CN102272583A - 荧光寿命测量设备、荧光寿命测量方法和程序 - Google Patents

Abstract

提供了用于以简单配置获取荧光寿命的荧光寿命测量设备、荧光寿命测量方法以及程序。移动在其上放置了要测量的荧光材料的平台，将激励光施加到以恒定速度移动的在平台上放置的荧光材料，捕获通过施加激励光发射的荧光的余光的图像；以及使用捕获的图像测量从在作为对象的余光位置中的荧光位置开始的经历时间以及其中余光的强度，并且计算荧光寿命。

Description

荧光寿命测量设备、荧光寿命测量方法和程序

技术领域

本发明涉及荧光寿命测量设备、荧光寿命测量方法和程序，其用于使用检测由激励光的照射引起的发射光的寿命的技术领域。

背景技术

传统上，已经提出荧光寿命测量设备，其以脉冲式激励光照射在小单元内支撑的样本，使用光电倍增管(photomultiplier tube)或者高速扫描照相机(streak camera)测量由激励光引起的发射的荧光的时间波形，并根据测量结果获得荧光寿命(例如，参见专利文献1)。

现有技术文献

专利文献1JP-A-2001-349833

发明内容

然而，光电倍增管或者高速扫描照相机本身相对大，这使得这种荧光寿命测量设备整体上大。此外，在这种荧光寿命测量设备中，使用用于以脉冲式激励光照射的光源，而光电倍增管或者高速扫描照相机需要根据来自光源的照射定时驱动，这就需要光电倍增管或者高速扫描照相机的复杂并且耗时的调整处理。

鉴于上述原因，本发明提出了种荧光寿命测量设备、荧光寿命测量方法和程序，其可以使用简单的配置获得荧光寿命。

为了解决上述问题，本发明提供了荧光寿命测量设备，包括：移动装置，用于移动其上放置了要测量的荧光材料的平台；照射装置，用于以激励光照射由移动装置以恒定速度移动的、在平台上放置的荧光材料；成像装置，用于对由激励光引起的发射的荧光的余光成像；以及荧光寿命计算装置，用于使用由成像单元成像的图像以检测在目标余光位置的从荧光位置开始经历时间以及余光强度，并且计算荧光寿命。

此外，本发明还提供了荧光寿命测量方法，包括：移动控制步骤，用于移动在其上放置了要测量的荧光材料的平台；照射步骤，用于以激励光照射通过移动控制步骤的控制以恒定速度移动的、在平台上放置的荧光材料；成像步骤，用于对由激励光引起的发射的荧光的余光成像；以及荧光寿命计算步骤，用于使用在成像步骤成像的图像检测在目标余光位置的从荧光位置开始经历时间以及余光强度，并且计算荧光寿命。

此外，本发明还提供了程序，用于使得移动控制装置移动在其上放置了要测量的荧光材料的平台；使得照射装置以激励光照射由移动控制装置以恒定速度移动的、在镜头上放置的荧光材料；使得成像装置对由激励光引起的发射的荧光的余光成像；以及使得计算单元使用成像装置成像的图像以检测在目标余光位置的从荧光位置开始经历的时间以及余光强度，并且计算荧光寿命。

根据本发明，荧光寿命测量设备在移动方向以余光图像的形式捕获荧光寿命，这允许以普通照相机而不是光电倍增管或者高速扫描照相机获得短时段内发生的光的强度变化，从而得到荧光寿命的简单配置。

附图说明

图1示意性地示出荧光寿命测量设备的配置。

图2示意性地示出盘平台的结构。

图3示出光学系统的配置示例。

图4示意性地示出光接收面上的光束形状。

图5是示出测量单元的配置的框图。

图6是当照射激励光时的成像结果的照片。

图7是示出余光强度随时间的变化的曲线图。

图8是示出荧光寿命测量处理的流程图。

具体实施方式

下面将描述根据本发明的实施例。以下面的顺序进行描述：

<1.实施例>；

[1-1.荧光寿命测量设备的配置]；

[1-2.测量单元的具体配置]；

[1-3.荧光寿命测量处理]；

[1-4.效果等]；以及

<2.其他实施例>

<1.实施例>

作为根据本发明的实施例，描述荧光寿命测量设备。

[1-1.荧光寿命测量设备的配置]；

图1示出荧光寿命测量设备1的示意性配置。荧光寿命测量设备1包括：盘状平台(stage)(下面称为“盘平台”)2、激光光源3、光学系统4、聚焦控制单元5、成像单元6和测量单元7。

盘平台2通过提供在盘平台2的中心的通孔可拆卸地支撑在转轴SA上。图2示出盘平台2的结构。盘平台2具有层结构，其中，反射膜2B和荧光膜2C依次形成在盘基板2A的一个表面上。

盘基板2A由当为了激励荧光膜2C而照射光(下面称为“激励光”)时变得透明的材料形成，并且其厚度为例如约1.3mm。具体地说，例如，石英用作这种材料。

反射膜2B由可以引起预定量的界面反射的材料形成，并且其均匀厚度为例如约100nm。具体地说，例如，氧化钛用作这种材料，这样，当激励光的波长为405nm，并且盘基板2A由石英形成时，引起约20％的界面反射。

作为荧光寿命测量的目标，荧光膜2C由有机或者无机材料形成，并且具有例如约100nm的均匀厚度。

激光光源3的位置面对盘基板2A的表面不是其上形成反射膜2B的表面的表面，并且被配置为以对激励光照射荧光膜2C。该实施例中使用的激光光源3以波长为405nm、输出功率为1mW、而横模为TEM00的激励光进行照射。

光学系统4被配置为采集由激光光源3照射到盘基板2A和反射膜2B之间的界面上的激励光，并且将从该界面反射的光引导到聚焦控制单元5。图3示出光学系统4的特定配置示例。

在光学系统4中，作为平行于纸的平面的线性偏振光，从激光光源3发出的激光由准直仪透镜11转换为平行光，并且被引导到偏置光束分离器12。然后，在光学系统4中，已经通过偏置光束分离器12的激光由四分之一波长板13转换为圆偏振光，并且由物镜14采集到在盘基板2A与反射膜2B之间的界面上。

当激励光通过反射膜2B并且到达荧光膜2C时，激发形成为荧光膜2C的要测量的荧光材料，以在空间上各向同性地发射荧光。

此外，在光学系统4中，从盘基板2A和反射膜2B之间的界面反射的光被引导通过物镜14到四分之一波长板13，并且由四分之一波长板13转换为s偏振光。然后，在光学系统4中，将转换为s偏振光的反射光从偏置光束分离器12反射90°，并且引导通过聚光透镜15和圆柱形透镜16到聚焦控制单元5(图1)。

聚焦控制单元5包括光接收单元，用于接收从光学系统4引导的光。在此，图4示出在光接收单元的光接收表面上由光学系统4引导的光的形状。当焦点在盘基板2A与反射膜2B之间的界面上时，光的形状是圆形，如虚线所示。另一方面，当焦点偏离该界面时，因为在圆柱形透镜16发生的像差，光的形状是椭圆形，如交替的长、短点划线所示。具体地说，该椭圆形的长轴和短轴根据焦点达不到或超出盘基板2A与反射膜2B之间的界面而改变。

作为在划分的四个区域的每个中进行光电转换的结果，聚焦控制单元5根据从光接收单元获得的信号产生聚焦控制信号。具体地说，在图4所示的示例中，获得区域A至D的信号，然后，计算(A+D)-(B+C)以产生该聚焦控制信号。

聚焦控制单元5控制致动器，该致动器可以根据聚焦控制信号在光轴方向上移动，以移动在该致动器上提供的物镜14(图3)，使得焦点位于盘基板2A与反射膜2B之间的界面上。

成像单元6与盘平台2的荧光膜2C相对地设置，并且被配置为成像从荧光膜2C发射的荧光，并且将成像结果给予测量单元7作为成像数据。

测量单元7被配置为基于成像单元6给出的成像数据，来计算荧光寿命。

[1-2.测量单元的具体配置]

接着，具体描述测量单元7。图5示出测量单元7的示意性配置。测量单元7被配置为使得各种硬件装置经由总线22连接到CPU(中央处理单元)21。

作为硬件单元，测量单元7至少包括ROM(只读存储器)23、作为CPU21的工作存储器的RAM(随机存取存储器)24以及接口25。在该实施例中，测量单元7还包括用于根据用户操作输入指令的输入装置26、显示器27和存储器28。

ROM 23存储用于执行荧光寿命测量处理的程序(下面称为“荧光寿命测量程序”)。接口25连接到附于转轴SA上的主轴马达(图1)、激光光源3、聚焦控制单元5和成像单元6(图1)。

当从操作输入装置给出测量荧光寿命的指令时，CPU 21在RAM 24内展开存储在ROM 23内的荧光寿命测量程序，并且作为驱动器31、预处理器32和荧光寿命计算器33工作。

驱动器31驱动激光光源3以在预定时段内以激励光照射，并且驱动聚焦控制单元5以使得焦点位于盘基板2A与反射膜2B之间的界面上。此外，驱动器31驱动主轴马达SM从而以恒定线速度旋转，并且驱动成像单元6以在预定时段内成像。

在此，图6示出当旋转的盘平台2处于要照射的位置时以激励光短暂照射在盘基板2A与反射膜2B之间的界面上的预定位置的成像结果。注意，在图6中，14位数码照相机用作成像单元6，其包括焦距为6.33至19mm的镜头和810万像素的交错1/2.5英寸CCD(电荷耦合器件)。

如图6所示，当在照射位置短暂地激励旋转的盘平台2的荧光膜2C时，在所照射的位置发射的荧光在旋转方向成像为余光(afterglow)。

预处理器32计算由成像单元6给出的成像数据表示的图像中在照射位置发射的荧光的余光的尾部位置(图6中最远离照射位置的黑圆区域)的强度与在头部位置(图6中最靠近该照射位置的黑圆区域)的强度之比值。

然后，预处理器32通过接口25调整盘平台2的转速或者成像单元6的视角，以使该比值落入特定范围内。因此，从所照射的位置到保持目标强度的位置(例如，刚好在消失之前的位置)的余光落入成像范围内。

当盘平台2的转速或者成像单元6的视角已经调整时，荧光寿命计算器33以预定间隔计算从头部位置到尾部位置(在图6中的黑圆)的余光的强度和经历时间，并基于该计算结果创建示出该余光随时间变化的表(下面称为“余光变化表”)。图7示出图6所示余光的余光变化表。

根据余光的位置信息以及盘平台的半径和转速可以确定经历时间。

然后，荧光寿命计算器33基于下面的等式计算荧光寿命：

I_(t)＝I₀·exp(-t/τ)          (1)

其中I_(t)是在要关注的位置的余光强度(余光强度随时间变化)，I₀是在照射位置的强度，t是在要关注的位置的经历时间，τ是荧光寿命。此外，-t/τ是指余光变化表的梯度(图6)。

顺便提到，形成在盘平台2上的荧光膜2C(图2)并不限于具有单激发态，而可以具有多激发态。当荧光膜2C具有多激发态时，该余光变化表不显示如图7所示的线性关系，而根据激发态的数量显示多种线性关系的混合。

在这种情况下，通过将余光变化表中具有不同梯度的线性部分和斜率的弯曲部分指定为要关注的位置，荧光寿命计算器33可以计算具有多激发态的荧光膜2C的荧光寿命。

对于呈现图6所示的斜率的荧光膜2C，当图5所示的成像中的盘平台2的线速度是1m/秒时，所计算的荧光寿命是1.8毫秒。

[1-3.荧光寿命测量处理]；

接着，将参考图8所示的流程图描述测量单元7的荧光寿命测量处理。

当给出测量荧光寿命的指令时，CPU 21开始荧光寿命测量处理，以进行到第一步骤SP1。在第一步骤SP1中，CPU 21驱动主轴马达SM以使盘平台2以恒定线速度旋转，然后进行到第二步骤SP2。

在第二步骤SP2中，CPU 21驱动激光光源3以预定周期用激励光照射盘平台2，然后进行到第三步骤SP3。在第三步骤SP3，CPU 21驱动聚焦控制单元4，以将焦点定位在盘基板2A与反射膜2B之间的界面上，然后进行到第四步骤SP4。

在第四步骤SP4中，CPU 21驱动成像单元5以在以激励光照射盘平台2时开始捕获图像，然后进行到第五步骤SP5。

在第五步骤SP5中，CPU 21使得在第四步骤SP4捕获的图像的、从照射位置到保持目标强度的位置(例如，刚好在消失之前的位置)的余光落入成像范围内，然后进行到第六步骤SP6。具体地说，如上所述，调整盘平台2的转速或者成像单元6的视角，以使得在照射位置发射的荧光的余光在尾部位置的强度与在头部位置的强度之比值落入特定范围内。

在第六步骤SP6中，CPU 21以预定间隔计算余光从头部位置到尾部位置的强度和经历时间，然后进行到第七步骤SP7。在第七步骤SP7中，CPU 21基于第六步骤SP6的计算结果创建余光变化表，然后进行到第八步骤SP8。

在第八步骤SP8中，CPU 21基于等式(1)计算荧光寿命，然后结束该荧光寿命测量处理。注意，CPU 21被配置为使得当在第七步骤SP产生的倾斜非线性时，在第八步骤SP8中，CPU 21分别计算余光变化表中所示的具有不同梯度的线性部分和倾斜的弯曲部分中每一个的荧光寿命。

[1-4.效果等]

在上面的配置中，荧光寿命测量设备1以激励光照射在旋转盘平台2上的荧光材料，并且在成像单元6中对由激励光引起的发射的荧光的余光成像。然后，荧光寿命测量设备1检测在目标余光位置的从荧光位置开始的经历时间和余光强度，并且根据该余光强度和经历时间计算荧光寿命。

荧光寿命测量设备1在旋转方向以余光图像的形式捕获荧光寿命，这允许获得在短时段内发生的光的强度变化，而无需使用高速扫描照相机，从而获得荧光寿命的简单配置。

此外，荧光寿命测量设备1以预定使得以激光短暂照射旋转盘平台2上放置的荧光材料。因此，与使用脉冲式激光的情况相比，荧光寿命测量设备1可以更简单地配置。此外，与在测量的同时以脉冲式激光连续照射的情况相比，该荧光寿命测量设备1可以减小由激励光引起的荧光材料的属性变化，这允许正确地测量要正确测量的荧光材料的荧光寿命。

此外，当示出余光强度随时间变化的线非线性时，荧光寿命测量设备1对于那些线上具有不同梯度的线性部分和弯曲部分中的每一个分别计算荧光寿命。

因此，即使当荧光材料具有多激发态时，荧光寿命测量设备1也可以计算荧光材料的荧光寿命。

根据上述配置，荧光寿命测量设备1在旋转方向以余光图像的形式捕获荧光寿命，这允许获得短时段内发生的光的强度变化，而无需使用高速扫描照相机，从而获得荧光寿命的简单配置。

<2.其他实施例>

在上述实施例中，在计算荧光寿命之前，调整盘平台2的转速或者成像单元6的视角，以使得成像余光在尾部位置的强度与在头部位置的强度之比值落入特定范围内。

与该实施例不同，成像单元6的视角可以固定，以使得整个盘平台2落入成像范围内。这种配置允许以与上述实施例相同的方式计算荧光寿命，而保持成像范围内荧光强度和余光光强的比值不变，而无需上述调整。然而，考虑余光敏感性，对盘平台2的转速或者成像单元6的视角进行调整的上述实施例是优选的。

此外，在上述实施例中，作为用于移动其上放置了要测量的荧光材料的平台的移动装置，可以使用主轴马达SM以旋转地移动镜头。然而，移动装置并不限于旋转地移动平台的装置。例如，可以使用线性地移动平台的装置。无论如何，移动装置仅需要在整个处理或者在其一部分中提供恒定的移动速度。

此外，在上述实施例中，要测量的荧光材料以薄膜形式放置在整个盘平台2上。然而，放置位置并不限于整个平台，此外，放置也可以以膜之外的任意方式进行。

工业应用

本发明可以应用于基于生物的应用，诸如基因测试、药物发明或者患者随访。

附图标记的描述

1荧光寿命测量设备、2盘平台、2A盘基板、2B反射膜、2C荧光膜、3激光光源、4光学系统、5聚焦控制单元、6成像单元、7测量单元、21CPU、22总线、23ROW、24RAM、31驱动器、32预处理器、33荧光寿命计算器、SM主轴马达、SA转轴

Claims (6)

1.一种荧光寿命测量设备，包括：

移动装置，用于移动在其上放置了要测量的荧光材料的平台；

照射装置，用于以激励光照射由所述移动装置以恒定速度移动的、在平台上放置的荧光材料；

成像装置，用于对由激励光引起的发射的荧光的余光成像；以及

荧光寿命计算装置，用于使用由所述成像单元成像的图像以检测在目标余光位置的从荧光位置开始的经历时间以及余光强度，并且计算荧光寿命。

2.根据权利要求1所述的荧光寿命测量设备，

其中，所述荧光寿命计算装置当示出余光强度随时间变化的线是非线性时，对于那些线上具有不同梯度的线性部分和弯曲部分中的每一个分别计算荧光寿命。

3.根据权利要求2所述的荧光寿命测量设备，

进一步包括调整装置，用于调整所述移动装置的移动速度或者所述成像装置的视角，以使得成像的余光在尾部位置的强度与在头部位置的强度之比值落入特定范围内，

其中，所述荧光寿命计算装置根据由所述调整装置进行调整之后的图像计算荧光寿命。

4.根据权利要求3所述的荧光寿命测量设备，其中，所述移动装置旋转地移动在其上放置了要测量的荧光材料的平台。

5.一种荧光寿命测量方法，包括：

移动控制步骤，移动在其上放置了要测量的荧光材料的平台；

照射步骤，以对激励光照射通过所述移动控制步骤的控制以恒定速度移动的、在平台上放置的荧光材料；

成像步骤，对由激励光引起的发射的荧光的余光成像；以及

荧光寿命计算步骤，使用在所述成像步骤中成像的图像，检测在目标余光位置的从荧光位置开始的经历时间以及余光强度，并且计算荧光寿命。

6.一种程序，用于使得：

移动控制装置移动在其上放置了要测量的荧光材料的平台；

照射装置以激励光照射由所述移动控制装置以恒定速度移动的、在平台上放置的荧光材料；

成像装置对由激励光引起的发射的荧光的余光成像；以及

计算单元使用由所述成像装置成像的图像以检测在目标余光位置的从荧光位置开始的经历时间以及余光强度，并且计算荧光寿命。

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