CN102283905A

CN102283905A - 防治鱼类水霉病的中草药复方制剂及其应用

Info

Publication number: CN102283905A
Application number: CN2011101915837A
Authority: CN
Inventors: 盛竹梅; 黄文�; 殷守仁; 何川; 杨华莲; 贾丽; 沈钦一
Original assignee: BEIJING AQUACULTURE NUTRITION RESEARCH CENTRE
Current assignee: BEIJING AQUACULTURE NUTRITION RESEARCH CENTRE
Priority date: 2011-07-08
Filing date: 2011-07-08
Publication date: 2011-12-21
Anticipated expiration: 2031-07-08
Also published as: CN102283905B

Abstract

本发明公开了一种防治鱼类水霉病的中草药复方制剂及其应用，其各成分质量比为：黄芩22-28％、苦参22-28％、麻黄22-28％、辣蓼22-28％。本发明与化学药物相比，具有下列优点：一是无毒，使用后无毒副作用；二是由于中草药抗菌作用的协同性和广谱性，所以不会对病菌产生抗药性。

Description

防治鱼类水霉病的中草药复方制剂及其应用

技术领域：

本发明涉及一种防治水生动物疾病的药物，尤其是防治鱼类真菌性疾病的药物。

背景技术：

鱼类细菌性和真菌性疾病是我国水产养殖中危害最大的两类鱼病，据统计，北京地区近年来真菌性、细菌性疾病发病率占全年总发病率的65％，直接造成经济损失2000多万元。由于这两类疾病发病广危害大，而目前国内外针对细菌性、真菌性鱼病并发症的有效药物不多，多年来一直采用孔雀石绿等化学药物进行治疗。特别是孔雀石绿，因其价格低廉，具有杀菌等作用，曾广泛用于水产动物的真菌、细菌性(往往出现真菌性疾病并发症)等疾病的防治。

孔雀石绿是一种合成的三苯甲烷类工业染料，自1933年证实孔雀石绿具有抗菌、杀虫等药效以来，许多国家曾将其广泛用作驱虫剂和杀菌剂，以杀灭水产动物体外的寄生虫、原生动物和鱼卵中的霉菌等，是药用染料中抗菌效力较强的一类。从1990年代开始，国内外学者陆续研究发现，孔雀石绿及其代谢产物无色孔雀石绿在鱼体内和环境中残留时间长，被确证具有致癌、致畸、致突变等毒副作用。鉴于此，美国、加拿大、日本、欧盟等许多国家都将其列为水产养殖禁用药物。我国于2002年5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中，但由于孔雀石绿抗菌效果好、价格低廉、对其毒副作用的宣传力度不够等原因，在水产养殖中仍有违规使用的情况。2005年6月5日在英国超市出售的鲑鱼体内检出孔雀石绿后，许多国家和地区也相继在水生动物中发现其残留，并迅速做出反应，孔雀石绿成为继“苏丹红1号”之后食品安全的又一热点问题。因此研究代替孔雀石绿防治水生动物疾病效果的药物迫在眉睫。

目前市场上的硫脒杀星和霉病力克虽然对真菌病有一定的疗效，但都不太理想。因此，研发可代替孔雀石绿的药物势在必行。中草药取自天然的动植物，资源丰富，价格低廉，加工简易方便，无毒无副作用，被作为“绿色渔药”日益广泛地应用在水生动物病害防治上，发展前景广阔。

发明内容：

本发明鉴于当前鱼类水霉病防治中化学药物所带来的不良影响，提供一种具有“绿色药品”的中草药配方制剂，其成分质量比为：

黄芩22-28％、苦参22-28％、麻黄22-28％、辣蓼22-28％。

本发明中采用的中草药均具有杀虫、抑菌、消炎和清热解毒等作用，常用于真菌性疾病的防治。

本发明采用将各中草药混合，粉碎，过80目筛网，制成粉剂。

使用方法，制成药饵或煎煮后泼洒。

用量：可以将制剂混入饲料中，按饲料质量的1-2％添加，建议采用1-1.5％添加，因为这样成本低且效果不会明显下降；或按照浓度为1.5-2ppm，计算好制剂重量，加3倍水煎煮，在水开后再煎煮20分钟后，将药液和药渣混合物直接泼洒到水体中，这样成本低且有较好的防治效果。其中2ppm即药剂与水体质量比为2∶1000000(百万分之二)。

本发明与化学药物相比，具有下列优点：一是无毒，使用后无毒副作用；二是由于中草药抗菌作用的协同性和广谱性，所以不会对病菌产生抗药性。

具体实施方式

急性毒力试验

取150g的该制剂用蒸馏水浸泡4h，用大火烧开后用中火煎20min，过滤药液后，再煎第二剂，两剂合并经灭菌200目筛绢过滤除去药渣，用三角锥瓶浓缩成100ml，制成浓度为1.5g/ml的药液。于灭菌的容器内4℃保存备用。

试验鱼选用体质健康，没有疾病体重为75±5g的锦鲤，每组10尾，共260尾鱼。试验鱼暂养7天，无死亡出现。在120L的水族箱内注入81L水，曝气48h，试验在20℃恒温下进行。于背鳍基部注射，注射深度为0.2cm左右。在注射后的4d内停食，停气，停水。观察记录24h、48h、72h、96h鱼的死亡情况。制剂设0.5ml、1ml、1.5ml、2ml四个浓度梯度，外加一个注射灭菌生理盐水作为对照组，同时设平行组。试验结果取重复组的平均值，试验组出现死亡时死亡率根据Abbott公式修正：

P＝(P1-C)/(1-C)

试验结果表明制剂的安全浓度为0.13g/L，即130ppm。

制剂浸泡对鲫鱼非特异免疫力的影响

1)实验设计

将实验鱼分成五个组，正式实验时，将制剂按质量分数加入饲料，配制成0(对照组)、0.5％(A组)、1.0％(B组)、2.0％(C组)。实验期间的进行虹吸、投饲等管理，在试验进行的第3、7、14、21、28d采血进行非特异性免疫指标的测定，采血方式为鱼尾静脉采血。

2)测定指标和方法

分别于实验后第3、7、14、21、28d各取样一次，每次每组随机取鲫5条，先用MS-222快速麻醉，然后用注射器于尾静脉处采血。将每尾鱼的血液分为2份，1份加肝素抗凝，供测定白细胞吞噬活性和NBT阳性细胞检测；1份置于室温下，待凝血后分离血清，供测定血清杀菌、溶菌酶活性测定，同时解剖取脾脏并称重。

血清溶菌酶活性：

溶菌酶活性的测定采取Parry等的方法。用0.067mol/L PBS(pH＝6.4)将溶壁微球菌配成0.2mg/mL的菌悬液，每个样品取3mL菌悬液，吸取40μL血清加入到3mL菌悬液中，混合后立即在540nm下测定A0值，然后在28℃水浴中温浴30min，取出后置于4℃水浴终止反应，再测定A值，按U＝(A0-A)/A计算溶菌酶活力。

血清杀菌活性：

参照Ainsworth等方法。利用计数板，将嗜水气单胞菌用生理盐水配制成10⁶cfu/mL的菌悬液。将50μL血清加入到等量菌悬液中，22℃孵育5h之后，将混合液倍比稀释，不同稀释度各取10μL加于平板培养基上，28℃孵育过夜，计数平板菌落数。用50μL生理盐水代替50μL血清加入等量菌悬液作为阳性对照。结果用杀菌百分率表示。

杀菌百分率(％)＝(1-试验组CFU/对照组CFU)×100％

NBT阳性细胞检测：

主要根据修改后的Anderson的方法进行。取50μL血细胞滴于盖玻片上，于温和中培养30min后，在0.067mol/L PBS(pH＝6.4)中轻轻洗涤盖玻片以完全去除红细胞，然后在载玻片上滴50μL0.2g/L NBT溶液，将盖玻片反扣在NBT溶液上，于温盒中温育30min，直接于40×10的显微镜下观察结果，计数100各细胞，记录阳性细胞数，呈棕黑色者为阳性细胞，并计算出阳性细胞比率。

血液白细胞吞噬活性：

参照Chen等的方法，在0.5mL抗凝血中加入0.2mL金黄色葡萄球菌液液(含菌量为3.0×10⁹cfu/mL)，置于25℃培养箱中培养1h，3000r/min离心15min，取沉淀底层物抹片，甲醇固定，姬姆萨氏染液染色，镜检，计数并计算白细胞的吞噬活性。

白细胞吞噬百分比(PP)＝吞噬葡萄球菌的白细胞数/白细胞总数×100％

脾脏质量指数：

每次采血后取试验鱼的脾脏，测定其脏器系数。先用吸水纸吸干鱼体表的液体，称量试验鱼体重，再摘取脾脏，用吸水纸吸干表面液体，立即在电子秤上称重。脾脏重量与体重之比即为脾脏质量指数。

血清皮质醇浓度：

采用放射免疫法(RIA)，用试剂盒测定。试剂盒购自北京北方生物技术研究所。

实验数据处理：

采用了SPSS 13.0和EXCEL 2007软件。

3)试验结果

血清溶菌酶活性

实验开始后第3d，实验组的血清溶菌酶活性显著高于对照组(P＜0.05)，而实验组间转移不显著(P＞0.05)，在第7d，各实验组间差异显著(P＜0.05)，随着时间的推移，对照组血清溶菌酶活性维持在稳定水平，实验组均有不同程度的上升，其中C组上升最明显，B组次之，A组最小。整个实验期间，实验组的血清溶菌酶活性显著高于对照组(P＜0.05)。

血清杀菌活性

实验的第3d，实验组的血清杀菌活性均高于对照组，只有C组显著高于对照组(P＜0.05)，各实验组间差异不显著(P＞0.05)；在第7d，各实验组显著高于对照组(P＜0.05)，C组显著高于A组(P＜0.05)而与B组差异不显著(P＞0.05)，A组与B组差异不显著(P＞0.05)第14d差异显著性与第7d相同。

NBT阳性细胞数目

整个实验期间，对照组的NBT白细胞数目几乎没有变化，各实验组的NBT阳性细胞数目是显著高于对照组的(P＜0.05)，并且随着时间推移，各实验组的NBT阳性细胞数目呈上升趋势，浓度越高越明显。在第3d，A组与B组无显著差异(P＞0.05)，C组显著高于A组(P＜0.05)；在第7d，各实验组间均差异显著(P＜0.05)；第14d的显著性水平和第7d相同。

白细胞吞噬活性

从实验第3d起，实验组的白细胞吞噬活性显著高于对照组(P＜0.05)，随着实验的推移，对照组白细胞吞噬活性没有明显变化，各实验组白细胞吞噬活性水平在一定时期内事不断上升的，在21d后有所下降。在第3d，各实验组间差异显著(P＜0.05)；在第7d，A组与B组差异不显著(P＞0.05)，C组显著高于A组和B组；第14d显著性水平与第7d相同。

脾脏指数

各实验组间无显著性差异。

从上可以得出制剂用量：可以将制剂混入饲料中，按饲料质量的1-2％添加，更好采用1-1.5％添加，因为这样成本低且效果不会明显下降。

4、中草药配方中各药物质量比为：黄芩25％、苦参25％、麻黄25％、辣蓼25％。

投加方式：直接泼洒到水体中，浓度为2ppm。

在北京市通州区选取池塘分别为：对照组393亩、预防组400亩、治疗组407亩。在同一个养殖场分别设置对照组、预防组和治疗组。对照组和预防组分别选在疾病高发季节尚未发病的池塘。治疗组在试验前进行采样，通过肉眼诊断和镜检确定为真菌性水霉病，且选取发病率在40-60％以上的池塘。

试验结果表明，对照池塘在疾病高发季节，平均发病率为45-60％，死亡率为16-58％；预防池塘在疾病高发季节，平均发病率为10％，死亡率为0；治疗池塘经过两次药物泼洒后，症状基本消失，体表水霉菌消退恢复为正常的体色，治愈率达到86.5％以上，有效率100％。预防组的发病率和死亡率低于对照组，治疗组则有显著的治疗效果。

5、中草药配方中各药物质量比为：黄芩22％、苦参22％、麻黄28％、辣蓼28％。

投加方式：按照泼洒使用方法，经煎煮后直接泼洒到水体中，浓度为2ppm。

在北京市顺义区选取精养草鱼池塘分别为：对照组100亩、治疗组120亩。在同一个养殖场分别设置对照组和治疗组。对照组选在疾病高发季节尚未发病的池塘。治疗组在试验前进行采样，通过肉眼诊断和镜检确定为真菌性水霉病，且选取发病率在40％以上的池塘。

试验结果表明，对照池塘在疾病高发季节，平均发病率为45-55％，死亡率为18-45％；治疗池塘经过两次药物泼洒后，症状基本消失，体表水霉菌消退恢复为正常的体色，治愈率达到80％以上，有效率100％。

另外本发明应用到多个区都取得了良好治疗效果，产生了很好的经济效益，甚至对水质改善有一定好处。

Claims

1.一种防治鱼类水霉病的中草药复方制剂，其特征在于：由以下中草药配制而成：黄芩、苦参、麻黄、辣蓼。

2.根据权利要求1所述防治鱼类水霉病的中草药复方制剂，其中草药各成分含量质量比为：黄芩22-28％、苦参22-28％、麻黄22-28％、辣蓼22-28％。

3.根据权利要求1所述防治鱼类水霉病的中草药复方制剂的应用，其特征在于：将上述各中草药混合，粉碎，过80目筛网，制成粉剂，然后将制剂混入饲料中或经过煎煮后泼洒到水体中；

将制剂混入饲料中，按饲料质量的1-2％添加，

或将制剂经过煎煮泼洒到水体中，泼洒浓度为1.5-2ppm。