CN104818252A - 一种3d细胞培养材料及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种3D细胞培养材料及其应用。所述三维细胞培养材料包括PEG8000 Fe₃O₄、PEG400 Fe₃O₄和NH₂Fe₃O₄。本发明三维细胞培养材料可长时间保持微环境pH和细胞因子活性和浓度，更有利于细胞的快速生长、增殖以及细胞活的维持。在本发明中，三维细胞培养材料中纳米粒NH₂Fe₃O₄方便、容易的固定细胞因子，束胶的外残基能以氢键在低浓度戊二醛的条件下结合细胞因子蛋白。防止了蛋白在水基中游离产生培养效率的低下。本发明三维细胞培养材料对肿瘤细胞、干细胞分化的抑制和培养具有良好的效果；且可满足对不同的原代哺乳动物细胞的培养。

Description

一种 3D 细胞培养材料及其应用

技术领域

本发明属于材料化学与生物医药技术领域，具体涉及细胞体外三维培养的材料及其应生。

背景技术

三维细胞培养技术 ( three-dimensionalcell culture, TDCC ) 是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养，使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长，构成三维的细胞-载体复合物。

三维细胞培养技术有着重要的应用。普通的细胞培养由于细胞在体外改变的环境下增生逐渐丧失了原有的性状，往往和体内情况不相符，而动物实验完全在体内进行, 但由于体内的多种因素制约以及体内和外界环境相互影响而变得复杂化, 难以研究单一过程，且难以研究中间过程。三维细胞培养技术是介于单层细胞培养与动物实验之间的一种技术，既能最大程度的模拟体内环境，又能展现细胞培养的直观性及条件可控性的优势。

肿瘤生物学：肿瘤的实验性治疗、肿瘤的侵袭性、转移和中心坏死的机制、肿瘤的血管形成和营养供给、体内基因表达、测试药物对肿瘤生长和向邻近组织转移的抑制效果的模拟等方面。

软骨和骨组织：成熟的软骨细胞和干细胞被广泛用于三维细胞培养，以再生损伤的软骨、骨、韧带、肌腱和膝关节半月板。

循环系统和心脏：在成熟的组织中及时产生血管网络是组织工程的重要课题；在治疗领域, 所关心的也是如何有目的地改变血管形成，以抑制肿瘤的进展。

神经系统：培植单一神经元成为多细胞聚集体、海马体活标本切片后测试神经元电势、神经干细胞培养治疗老年痴呆症、帕金森病等。

可见细胞培养对生物医疗领域具有重大的意义。

目前，三维细胞培养的生物反应器研制进展迅速，而且种类多样，各有不同特点，都是以不同的方式提供给细胞最适宜的生长环境，目前较有代表性的有搅拌式、中空纤维、旋转等各种生物反应器。但到目前为止，针对肿瘤细胞，干细胞分化的抑制和培养具有良好的效果。但是针对不同的原代哺乳动物细胞，具体的微环境大小，细胞因子组合，以及微环境pH调节等等，特异性细胞的生长条件需要进一步设计具体产品。仍然没有一种细胞支架能完全同时满足多种细胞快速、高活力生长，且能满足干细胞有增殖过程中有效维持细胞干性的需要。

有鉴于此，有必要对现有三维细胞培养材料进行了改进，以解决上述问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种三维细胞培养材料。

本发明的另一目的在于提供上述三维细胞培养材料的应用。

本发明所采取的技术方案是：

一种三维细胞培养材料，所述三维细胞培养材料包括PEG8000@ Fe₃O₄和PEG400@ Fe₃O₄；二者的制备方法如下，

PEG8000@ Fe₃O₄的制备方法：

1）烷基化：取粒径为15~25nm的Fe₃O₄纳米球，加入有机物的氨水溶液，混匀，于8℃~10℃条件下反应16～20h，使Fe₃O₄纳米球表面被阳离子烷基化形成保护膜；

2）将烷基化的Fe₃O₄纳米球与磷酸化PEG8000水溶液混合，并通过氩气排除氧气，再加入金属盐，混匀在55～65℃条件下搅拌催化反应1～2h，即得PEG8000@ Fe₃O₄；

PEG400@ Fe₃O₄ 的制备方法与上述PEG8000@ Fe₃O₄的制备方法相同，除了将磷酸化PEG8000改用为磷酸化PEG400，其他均不变。

进一步的，上述三维细胞培养材料还包括纳米粒NH₂@Fe₃O₄，其制备方法为：

1）烷基化：取粒径为100~200nm的Fe₃O₄纳米球，加入有机物的氨水溶液，混匀，于8℃~10℃条件下反应16～20h，使Fe₃O₄纳米球表面被阳离子烷基化形成保护膜；

2）氨基化：取上述烷基化后的Fe₃O₄纳米球加入到含氢氧化钠的氨水溶液中，混匀，使反应完全，即得氨基化的纳米粒NH₂@Fe₃O₄；

或者将烷基化后的Fe₃O₄纳米球加入纯正硅酸乙酯中，于14～18℃磁力搅拌18～22h对纳米粒进行包埋，洗脱包埋后的纳米颗粒，置于含氢氧化钠的氨水中反应完全，即得氨基化的纳米粒NH₂@Fe₃O₄。

进一步的，上述有机物的氨水溶液中有机物的浓度为180～220g/L；所述有机物为顺式十八碳-9-烯酸。

进一步的，上述步骤2）中烷基化的Fe₃O₄纳米球与磷酸化PEG8000水溶液的质量体积比为100g：(350~450)mL；所述磷酸化PEG8000水溶液中PEG8000浓度为0.2~0.3g/mL。

进一步的，上述步骤2）中所述金属盐为CoCl₂，金属盐加入量为使其终浓度为0.18~0.22mol/L。

进一步的，上述所制得的PEG8000@ Fe₃O₄、PEG400@ Fe₃O₄分别经红外线灭菌后，再用稀盐酸清洗，洗后分别保存在PBS缓冲液中，备用。

进一步的，上述步骤2）中所述含氢氧化钠的氨水溶液中的氢氧化钠浓度为1.8～2.2%w/v。

三维细胞培养材料的应用，应用过程中的具体操作包括以下步骤：

1）取权利要求1中所述的PEG8000@Fe₃O₄、PEG400@ Fe₃O₄溶解到细胞培养基中，

2）将步骤1）中的培养基经超声波处理3~5min制备细胞培养空腔；

3）将需要培养的细胞加入到上述经超声波处理后的培养基中，混匀，在常规培养条下进行培养即可。

进一步的，上述步骤1）中所述PEG8000@Fe₃O₄、PEG400@ Fe₃O₄、细胞培养基的用量比为（22~27）mg：（8~12）mg：（15~30）mL。

进一步的，在上述步骤1）的操作过程中，根据所培养的细胞的需求，可以将培养过程中需加入的细胞因子先与权利要求2所述的纳米粒NH₂@Fe₃O₄进行反应，制得纳米粒状的细胞因子@Fe₃O₄，再将细胞因子@Fe₃O₄与PEG8000@Fe₃O₄、PEG400@ Fe₃O₄一起加入到细胞培养基中；

上述细胞因子@Fe₃O₄的具体制备过程为：将权利要求2所述纳米粒NH₂@Fe₃O₄和细胞因子加入甲醛溶液或者戊二醛溶液中，混匀，反应完全即可。

本发明的有益效果是：

1）控制细胞微环境的变化是模拟细胞活体离体培养、抑制细胞分化、保持细胞活性大规模培养的关键技术。本发明三维细胞培养材料对肿瘤细胞、干细胞分化的抑制和培养具有良好的效果；且可满足对不同的原代哺乳动物细胞的培养。

2）本发明三维细胞培养材料可长时间保持微环境pH和细胞因子活性和浓度，更有利于细胞的快速生长、增殖以及细胞活的维持。在本发明中，三维细胞培养材料中纳米粒NH₂@Fe₃O₄方便、容易的固定细胞因子，束胶的外残基能以氢键在低浓度戊二醛的条件下结合细胞因子蛋白。防止了蛋白在水基中游离产生培养效率的低下。

3）在本发明中，PEG束胶的羟基端结合纳米Fe磁珠，在培养好的细胞进行下一步的细胞治疗或者其他分子生物学实验，传统的分离胶原和细胞的方法，无比复杂并且极端伤害细胞。本专利通过磁珠联合束胶，在磁场的作用下，没有磁性的细胞会游离到水基中。

4）本发明的3D细胞培养束胶构造的羟基端带上纳米磁珠。便于细胞脱胶，将培养好的细胞完好地的释放到水基中。

5）肿瘤细胞可以通过自分泌和旁分泌，改变和维持自身生存和发展的条件，促进肿瘤的生长和发展。干细胞龛(the stem cell niche)是干细胞的集中存储部位，通过特定的细胞外基质和龛细胞提供特殊的微环境，对维持干细胞的高增殖力和诱导定向分化起关键作用。原代细胞在活体特定部位也有其特定的培养条件。本发明3D培养材料采用PEG为基本结构，惰性强，pH值稳定，在形成的三维微环境中可以保持肿瘤所需要的生长因子作用活性；保持三维微环境中保持干细胞干性的细胞因子。也能长时间地维持模拟原代细胞生长的微环境。

6）细胞三维培养时，需要把三维材料的微环境打开，让细胞释放到水基中，这是传统三维培养比较困难的部分，而本发明3D培养材料在束胶上带上Fe性磁珠，结合磁力架的使用，该材料的构象会发生改变，细胞很容易融解到水基中。

附图说明

图1为含有本发明材料的细胞培养基的稳定性检测；

图2为本发明3D细胞培养材料形成微环境的电镜图。

具体实施方式

一种三维细胞培养材料，所述三维细胞培养材料包括PEG8000@ Fe₃O₄和PEG400@ Fe₃O₄；二者的制备方法如下，

PEG8000@ Fe₃O₄的制备方法：

1）烷基化：取粒径为15~25nm的Fe₃O₄纳米球，加入有机物的氨水溶液，混匀，于8℃~10℃条件下反应16～20h，使Fe₃O₄纳米球表面被阳离子烷基化形成保护膜；

2）将烷基化的Fe₃O₄纳米球与磷酸化PEG8000水溶液混合，并通过氩气排除氧气，再加入金属盐，混匀在55～65℃条件下搅拌催化反应1～2h，即得PEG8000@ Fe₃O₄；

PEG400@ Fe₃O₄ 的制备方法与上述PEG8000@ Fe₃O₄的制备方法相同，除了将磷酸化PEG8000改用为磷酸化PEG400，其他均不变。

优选的，上述三维细胞培养材料还包括纳米粒NH₂@Fe₃O₄，其制备方法为：

1）烷基化：取粒径为100~200nm的Fe₃O₄纳米球，加入有机物的氨水溶液，混匀，于8℃~10℃条件下反应16～20h，使Fe₃O₄纳米球表面被阳离子烷基化形成保护膜；

2）氨基化：取上述烷基化后的Fe₃O₄纳米球加入到含氢氧化钠的氨水溶液中，混匀，使反应完全，即得氨基化的纳米粒NH₂@Fe₃O₄；

或者将烷基化后的Fe₃O₄纳米球加入纯正硅酸乙酯中，于14～18℃磁力搅拌18～22h对纳米粒进行包埋，洗脱包埋后的纳米颗粒，置于含氢氧化钠的氨水中反应完全，即得氨基化的纳米粒NH₂@Fe₃O₄。

优选的，上述有机物的氨水溶液中有机物的浓度为180～220g/L。

优选的，上述有机物为顺式十八碳-9-烯酸。

优选的，上述烷基化反应过程中往反应体系中通入惰性气体排除氧气。

优选的，步骤2）中烷基化的Fe₃O₄纳米球与磷酸化PEG8000水溶液的质量体积比为100g：(350~450)mL。

优选的，上述磷酸化PEG8000水溶液中PEG8000浓度为0.2~0.3g/mL。

优选的，上述磷酸化PEG8000水溶液的制备方法为将EG800和磷酸按摩尔比（0.8～1.2）: （0.8～1.2）加入入水中，反应完全后所得到的溶液，其中PEG8000浓度为0.2~0.3g/mL。

优选的，步骤2）中所述金属盐为CoCl₂，金属盐加入量为使其终浓度为0.18~0.22mol/L。

优选的，上述制得的PEG8000@ Fe₃O₄、PEG400@ Fe₃O₄分别经红外线灭菌后，再用稀盐酸清洗，洗后分别保存在PBS缓冲液中，备用。

优选的，上述骤2）中所述含氢氧化钠的氨水溶液中的氢氧化钠浓度为1.8～2.2%w/v。

三维细胞培养材料的应用，其特征在于：应用过程中的具体操作包括以下步骤：

1）取权利要求1中所述的PEG8000@Fe₃O₄、PEG400@ Fe₃O₄溶解到细胞培养基中，

2）将步骤1）中的培养基经超声波处理3~5min制备细胞培养空腔；

3）将需要培养的细胞加入到上述经超声波处理后的培养基中，混匀，在常规培养条下进行培养即可。

优选的，上述步骤1）中所述PEG8000@Fe₃O₄、PEG400@ Fe₃O₄、细胞培养基的用量比为（22~27）mg：（8~12）mg：（15~30）mL。

优选的，在步骤1）的操作过程中，根据所培养的细胞的需求，可以将培养过程中需加入的细胞因子先与权利要求2所述的纳米粒NH₂@Fe₃O₄进行反应，制得纳米粒状的细胞因子@Fe₃O₄，再将细胞因子@Fe₃O₄与PEG8000@Fe₃O₄、PEG400@ Fe₃O₄一起加入到细胞培养基中；

上述细胞因子@Fe₃O₄的具体制备过程为：将权利要求2所述纳米粒NH₂@Fe₃O₄和细胞因子加入甲醛溶液或者戊二醛溶液中，混匀，反应完全即可。

优选的，上述甲醛溶液或者戊二醛溶液的浓度均为3.5~4.5%w/v。

优选的，上述步骤1）中所述超声波处理的声强为280~320W/m²。

实施例 1 一种三维细胞培养材料的制备方法

1）取粒径分别为20nm、100nm的Fe₃O₄纳米球，且Fe₃O₄纳米球的饱和磁化强度在71emu/g及以上；将该两种粒径的Fe₃O₄纳米球分别加入浓度200g/LOleic acid（顺式十八碳-9-烯酸）的氨水溶液中，于8℃~10℃条件下，连续通氩气保持还原性催化反应16～20h，使纳米球表面被阳离子烷基化形成保护膜，反应完全后洗去氨水；

2）取100g烷基化的粒径为20nm 的Fe₃O₄纳米球加入400mL （使得球的含量为25%）PEG8000浓度为0.25g/mL的磷酸化PEG8000水溶液（即将PEG800和磷酸按摩尔比1:1加入入水中，反应完全后所得到的溶液，其中PEG8000浓度为0.25g/mL）；并通过氩气排除氧气，再加入金属盐（CoCl₂）使其浓度为0.2mol/L，以便吸取多余的氨和催化脂化反应，于55～65℃条件下磁力搅拌催化反应1～2h，使PEG的羟基和Oleic acid形成氧桥、PEG的磷酸基团和Oleic acid形成脂键，即可获得3D细胞培养纳米材料基质PEG8000@ Fe₃O₄；

按上述同样的方法，将PEG8000改用为PEG400，制得3D细胞培养纳米材料基质PEG400@ Fe₃O₄；

将上述获得的PEG8000@ Fe₃O₄、PEG400@ Fe₃O₄分别经红外线灭菌器照射10min。

用1M 50mL的稀盐酸清洗掉多余的未被包埋Fe₃O₄，洗后将沉淀分别保存在细胞培养级别的PBS缓冲液中，备用。

3）取25g烷基化的粒径为100nm 的Fe₃O₄纳米球加入100mL纯正硅酸乙酯中，于16℃搅拌2h，将Fe₃O₄纳米球进行包埋，将包埋后纳米颗粒洗脱，并晾干，再将包埋好的纳米球置入到含2%w/v氢氧化钠的氨水溶液中混匀，反应1～2h，即可得到氨基化的纳米粒NH₂@Fe₃O₄。

或者将25g烷基化的粒径为100nm 的Fe₃O₄纳米球加入到含2%w/v氢氧化钠的氨水溶液中，混匀，使反应完全（反应1～2h），即可得到氨基化的纳米粒NH₂@Fe₃O₄。

上述纳米粒NH₂@Fe₃O₄在4%w/v甲醛溶液或者4%w/v戊二醛溶液作用下，可以与蛋白（如细胞因子）结合。例如，在细胞培养中，需要细胞因子 IL6存在，可以在细胞培养前，将IL6蛋白（Sino Bio 购买）和NH₂@Fe₃O₄在4%w/v甲醛溶液反应 2小时，即得纳米粒IL6@Fe₃O₄，在细胞培养时将纳米粒IL6@Fe₃O₄加入到细胞培养基质中即可。

实施例 2 一种三维细胞培养材料的应用

本实施例利用上述实施例1制备的3D细胞培养材料进行间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）的培养，具体步骤如下：

1）细胞因子纳米粒的制备：取0.025g实施例1中制备的纳米粒NH₂@Fe₃O₄加入到1mL的4%w/v甲醛溶液中，混匀，再加入2mg细胞因子LIF，混匀，反应2小时，即得细胞因子纳米粒LIF@Fe₃O₄。（根据培养的特定细胞，可以制备成其他细胞因子纳米粒；而有些细胞培养时无需细胞因子的，则可省去该步细胞细因子纳米粒的制备。在本实施例是为了扩大间充质干细胞MSC的增殖培养，细胞因子LIF可以抑制干细胞MSC的分化，故制备纳米粒LIF@Fe₃O₄可以有效维持干细胞的细胞干性。）

2）3D细胞培养材料基质的准备：

分别取实施例1制备的PEG8000@Fe₃O₄ 25mg、PEG400@ Fe₃O₄10mg和纳米粒LIF@Fe₃O 0.5mg~1mg加入到10mL NutriStem® MSC XF Basal Medium培养基中，振荡混匀，再经300W/m²声强的超声波进行打孔处理3~5min，形成均一的三维空腔，并能产生和微环境大小相当的孔，便于直接混匀和种植细胞；最后将间充质干细胞MSC接种到培养基中，用微弱超声震荡1-2mim混匀。

3）培养：将上步细胞培养物置于细胞二氧化碳培养箱内下培养，也可以使用哺乳动物发酵的磁力搅拌器控温搅拌培养。其他培养条件与现有方法的培养条件相同。

下面对本实施例培养的细胞作相关的实验检测。

细胞数量与细胞干性检测

将上述培养2周后的细胞取出，检测细胞数量和培养后细胞的细胞干性。将培养2周后的上清用PBS溶出，收集上清，离心收集细胞，应用qRT-PCR方法检测的所培养的干细胞的标志物CD34，Endoglin / CD105，Vimentin的表达量，干细胞起始培养量为每皿10³个细胞。

2周后的细胞数量检测结果显示，本发明培养方法的活干细胞数量为每皿10⁵个；传统培养方法（纯培养基培养）的活干细胞数量为每皿10⁴个；说明本发明的培养方法可以有效地进行中小规模扩培干细胞，并保持活性，抑制分化。

qRT-PCR检测结果显示，应用本发明材料培养的干细胞中，CD34、Endoglin / CD105、Vimentin的表达量相对培养前只降低了约5%左右，而现有传统培养方法（纯培养基培养，培养基中也加有细胞因子LIF）培养相同时间后，干细胞中CD34、Endoglin / CD105、Vimentin的表达量相对培养前降低了约45%的左右。

上述结果说明，本发明的3D细胞培养材料在确保干细胞快速生长、增殖的条件下，还能很好地抑制干细胞分化，维持干细胞干性。

实施例 3 一种三维细胞培养材料的应用

分别取实施例1制备的PEG8000@Fe₃O₄ 25mg、PEG400@ Fe₃O₄10mg加入到10mL GIBICO的DMEM Basal Medium培养基中，振荡混匀，再经300W/m²声强的超声波进行打孔处理3~5min，形成均一的三维空腔，并能产生和微环境大小相当的孔，便于直接混匀和种植细胞；最后将人胚肾293T细胞接种到培养基中，用微弱超声震荡1-2mim混匀。

3）培养：将上步细胞培养物使用哺乳动物发酵的磁力搅拌器进行控温搅拌培养，其他培养条件与现有方示的培养条件相同。

下面对本实施例培养的细胞作相关的实验检测。

MTT 检测

培养一周后，MTT法检测细胞活力，检测结果显示实施例3培养的细胞活力比传统培养方法（纯培养基培养）的细胞活力高40%。

上述检测结果说明，本发明的三维细胞培养材料可以很好地维持细胞的活力。

扩大培养检测

按照实施例3中所述的方法扩大培养人胚肾293T细胞（记为实施例3组），起始培养量为每皿10³个细胞，培养5天后检测细胞数量，同时设立对照组，对照组为现有传统培养方法（纯培养基培养）。

检测结果显示，实施例3组中的活细胞数量为每皿10¹²个细胞，SEM=5%；而对照组的数量为10⁷个细胞。

上述实验结果表明，该材料可以应用哺乳动物细胞的大规模培养。为工程病毒的生产，抗体的生成提供的在发酵阶段提供了新的方法。

实施例 4 一种三维细胞培养材料的应用

实验组1：按照实施例3所述的操作，培养人胚肾293T细胞；

对比组1：用含30%w/v鼠尾胶原蛋白的GIBICO的DMEM培养基培养人胚肾293T细胞；

对比组2：用含30%w/v明胶（geltin）的GIBICO的DMEM基础培养基培养人胚肾293T细胞；

对比组3：用纯培养基（即GIBICO的DMEM基础培养基）培养293T细胞。

上述各组中所培养的细胞数目、培养基总体积等其他条件均相同。

培养4天后，在各组培养基中加入等量的染料MitoTracker® Red CMXRos（该染了可以染线粒体，只显示活细胞），混匀，再培养3天，然后用吸光光度计检测各组培养基600nm红光淬灭情况。

检测结果显示，应用到本发明材料的实验组1的红光淬灭率为细胞培养起始的15%，含鼠尾胶原蛋白的对比组1的淬灭率为细胞培养起始的45%，含明胶（geltin）的对比组2的淬灭率为细胞培养起始的30%，仅用GIBCO培养基的对比组3的淬灭率为达70%。

上述结果说明应用本发明三维细胞培养材料进行细胞培养，可以有效维持细胞的活力，使细胞在培养过程尽可能持有原有的活性，远远优于现有传统培养方法。

实施例 5 三维细胞培养材料的稳定性检测及其电镜检测

分别取实施例1制备的PEG8000@Fe₃O₄ 25mg、PEG400@ Fe₃O₄10mg加入到10mL GIBICO的DMEM培养基中，振荡混匀，再经300W/m²声强的超声波进行打孔处理3~5min，形成均一的三维空腔，并能产生和微环境大小相当的孔，便于直接混匀和种植细胞；然后放置在37℃恒温箱中2周后，检测培养基的pH情况，并在电镜条件下检测PEG8000@Fe₃O₄和PEG400@ Fe₃O₄在培养基中形成的微结构。

pH检测结果如图1所示，从中可以看出含有本发明材料的细胞培养基GIBICO的pH值在2周内基本稳定不变，而只有GIBICO的培养基时，其的pH值在2周内不断上升，不断碱化。说明本发明3D细胞培养材料有利于细胞培养液的稳定，更有利于细胞的生长和增殖。也说明了本发明PEG束胶的惰性特性可以有利于其他的添加物发挥相应的生物效应，不会发生副效应。

电镜检测结果如图2所示，从中可以看出白色支状的为PEG8000的束胶结构，周围裹着PEG400，以增加流动性和粘合度；从图中还可以看出，PEG8000@Fe₃O₄和PEG400@ Fe₃O₄在形成的微结构中，存在许多三维空腔，有利于细胞在空腔中生长，利于细胞因子纳米粒在之间运动。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种三维细胞培养材料，其特征在于：所述三维细胞培养材料包括PEG8000@ Fe₃O₄和PEG400@ Fe₃O₄；二者的制备方法如下，

PEG8000@ Fe₃O₄的制备方法：

1）烷基化：取粒径为15~25nm的Fe₃O₄纳米球，加入有机物的氨水溶液，混匀，于8℃~10℃条件下反应16～20h，使Fe₃O₄纳米球表面被阳离子烷基化形成保护膜；

2）将烷基化的Fe₃O₄纳米球与磷酸化PEG8000水溶液混合，并通过氩气排除氧气，再加入金属盐，混匀在55～65℃条件下搅拌催化反应1～2h，即得PEG8000@ Fe₃O₄；

PEG400@ Fe₃O₄ 的制备方法与上述PEG8000@ Fe₃O₄的制备方法相同，除了将磷酸化PEG8000改用为磷酸化PEG400，其他均相同。

2.根据权利要求1所述的一种三维细胞培养材料，其特征在于：所述三维细胞培养材料还包括纳米粒NH₂@Fe₃O₄，其制备方法为：

1）烷基化：取粒径为100~200nm的Fe₃O₄纳米球，加入有机物的氨水溶液，混匀，于8℃~10℃条件下反应16～20h，使Fe₃O₄纳米球表面被阳离子烷基化形成保护膜；

2）氨基化：取上述烷基化后的Fe₃O₄纳米球加入到含氢氧化钠的氨水溶液中，混匀，使反应完全，即得氨基化的纳米粒NH₂@Fe₃O₄；

或者将烷基化后的Fe₃O₄纳米球加入纯正硅酸乙酯中，于14～18℃磁力搅拌18～22h对纳米粒进行包埋，洗脱包埋后的纳米颗粒，置于含氢氧化钠的氨水中反应完全，即得氨基化的纳米粒NH₂@Fe₃O₄。

3.根据权利要求1或2所述的一种三维细胞培养材料，其特征在于：所述有机物的氨水溶液中有机物的浓度为180～220g/L；所述有机物为顺式十八碳-9-烯酸。

4.根据权利要求1所述的一种三维细胞培养材料，其特征在于：步骤2）中烷基化的Fe₃O₄纳米球与磷酸化PEG8000水溶液的质量体积比为100g：(350~450)mL；所述磷酸化PEG8000水溶液中PEG8000浓度为0.2~0.3g/mL。

5.根据权利要求1所述的一种三维细胞培养材料，其特征在于：步骤2）中所述金属盐为CoCl₂，金属盐加入量为使其终浓度为0.18~0.22mol/L。

6.根据权利要求1所述的一种三维细胞培养材料，其特征在于：所制得的PEG8000@ Fe₃O₄、PEG400@ Fe₃O₄分别经红外线灭菌后，再用稀盐酸清洗，洗后分别保存在PBS缓冲液中，备用。

7.根据权利要求2所述的一种三维细胞培养材料，其特征在于：步骤2）中所述含氢氧化钠的氨水溶液中的氢氧化钠浓度为1.8～2.2%w/v。

8.三维细胞培养材料的应用，其特征在于：应用过程中的具体操作包括以下步骤：

1）取权利要求1中所述的PEG8000@Fe₃O₄、PEG400@ Fe₃O₄溶解到细胞培养基中，

2）将步骤1）中的培养基经超声波处理3~5min制备细胞培养空腔；

3）将需要培养的细胞加入到上述经超声波处理后的培养基中，混匀，在常规培养条下进行培养即可。

9.根据权利要求8中所述的三维细胞培养材料的应用，其特征在于：步骤1）中所述PEG8000@Fe₃O₄、PEG400@ Fe₃O₄、细胞培养基的用量比为（22~27）mg：（8~12）mg：（15~30）mL。

10.根据权利要求8中所述的三维细胞培养材料的应用，其特征在于：在步骤1）的操作过程中，根据所培养的细胞的需求，可以将培养过程中需加入的细胞因子先与权利要求2所述的纳米粒NH₂@Fe₃O₄进行反应，制得纳米粒状的细胞因子@Fe₃O₄，再将细胞因子@Fe₃O₄与PEG8000@Fe₃O₄、PEG400@ Fe₃O₄一起加入到细胞培养基中；

上述细胞因子@Fe₃O₄的具体制备过程为：将权利要求2所述纳米粒NH₂@Fe₃O₄和细胞因子加入甲醛溶液或者戊二醛溶液中，混匀，反应完全即可。