CN102286452A - 磁性共价固定化酶载体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物化学领域，公开了一种磁性共价固定化酶载体的制备方法，首先制备出油酸包裹且具有磁性纳米结构的Fe3O4，接着Fe3O4与烯酸酯类进行聚合反应，然后与水合肼、亚硝酸依次反应得到活化的叠氮磁性纳米结构的固定化酶载体。本发明方法工艺简单，操作成本低，酶装载量高，稳定性好，反应易控制和操作，酶装载量高达250mg/g，固定化酶几乎能100%保留原酶性。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学领域，尤其涉及了一种磁性共价固定化酶载体的制备方法。
背景技术
固定化酶指经物理或化学方法处理后，使酶变成不易随水流失即运动受限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。与游离酶相比，固定化酶的优点有：可多次使用，且酶的稳定性提高；反应后，固定化酶易与底物和产物分离；反应条件易于控制，有利于自动化生产。
磁性纳米结构的Fe3O4因其生物相容性，小尺寸效应，大的表面积，特殊磁性而受到广泛的关注。国内外一些用Fe3O4作为载体来共价固定化酶的文献，基本存在某些不足，如颗粒易团聚，酶装载量不高，酶固定化反应时反应条件苛刻等。如文献一：（Xia
Wang, Wen Wang, Yi Xu, Daniel I. C. Wang, and Zhi Li/ Journal of the american
chemical society. 2009, 131, 12892-12893）反应体系是：首先甲基丙烯酸缩水甘油酯在油酸包裹的Fe3O4上发生聚合反应引人环氧基，然后加入乙二胺引入氨基，最后加入戊二醛使载体和酶交联。虽然酶在载体上的活性没有减少，但是每克载体装载酶量也才达到16.1mg/g。文献二：（ Xia Wang, Peipei Dou, Peng Zhao, Chuanming Zhao, Yi
Ding, and Ping Xu/ ChemSusChem. 2009, 2, 947-950）反应体系是：氨水共沉淀铁离子产生带有氨基的Fe3O4颗粒，然后用戊二醛使载体和酶交联。方法虽然巧妙得利用Fe3O4上残有的氨基，但是酶的装载量很有限，文献中也没给出确切的数值。文献三：（Lin Lei, Xiao
Liu, Yanfeng Li, Yanjun Cui, Yong Yang, Guorui Qin/ Materials Chemistry and
Physics. 2011, 125, 866-871）反应体系是：在改性过的Fe3O4/
SiOX纳米颗粒上进行甲基丙烯酸缩水甘油酯的聚合反应，然后利用环氧基进行固定化酶。相比其它看过的文献，用此方法得到了较好的装载量—98.4
mg/g。但其固定化条件是在30℃载体和酶反应6小时，这多少会影响酶的活性。
本发明是利用载体上的叠氮基易与酶上的氨基发生置换从而达到固定作用。用此方法酶液不会接触戊二醛等试剂，且是在较低的温度（0℃）下与载体反应，因此对酶的活性及选择性不会造成伤害，未参与固定的酶可回收继续进行下一轮固定化。本发明的方法，首先制备出被油酸包裹且具有磁性纳米结构的Fe3O4，接着Fe3O4与烯酸酯类反应得到酯基，然后和水合肼反应引入肼基，最后与亚硝酸反应生成叠氮基。利用本发明方法得到的颗粒载体在反复用十几次后其酶活保留还是100 %。
水溶性聚乙二醇（PEG）因其无免疫性、无毒性、无蛋白依附性而被用于酶等生物活性物质固定化载体。本发明中PEG在反应体系中起到很好的混溶和分散的作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种工艺简单，操作成本低，酶装载量高，稳定性好，在有机相和水相中具有很强的分散性的磁性共价固定化酶载体的制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决：
磁性共价固定化酶载体的制备方法，包括以下步骤：
步骤a：制备油酸包裹的Fe3O4纳米颗粒：
先通过氮气排出三口瓶中的空气，将FeCl3∙6H2O、FeSO4∙7H2O以摩尔比为2~5：0.2~2的比例混合并加到三口瓶中，加入包裹剂，将其放置于50-80℃恒温搅拌池中搅拌0.5-2.5小时；加入碱性溶液，调节反应液pH值于9-13之间，继续搅拌30分钟；搅拌结束后，利用磁场分离出磁性颗粒；洗涤磁性颗粒，至洗涤液的pH =
7，即可得到黑色的油酸包裹的Fe3O4纳米粒子，用冷冻干燥机冻干或用烘箱烘干以备用；
步骤b：Fe3O4和烯酸酯的共聚反应：
通过氮气排出反应器皿内的空气，在25-55℃的温度下，加入0.3-2g步骤a中制得的Fe3O4纳米粒子、0.1g-0.3g
的分散剂和0.1-0.4g的引发剂，然后加入40ml醇水混合溶液，同时磁力搅拌，再加入0.2-5ml的烯酸酯类进行共聚反应，反应时间持续30-60分钟；用乙酸乙酯和蒸馏水洗涤上述得到的聚合产物，用磁场分离出磁性颗粒，然后加入1%-8%的水合肼乙醇溶液，反应2小时后用蒸馏水洗涤并用冷冻干燥机冻干或用烘箱烘干以备用；
步骤c：载体的活化与固定化效率检测：
称取一定量的由步骤b制备的载体，在0℃的温度下加入NaNO2（0.3-1M）和HCl（0.3-1N）的混合液，反应5分钟后蒸馏水洗涤得到活化的载体; 将活化的载体加入到酶溶液中，0℃下搅拌1小时，根据酶溶液使用前后总酶蛋白的差值来计算酶的装载量，其中酶的含量用考马斯亮蓝法测定。
作为优选，所述的步骤a中的包裹剂为油酸钾、二氧化硅、油酸钠中的任一种。
作为优选，所述的步骤a中的碱性溶液为氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、氨水中的任一种。
作为优选，所述的步骤b中的分散剂为聚乙烯醇、十二烷基硫酸钠、聚乙二醇（PEG）中任一种。
作为优选，所述的步骤b中的烯酸酯类包括丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙稀酸乙酯中的任一种。
作为优选，所述的步骤b中的引发剂包括过硫酸钾、过硫酸铵、过氧化苯甲酰中的任一种，其中过硫盐可与亚铁离子构成氧化还原剂，过氧化苯甲酰可与苯胺构成氧化还原剂。
本发明由于采用了以上技术方案，具有显著的技术效果：
1、原料便宜，成本低，固定化效率高，分散性好，易回收；
2、用本载体制得的固定化酶，几乎能保持95~100%的活力；
3、用本载体固定化酶的过程中，酶不接触任何刺激性化学溶剂，只接触水和载体，剩余的酶能循环使用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细描述：
实施例
1
磁性共价固定化酶载体的制备方法，方法如下：
制备油酸包裹的Fe3O4纳米颗粒：通入氮气，排出三口烧瓶内空气后加入94g FeCl3∙6H2O、50.5g FeSO4∙7 H2O、100g油酸钾（化学纯）和100ml水。将其置于80℃恒温搅拌池中搅拌30分钟，搅拌完毕后加入NH3∙H2O溶液（1M），至溶液pH = 11，然后继续搅拌30分钟。反应结束后，利用磁场分离出磁性颗粒。用乙醇和去离子蒸馏水洗涤磁性颗粒，至洗涤液的pH =
7，即可得到黑色的油酸包裹的Fe3O4纳米粒子，然后将得到的纳米粒子用冷冻干燥机冻干备用。
Fe3O4和烯酸酯的共聚反应：通入氮气，排出三口烧瓶内空气，加入1g被油酸包裹的Fe3O4、0.2 g PEG 4000、0.1 g
FeSO4和0.1 g K2S2O8。加入20 mL乙醇和20 mL水溶液，搅拌使其溶解，并保持温度25℃左右，接着加入4 mL丙烯酸甲酯进行共聚反应。反应30分钟后，用对苯二酚终止反应，用乙酸乙酯和蒸馏水洗涤聚合产物，并用磁场分离出磁性颗粒。然后加入40 ml
2 %的水合肼乙醇溶液，反应2个小时后蒸馏水洗并用冷冻干燥机冻干以备用。
载体的活化与固定化效率检测：称取一定量的载体，在0℃加入 NaNO2（0.6 M）和HCl（0.3 N）的混合液并反应5分钟，然后蒸馏水洗得到活化的载体。将叠氮活化的载体加入到一定浓度的酶（PIR:A34959）溶液中，0℃下搅拌0.5小时。装载量按酶液中前后酶含量变化值计算，其中酶含量用考马斯亮蓝溶液检测。最后得到装载量245-255mg/ g的固定化酶，酶的保留活性为95-100%左右。
实施例
2
磁性共价固定化酶载体的制备方法，方法如下：
制备油酸包裹的Fe3O4纳米颗粒：通入氮气，排出三口烧瓶内空气，接着加入23.5g FeCl3∙6H2O、10.1 g FeSO4∙7 H2O、30g油酸钾和50ml 水。将其置于75 ℃的恒温搅拌池中搅拌1小时。加入一定量浓度为1 M的氢氧化钠溶液，直至溶液pH = 11，然后继续搅拌1小时。反应结束后，利用磁场分离出磁性颗粒。用乙醇和去离子蒸馏水洗涤磁性颗粒，至洗涤液的pH =
7，即可得到黑色的油酸包裹的Fe3O4纳米粒子。然后用冷冻干燥机冻干以备用。
Fe3O4和烯酸酯的共聚反应：通入氮气，排出三口烧瓶内空气，加入2g被油酸包裹的Fe3O4、0.1g 聚乙烯醇、0.1 g FeSO4和0.1 g K2S2O8。加入20 mL乙醇和20 mL水溶液，搅拌使其溶解，并保持温度30℃，接着加入5mL丙烯酸乙酯进行共聚反应。反应2小时后，用对苯二酚终止反应，后用乙酸乙酯和蒸馏水洗涤聚合产物，并用磁场分离出磁性颗粒。然后加入20 mL
4 %的水合肼乙醇溶液，反应2个小时后蒸馏水洗并用冷冻干燥机冻干备用。
载体的活化与酶的固定化：称取一定量的载体，在0℃加入 NaNO2（0.5 M）和HCl（0.4N）的混合液，反应5分钟后蒸馏水洗得到活化的载体。将由叠氮活化后的载体加入到一定浓度的酶溶液中，0℃下搅拌1小时。最后得到装载量为80-90 mg/ g，酶的保留活性为85-90 %左右。
实施例
3
磁性共价固定化酶载体的制备方法，方法如下：
制备油酸包裹的Fe3O4纳米颗粒：通入氮气，排出三口烧瓶内空气，接着加入1.04g FeCl3∙6H2O、0.48g FeSO4∙7 H2O、1g油酸钾（化学纯）和10ml水。将其放置于80 ℃恒温搅拌池中搅拌40分钟。加入一定量浓度为2M的氢氧化钾溶液，直至溶液pH =13，然后继续搅拌40分钟。反应结束后，利用磁场分离出磁性颗粒。用乙醇和去离子蒸馏水洗涤磁性颗粒，至洗涤液的pH =7，即可得到黑色的油酸包裹的Fe3O4纳米粒子。未经冻干直接用于以下反应。
Fe3O4和烯酸酯的共聚反应：通入氮气，排出三口烧瓶内空气，加入如上所得被油酸包裹的Fe3O4、0.1g十二烷基硫酸钠、0.1 g FeSO4和0.1 g K2S2O8。加入20 mL乙醇和20 mL水溶液，搅拌使其溶解，并保持温度30℃，接着加入3 mL甲基丙烯酸乙酯进行共聚反应。反应30分钟后，用对苯二酚终止反应，用乙酸乙酯和蒸馏水洗涤聚合产物，并用磁场分离出磁性颗粒。然后加入20 mL
8 %的水合肼乙醇溶液，反应2个小时后蒸馏水洗并用冷冻干燥机冻干备用。
载体的活化与酶的固定化：取一定量的载体，在0℃加入 NaNO2（1 M）和HCl（0.6 N）的混合液并反应5分钟，然后蒸馏水洗得到活化的载体。将叠氮活化的载体加入到一定浓度的酶溶液中，0℃下搅拌2小时。最后得到装载量为132-142 mg/ g，酶的保留活性为95-100 %左右。
实施例
4
磁性共价固定化酶载体的制备方法，方法如下：
Fe3O4的制备：将FeCl3∙6H2O溶液、FeSO4∙7 H2O溶液按摩尔比4：3的比例加到三口瓶中，放置于50 ℃恒温水浴，搅拌的同时加入一定量浓度为1M的氢氧化钾溶液，直至溶液pH = 9，50 ℃ 恒温水浴下静置2小时。反应结束后，利用磁场分离出磁性颗粒。用去离子蒸馏水洗涤磁性颗粒，至洗涤液的pH =7，即可得到黑色的Fe3O4纳米粒子。用冷冻干燥机冻干备用。
Fe3O4和烯酸酯的共聚反应：通入氮气排出三口烧瓶内空气，加入2g Fe3O4、0.3g PEG 8000、0.4 g
FeSO4和0.4g (NH4)S2O8。加入40 mL水溶液，温度30℃下搅拌30分钟，接着加入2 mL甲基丙烯酸乙酯进行共聚反应。反应30分钟后，用对苯二酚终止反应，用乙酸乙酯和蒸馏水洗涤聚合产物，并用磁场分离出磁性颗粒。然后加入40 mL
1 %的水合肼乙醇溶液，反应2个小时后蒸馏水洗并用冷冻干燥机冻干备用。
载体的活化与酶的固定化：称取一定量的载体，在0℃加入 NaNO2（0.5 M）和HCl（0.5N）的混合液并反应5分钟，然后蒸馏水洗得到活化的载体。将叠氮活化的载体加入到一定浓度的酶溶液中，0℃下搅拌半小时。最后得到装载量为169-179 mg/ g，酶的保留活性为90-95 %左右。
实施例
5
磁性共价固定化酶载体的制备方法，方法如下：
制备油酸包裹的Fe3O4纳米颗粒：同实施例1。
Fe3O4和烯酸酯的共聚反应：通入氮气，排出三口烧瓶内空气，设置温度为80℃，在其上安装一个冷凝回流装置。在三口瓶中加入0.1g被油酸包裹的Fe3O4、30 ml正己烷、0.1 g 过氧化苯甲酰（BPO）、0.1g苯胺和3 mL丙烯酸乙酯进行共聚反应。反应1小时后，用对苯二酚终止反应，接着用旋转蒸发仪除去正己烷，用乙醇洗涤聚合产物，用磁场分离出磁性颗粒。然后加入40 ml
2 %的水合肼乙醇溶液，反应2个小时后蒸馏水洗并用冷冻干燥机冻干备用。
载体的活化与酶的固定化：同实施例1。最后得到装载量为50-60
mg/ g，酶的保留活性为85-90%左右。
实施例
6
磁性共价固定化酶载体的制备方法，方法如下：
制备油酸包裹的Fe3O4纳米颗粒：同实施例2。
Fe3O4和烯酸酯的共聚反应：通入氮气排出三口烧瓶内空气，加入2g被油酸包裹的Fe3O4、0.2 g PEG 400、0.1 g
FeSO4和0.1 g K2S2O8。加入20 mL乙醇和20 mL水溶液，搅拌使其溶解，并保持温度25℃左右，接着加入3 mL丙烯酸乙酯进行共聚反应。反应30分钟后，用适量对苯二酚终止反应，用乙酸乙酯和蒸馏水洗涤聚合产物，并用磁场分离出磁性颗粒。然后加入20ml
2 %的水合肼乙醇溶液，反应2个小时后蒸馏水洗并用冷冻干燥机冻干备用。
载体的活化与酶的固定化：同实施例2。最后得到装载量为58-68
mg/ g，酶的保留活性为85-90 %左右。
实施例
7
磁性共价固定化酶载体的制备方法，方法如下：
制备油酸包裹的Fe3O4纳米颗粒：同实施例1。
Fe3O4和烯酸酯的共聚反应：通入氮气排出三口烧瓶内空气，加入0.5g被油酸包裹的Fe3O4、0.2 g PEG 200、0.1 g
FeSO4和0.1 g K2S2O8。加入20 mL乙醇和20 mL 50 mM pH4的磷酸二氢钠水溶液，温度25℃左右搅拌10分钟，接着加入3 mL丙烯酸乙酯进行共聚反应。反应30分钟后，用对苯二酚终止反应，用乙酸乙酯和蒸馏水洗涤聚合产物，并用磁场分离出磁性颗粒。然后加入20ml 2 %的水合肼乙醇溶液，反应2个小时，反应结束后，蒸馏水洗并用冷冻干燥机冻干备用。
载体的活化与酶的固定化：同实施例3。最后得到装载量为171-181
mg/ g，酶的保留活性为95-100 %左右。
实施例
8
磁性共价固定化酶载体的制备方法，方法如下：
制备油酸包裹的Fe3O4纳米颗粒的方法：同实施例2。
Fe3O4和烯酸酯的共聚反应：通入氮气，排出三口烧瓶内空气，加入2g油酸包裹的Fe3O4、0.3 g PEG 4000、0.2 g
FeSO4和0.2 g K2S2O8。加入20 mL叔丁醇和20 mL水溶液，搅拌使其溶解，并保持温度25℃左右，接着加入3 mL丙烯酸甲酯进行共聚反应。反应30分钟后，用对苯二酚终止反应，用乙酸乙酯和蒸馏水洗涤聚合产物，并用磁场分离出磁性颗粒。然后加入20ml
4 %的水合肼乙醇溶液，反应2个小时后，蒸馏水洗并用冷冻干燥机冻干备用。
载体的活化与酶的固定化：同实施例4。
最后得到装载量为190-200 mg/ g，酶的保留活性为95-100
%左右。
实施例
9
磁性共价固定化酶载体的制备方法，方法如下：
被油酸包裹的Fe3O4的制备的方法：同实施例2。
Fe3O4和烯酸酯的共聚反应：通入氮气排出三口烧瓶内空气，加入1g油酸包裹的Fe3O4、0.3 g十二烷基硫酸钠、0.1 g FeSO4和0.1 g K2S2O8。加入20 mL乙醇和20 mL水溶液，搅拌使其溶解，并保持温度35℃，接着加入4 mL丙烯酸乙酯进行共聚反应。反应30分钟后，用对苯二酚终止反应，用乙酸乙酯和蒸馏水洗涤聚合产物，并用磁场分离出磁性颗粒。然后加入20ml
4%的水合肼乙醇溶液，反应2个小时后蒸馏水洗并用冷冻干燥机冻干备用。
载体的活化与酶的固定化：同实施例1。
最后得到装载量为168-178 mg/ g，酶的保留活性为95-100
%左右。
实施例
10
磁性共价固定化酶载体的制备方法，方法如下：
制备油酸包裹的Fe3O4纳米颗粒的方法：同实施例1。
Fe3O4和烯酸酯的共聚反应：通入氮气，排出三口烧瓶内空气，加入1g被油酸包裹的Fe3O4、0.2 g PEG 2000、0.1 g
FeSO4和0.1 g K2S2O8。加入20 mL乙醇和20 mL水溶液，搅拌使其溶解，并保持温度25℃左右，接着加入5 mL丙烯酸乙酯进行共聚反应。反应30分钟后，用对苯二酚终止反应，用乙酸乙酯和蒸馏水洗涤聚合产物，并用磁场分离出磁性颗粒。然后加入20ml
4 %的水合肼乙醇溶液，反应2个小时后，蒸馏水洗并用冷冻干燥机冻干备用。
载体的活化与酶的固定化：与实施例3相同。
最后得到装载量为98-100 mg/ g，酶的保留活性为95-100
%左右。
实施例
11
磁性共价固定化酶载体的制备方法，方法如下：
制备油酸包裹的Fe3O4纳米颗粒的方法：同实施例1。
Fe3O4和烯酸酯的共聚反应：通氮气去除三口瓶中的空气，设置温度为80℃，在其上安装一个冷凝回流装置。在三口瓶中加入0.1g被油酸包裹的Fe3O4，30 ml乙醇，0.4g 过氧化苯甲酰（BPO）和3 mL丙烯酸甲酯进行共聚反应。反应1小时后，用对苯二酚终止反应，接着用磁场分离出磁性颗粒。然后加入2 %的水合肼乙醇溶液，反应2个小时后蒸馏水洗并用冷冻干燥机冻干备用。
载体的活化与酶的固定化：同实施例1。
最后得到装载量为130-140 mg/ g，酶的保留活性为90-95%左右。
总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。
Claims (6)
1.磁性共价固定化酶载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤a：制备油酸包裹的Fe3O4纳米颗粒：
先通过氮气排出三口瓶中的空气，将FeCl3∙6H2O、FeSO4∙7H2O以摩尔比为2~5：0.2~2的比例混合并加到三口瓶中，加入包裹剂，将其放置于50-80℃恒温搅拌池中搅拌0.5-2.5小时；加入碱性溶液，调节反应液pH值于9-13之间，继续搅拌30分钟；搅拌结束后，利用磁场分离出磁性颗粒；洗涤磁性颗粒，至洗涤液的pH = 7，即可得到黑色的油酸包裹的Fe3O4纳米粒子，用冷冻干燥机冻干或用烘箱烘干以备用；
步骤b：Fe3O4和烯酸酯的共聚反应：
通过氮气排出反应器皿内的空气，在25-55℃的温度下，加入0.3-2g步骤a中制得的Fe3O4纳米粒子、0.1g-0.3g 的分散剂和0.1-0.4g的引发剂，然后加入40ml醇水混合溶液，同时磁力搅拌，再加入0.2-5ml的烯酸酯类进行共聚反应，反应时间持续30-60分钟；用乙酸乙酯和蒸馏水洗涤上述得到的聚合产物，用磁场分离出磁性颗粒，然后加入1%-8%的水合肼乙醇溶液，反应2小时后用蒸馏水洗涤并用冷冻干燥机冻干或用烘箱烘干以备用；
步骤c：载体的活化与固定化效率检测：
称取一定量的由步骤b制备的载体，在0℃的温度下加入NaNO2（0.3-1M）和HCl（0.3-1N）的混合液，反应5分钟后蒸馏水洗涤得到活化的载体; 将活化的载体加入到酶溶液中，0℃下搅拌1小时，期间用考马斯亮蓝溶液测量酶溶液中酶的含量，根据酶溶液使用前后蛋白差值计算酶的装载量。
2.根据权利要求1所述的磁性共价固定化酶载体的制备方法，其特征在于：所述的步骤a中的包裹剂为油酸钾、二氧化硅、油酸钠中的任一种。
3.根据权利要求1所述的磁性共价固定化酶载体的制备方法，其特征在于：所述的步骤a中的碱性溶液为氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、氨水中的任一种。
4.根据权利要求1所述的磁性共价固定化酶载体的制备方法，其特征在于：所述的步骤b中的分散剂为聚乙烯醇、十二烷基硫酸钠、聚乙二醇（PEG）中任一种。
5.根据权利要求1所述的磁性共价固定化酶载体的制备方法，其特征在于：所述的步骤b中的烯酸酯类包括丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙稀酸乙酯中的任一种。
6.根据权利要求1所述的磁性共价固定化酶载体的制备方法，其特征在于：所述的步骤b中的引发剂包括过硫酸钾、过硫酸铵、过氧化苯甲酰中的任一种，其中过硫盐可与亚铁离子构成氧化还原剂，过氧化苯甲酰可与苯胺构成氧化还原剂。
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