CN101926874A - 一种植物源杀菌剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种植物源杀菌剂及其制备方法，所述杀菌剂的组分为下列原料的水提物：虎杖、千里光、黄芩、黄柏和苦参；各原料水提物的体积比如下：虎杖液35-55%，黄芩液10-30%，千里光液5-25%，黄柏液5-30%，苦参液5-30%。将原料水提物分别配制成含生药浓度1g/L的溶液，按比例混合，即得到植物源杀菌剂。本发明的植物源杀菌剂，植物药来源于天然，为纯植物天然抗菌剂，具有不同于其它抗菌剂、洗液品种的无刺激性、无毒副作用、无残留、稳定和安全高效的特点。

Description

一种植物源杀菌剂及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体涉及药用植物抗菌成分提取及植物源杀菌剂的研制。

技术背景

化学杀菌剂的广泛使用带来了环境污染、残毒危害、病菌抗药、人畜安全受到威胁等一系列问题。从植物中寻找抑菌活性物质是开发无公害生物抗菌剂的一条有效途径，以此来缓解当前化学药物严重污染问题。中国药用植物资源十分丰富，其中许多植物具有强大的杀菌功能，为人类开发利用这些药用植物资源提供了便利的条件。

据统计，地球上的植物至少有50万种，而植物产生的次生代谢物质种类繁多，已超过40万种。Wilkins等曾报道有1389种植物有可能作为杀菌剂的原材料，Grange和Ahmed报道约有2400种植物具有防治有害生物的活性。目前人们认为具有抑菌、杀菌活性的植物，大部分资源集中在菊科、唇形科、木兰科、马兜铃科、蓼科、木犀科、百合科、葫芦科、莎草科、豆科、十字花科等植物中，除此之外还有樟科的肉桂、香叶树、暴马丁香、Thymbra spicata、Satureja thymbra、白桂等。

有关植物及其提取物的抗菌、抑菌作用已有相关的文献报道，主要集中在对人、动物的杀菌治疗和作为农作物杀菌剂的试验及应用研究。张薇等（2007）对植物挥发性物质的化学成分及其抵抗微生物的能力以及与生态学相关可能产生的增效作用进行了研究；索菲娅等（2006）对孜然挥发油、孜然醇提物、孜然水提物、孜然醇后水提物，用Bauer-Kirby 法实验探讨了各提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等7 种细菌和酵母菌的抑菌效果；司红彬等（2006）测定了黄连、鱼腥草、大青叶和苦参 4 味中药及其相互配比（1∶1）对标准大肠杆菌的最小抑菌浓度MIC值介于3.91～62.50mg/mL之间；陈枝岚等（2006）测定了黄连、黄柏、虎杖、丁香、石榴皮、七叶一枝花、五倍子、白头翁、仙鹤草、连翘、金银花、苦参、蛇床子、诃子等 14 味中药对白色念珠菌的抗菌作用，黄连的最小抑菌浓度为6.25mg/mL，黄柏、虎杖的最小抑菌浓度为25.00mg/mL，丁香、石榴皮、七叶一枝花、五倍子的最小抑菌浓度为50.00mg/mL；蔡金等（2006）测定了 20种具有抗菌消炎作用的中药水提物对啤酒酵母、假丝酵母、黑曲霉及拟青霉的抗菌活性，其中苦参总碱，黄芩提取物具有较强的抑菌活性，对假丝酵母的抑菌浓度小于0.00625g/mL；王德海等（2005）采用试管法和平板法，分别测定了 10种中草药对临床分离的一株鸡关节炎源性金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（MIC），发现黄连、大青叶、艾叶、连翘 4 种中草药体外抗菌效果更明显；陈文伟等（2005）检测了 8 种中草药对耐药金葡菌的最小抑菌浓度分别为：九节茶、白芍、黄芩为62.5mg/mL，丹皮、黄连、厚朴为15.6mg/mL，夏枯草为7.8mg/mL，诃子为1.0mg/mL；王兴华等（2005）测定了多种药用植物及不同复方对 4 种植物病原菌的MIC，复方药物的最佳组方为：雷公藤5g、蛇床子10g、大黄5g、苦参10g、马齿苋10g、黄柏10g、黄芩10g，对4种植物病原菌的MIC分别为：黄瓜黑斑病菌3.2%，青椒枯萎病菌5.0%，黄瓜枯萎病菌4.4%，禾谷类作物病菌3.0%；刘志春等（2004）测定了五味子等 29 种中草药对金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌、绿脓杆菌的抑菌作用，其中五味子的抑菌作用最强，抑菌圈最大者达40mm，MIC为6.25~10.00mg/mL；王理达等（2001）对 13 种生药的醇提物及 13 种单体化合物进行啤酒酵母突变性GL7和威克海姆原藻的敏感性测试，结果发现黄柏、丁香、乌梅、黄连、山豆根对二者均有强烈抑制作用。

发明内容

本发明提供了一种植物源杀菌剂及其制备方法，以虎杖、千里光、黄芩、黄柏、苦参等植物为原材料，通过独特的配方工艺，研发出杀菌力强、无毒副作用的纯植物天然抗菌制剂产品。

本发明的植物源杀菌剂，其组分为下列原料的水提物：虎杖、千里光、黄芩、黄柏和苦参；各原料水提物的体积比如下：虎杖液35-55%，黄芩液10-30%，千里光液5-25%，黄柏液5-30%，苦参液5-30%。

所述各原料水提物优选的体积比如下：虎杖液45%，黄芩液20%，千里光液15%，黄柏液10%，苦参液10%。

所述原料的水提物是在原料中加入10～30倍原料重量（w/v）的水，在80～100℃下水提1～3h，提取2～3次，合并提取液，得到原料的水提物。

其中虎杖液为虎杖：加水比1∶10（w/v），在100℃下水提2~3h，提取2~3次；千里光液为千里光：加水比1∶30（w/v），在100℃下水提2~3h，提取1~2次；黄芩液为黄芩：加水比1∶10（w/v），在100℃下水提2~3h，提取2~3次；

黄柏液为黄柏：加水比1∶15（w/v），在100℃下水提1~2h，提取2~3次；苦参液为苦参：加水比1∶12（w/v），在100℃下水提1~2h，提取1~2次。

将虎杖、黄芩、千里光、黄柏和苦参的水提物分别配制成含生药浓度1g/L的溶液，按比例混合，即得到植物源杀菌剂。

由于该产品为纯植物天然抗菌剂，故具有不同于其它抗菌剂、洗液品种的无刺激性、无毒副作用、无残留、稳定和安全高效的特点。

本发明植物源杀菌剂的主要技术指标如下：

（1）棕色半透明液体，并有微量不溶物沉淀；略带酸味，无其他杂味；

（2）pH值（1∶10溶液）7.0~8.5，总固体含量0.1~2%，汞≤1mg/kg，砷≤10mg/kg，铅≤40mg/kg；

（3）对4种致病菌（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌、淋球菌）的抑菌率达100%，具有较强的抑菌作用；

（4）小鼠急性经口毒性试验、家兔皮肤刺激试验和皮肤变态反应试验表明，“植物源杀菌剂”稳定、安全、无毒副作用；

（5）可用于垃圾、污水的杀菌、除臭。

本发明的特点：

1．纯植物制剂：以虎杖、千里光、黄岑、黄柏、苦参等植物为原材料，产品稳定、安全、无残留、无毒副作用。

2．杀菌效果显著：对4种致病菌——金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌、淋球菌的抑菌率达100%；对生活垃圾和污水中细菌的杀菌效果显著。

3．植物源杀菌剂除可应用于外科抗菌消炎外，还可广泛应用于对生活垃圾、粪便、污水、公共厕所的杀菌除臭，达到杀菌、防病和改善生态环境的作用，提高人们的生活质量。且用量少，每吨垃圾只需用本产品10公斤，每m³污水只需用本产品50mL，就可有效杀灭其中存在的细菌，达到除臭的目的。

本发明的显著优点：

植物源杀菌剂的优势特色与抗生素等的比较，主要体现在药效的整体性和药源的天然性两方面。其一，西药大多数是化学合成的，成分单一；而植物药来源于天然，大多含有复杂的化学成分，由多味植物药配伍组成的复方，其化学成分就更复杂；多种化学成分作用于动物体，往往会产生多元组合效应。其二，由于植物药绝大多数来自天然，因而具有许多天然的属性，如化学成分组合的天然合理性，功效的整体性和双向性，以及毒副作用小，不易导致病原微生物产生抗耐药性，很少在动物体内形成有害残留等。植物药的这些天然属性是许多西药所没有的。

具体实施方式

实施例1 植物源杀菌剂配方优化

1．药用植物的筛选

通过市场调查和查阅相关文献资料，选取药理作用比较接近、并在药理上有互补性的虎杖、千里光、黄芩、黄柏、苦参等植物作为原材料。

2．药用植物的浸提条件研究

以浸膏得率为指标，采用L₉（3⁴）正交表设计正交实验，研究提取温度、提取时间、提取次数、原料加水比对各原料浸膏得率的影响。

（1）虎杖

表1-1 因素水平表

表1-2 正交实验结果

表1-3 方差分析表

如表1-1、1-2、1-3所示，方差分析结果表明，因素A（提取温度）和因素D（原料加水比）影响显著，因素作用的主次顺序D→A→C→B，最佳工艺条件为A₃B₂C₃D₁，即加水比1∶10，在100℃下提取2h，提取3次。在此条件下进行验证实验，浸膏得率为17.13%，高于正交设计的9批试验，因此该条件确为最佳条件。

（2）千里光

表2-1 因素水平表

表2-2 正交实验结果表2-3 方差分析表

如表2-1、2-2、2-3所示，方差分析结果表明，因素A（提取温度）影响极其显著，因素B（提取时间）影响显著，因素作用的主次顺序A→B→D→C，最佳工艺条件为A₃B₁C₁D₃，即加水比1∶30，在100℃下提取2h，提取1次。在此条件下进行验证实验，浸膏得率为12.07%，高于正交设计的9批试验，因此该条件确为最佳条件。

（3）黄芩

表3-1 因素水平表

表3-2 正交实验结果

表3-3 方差分析表

如表3-1、3-2、3-3所示，方差分析结果表明，因素A（提取温度）和因素B（提取时间）影响显著，因素作用的主次顺序A→B→C→D，最佳工艺条件为A₃B₃C₃D₂，即加水比1∶10，在100℃下提取2h，提取3次。在此条件下进行验证实验，浸膏得率为15.31%，高于正交设计的9批试验，因此该条件确为最佳条件。

（4）黄柏

表4-1 因素水平表

表4-2 正交实验结果

表4-3 方差分析表

如表4-1、4-2、4-3所示，方差分析结果表明，因素A（提取温度）影响显著，因素作用的主次顺序A→C→D→B，最佳工艺条件为A₃B₂C₃D₃，即加水比1∶15，在100℃下提取1.5h，提取3次。在此条件下进行验证实验，浸膏得率为7.79%，高于正交设计的9批试验，因此该条件确为最佳条件。

（5）苦参

表5-1 因素水平表

表5-2 正交实验结果

表5-3 方差分析表

如表5-1、5-2、5-3所示，方差分析结果表明，因素B（提取时间）影响极其显著，因素A（提取温度）影响显著，因素作用的主次顺序B→A→D→C，最佳工艺条件为A₃B₃C₁D₃，即加水比1∶12，在100℃下提取2h，提取1次。在此条件下进行验证实验，浸膏得率为11.93%，高于正交设计的9批试验，因此该条件确为最佳条件。

小结：确定药用植物的最佳提取条件分别为：

虎杖的提取条件：加水比1∶10，在100℃下水提2h，提取3次，浸膏得率为17.13%；

千里光的提取条件：加水比1∶30，在100℃下水提2h，提取1次，浸膏得率为12.07%；

黄芩的提取条件：加水比1∶10，在100℃下水提2h，提取3次，浸膏得率为15.31%；

黄柏的提取条件：加水比1∶15，在100℃下水提1.5h，提取3次，浸膏得率为7.79%；

苦参的提取条件：加水比1∶12，在100℃下水提2h，提取1次，浸膏得率为11.93%。

3．药用植物的配伍

以对革兰氏阳性菌—金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌—大肠杆菌的抑菌活性为指标，采用L₁₄（4⁵）正交表设计正交实验，研究虎杖、黄芩、千里光、黄柏、苦参提取物不同配比对抑菌活性的影响，如表6、7所示。

将虎杖、黄芩、千里光、黄柏和苦参的水提物分别配制成含生药浓度1g/L的溶液，按一定比例混合，高压蒸汽灭菌（8磅，10min）后检测其对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌生长的抑制作用。抑菌活性采用纸片法测定抑菌圈直径/mm。

表6 因素水平表

表7 正交实验结果

确定最佳配方的重量比例为：虎杖液45%，黄芩液20%，千里光液15%，黄柏液10%，苦参液10%。根据此配方研制而成的“植物源杀菌剂”对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为250mg/L。

实施例2 抑菌试验

分别以金黄色葡萄球菌ATCC 6538P、大肠杆菌ATCC 25922P、白色念珠菌、淋球菌为实验菌株，起始菌数均为5.0×10⁵-5.0×10⁶ cfu/mL；取实施例1制得的植物源杀菌剂10%稀释液，分别与上述实验菌株作用5min，杀菌率达100%。

有机物存在时的杀菌试验：以受1%人血清保护的金黄色葡萄球菌ATCC 6538P为实验菌株，起始菌数为5.0×10⁵-5.0×10⁶ cfu/mL；取植物源杀菌剂10%稀释液作用5min，杀菌率达100%。

植物源杀菌剂稳定性试验：取植物源杀菌剂置54℃水中保温2h，配制10%稀释液，与金黄色葡萄球菌ATCC 6538P（起始菌数为5.0×10⁵-5.0×10⁶ cfu/mL）作用10min，杀菌率达100%。

实施例3 对生活垃圾的杀菌效果

取生活垃圾500g，分别用5mL实施例1制得的植物源杀菌剂和5mL经过10倍稀释后的杀菌剂均匀喷洒，作用5min后，加入无菌水，搅拌均匀，适当稀释后，涂布于营养琼脂平板上，在37℃下培养48h，计算活菌数，与对照（不加植物源杀菌剂）相比，计算杀菌率。结果显示，当“植物源杀菌剂”药物浓度为10%时，对生活垃圾中细菌的杀灭率就可达81%。

实施例4 对污水的杀菌效果

取500mL池塘污水，加入20uL实施例1制得的植物源杀菌剂，混合均匀，作用5min，振荡均匀，经适当稀释后，涂布于营养琼脂平板上，在37℃下培养48h，计算活菌数，与对照（不加植物源杀菌剂）相比，计算杀菌率。结果显示，“植物源杀菌剂”对污水中细菌的杀灭率可达98%。

实施例5 安全性试验

植物源杀菌剂对小白鼠急性经口毒性试验半致死剂量为LD₅₀＞5000mg/kg BW，属实际无毒；对家兔皮肤一次完整皮肤刺激反应强度级别为零，属无刺激性。

实施例6 理化分析

取实施例1制得的植物源杀菌剂进行理化分析，结果如表8所示。

表8 植物源杀菌剂产品的理化分析

Claims (5)

1.一种植物源杀菌剂，其特征在于：所述杀菌剂的组分为下列原料的水提物：虎杖、千里光、黄芩、黄柏和苦参；各原料水提物的体积比如下：虎杖液35-55%，黄芩液10-30%，千里光液5-25%，黄柏液5-30%，苦参液5-30%。

2.根据权利要求1所述的植物源杀菌剂，其特征在于：所述各原料水提物的体积比如下：虎杖液45%，黄芩液20%，千里光液15%，黄柏液10%，苦参液10%。

3.根据权利要求1或2所述的植物源杀菌剂，其特征在于：所述原料的水提物是在原料中加入10～30倍原料重量（w/v）的水，在80～100℃下水提1～3h，提取2～3次，合并提取液，得到原料的水提物。

4.根据权利要求3所述的植物源杀菌剂，其特征在于：所述原料的水提物中虎杖液为虎杖：加水比1∶10（w/v），在100℃下水提2~3h，提取2~3次；

所述千里光液为千里光：加水比1∶30（w/v），在100℃下水提2~3h，提取1~2次；

所述黄芩液为黄芩：加水比1∶10（w/v），在100℃下水提2~3h，提取2~3次；

所述黄柏液为黄柏：加水比1∶15（w/v），在100℃下水提1~2h，提取2~3次；

所述苦参液为苦参：加水比1∶12（w/v），在100℃下水提1~2h，提取1~2次。

5.一种如权利要求1、2、3或4所述的植物源杀菌剂的制备方法，其特征在于：将虎杖、黄芩、千里光、黄柏和苦参的水提物分别配制成含生药浓度1g/L的溶液，按比例混合，即得到植物源杀菌剂。