化反应都是由细胞色素P450酶介导的,通过使用一些经典的细胞色素P450酶抑制剂,如SKF525A,美替拉酮(metyrapone)或CO等对转化反应的抑制作用已经间接证明了细胞色素P450酶参与了转化反应。与哺乳动物类似,真菌的细胞色素P450酶也是结合在内质网膜上。
Cunninghammella Matruchot是一类丝状真菌,根据形态及生理特性分为5个种:刺孢(短刺)小克银汉霉(C.echinulata(Thaxt.)Thaxter)、班氏小克银汉霉(C.bainieri N.Naumov=C.japonica(Saito)Ito)、布氏小克银汉霉(C.blakesleeana Lendner=C.verticillata Paine)、巴西果小克银汉霉(C.bertholletial Stadel)、绮丽(雅致)小克银汉霉(C.elegans Lender)。小克银汉霉菌属的许多菌株具有与人体类似的I相和II相药物代谢酶,在模拟人体的药物代谢研究方面得到广泛的应用。黄海华等选用短刺小克银汉霉菌AS 3.153对普萘洛尔进行了芳环氧化试验,结果显示该菌株具有良好的选择性氧化能力,主要形成5-羟基普萘洛尔,转化48h产率达76%左右,证明该菌体中存在与药物代谢有关的氧化酶(黄海华,陈笑艳,崔红霞等.采用微生物转化法合成5-羟基普萘洛尔.药物生物技术,2001,8(5):268-271.)。钟大放等以小克银汉霉菌CunninghamellaAS 3.910为转化株,对SFZ-47进行了代谢转化,通过改变转化条件获得了多种类、高产率的代谢物(钟大放,王英等.小克银汉霉菌对SFZ-47的代谢转化.Pharmaceutical Biotechnology 1997,4(3):158-163.)。其中,短刺小克银汉霉是一种常用的微生物转化菌,被称为“药物代谢载体”,其具有与哺乳动物药物代谢酶功能相似的细胞色素P450同工酶和其他与药物代谢有关的酶系,可进行某些I相和II相药物代谢反应,经过I相代谢反应包括氧化、还原、水解等,药物能产生羧基、羟基、氨基等基团,改变原有基团或增加新的基团,使底物的生物活性改变包括药用功能的活化。
发明内容
本发明提供了一种短刺小克银汉霉转化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法,以植物中来源丰富的白桦脂醇为底物,利用短刺小克银汉霉生物转化合成白桦脂酸,工艺简单,转化条件温和,转化时间短,产物得率高,安全性高。
一种短刺小克银汉霉转化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法,包括:
(1)向培养液中接入短刺小克银汉霉(Cunninghamella blakesleeana)AS 3.910,得到预培养体系;
(2)向步骤(1)得到的预培养体系中加入白桦脂醇溶液,使白桦脂醇的浓度达到0.01~0.1g/L,于25~30℃转化反应2~6天得到转化液;
(3)所述的转化液经分离纯化得到白桦脂酸。
所述的短刺小克银汉霉AS 3.910购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),菌株编号为3.910。
步骤(1)中,为获得预培养体系可采用直接生长转化法或静息细胞转化法。
采用直接生长转化法时:
所述的步骤(1)为:向生长培养基中接入短刺小克银汉霉AS 3.910孢子悬浮液,于25~30℃培养1~3天得到预培养体系。
优选地,以体积1L计,所述的生长培养基包括:葡萄糖0~40g,酵母膏1~5g,蛋白胨2~5g,磷酸氢二钾1~5g,生长培养基的pH为6.0~7.0。更优选地,以体积1L计,所述的生长培养基包括:葡萄糖40g,酵母膏5g,蛋白胨5g,磷酸氢二钾5g,生长培养基的pH为6.5。
优选地,所述的短刺小克银汉霉AS 3.910孢子悬浮液的接入量以每升生长培养基计为10~50mL,更优选为20mL。其中,所述的短刺小克银汉霉AS 3.910孢子悬浮液中短刺小克银汉霉AS 3.910的孢子浓度优选为1×106~1×108个/毫升。
所述的短刺小克银汉霉AS 3.910孢子悬浮液的制备可以采用如下方法:将在4℃下保藏的短刺小克银汉霉AS 3.910接种于马铃薯琼脂斜面培养基上,于25~30℃活化培养5~6天,菌株活化后用接种针刮入无菌水中,振荡制得短刺小克银汉霉AS 3.910孢子悬浮液。
优选地,所述的生长培养基接种后的培养温度为28℃,培养时间为2天。
采用静息细胞转化法时:
所述的步骤(1)为:向含有葡萄糖的磷酸缓冲溶液中接入短刺小克银汉霉AS 3.910湿细胞,得到预培养体系。
优选地,所述的磷酸缓冲溶液的pH为6,磷酸缓冲溶液中葡萄糖的质量百分比溶度为1~3%。所述的磷酸缓冲溶液采用本领域常规配制方法进行配制即可。
优选地,所述的短刺小克银汉霉AS 3.910湿细胞的接入量以每升磷酸缓冲溶液计为100~250g。
所述的短刺小克银汉霉AS 3.910湿细胞的制备可以采用如下方法:取短刺小克银汉霉AS 3.910孢子悬浮液加入生长培养基中,于25~30℃、转速160~200rpm的摇床中培养2~3天后停止培养,通过冷冻离心或无菌过滤的方法除去培养液,得到短刺小克银汉霉AS 3.910湿细胞。其中,短刺小克银汉霉AS 3.910孢子悬浮液的制备方法、生长培养基的成分可以与上述直接生长转化法中的相同。
步骤(2)中,所述的白桦脂醇可以为市售商品或自制产品,纯度为90%以上。CN101328201A的发明专利申请公开了一种从桦树皮中提取白桦脂醇的方法,能得到纯度90%左右的白桦脂醇,本发明可采用该方法制备白桦脂醇作为本发明的底物,不但能降低成本、综合利用资源,而且更能为工业化生产提供参考。
优选地,所述的白桦脂醇溶液为白桦脂醇浓度达到7~9mg/mL的二甲基亚砜溶液,即该溶液的溶剂为二甲基亚砜。二甲基亚砜属于极性非质子溶剂,可与多种有机溶剂或水互溶,对某些反应具有加速、催化等作用。底物白桦脂醇微溶于水,以二甲基亚砜作为溶剂能提高白桦脂醇在水相培养液中的溶解性,同时也更有利于细胞与底物的接触。
优选地,所述的白桦脂醇在预培养体系中的浓度为0.03g/L。此添加量下,能确保所加入的二甲基亚砜和白桦脂醇不会影响水相培养液中菌体细胞的催化活性。
优选地,所述的预培养体系中还加有体积百分比浓度为0.1~1.0%的表面活性剂;更优选地,所述的表面活性剂为吐温80,吐温80在所述的预培养体系中的体积百分比浓度为0.1%。表面活性剂能降低两种液体间的界面张力,提高有机相在水相中的可溶性。本发明在添加底物的同时添加低浓度的吐温80,更有利于底物白桦脂醇在预培养体系中的分散和溶解,提高微生物细胞与底物之间的接触。
优选地,所述的转化反应温度为28℃,转化反应时间为4天,该条件下进行转化反应最有利于微生物细胞的生长和产物的积累。
所述的预培养体系中加入白桦脂醇溶液后,可以置于摇床中进行转化反应,摇床转速优选为120~200rpm,更优选为180rpm,这样更有利于细胞的分散及其与底物的充分接触。
步骤(3)中,所述的分离纯化包括:转化液经离心取上清液,调节上清液pH至3~4,用乙酸乙酯萃取,萃取液经浓缩得到白桦脂酸。采用萃取法能从转化液中有效分离出白桦脂酸产物,操作简单方便;所得到的白桦脂酸可根据需要进一步提纯。
调节上清液的pH可采用常用的酸或碱,如盐酸、氢氧化钠等。
传统化学合成法中,白桦脂酸可由白桦脂醇经几步氧化、还原反应制得。本发明利用短刺小克银汉霉为载体,以桦树皮中提取获得的白桦脂醇为底物,通过直接生长转化法或静息细胞转化法催化合成白桦脂酸,具有比较清晰的作用机理,是一种机理清晰、转化路线简单且具有可操作性的转化方式和体系。本发明工艺简单,条件温和,便于控制,转化周期短,且环境友好,能获得较高得率的白桦脂酸。同时,针对本发明所用的短刺小克银汉霉,后续可深入研究相关催化转化机理,以便进一步提高白桦脂酸的转化得率。
附图说明
图1为本发明方法的流程示意图。
具体实施方式
实施例1采用直接生长转化法转化白桦脂醇合成白桦脂酸
(1)短刺小克银汉霉AS 3.910孢子悬浮液的制备:将在4℃下保藏的短刺小克银汉霉AS 3.910(购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)接种于马铃薯琼脂斜面培养基上,于28℃活化培养6天;在超净台上,将活化后的短刺小克银汉霉AS 3.910用接种针刮入装有100mL无菌水和若干个玻璃珠的锥形瓶中,振荡制得短刺小克银汉霉AS 3.910孢子悬浮液,其中短刺小克银汉霉AS 3.910的孢子浓度为1×106个/毫升。
(2)预培养体系的制备:取葡萄糖20g,酵母膏5g,蛋白胨5g,磷酸氢二钾5g,加入1000mL水中,加热混匀,调pH至6.5,获得生长培养基,分装于锥形瓶,使每个锥形瓶含30mL生长培养基;向30mL生长培养基中接入1mL短刺小克银汉霉AS 3.910孢子悬浮液,于28℃、转速180rpm的摇床中培养2天得到预培养体系。
(3)转化合成白桦脂酸:向预培养体系中加入0.2mL白桦脂醇的二甲基亚砜溶液(浓度7.5mg/mL,白桦脂醇纯度为90%),于28℃、转速180rpm的摇床中转化反应3天得到转化液。
(4)后处理及产物含量测定:转化液经3000rpm冷冻离心30分钟,取上清液,调节上清液pH至3~4,用乙酸乙酯萃取,萃取液经旋转蒸发浓缩得到白桦脂酸。采用RP-HPLC法测定样品中白桦脂醇、白桦脂酸的含量。
其中,测定白桦脂醇、白桦脂酸含量的RP-HPLC法可参照发明专利CN101457250B公开的相关部分。白桦脂酸得率(μg/100mL)=生成的白桦脂酸质量(μg)/培养液体积(mL)×100;白桦脂醇转化率(%)=消耗的白桦脂醇质量(mg)/加入的白桦脂醇总质量(mg)×100%。
实施例2采用静息细胞转化法转化白桦脂醇合成白桦脂酸
(1)短刺小克银汉霉AS 3.910湿细胞的制备:取1mL短刺小克银汉霉AS 3.910孢子悬浮液(孢子浓度为1×106个/毫升)加入30mL生长培养基中,于28℃、转速180rpm的摇床中培养2天后停止培养,于3000rpm冷冻离心30分钟,蒸馏水洗3次,除去培养液,得到短刺小克银汉霉AS3.910湿细胞。
其中,短刺小克银汉霉AS 3.910孢子悬浮液的制备方法、生长培养基的成分与实施例1中的相同。
(2)预培养体系的制备:于超净台上,向30mL含有2%葡萄糖的磷酸缓冲溶液(pH为6)中接入5g短刺小克银汉霉AS 3.910湿细胞,得到预培养体系。
(3)转化合成白桦脂酸:向预培养体系中加入0.2mL白桦脂醇的二甲基亚砜溶液(浓度7.5mg/mL,白桦脂醇纯度为90%),于28℃、转速180rpm的摇床中转化反应3天得到转化液。
(4)后处理及产物含量测定:转化液经3000rpm冷冻离心30分钟,取上清液,调节上清液pH至3~4,用乙酸乙酯萃取,萃取液经旋转蒸发浓缩得到白桦脂酸。采用RP-HPLC法测定样品中白桦脂醇、白桦脂酸的含量。
对比实施例1、实施例2两种不同转化方式下的白桦脂醇转化率和白桦脂酸得率,具体结果见表1。
表1直接生长转化法与静息细胞转化法催化合成白桦脂酸的比较
注:表中序号1-3为实施例1的三个平行试验;序号4-6为实施例2的三个平行试验。
根据表1,通过对直接生长转化法和静息细胞转化法的结果进行差异性分析,得出两种方法在1%和5%显著水平下均无区别。而直接生长转化法相比静息细胞转化法在操作上更加简单,过程控制也相对容易,为此,优先选取直接生长转化法来制备白桦脂酸。
实施例3-5生长培养基中不同葡萄糖浓度对直接生长转化法合成白桦脂酸的影响
参照实施例1的方法,步骤(2)中,每升生长培养基中分别不含或含有20g、40g的葡萄糖,即生长培养基中葡萄糖浓度分别为0、2%、4%,其余步骤相同;测定样品中白桦脂醇、白桦脂酸的含量,具体结果见表2。
表2生长培养基中不同葡萄糖浓度对直接生长转化法合成白桦脂酸的影响
由表2结果可知,葡萄糖浓度在0~4%范围内,白桦脂醇的转化率先增后减,在葡萄糖浓度为2%时达到最大98.6%;白桦脂酸的转化得率有增长趋势,但是随着葡萄糖浓度的增加其增长趋势放缓。整体来看,2~4%的葡萄糖浓度均能满足短刺小克银汉霉AS 3.910转化白桦脂醇的生长代谢需要。
实施例6-9不同接种量对直接生长转化法合成白桦脂酸的影响
参照实施例1的方法,步骤(2)中,30mL生长培养基中分别接入0.3mL、0.6mL、0.9mL、1.5mL的短刺小克银汉霉AS 3.910孢子悬浮液,即接种量分别为1%、2%、3%、5%,其余步骤相同;测定样品中白桦脂醇、白桦脂酸的含量,具体结果见表3。
表3不同接种量对直接生长转化法合成白桦脂酸的影响
表3结果显示,在接种量1~5%的范围内,白桦脂醇的转化率和白桦脂酸的转化得率并不是随着接种量的增加而增加的。白桦脂醇的转化率在3%的接种量下达到最大98.6%,白桦脂酸的转化得率在接种量为2%时达到最大260μg/100mL。可能是因为过多的接种量不仅会导致发酵液中传质困难,还会使细胞之间因为对营养物质、氧气等因素的竞争而影响其生长和代谢,所以白桦脂醇的转化率和白桦脂酸的转化得率都有所下降。
实施例10-13不同底物浓度对直接生长转化法合成白桦脂酸的影响
参照实施例1的方法,步骤(3)中,预培养体系中分别加入0.044mL、0.13mL、0.22mL、0.44mL白桦脂醇的二甲基亚砜溶液(浓度7.5mg/mL,白桦脂醇纯度为90%),即预培养体系中白桦脂醇底物浓度分别为0.01g/L、0.03g/L、0.05g/L、0.1g/L,其余步骤相同;测定样品中白桦脂醇、白桦脂酸的含量,具体结果见表4。
表4不同底物浓度对直接生长转化法合成白桦脂酸的影响
由表4结果可知,在底物浓度0.01~0.1g/L之间,白桦脂醇的转化率和白桦脂酸的转化得率都是先增加后减少。在底物浓度为0.05g/L时白桦脂醇的转化率最高为98.6%;在底物加量为0.03g/L时白桦脂酸的转化得率最大为187.9μg/100mL。高浓度的底物加量有利于白桦脂酸的积累,但过高浓度的底物加量会导致转化液中存在较多的二甲基亚砜,可能对细胞产生破坏作用。
实施例14-17不同表面活性剂浓度对直接生长转化法合成白桦脂酸的影响
参照实施例1的方法,步骤(3)中,在加入白桦脂醇的二甲基亚砜溶液之前,先向预培养体系中不加或分别加入0.03mL、0.15mL、0.3mL的表面活性剂吐温80,即预培养体系中吐温80的浓度分别为0、0.1%、0.5%、1.0%,其余步骤相同;测定样品中白桦脂醇、白桦脂酸的含量,具体结果见表5。
表5不同表面活性剂浓度对直接生长转化法合成白桦脂酸的影响
从上表可以看出,添加少量的表面活性剂吐温80对白桦脂酸的产出有促进作用;但随着表面活性剂浓度的增加,转化效果有小幅度的下降,即过多的吐温80反而不利于白桦脂酸的获得。
实施例18-22不同转化时间对直接生长转化法合成白桦脂酸的影响
参照实施例1的方法,步骤(3)中,转化反应时间分别为2天、3天、4天、5天、6天,其余步骤相同;测定样品中白桦脂醇、白桦脂酸的含量,具体结果见表6。
表6不同转化时间对直接生长转化法合成白桦脂酸的影响
随着转化时间的推移,白桦脂醇的转化率和白桦脂酸的转化得率均有提高,但是在转化4天后提高不大,白桦脂酸的转化得率反而有所下降。白桦脂醇的最大转化率和白桦脂酸的最大转化得率分别为98.6%和110.8μg/100mL,说明转化反应4天最有利于产物的积累。
Claims (10)
1.一种短刺小克银汉霉转化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法,包括:
(1)向培养液中接入短刺小克银汉霉(Cunninghamella blakesleeana)AS 3.910,得到预培养体系;
(2)向步骤(1)得到的预培养体系中加入白桦脂醇溶液,使白桦脂醇的浓度达到0.01~0.1g/L,于25~30℃转化反应2~6天得到转化液;
(3)所述的转化液经分离纯化得到白桦脂酸。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的步骤(1)为:向生长培养基中接入短刺小克银汉霉AS 3.910孢子悬浮液,于25~30℃培养1~3天得到预培养体系;其中,以体积1L计,所述的生长培养基包括:葡萄糖0~40g,酵母膏1~5g,蛋白胨2~5g,磷酸氢二钾1~5g,生长培养基的pH为6.0~7.0;所述的短刺小克银汉霉AS 3.910孢子悬浮液的接入量以每升生长培养基计为10~50mL。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述的步骤(1)为:向生长培养基中接入孢子浓度为1×106~1×108个/毫升的短刺小克银汉霉AS 3.910孢子悬浮液,于28℃培养2天得到预培养体系;其中,以体积1L计,所述的生长培养基包括:葡萄糖40g,酵母膏5g,蛋白胨5g,磷酸氢二钾5g,生长培养基的pH为6.5;所述的短刺小克银汉霉AS 3.910孢子悬浮液的接入量以每升生长培养基计为20mL。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的步骤(1)为:向含有葡萄糖的磷酸缓冲溶液中接入短刺小克银汉霉AS 3.910湿细胞,得到预培养体系;其中,所述的磷酸缓冲溶液的pH为6,磷酸缓冲溶液中葡萄糖的质量百分比溶度为1~3%;所述的短刺小克银汉霉AS 3.910湿细胞的接入量以每升磷酸缓冲溶液计为100~250g。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)中,所述的白桦脂醇溶液为白桦脂醇浓度达到7~9mg/mL的二甲基亚砜溶液;所述的白桦脂醇在预培养体系中的浓度为0.03g/L。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)中,所述的预培养体系中还加有体积百分比浓度为0.1~1.0%的表面活性剂。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述的表面活性剂为吐温80,吐温80在所述的预培养体系中的体积百分比浓度为0.1%。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)中,所述的转化反应温度为28℃,转化反应时间为4天。
9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)中,所述的预培养体系中加入白桦脂醇溶液后置于摇床中进行转化反应,摇床转速为120~200rpm。
10.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(3)中,所述的分离纯化包括:转化液经离心取上清液,调节上清液pH至3~4,用乙酸乙酯萃取,萃取液经浓缩得到白桦脂酸。
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CN101457250A (zh) * | 2008-12-25 | 2009-06-17 | 浙江大学 | 一种微生物细胞生物转化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法 |
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Title |
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---|---|---|---|---|
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Publication number | Publication date |
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CN102286595B (zh) | 2013-08-28 |
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