CN104367907B - 一种中草药羊蜱抗虫剂及其制备与使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种中草药羊蜱抗虫剂，它由按质量配比为2:2:1的中草药百部、苦楝皮和青蒿制成。制备时先将质量配比为2:2:1的百部、苦楝皮和青蒿按量称重混合成质量份数为200‑500份的中药方剂，加入质量份数为2500‑3000份的水浸泡后，水煎1次，每次30分钟，过滤，再加重量份数5倍于药量的水盖过滤渣，再煮沸30分钟后再次过滤，将两次滤液合并浓缩至2.0g/ml最后瓶装并在116℃温度条件下高压灭菌30分钟后进行冷藏。采用在羊身喷雾喷淋或中草药药浴的方法使用。

Description

一种中草药羊蜱抗虫剂及其制备与使用方法
技术领域
本发明涉及畜牧兽医技术领域，具体涉及一种中草药羊蜱抗虫剂及其制备与使用方法。
背景技术
蜱是动物体表常见的一类外寄生虫，广泛分布于世界各地，可叮咬人类、哺乳动物、鸟类、爬行类及两栖类。蜱的危害直接表现为被叮咬动物骚动不安和伤口感染而致的生产性能下降，大量寄生时，蜱分泌的毒素引起动物麻痹，造成蜱瘫。此外，蜱是莱姆病、斑疹热、Q热、森林脑炎、出血热、巴贝斯虫病、泰勒虫病和无浆体病等疾病的传播媒介，其在某些自然疫源性疾病流行中发挥的作用仅次于蚊类。蜱及蜱传病给人类健康和动物生产带来的威胁，已成为全球医学界和兽医学界倍加关注的公共卫生问题。国内外均有牛羊蜱虫危害及控制方案的报道。通常选择溴氰菊脂、螨净、敌百虫等药液进行喷洒、药浴或洗刷，以杀死牛羊身上的蜱类，每年2~3次。也可按每千克体重0.2～0.3mg皮下依维菌素注射。但长期使用这类杀虫剂会带来毒性残留和耐药性产生，给生态环境带来潜在威胁。蜱在畜牧业业中危害和滥用化学杀虫剂带来的负面影响，研究开发中草药驱避剂或杀虫剂并推广应用有一定现实意义。
发明内容
本发明的目的是针对羊蜱危害的问题，以及采用溴氰菊脂、螨净、敌百虫等药液杀灭羊蜱容易造成的毒性残留和耐药性产生的问题，提供一种中草药羊蜱抗虫剂及其制备方法与使用方法。
本发明的技术方案如下：
本发明先提出了一种中草药羊蜱抗虫剂，它由中草药百部、苦楝皮和青蒿制成。进一步的，它由按质量配比为2:2:1的中草药百部、苦楝皮和青蒿制成。
这种中草药羊蜱抗虫剂的制备方法是：先将质量配比为2:2:1的百部、苦楝皮和青蒿按量称重混合成质量份数为200-500份的中药方剂，加入质量份数为2500-3000份的水浸泡后，水煎1次，每次30分钟，过滤，再加重量份数5倍于药量的水盖过滤渣，再煮沸30分钟后再次过滤，将两次滤液合并浓缩至2.0g/ml最后瓶装并在116℃温度条件下高压灭菌30分钟后进行冷藏。
这种中草药羊蜱抗虫剂的制备方法是：采用在羊身喷淋或中草药药浴的方法使用；喷淋按2.0g/ml的药物浓度使用，分别于首次喷淋后的24小时和72小时后各重复一次；中草药药浴按0.2g/ml药物浓度使用，药浴时间为一分钟左右，浸泡部位包括羊头在内的羊全身。
本项发明专利选择具有润肺止咳杀虫功效的百部和驱虫疗癣的苦楝皮与具有清热解暑，出蒸疗疟功效的青蒿按2:2:1的比例组成中草药抗蜱配方,该杀蜱剂不仅具有较强的抵抗畜禽体表寄生虫蜱的危害、也可抑制以蜱传播媒介的血液寄生虫焦虫的侵袭，为畜禽体表寄生虫和血液原虫杀虫药的研发提供了一种新的中草药配方、制剂及其制备和使用方法，从而解决现有技术中采用采用溴氰菊脂、螨净、敌百虫等药液杀灭羊蜱容易造成的毒性残留和耐药性产生的一系列问题。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：
一种中草药羊蜱抗虫剂，由按质量配比为2:2:1的中草药百部、苦楝皮和青蒿制成。
制备方法：先将质量配比为2:2:1的百部、苦楝皮和青蒿按量称重混合成质量份数为200份的中药方剂，加入质量份数为2500份的水浸泡后，水煎1次，每次30分钟，过滤，再加重量份数5倍于药量的水盖过滤渣，再煮沸30分钟后再次过滤，将两次滤液合并浓缩至2.0g/ml最后瓶装并在116℃温度条件下高压灭菌30分钟后进行冷藏。
使用方法：按2.0g/ml的药物浓度在羊身进行喷淋使用，分别于首次喷淋后的24小时和72小时后各重复一次。
实施例2：
一种中草药羊蜱抗虫剂，由按质量配比为3:4:2的中草药百部、苦楝皮和青蒿制成。
制备方法：先将质量配比为3:4:2的百部、苦楝皮和青蒿按量称重混合成质量份数为300份的中药方剂，加入质量份数为2800份的水浸泡后，水煎1次，每次30分钟，过滤，再加重量份数5倍于药量的水盖过滤渣，再煮沸30分钟后再次过滤，将两次滤液合并浓缩至2.0g/ml最后瓶装并在112℃温度条件下高压灭菌30分钟后进行冷藏。
使用方法：按2.0g/ml的药物浓度在羊身进行喷淋使用，分别于首次喷淋后的24小时和72小时后各重复一次。
实施例3：
一种中草药羊蜱抗虫剂，由按质量配比为3:2:1的中草药百部、苦楝皮和青蒿制成。
制备方法：先将质量配比为3:2:1的百部、苦楝皮和青蒿按量称重混合成质量份数为300份的中药方剂，加入质量份数为3000份的水浸泡后，水煎1次，每次30分钟，过滤，再加重量份数5倍于药量的水盖过滤渣，再煮沸30分钟后再次过滤，将两次滤液合并浓缩至1.5g/ml最后瓶装并在121℃温度条件下高压灭菌20分钟后进行冷藏。
使用方法：按1.5g/ml的药物浓度在羊身进行喷淋使用，分别于首次喷淋后的36小时和84小时后各重复一次.
实施例4：
一种中草药羊蜱抗虫剂，由按质量配比为1:1:1的中草药百部、苦楝皮和青蒿制成。
制备方法：先将质量配比为1:1:1的百部、苦楝皮和青蒿按量称重混合成质量份数为500份的中药方剂，加入质量份数为2500份的水浸泡后，水煎1次，每次30分钟，过滤，再加重量份数5倍于药量的水盖过滤渣，再煮沸30分钟后再次过滤，将两次滤液合并浓缩至2.5g/ml最后瓶装并在115℃温度条件下高压灭菌15分钟后进行冷藏。
使用方法：按2.5g/ml药物浓度进行羊全身药浴使用，药浴时间为60s，浸泡部位包括羊头在内的羊全身，浸泡过程中注意使羊及时换气以免造成呼吸障碍。
实施例5：
一种中草药羊蜱抗虫剂，由按质量配比为2:1:1的中草药百部、苦楝皮和青蒿制成。
制备方法：先将质量配比为2:1:1的百部、苦楝皮和青蒿按量称重混合成质量份数为400份的中药方剂，加入质量份数为3500份的水浸泡后，水煎1次，每次30分钟，过滤，再加重量份数4倍于药量的水盖过滤渣，再煮沸30分钟后再次过滤，将两次滤液合并浓缩至2.0g/ml最后瓶装并在110℃温度条件下高压灭菌20分钟后进行冷藏。
使用方法：按2.0g/ml药物浓度进行羊全身喷雾使用，喷雾时间为80s，喷雾部位包括羊头在内的羊全身。
实施例6：
一种中草药羊蜱抗虫剂，由按质量配比为3:4:3的中草药百部、苦楝皮和青蒿制成。
制备方法：先将质量配比为3:4:3的百部、苦楝皮和青蒿按量称重混合成质量份数为300份的中药方剂，加入质量份数为3000份的水浸泡后，水煎1次，每次15分钟，过滤，再加重量份数4倍于药量的水盖过滤渣，再煮沸15分钟后再次过滤，将两次滤液合并冷却至37℃
使用方法：按2.0g/ml药物浓度进行羊全身浇泼使用，使药物有效杀灭羊蜱。
实施例7：
该中草药配方由按质量配比为2:2:1的中草药百部、苦楝皮和青蒿制成，加入雄黄少许。
制备方法：先将质量配比为2:2:1的百部、苦楝皮和青蒿按量称重混合成质量份数为200g的中药方剂，加入质量份数为2500g的水浸泡后，水煎1次，每次15分钟，过滤，再加重量份数4倍于药量的水盖过滤渣，再煮沸15分钟后再次过滤，将两次滤液合并冷却至40℃，再加入雄黄0.8g。
使用方法：按照2.0g/ml药物浓度对羊全身进行涂抹，使药物有效杀灭羊蜱。
实施例8：
本发明的中草药羊蜱抗虫剂用于杀灭焦虫病上的应用：
该中草药配方由按质量配比为2:2:1的中草药百部、苦楝皮和青蒿制成。
制备方法：先将质量配比为2:2:1的百部、苦楝皮和青蒿按量称重混合成质量份数为200份的中药方剂，加入质量份数为2500份的水浸泡后，水煎1次，每次15分钟，过滤，再加重量份数4倍于药量的水盖过滤渣，再煮沸15分钟后再次过滤，将两次滤液合并冷却至30℃
使用方法：按2.5g/ml药物浓度进行羊全身药浴使用，药浴时间为60s，浸泡部位包括羊头在内的羊全身，在药浴过程中进行适量口服药物。
下面给出一个试验例以验证本发明的技术效果：
试验例1：
1材料和方法：
1.1 .1仪器设备：接种环；酒精灯；打孔器；牛津杯；移液器；滴头；载玻片；酸度计（德国）；超纯水器（10L）；控温、控湿全自动生化培养箱；卧式高压消毒柜；超生波裂解仪；欧林巴氏显微镜系列；二氧化碳培养箱 (sanyo公司)；倒置显微镜 (Olympus )；超净工作台；自动酶标读数仪 ( E2500型, 美国Bio-Rad)；96孔板；酶标板。
1.1.2主要试剂：
培养基L-15粉末（GBICO）；TC100(HyClone)培养基干粉；胎牛血清（杭州四季青）；MTT试剂盒（南京凯基）；二甲基亚砜（Amresco公司）；姬氏染液。
1.1.3试验动物：
1.1.3.1昆明小鼠120只,雌雄各半,体重(20±2) g ,购于贵阳医学院试验动物中心,适应环境1周后进入正式试验。
1.1.3.2山羊：
贵州花溪、清镇、修文、龙里、天柱几个养羊基地养羊场、养羊户饲养的白山羊、波杂羊、黑山羊、简阳大耳羊、绵羊、南江黄羊2000余只。
1.1.3.3蜱：
采集贵州部分羊场璃眼蜱属残缘璃眼蜱、血蜱属二棘血蜱和方头蜱属微小牛蜱400头。
1.1.3.中草药：
润肺下气止咳、杀虫功效的百部；驱虫疗癣、虫积腹痛的苦楝根皮；清热解暑，出蒸疗疟的青蒿。
1.1.4 试验地点：贵州省畜牧兽医研究所；贵州部分养羊场。
1. 2方法：
1.2.1 基本处方配制：百部、苦楝根皮、青蒿中草药均由当地药材批发市场购入，按2:2:1组成中草药抗蜱方剂。加工（60目）粉粹包装待用。
1.2.2中草药驱避剂的制备：先将以上中草药按量称重混合，即中药方剂200-500克，加水2500-3000毫升浸泡后，水煎1次，每次30分钟，过滤，再加5倍于药量的水盖过滤渣，再煮沸30分钟纱布过滤，将两次滤液合并浓缩至2g/ml最后瓶装116℃，高压灭菌30分钟,放入4℃冰箱备用。
1.2.3中草药驱避剂抗虫安全性检测：
中草药在推广应用前检验其安全性与毒性。试验动物为小鼠；测定半数致死量LD50 ；试验结果按简化寇氏法进行计算。
1.2.3.1昆明小白鼠的饲养：自由饮水, 自由采食，定时通风,湿度保持60%,光照和黑暗时间各12h。小白鼠配方饲料由贵阳医学院提供。
1.2.3.2预备试验：取小鼠20只, 按序贯法进行预备试验, 连续观察7d，测定鼠腹腔注射100%致死率。
1.2.3.3 取体重( 20±2 )g健康小白鼠80只,随机分组, 每组10只, 雌雄各半,试验前禁食不禁水12h,试验时以适当剂量一次性腹腔注射染毒, 注射量为0.2mL/20g体重, 组数为8, 剂距为1.6, 染毒2h后给食, 观察7天。记录各组小鼠的中毒症状, 死亡时间和死亡数。计算LD50。
1.2.4中草药驱避剂使用方法与抗虫效果检测试验：
1.2.4.1中草药驱避剂对蜱细胞活性的影响：
1.2.4.1.1蜱细胞培养基配置：
分别取双蒸水1升溶解L-15粉末（1袋）、L-天冬氨酸（2.25×10-3）、L-谷氨酸（3.40×10-3）、L-谷氨酰胺（2.0×10-3）、L-脯氨酸（2.61×10-3），ɑ-酮戊二酸（2.05×10-3）、D-葡萄糖（12.43×10-3）、CoCl·6H2O（8.43×10-9）、CuSO4· 5H2O（8.0×10-9）、MnSO4·H2O（9.5、×10-8）ZnSO4·7H2O（7.0×10-8）、NaMoO4·2H2O（8.3×10-9）、NaSeO3（1.2×10-8）、谷胱甘肽（3.3×10-5）、维生素C（7.5×10-5）、FeSO4·7H2O（1.8×10-6）、氨苯甲酸（7.3×10-3）、维生素B12（3.7×10-4）、生物素（4.1×10-4），用1mol/L氢氧化钠调pH至6.4-6.6，配好后过滤处菌（滤孔为0,2um）。
1.2.4.1.2蜱细胞培养：
蜱细胞于25-28℃条件下培养（无需CO2）。先后称取2.09克培养基L-15粉末（GBICO）或TC100培养基干粉，倒入1L三蒸水中，磁力搅拌器搅拌，加0.035克NaHCO3,调PH值至6.3，在超净工作台中倒入抽滤过滤器，真空泵抽滤除菌。过滤除菌的细胞培养液原液在使用前添加10%灭活胎牛血清。添加双抗（100U/mL青霉素，100U/mL链霉素），3天传代1次。
收集饱血雌蜱，分别用自来水冲洗，70%乙醇消毒、无菌蒸馏水洗各2-3次，然后置于六孔板中产卵，用自制绢纱袋收集卵块，卵块用蒸馏水冲洗二次，放入5%新洁尔灭中泡10分钟，水冲洗后用含的70%乙醇消毒5分钟，去离子水和L-15B培养液漂洗，将绢纱袋放入盛有2-3ml的3cm的平皿中，用玻棒碾碎卵块，用3ml培养液冲洗，将平皿中的细胞悬液1000r/min离心10min，去上清。取4ml全细胞培养液冲打成细胞悬液后，分别取2ml接种2个瓶，先37过夜，在28温箱中培养4周乃至几月，每6-10天换液一次，获得圆形细胞待用。
1.2.4.1.3 MTT法对施药前后蜱细胞活性检测：
取蜱细胞，细胞计数器计数，保证细胞浓度为 4×104个/孔,接种于96孔培养板,每孔180μl。边缘孔设立为不加细胞只加培养液的空白对照孔, 并设立阴性对照组（有细胞但不加药物），置入细胞培养箱,培养 24h待细胞进入对数生长期，加入不同浓度中草药蜱虫驱避剂使终浓度分别为：0.01、0.1、0.5、1.0、1.5%、2.0g/ml培养，每个处理设3个重复，分别于24h、48h、72h、96h，每孔加入MTT (5 mg/ml)溶液20μl,继续培养4 h后中止培养,离心去上清,加入150μL二甲基亚砜溶液,室温下振荡器振荡 10 min,自动酶标仪比色 (波长490 nm)。测定吸光值 (A)，并计算细胞存活率和细胞抑制率（细胞抑制率%=药物组平均吸光度值-空白组值 /阴性对照组平均吸光度值-空白组值）×100% , 细胞存活率% =（100%-细胞抑制率）× 100%。
1.2.4.2中草药驱避剂对蜱虫的影响：
1.2.4.2.1用药前后蜱形态结构观察：
在养殖场采集寄生节肢动物，对蜱虫形态结构和种类进行观测分析。寄生在山羊体表的蜱，用凡士林油类涂抹在蜱身上和叮咬处，然后小镊子捏取。直接在解剖镜下或低倍显微镜下观察形态结构。主要依据传统形态学，借助体视镜观察记录蜱虫的假头基、基突、须肢、盾板、侧沟、生殖孔、足基节、足转节、肛沟、气门板等形态学特征。
1.2.4.2.2本发明的中草药驱避剂的使用方法和对羊蜱的抗虫效果试验：
喷雾方法：将目标蜱虫盛入垫有湿滤纸的培养皿底，置于液体喷雾器低部，定量的药液均匀地直接喷洒在目标蜱体上，待药液较干稳定后，将喷过药的目标蜱虫移入干净的容器或培养皿内，置于适合目标蜱生活的环境条件中恢复，1-2h后，放入无药的新鲜饲料（TC100培养基干粉与10%灭活胎牛血清按100:1质量体积比比例混合），于规定的时间内（24、48h）观察蜱的中毒及死亡情况。
浸渍法：配置0.01%、0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%不同浓度梯度的药液。选取同性别、大小一致、虫龄相近的虫体160头，分成1、2、3、4、5、6、7、8个组，每组20头，第7组为无药对照组、第8组为药物对照组。用镊子取虫快速浸人不同浓度的药液中，再分别移到铺有9cm滤纸的培养皿上，让试虫在上面爬行。1-2h后，放入无药的新鲜饲料，于规定的时间内（24、48h）观察目标昆虫的中毒及死亡情况。按一定时间内以剂量表示。
1.2.4.2.3本发明的中草药羊蜱抗虫剂对羊蜱虫体抗虫效果试验：
选择贵州养羊户1000余只山羊，开展蜱害监测与中草药抗蜱剂药物防除试验，喷淋按2.0g/ml使用，分别于24小时、72小时后重复一次。中草药药浴按0.2g/ml药物浓度使用，药物对照组按2.5%溴氰菊脂25ppm药浴。药浴时间为一分钟左右，并注意浸泡羊头，大批羊药浴时，应随时添加药液。用药后若未发现虫体，则判断为阴性；若发现虫体，则判断为阳性。并计算虫体转阴率。虫体转阴率（%）=（驱虫后虫体转阴羊头数/驱虫前虫体阳性羊头数）×100%。
试验结果：
2.1本发明的中草药抗蜱剂对实验动物小白鼠毒性试验
测得小鼠腹腔注射100%致死率为264mg/kg、小鼠腹腔注射LD50为54.95mg/kg。比一般的植物杀虫剂如川楝素等毒性要低，使用较安全、方便。
2.2 浓度对蜱细胞增殖的影响
设置为0.01、0.1、0.5、1.0、2.0g/ml五个作用浓度，分别作用蜱细胞24～96h，测定各处理组活细胞的数目并测定OD值、成活率和抑制率。从0.1-2.0g/ml这一浓度范围，细胞成活率分别为64、55、44、38，与对照组（成活率100%）均有统计学差异（p<0.05），均表现出对蜱细胞抑制效应，但1.0- 2.0g/ml处理24h-48h抑制效果较好。
2.3本发明的中草药抗虫效果试验：
2.3.1本发明的中草药对蜱的体外抑制：
分别选取同性别、大小一致、虫龄相近的虫体160头，分成8个组，每组20头，配置0.01%-2%不同浓度梯度的中草药抗蜱药液，分别采用浸渍施药法与无药对照组和溴氰菊脂组进行体外抗虫试验（结果见表1）。
2.3.2中草药对蜱体外抑制
选择贵州养羊户1000余只山羊，开展蜱害监测与中草药抗蜱剂药物防除试验，计算虫体平均转阴率（结果见表2）。
3 结论：
本发明选择百部、苦楝皮和青蒿按2:2:1的比例组成中草药抗虫配方制剂, 形成制剂制备和使用方法。通过对山羊体表寄生虫蜱及其对以蜱为传播媒介的血液寄生虫焦虫驱虫试验表明：山羊体表寄生虫蜱的数量明显减少，瘙痒、暑热、黄疸，血红蛋白尿等焦虫病症状缓解。
本发明通过对中草药抗蜱剂毒性试验表明：测得小鼠腹腔注射100%致死率为264mg/kg、小鼠腹腔注射LD50为54.95mg/kg。应用MTT法采用不同浓度中草药抗蜱剂处理蜱细胞，分别测定相同时间不同浓度中草药抗蜱剂作用效果。结果表明：低浓度（0.01g/ml）对细胞活性(48h内)无抗虫效果；从0.1-2.0g/ml这一浓度范围，24h以上各药物组OD值与对照组均有统计学差异（p<0.05），表现明显抑制效应。在同一浓度，在72h内，随着时间的延长，细胞存活率下降明显，抑制作用明显增强。而且中草药抗蜱剂浓度达到0.1g/ml以上时，抑制蜱胚胎细胞生长效应明显，但在24-72h范围内差异较小，表明一定浓度范围内蜱细胞对中草药驱避剂作用剂量依赖性不强。采用浸渍施药法对蜱的体外抑制试验进一步表明：0.1-2 g/ml不同浓度梯度的中草药抗蜱药液与25ppm溴氰菊脂对蜱虫均有有抑制和杀灭作用；在蜱和焦虫病高发季节，选择感染蜱的山羊1000余只，采用喷雾喷淋法对贵州龙里、黔西、修文、天柱、花溪部分养羊场开展蜱害监测与中草药抗蜱剂药物防除试验，采用本发明的抗蜱中草药剂量按2.0g/ml对羊体直接喷雾喷淋，施药前后虫体平均转阴率（%）分别为94.05%、91.43%、87.80%、94.12%、84.21%。表明本发明的这种抗蜱中草药剂与溴氰菊脂对蜱害均有抗虫效果。
当然，以上只是本发明的具体制备与使用范例，本发明还有其他的实施方式，凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明所要求的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种中草药羊蜱抗虫剂，其特征在于：它由按质量配比为2:2:1的中草药百部、苦楝皮和青蒿制成。
2.一种如权利要求1所述的中草药羊蜱抗虫剂的制备方法，其特征在于：先将质量配比为2:2:1的百部、苦楝皮和青蒿按量称重混合成质量份数为200-500份的中药方剂，加入质量份数为2500-3000份的水浸泡后，水煎1次，每次30分钟，过滤，再加重量份数5倍于药量的水盖过滤渣，再煮沸30分钟后再次过滤，将两次滤液合并浓缩至2.0g/ml最后瓶装并在116℃温度条件下高压灭菌30分钟后进行冷藏。
3.一种如权利要求1所述的中草药羊蜱抗虫剂的使用方法，其特征在于：采用在羊身喷淋或中草药药浴的方法使用；喷淋按2.0g/ml的药物浓度使用，分别于首次喷淋后的24小时和72小时后各重复一次；中草药药浴按0.2g/ml药物浓度使用，药浴时间为一分钟左右，浸泡部位包括羊头在内的羊全身。
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