CN102286042A - 高纯度连翘苷的分离制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高纯度单体连翘苷的高速逆流色谱分离制备方法，该方法包括：制备连翘粗提物作为进样物；配制构成固定相、流动相的两相溶剂体系；使高速逆流色谱仪分离柱中充满固定相，再使主机转动，然后将流动相泵入柱内；由进样阀进样，根据紫外检测吸收峰接收目标组分。所述的溶剂体系由四个组分(A，B，C，D)构成，A组分为正构烷烃、环烷烃或卤代烷烃；B组分为卤代烷烃；C组分为脂肪醇；D组分为水。上相为固定相，下相为流动相。本方法可获得高纯度单体连翘苷，纯度均可达98％以上，且该方法能保证较高峰形分辨度，分离量大、分离环境温和、操作简便、目标化合物回收率高，易于推广使用。
Description
技术领域
本发明涉及一种连翘苷的分离制备方法，尤其涉及一种应用高速逆流色谱法(HSCCC)分离制备高纯度连翘苷的方法。
技术背景
连翘(Forsythia suspense(thumb.)Vah1)为木犀科连翘属植物。始载自《神农本草经》，其性苦，微寒。归肺、心、小肠经。功能清热解毒，消肿散结。用于痈疽，瘰疬，乳痈，丹毒，风热感冒，温病初起，温热入营，高热烦渴，神昏发斑，热淋尿闭。
连翘苷是一种木脂素单糖苷，是由连翘苷元与葡萄糖组成，在连翘药材中含量约为0.15％，是连翘药材的主要指标性成分。连翘苷具有抗氧化和降血脂及减肥的活性，对于预防动脉粥样硬化和冠心病等疾病具有一定的作用，也是连翘药材的活性成分之一。连翘苷结构式如下所示：
高速逆流色谱技术(High-speed Counter-current Chromatography，HSCCC)是20世纪90年代发展起来的一种新型液-液色谱分离方法。其原理是利用螺旋柱在行星运动时产生的离心力，使互不相溶的两相不断混合，同时保留其中的一相(固体相)，利用恒流泵连续输入另一相(流动相)，随流动相进入螺旋柱的溶质在两相之间反复分配，按分配系数的次序，被依次洗脱。在流动相中分配比例大的先被洗脱，反之，在固体相中分配比例大的后被洗脱。不同于传统液相色谱法，HSCCC分析方法不使用固相载体，因而避免了有效成分被固相载体的不可逆吸附和峰形拖尾等缺点；样品粗提物可直接进样分离，可以高效、快速和大制备量分离，分离纯化与制备可同步完成，有机溶剂消耗少，无损失、无污染。基于以上优点，HSCCC色谱仪无论是作为分析型仪器还是制备型仪器，在天然产物上具有广阔的开发前景和实际的应用意义，它可以从复杂的天然粗制品中提取不同特性的有效成分，为天然药物的发展提供了有利条件。
在本发明之前，还没出现应用高速逆流色谱法(HSCCC)分离出高纯度连翘苷的公开报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种高纯度连翘苷的高速逆流色谱分离制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
一种高纯度连翘苷的分离制备方法，该方法采用高速逆流色谱技术，包括如下步骤：
(1)制备连翘粗提物作为进样物；
(2)配制构成固定相、流动相的两相溶剂体系，该溶剂体系由四个组分A，B，C，D构成，A组分为正构烷烃、环烷烃或卤代烷烃，B组分为卤代烷烃，C组分为脂肪醇，D组分为水，将该溶剂体系混匀静置分层后，以上相为固定相，下相为流动相；
(3)使高速逆流色谱仪分离柱中充满固定相，再使主机转动，然后将流动相泵入柱内；或者将固定相和流动相同时泵入柱内，再使主机转动；
(4)由进样阀进样，根据紫外检测吸收峰接收目标组分，经分离后可得到连翘苷。
步骤(2)中，所述的正构烷烃为正己烷；所述的环烷烃为环己烷；
所述的卤代烷烃为四氯化碳或氯仿；所述的脂肪醇为甲醇或乙醇。优选地，
所述的溶剂体系由以下A，B，C，D组分组成：所述的A组分为正己烷、环己烷或四氯化碳，所述的B组分为氯仿，所述的C组分为甲醇，所述的D组分为水。
步骤(2)中，所述的溶剂体系中A，B，C，D四项组分的体积比依次为(0-2)∶(1-4)∶(1-4)∶(1-3)，例如0.2∶3.8∶4∶2或2∶3∶3∶2等。当其中的A组分比例变为0时，溶剂体系变为氯仿-甲醇-水体系。溶剂体系优选氯仿-甲醇-水体系且优选体积比为4∶3∶2，以上相为固定相，下相为流动相。
按体积比将各溶剂置于分液漏斗中，摇匀静置分层。待平衡一段时间后，将上相(固定相)和下相(流动相)分开。采用TBE-300A型高速逆流色谱仪，柱容积119ml，进样圈为10ml，purifier P-900泵，UV检测器，HX-1050恒温循环器。流动相进样前，先用固定相充满整个柱子，调整主机转速为600-999rpm，以1-3mL/min的流速将流动相泵入柱内；或者固定相和流动同时泵入柱内，待溶剂充满整个柱子后，调整主机转速为600-999rpm。
主机转速越高，固定相保留率越高，但转速越高，越易产生乳化现象。当转速在800-999r/min范围内，分离效果较好，在此范围内改变转速，对结果无太大影响，故优选900r/min。
流动相流速越小，固定相保留值越高，分离效果好。当流速在1-1.5mL/min范围内，分离效果较好，当流速为1.2mL/min，分离度最佳，故优选流速为1.2mL/min。
本发明适合温度20-30℃。在上述温度范围内，温度较低时，出峰时间略有提前，分离效率变化不大，对峰形无多大影响。
经过体系的一次分离后收集到的连翘苷经蒸干后，经甲醇溶剂重结晶后为无色针状结晶。
本发明具有以下有益效果：本发明应用高速逆流色谱法分离连翘苷，采用优选的溶剂体系、调整主机转速和流速的工艺条件，使分离效率提高，获得高纯度的连翘苷；同时被分离物回收率高，理论达100％，本发明实际达到90％以上；并且本发明的分离制备方法适合于各种工艺途径制备的连翘粗提物，能保证较高峰形分辨度、分离量大、分离环境温和、节约溶剂、操作简便，最后得到的连翘苷固体经HPLC(高压液相色谱)检测，纯度均在98％以上。
附图说明
图1是本发明实施例1的HSCCC-UV检测图谱；
图2是本发明实施例2的HSCCC-UV检测图谱；
图3是本发明实施例3的HSCCC-UV检测图谱；
图4是本发明实施例4的HSCCC-UV检测图谱；
图5是本发明实施例5的HSCCC-UV检测图谱；
图6是本发明实施例6的HSCCC-UV检测图谱。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述：
实施例1
将连翘粉碎为粗粉，取100g粗粉加入1000mL 75％乙醇，回流提取2次，分别为2小时、1小时，提取液过滤，旋转蒸干，浸膏备用。
从体系中选取正己烷-氯仿-甲醇-水在半制备型高速逆流色谱仪上来分离制备连翘苷。按0.5∶3.5∶2.8∶2.2体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相(固定相)和下相(流动相)分开，实验条件温度20℃。采用TBE-300A型高速逆流色谱仪，配有purifier P-900泵，UV检测器，HX-1050恒温循环器。称取25mg进样物溶于10mL流动相中待用。进样前，用固定相充满整个分离柱，调整主机转速为900rpm，以2.0mL/min的流速将流动相泵入柱内直至建立动态平衡，由进样阀进样；然后根据277nm的UV值检测图谱，接收目标成分。HSCCC-UV图谱如图1所示，峰I为连翘苷。目标馏分蒸干后，经甲醇重结晶后得无色晶体，经HPLC-UV的检测，纯度在98％以上。
实施例2
将连翘粉碎为粗粉，取100g粗粉加入1000mL 75％乙醇，回流提取2次，分别为2小时、1小时，提取液过滤，旋转蒸干，浸膏备用。
从体系中选取四氯化碳-氯仿-乙醇-水在半制备型高速逆流色谱仪上来分离制备连翘苷。按0.2∶3.8∶4∶2体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相(固定相)和下相(流动相)分开，实验条件温度20℃。采用TBE-300A型高速逆流色谱仪，配有
purifier P-900泵，UV检测器，HX-1050恒温循环器。称取100mg进样物溶于10mL流动相中待用。进样前，用固定相充满整个分离柱，调整主机转速为900rpm，以3.0mL/min的流速将流动相泵入柱内直至建立动态平衡，由进样阀进样；然后根据277nm的UV值检测图谱，接收目标成分。HSCCC-UV图谱如图2所示，峰I为连翘苷。目标馏分蒸干后，经甲醇重结晶后得无色晶体，经HPLC-UV的检测，纯度在98％以上。
实施例3
将连翘粉碎为粗粉，取100g粗粉加入1000mL 75％乙醇，回流提取2次，分别为2小时、1小时，提取液过滤，旋转蒸干，浸膏备用。
从体系中选取氯仿-甲醇-水在半制备型高速逆流色谱仪上来分离制备连翘苷。按4∶3∶2体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相(固定相)和下相(流动相)分开，实验条件温度20℃。采用TBE-300A型高速逆流色谱仪，配有
purifier P-900泵，UV检测器，HX-1050恒温循环器。称取100mg进样物溶于10mL流动相中待用。进样前，用固定相充满整个分离柱，调整主机转速为900rpm，以1.2mL/min的流速将流动相泵入柱内直至建立动态平衡，由进样阀进样；然后根据277nm的UV值检测图谱，接收目标成分。HSCCC-UV图谱如图3所示，峰I为连翘苷。目标馏分蒸干后，经甲醇重结晶后得无色晶体，经HPLC-UV的检测，纯度在99％以上。
实施例4
将连翘粉碎为粗粉，取100g粗粉加入1000mL 75％乙醇，回流提取2次，分别为2小时、1小时，提取液过滤，旋转蒸干，浸膏备用。
从体系中选取环己烷-氯仿-甲醇-水在半制备型高速逆流色谱仪上来分离制备连翘苷。按1∶3∶3∶2体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相(固定相)和下相(流动相)分开，实验条件温度30℃。采用TBE-300A型高速逆流色谱仪，配有
purifier P-900泵，UV检测器，HX-1050恒温循环器。称取50mg进样物溶于10mL流动相中待用。进样前，用固定相充满整个分离柱，调整主机转速为600rpm，以1.2mL/min的流速将流动相泵入柱内直至建立动态平衡，由进样阀进样；然后根据277nm的UV值检测图谱，接收目标成分。HSCCC-UV图谱如图4所示，峰I为连翘苷。目标馏分蒸干后，经甲醇重结晶后得无色晶体，经HPLC-UV的检测，纯度在98％以上。
实施例5
将连翘粉碎为粗粉，取100g粗粉加入1000mL 75％乙醇，回流提取2次，分别为2小时、1小时，提取液过滤，旋转蒸干，浸膏备用。
从体系中选取氯仿-乙醇-水在半制备型高速逆流色谱仪上来分离制备连翘苷。按1∶1∶1体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相(固定相)和下相(流动相)分开，实验条件温度20℃。采用TBE-300A型高速逆流色谱仪，配有
purifier P-900泵，UV检测器，HX-1050恒温循环器。称取120mg进样物溶于10mL流动相中待用。进样前，用固定相充满整个分离柱，调整主机转速为800rpm，以1.0mL/min的流速将流动相泵入柱内直至建立动态平衡，由进样阀进样；然后根据277nm的UV值检测图谱，接收目标成分。HSCCC-UV图谱如图5所示，峰I为连翘苷。目标馏分蒸干后，经甲醇重结晶后得无色晶体，经HPLC-UV的检测，纯度在98％以上。
实施例6
将连翘粉碎为粗粉，取100g粗粉加入1000mL 75％乙醇，回流提取2次，分别为2小时、1小时，提取液过滤，旋转蒸干，浸膏备用。
从体系中选取四氯化碳-氯仿-甲醇-水在半制备型高速逆流色谱仪上来分离制备连翘苷。按2∶4∶4∶3体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相(固定相)和下相(流动相)分开，实验条件温度25℃。采用TBE-300A型高速逆流色谱仪，配有
purifier P-900泵，UV检测器，HX-1050恒温循环器。称取150mg进样物溶于10mL流动相中待用。进样前，用固定相充满整个分离柱，调整主机转速为999rpm，以1.2mL/min的流速将流动相泵入柱内直至建立动态平衡，由进样阀进样；然后根据277nm的UV值检测图谱，接收目标成分。HSCCC-UV图谱如图6所示，峰I为连翘苷。目标馏分蒸干后，经甲醇重结晶后得无色晶体，经HPLC-UV的检测，纯度在98％以上。
Claims (9)
1.一种高纯度连翘苷的分离制备方法，其特征在于，该方法采用高速逆流色谱技术，包括如下步骤：
(1)制备连翘粗提物作为进样物；
(2)配制构成固定相、流动相的两相溶剂体系，该溶剂体系由四个组分A，B，C，D构成，A组分为正构烷烃、环烷烃或卤代烷烃，B组分为卤代烷烃，C组分为脂肪醇，D组分为水，将该溶剂体系混匀静置分层后，以上相为固定相，下相为流动相；
(3)使高速逆流色谱仪分离柱中充满固定相，再使主机转动，然后将流动相泵入柱内；或者将固定相和流动相同时泵入柱内，再使主机转动；
(4)由进样阀进样，根据紫外检测吸收峰接收目标组分，经分离后可得到连翘苷。
2.如权利要求1所述的高纯度连翘苷的分离制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的正构烷烃为正己烷；所述的环烷烃为环己烷；所述的卤代烷烃为四氯化碳或氯仿；所述的脂肪醇为甲醇或乙醇。
3.根据权利要求1所述的高纯度连翘苷的分离制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的溶剂体系中A，B，C，D四项组分的体积比依次为(0-2)∶(1-4)∶(1-4)∶(1-3)。
4.根据权利要求1-3任一项所述的高纯度连翘苷的分离制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的溶剂体系由以下A，B，C，D组分组成：所述的A组分为正己烷、环己烷或四氯化碳，所述的B组分为氯仿，所述的C组分为甲醇，所述的D组分为水。
5.如权利要求1所述的高纯度连翘苷的分离制备方法，其特征在于，步骤(3)和步骤(4)中，所述主机的转速控制在600～999rpm/min之间，分离温度为20～30℃，流动相流速控制在1～3mL/min。
6.如权利要求5所述的高纯度连翘苷的分离制备方法，其特征在于，所述的主机转速为900rpm/min，分离温度为20℃，流动相流速为1.2mL/min。
7.如权利要求4所述的高纯度连翘苷的分离制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的溶剂体系由以下B，C，D组分组成：B组分为氯仿，C组分为甲醇，D组分为水。
8.如权利要求7所述的高纯度连翘苷的分离制备方法，其特征在于，所述的溶剂体系中B，C，D组分的体积比依次为4∶3∶2。
9.如权利要求1所述的高纯度连翘苷的分离制备方法，其特征在于：步骤(4)完成后，将经分离得到的连翘苷的组分蒸干后，连翘苷经甲醇溶剂重结晶后为无色针状结晶。
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