CN102271729B

CN102271729B - 处理血液

Info

Publication number: CN102271729B
Application number: CN200980152901.XA
Authority: CN
Inventors: J·L·麦菲尔森; D·佩里特; K·亨里奇森; G·P·西蒙兹; S·彭德; P·王
Original assignee: Therakos Inc
Current assignee: Therakos Inc
Priority date: 2008-12-23
Filing date: 2009-12-15
Publication date: 2015-09-09
Anticipated expiration: 2029-12-15
Also published as: US20160339165A1; CA2747941C; AU2009330352A1; US20210187181A1; US20100210989A1; JP2012513287A; KR20110102912A; US20140030238A1; BRPI0923057A2; WO2010075061A2; IL212898A0; BRPI0923057B1; EP2367580A2; CN102271729A; NZ592853A; MX2011006767A; JP6673974B2; JP2018171452A; WO2010075061A3; US10953149B2

Abstract

本发明描述了处理血液的方法(300)、设备和系统。所述方法(300)包括以下步骤：自患者获取(312)血液，所述患者与单一的血液处理设备连接以在所述患者与所述血液处理设备间形成封闭回路；通过使用所述封闭回路中的所述血液处理设备实施的白细胞析离来从血液中收集(314)批量单核血细胞；和同时使用所述封闭回路中的血液处理设备来使与所述批量单核血细胞中的非靶细胞分离的靶细胞富集(316)。

Description

处理血液

相关专利申请的交叉引证

本申请要求于2008年12月23日提交的美国临时申请号61/140,196的优先权，在此通过引证方式将其全部内容并入本申请。

技术领域

本发明整体上涉及用于处理血液的方法和装置，更具体地，涉及白细胞分离的方法和设备。

背景技术

血细胞在个体的寿命期内连续生成，并源自最为原始的血细胞，即所谓的造血干细胞(HSC)。造血干细胞能够产生造血祖细胞(HPC)和不同细胞型的血细胞(例如，红血细胞(RBC)和白细胞或白血细胞(WBC))，并且其往往存在于骨髓中。更为成熟的血细胞型存在于血液和淋巴组织中。造血是在个体中从HSC和HPC进行血细胞的连续生成。这将生成具有多种不同类型血细胞的外周血，所述血细胞属于不同的骨髓系和淋巴系并具有不同的成熟度。这些血细胞负责进行诸如红血细胞的氧输送，树突状细胞、B和T淋巴细胞的免疫功能以及粒细胞和巨噬细胞的炎性反应等生理过程。

析离(apheresis)是一种医疗过程，其中使个体的血液通过一装置，得到主要成分(如单核细胞)，并使其他组成分返回血液循环。析离通常是三步的过程，包括：(1)自个体取血；(2)分离血液成分(例如，基于密度)；和(3)使血液的某些成分返回给个体。血液通常分为三个部分：RBC(总血液的约45％)，“白细胞层”(buffy coat)(小于总血液的1％)和血浆(总血液的约55％)。可根据要除去的血液成分采用不同类型的血液析离过程。例如，“血浆析离”通常是指血液血浆的分离和收集；“血小板析离”是指血小板的分离和收集；而“白细胞析离”通常是指白细胞(WBC)的分离和收集。

作为医学科学发展的结果，析离可以连接到患者且以封闭回路连续流动的方式来进行。用于此目的的设备包括，例如以下析离系统：COBESpectra、Trima、Spectra Optia系统(全部由Gambro BCT出售)和Amicus以及CS-3000+(由Fenwal/Baxter出售)。

近来，白细胞析离还用来收集某些馏分的血液单核细胞(MNC)，以用于骨髓移植和其它病区。例如，可以对已进行切除来治疗恶性肿瘤的患者注入大量含有HSC和HPC供体单核细胞(存在于外周血的那些细胞，也称为外周血祖细胞或PBPC)，从而对他们的造血系统进行后续重建。在该实例中，首先收集白细胞层(含有占大部分的WBC(粒细胞、淋巴细胞、单核细胞)、PBPC和部分血小板)，同时使血液的剩余成分(包括血浆、RBC、血小板和部分WBC)返回给个体。然后富集PBPC并进行分离，而白细胞层的剩余部分(构成白细胞层的近99％)则丢弃。现今以不连接患者的方式，采用与那些析离机器相独立的设备来进行该细胞富集的过程(即细胞分离和纯化)。用于此目的的设备包括，例如Baxter Isolex 300i和Miltenyi CliniMACS，其基于特异性配体(CD34，两种设备都可用和CD133可用Miltenyi)在细胞表面富集PBPC。诸如Gambro COBE 2991血细胞处理器或BaxterCytoMate^TM细胞清洗系统等其它独立式设备通常用来清洗、浓缩细胞或将细胞放入合适的生长培养基或浸液培养基中。

在另一应用中，白细胞析离可用来在称作光分离置换的过程中处理个体的WBC(Edelson等，Yale J Biol Med.1989 Nov-Dec；62(6)：565-77)。在该过程中，个体首先接受一定剂量的光可激活物质(例如，8-甲氧基补骨脂素)。然后进行析离，其中使用紫外线A(UVA)光对个体的WBC进行辐照，以激活上述物质并抑制WBC的代谢过程。用于此目的的设备包括，例如UVAR和UVARXTS^TM光分离置换系统(由Therakos出售)。

除了上述富集过程之外，收集的PBPC还可在重新注入回个体前于另外的过程中进行改性。这通常通过使用细胞培养中的多种技术来实现。最后，可将改性细胞(例如，改变显型、基因型或活性)重新引入患者中，以获得某些治疗有益效果。改性过程的实例包括含有抗HIV基因的HSC/HPC的制备(R.G.Amado.等，Human Gene Therapy 15(2004)，251-262)和“被训导地”进行导向并杀死特定肿瘤的细胞毒素T淋巴细胞的生产。

图1示出了自患者取血，进行处理并返回至患者的一种现有方法的示意框图。这里，设备的安排100可被顺次地使用，以进行使用白细胞析离的细胞收集和细胞富集技术，例如细胞清洗、纯化。该框图还列出了可选的细胞改性。本方法中可使用的示例性设备包括Cobe Spectra设备。此类设备110用于白细胞析离(收集)，顺次与诸如Baxter CytoMate设备等细胞清洗设备120(富集)一起使用；该细胞清洗设备进而与诸如Baxter Isolex 300i设备等细胞纯化(富集)设备130一起使用。另外，可使用细胞操作(改性)设备140，其包括但不限于：电穿孔、微脂粒感染、病毒转导、光(UVA、UVB等)、药物添加、细胞活化、加压、加热功能等。将由设备110、120、130和140输出的经处理的血细胞包150提供给患者160，以将处理后的血液返回。

图2示出了用于细胞收集、富集和改性的方法300的具体实例。该实例是用来将抗HIV基因导入CD34+HSC/HPC的方法，其中经过5天的周期：

在步骤310中，通过白细胞析离来收集、即收获单核细胞。在该步骤310中，其它血细胞成分，即红血细胞、血小板、血浆和多形核细胞被返回给患者。

在步骤320中，使用例如CytoMate(参照上文)来清洗单核细胞部分(第2天)；用例如Isolex 300i设备来使靶CD34+细胞富集(第2天)，并丢弃非CD34+细胞。

在步骤330中，在细胞因子存在的情况下培养CD34+细胞(第2天)，并使用鼠逆转录病毒引入抗HIV基因(针对tat/vpr基因的保守区的核酶)(第4天)。

在步骤330后，进行产物释放测试(第5天)，并将上述细胞注入至原先进行白细胞析离的同一个体中。

然而，析离具有内在的缺陷和不足，例如，析离只是液体成分收集过程。虽然技术有所进步，但是如前文所述，仍通过使用分离的连续性或非连续性设备来实施靶血细胞的收集、富集和(可选的)改性的复合步骤。在这些步骤中，现今只有收集是连接患者的；只在一个实例中，收集和改性(光分离置换)是连接患者的。这些现今的非连续过程耗时，浪费材料、人力和成本(J.Gryn等，Journal of Hematotherapy & Stem Cell Research 11(2002)，719-730；K.R.Meehan等，Journal of Hematotherapy & Stem Cell Research 9(2000)，767-771)。这些过程还引起了诸如下述等严重关切的问题：(i)由潜在的微生物感染引发的安全问题；和(ii)由细胞选择和改性保障体系引起的监管链问题(即，确保正确的细胞返回患者并保持细胞完整性)。例如，溶血是一种由于析离收集盒边线扭结导致的罕见并发症(R.Reddy，Transfusion andApheresis Science 32(2005)63-72)。

为进一步说明，血小板减少症(血小板耗尽)是一种公知的白细胞析离的不良结果，并且是儿童中最为经常报道的白细胞析离的副作用(J.Sevilla等，Transfusion and Apheresis Science 31(2004)221-231；E.Yamaguchi等，Journal of Hematotherapy & Stem Cell Research 9(2000)565-572)。血小板减少症极为重要，因为患者通常由于其潜在的疾病而表现出血小板减少，并且在白细胞析离时产生额外的血小板损失。理想地，在因某种疾病状态而血小板数目不足的个体中，白细胞层内析离出的血小板应进行分离并返回给个体。然而，实践中析离出的血小板作为废物而被简单地丢弃。另外，白细胞层中血小板的减少还具有将对CD34+祖细胞(一种PBPC)的免疫亲和性选择的效率提高平均1.8倍的附加有益效果(R.Moog，Transfusion and ApheresisScience 31(2004)207-220)。

白细胞析离过程的另一缺陷是对某些患者有用的淋巴细胞的损失。如前所述，通常选择HSC和HPC(特别是CD34+祖细胞)用来对个体造血系统进行重建。对于感染人免疫缺陷病毒(HIV)的个体而言，使用白细胞析离选择CD34+祖细胞丢失了他们体内通常已经数目较少的有用的淋巴细胞(如CD3+和CD4+细胞)。活动化后约1.3％的CD34+祖细胞为PBPC白细胞析离时收集的最小细胞组分之一，而淋巴细胞和单核细胞占析离产物的高达70％(V.Witt等，Journal of Clinical Apheresis 16(2001)161-168)。

需要一种设备，所述设备能够克服或至少改善现有系统中的一个或多个不足，包括上文所述的那些不足。

发明内容

根据本发明的一个方面，提供了一种用于处理血液的装置。所述装置包含：入口接口，用于连接患者以接收直接来自患者血液循环的血液；白细胞析离模块，与所述入口接口连接，用于从接收的血液中收集批量单核血细胞；富集模块，与所述白细胞析离模块连接，用于同时使与所述批量单核血细胞中非靶细胞分离的靶细胞富集；出口接口，与所述白细胞析离模块和富集模块中的至少一个连接，用于连接所述患者以将富集的靶细胞返回给患者的血液循环；所述装置和患者在连接在一起时形成封闭回路；和控制器，用于所述入口和出口接口、白细胞析离模块和富集模块的运行的自动控制。

根据本发明的另一方面，提供了一种处理血液的方法。所述方法包括以下步骤：自与单一血液处理设备连接的患者获取血液以在患者和所述血液处理设备间形成封闭回路；通过所述封闭回路中的所述血液处理设备实施的白细胞析离收集批量单核血细胞；和使用所述封闭回路中所述血液处理设备同时使与所述批量单核血细胞中的非靶细胞分离的靶细胞富集。

根据本发明的又一方面，提供了一种用于处理血液的系统。所述系统包括：自患者获取血液的装置，和单一的血液处理设备；所述血液处理设备与所述血液获取装置和患者连接以在患者和所述血液处理设备间形成封闭回路。所述血液处理设备包含：通过使用所述封闭回路中的所述血液处理设备实施的白细胞析离而用于从血液中收集批量单核血细胞的模块；和使用所述封闭回路中的所述血液处理设备而用于同时使与所述批量单核血细胞中的非靶细胞分离的靶细胞富集的模块。

下面将更为详细地说明本发明的这些和其它方面。

附图说明

下面将参照附图描述本发明的实施例，其中：

图1是通过白细胞析离进行细胞收集和采用细胞清洗和纯化进行富集的设备框图；

图2是描述用于细胞收集、富集和改性的现有方法的具体实例的示意图；

图3是根据本发明的一个实施例处理血细胞的方法的流程图；

图4是描述同时进行的细胞收集、靶细胞富集和非靶细胞的返回的示意图；

图5是描述同时进行的细胞收集、靶细胞富集和靶细胞的返回的示意图；

图6是描述同时进行的自患者的细胞收集、靶细胞的富集、靶细胞的改性和将改性靶细胞返回到患者的方法的示意图；

图7是根据本发明的一个实施例进行收集和富集的设备的示意图；符号表示以下部件：盐水袋，蠕动泵，夹具，空气探测器，压力计，夹具，

图8是根据本发明的另一实施例进行收集、富集和改性的设备的示意图；符号表示以下部件：盐水袋，蠕动泵，夹具，空气探测器，压力计，夹具，

图9是包含收集、富集和(可选的)改性单元或模块的血液处理设备的元件的立体图；

图10是图9中的血液处理设备的元件的立体图，但是着重于细胞富集模块/过程；

图11是图9或图10中的血液处理设备的元件的立体图，但是着重于设备内可选的细胞改性步骤；和

图12是根据本发明的又一实施例进行收集和富集的设备的示意图。符号代表以下部件：盐水袋，蠕动泵，夹具，空气探测器，压力计，夹具，磁体，

具体实施方式

下面将描述用于处理血细胞的方法、装置和系统。特别地，本发明公开的方法、装置和系统用于白细胞析离，能够同时自个体的外周血中进行特异性靶细胞的收集和富集，并将剩余的血液成分返回到个体。另外，收集的靶细胞可进行改性并在析离过程中返回到个体，或可以稍后返回到个体。本发明的实施例涉及封闭回路设备，该设备能够自个体的外周血中同时进行特异性靶细胞的收集和富集，并将非靶细胞返回到个体。靶细胞可以进行改性以改变其显型、基因型或活性并在所述封闭回路的扩展部中返回到个体。本发明的实施例可以按照连接患者且封闭回路连续流动的方式有效地进行析离过程，由此仅使血液的靶成分(例如CD34+祖细胞)富集，而将全部的其它剩余成分返回到患者。另外，采用将改性细胞返回到患者的选择，可以在靶细胞上承载某些其它的功能(例如，改变显型)。所述设备的提供可以明显地降低运行成本(无需多个装置和耗材)，并保证了产物的稳定。使析离过程能够在单一设备的单一位置上进行还降低了产物损坏或损耗的风险。

然而，本领域技术人员从本发明中明显可知，在不背离本发明的范围和精神的情况下可以做出修饰和/或替换。

定义

具有封闭回路的多功能设备和其使用方法可以是连接患者的，并包括以下方面：

a)收集：对含有所关注的靶细胞群的批量单核血细胞群进行白细胞析离收集；以及同时

b)富集：使来自批量单核细胞群的靶细胞群富集。

富集的靶细胞群可返回到患者，或者被移除用于随后的包括改性在内的离线应用，还可包括随后将所述改性细胞注入给患者。靶细胞群的离线应用可包括用于研究或监测。非靶细胞群可同时返回到患者、离线移除应用或可选地被丢弃。另外，所述方法在封闭回路处理的扩展中可对靶血细胞群进行改性，然后将改性的靶血细胞群返回到患者。

图3高层次地示出了处理血液的方法300，所述方法300包括步骤310-316和330(由实线框示出)。尽管图3中未示出，但步骤312-316可以重复进行。方法300可以可选地包括步骤320-326中的一个或多个(由图3的虚线框示出)。同样，这些步骤320-326的一个或多个可重复进行(图3中未示出)。尽管将方法300的步骤示出为顺次地并以特定顺序进行，但是方法300并不限于所述被执行的全部步骤(其中一些是可选的)，或特定次序、顺序处理。本领域技术人员将了解的是，在本发明的教导下，所述步骤的顺序可以改变。另外，一个或多个步骤可并行。例如，步骤312至316可并行。还有，步骤326可与步骤314和316并行。下面将更详细地描述处理血液的方法300。

处理始于步骤310。在步骤312中，自患者获取血液，该患者与单一的血液处理设备连接以在患者与该血液处理设备间形成封闭回路。

在步骤314中，通过使用该封闭回路中的血液处理设备实施的白细胞析离来从血液中收集批量单核血细胞。收集步骤314可包括使用差分离心来收集单核血细胞。可以通过连续流动系统进行所述差速离心。

在步骤316中，同时使用该封闭回路中的血液处理设备来使与所述批量单核血细胞中的非靶细胞分离的靶细胞富集。靶细胞可以是B细胞、T细胞、树突状细胞、单核细胞、中性粒细胞、自然杀伤(NK)细胞、T调节细胞、T辅助细胞、细胞毒素T淋巴细胞(CTL)、造血干细胞(HSC)、造血祖细胞、内皮细胞、上皮细胞、间质细胞、淋巴细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。所述T细胞可以进行富集。所述T细胞可以是CD8+或CD4+。所述造血祖细胞和所述造血干细胞可以进行富集。所述造血干细胞和所述造血祖细胞对CD34、CD133和CD143的一种或多种可以是阳性的。或者，所述靶细胞可以是来自血液的恶性肿瘤细胞、来自组织的恶性肿瘤细胞、病毒性感染细胞、细菌型感染细胞中至少一种，至少一种病毒、至少一种细菌、寄生生物、胎细胞和病原性效应细胞。

富集步骤316可包括配体捕集以使靶细胞富集。所述配体可以是对细胞表面配体有特异性的抗体。所述细胞表面配体可以是上皮细胞粘附分子(EpCAM)、选择蛋白、粘附分子受体、归巢受体、细胞因子受体、趋化因子受体或酶。所述细胞表面配体可以是簇标示(CD)抗原。所述CD抗原可以是CD1a、CD4、CD8、CD14、CD25、CD34、CD133或CD143。可通过磁、荧光活化细胞分选、微流体、固体载体、声、生物发光、抗体标记和酶底物来实现步骤316中的靶细胞富集。所述固体载体可以包含颗粒。所述颗粒可以是磁性颗粒和密度改性颗粒中的至少一种。

所述收集和富集步骤314、316可以在血液处理设备的不同部分中进行。

在步骤320中，可以对富集的靶细胞进行改性。改性步骤320可涉及包括活化、膨胀、诱导细胞凋亡、基因改性和诱导抗原特异性中的一种或多种的改性。改性步骤320可涉及通过以下方式中的至少一种实现的改性：交联细胞表面受体、辐照和使用细胞因子、趋化因子、抗原刺激、激素、药物、加压和加热中的至少一种的处理。所述辐照可以是γ、β、α和光辐射中的至少一种。所述光辐射可以是紫外线A(UVA)、紫外线B(UVB)和可见光辐射。或者，改性步骤320可以涉及通过将遗传物质转染或转导到至少部分靶细胞中来实现的基因改性。遗传物质的转染可以通过电穿孔和脂转染之一来进行。遗传物质的转导可以通过病毒载体转导来进行。在另一替代形式中，改性步骤320可涉及包括细胞毒素T淋巴细胞(CTL)活化、T调节细胞(Treg)活化和免受人免疫缺陷病毒(HIV)影响的基因改性血细胞中的至少一种的改性。

在步骤322中，可对非靶细胞进行改性。另外，在步骤324中，可将所述非靶细胞返回到患者。所述非靶细胞可以返回到连接在所述封闭回路中的患者，或者返回到与所述封闭回路断开的患者。此外，可以丢弃所述非靶细胞。

在步骤326中，可以同时监测所述收集和富集步骤中的细胞数目。这将使得一旦足够的细胞已经被收集和富集，就允许所述收集完成，并允许收集可以对患者量身定做。

所述方法可包括在处理靶细胞时在封闭回路中保持对患者的连续性连接，或者在处理靶细胞时使患者与封闭回路断开一段时间。在步骤330中终止处理(结束)。下面将更为详细地描述这些和其它方面。

用于进行包括改性在内的离线应用或丢弃的同时进行的细胞收集和靶细胞富集

图4高水平地示出了同时进行自患者450的细胞收集410、靶细胞富集420和非靶细胞452的返回(全部在循环402中示出)的方法400。富集的靶细胞430可以离线用于研究/测试462、470，或者被丢弃482。或者，对富集的靶细胞430、462进行改性，而用于随后将靶细胞注入464给患者450。本方面包括同时进行的细胞收集410、靶细胞富集420和在封闭回路中将非靶细胞返回452给患者450。白细胞析离收集步骤410产生单核细胞群。进行靶细胞的在线富集步骤420。将非靶细胞返回452给患者450。富集的靶细胞430可进行离线使用，并可以可选地进行改性，以用于研究、测试等470或者随后将靶细胞注入464给患者450。靶细胞462可以在改性或未改性的情况下使用。细胞还可以被丢弃482。在靶细胞进行改性并返回464给患者的情况下，非靶细胞452可不必返回患者450。必要时，例如为了达到某一数目的靶细胞，可以使同时进行的细胞收集410、靶细胞富集420和离线细胞改性的方法400重复进行多次。可对一种或几种细胞型进行靶细胞富集420。可对一种或几种细胞型进行靶细胞改性。在细胞收集410和细胞返回452时使所述封闭回路连接患者450。

同时进行细胞收集和靶细胞富集以返回及非靶细胞离线使用或丢弃

图5高水平地示出了自患者550的细胞收集510、靶细胞富集520和将靶细胞552返回到患者550的方法500。富集的非靶细胞530随后在改性或未改性的情况下进行离线使用以进行研究/测试562、570，或者被丢弃582。再有，白细胞析离收集步骤510产生单核细胞群。进行靶细胞的在线富集步骤520。将靶细胞552返回到患者550。本方面包括同时进行的细胞收集510、靶细胞富集520和将靶细胞返回552给患者550。非靶细胞562可离线使用以用于研究、测试等570(具有或不具有改性步骤)，或者被丢弃582。在细胞收集510和细胞返回552时使所述封闭回路连接患者550。

同时进行的细胞收集、靶细胞的富集和改性

图6高水平地示出了同时进行的自患者650的细胞收集610、靶细胞的富集620、靶细胞630的改性660和将改性靶细胞670返回到患者650的方法600。还可将非靶细胞652返回到患者650。本方面包括同时进行的细胞收集610、靶细胞富集620、靶细胞的改性660和将改性靶细胞670在封闭回路工序中返回到患者650。可选地，可将非靶细胞652返回到患者。在细胞收集610和细胞返回652、670时使所述封闭回路连接患者650。

细胞收集

本发明的一个实施例包括细胞收集和同时进行的细胞富集。收集是批量单核血细胞的白细胞析离收集，从该细胞中富集靶血细胞。此步骤可使用本领域已知的任何方法自患者获取单核细胞，所述方法包括但不限于使用差速离心。用于此目的的设备包括COBESpectra、Trima Spectra Optia系统(全部由Gambro BCT出售)和Amicus或CS-300(由Fenwal/Baxter出售)、Gambro Cobe Spectra或Optia、Fenwal Amicus或CS-3000。优选的是，通过连续流动系统来实施所述差速离心。在一个优选的实施例中，该批量血细胞收集使用了Therakos CellEx技术，这是由于与包括以上列出的设备在内的其它设备相比，其具有优越的收集效率和较低的体外体积。在白细胞析离中，将非单核细胞群重新注入给个体。

图9示出了根据本发明一个实施例的血液处理设备。患者940采用封闭回路的方式与设备900连接，设备900的输入导管950与患者950连接以将作为输入物的血液提供给设备900，并且其输出导管952作为自设备900至患者的返回路径。设备900具有入口接口，以接收直接来自患者血液循环的血液。设备900还具有出口接口，以将富集的靶细胞和/或非靶细胞返回到患者的血液循环。设备900和患者在连接在一起时形成封闭回路。设备900包括白细胞析离收集单元910和富集单元920。(白细胞析离)收集单元或模块910从接收的血液中收集批量单核血细胞。富集单元或模块920同时使与所述批量单核血细胞中的非靶细胞分离的靶细胞富集。设备900具有用于接收输入或向操作者(未示出)提供输出的操作者接口960。设备900还包括泵/阀座964。设备900还可包括可选的改性单元930。设备900包括用于如下所述处理血细胞的离心机962。控制器(未示出)与所述操作接口960和其它模块连接，以用于对设备900运行的自动控制。

在Therakos CellEx系统中，例如如1981年12月1日授予Latham Jr的题为“Apparatus for separating blood into components thereof”(用于将血液分离成血液成分的设备)的美国专利号4,303,193(以引证方式整体并入本申请)中示出的Latham杯等离心杯将血液分离为红血细胞和“白细胞层”。Latham杯是已经在医学白细胞析离市场和诸如体外光分离置换(ECP)等医学疗法中使用了一段时间的血液成分分离器。美国专利号5984887“Photopheresis treatment of leukocyte”(白细胞的光分离置换疗法)提供了对体外光分离置换和其细胞分离和离心的方法的描述。

图7是图9所示的血液处理设备(和下面描述的图10的系统)的更为详细的示意图。图7中示出血液处理设备700与患者736连接。收集结点702和返回结点756以图9所示的方式与患者连接。收集结点702是包括导管704在内的输入接口的一部分，其继而与压力(“收集”)传感器720连接。依次地，收集压力传感器720与空气探测器722连接，空气探测器722与收集阀724连接。收集阀724与“收集”蠕动泵726连接，蠕动泵726继而与杯压力传感器728连接。压力传感器720影响收集泵726的运行。杯压力传感器728与离心杯730连接。离心杯730的一个输出与红血细胞泵(RBC)732和导管734连接，导管734继而与返回路径连接，这在下面更为详细地描述。

抗凝血剂(AC)袋710与抗凝血剂蠕动泵712和合适的导管连接。泵712继而与阀714连接，阀714继而与空气探测器716连接。空气探测器716通过合适的导管与输入导管704和收集压力传感器720连接。这种结构允许抗凝血剂能够施加给自患者736输入至设备700中的血液。

另一导管770提供了自离心杯730的输出并与阀772连接。另外与导管770连接的是连接到阀784的导管782。阀784继而与返回袋740连接。返回袋740与空气探测器742连接，空气探测器742继而与阀744连接。阀744继而与阀798、盐水阀760连接，盐水阀760继而与盐水袋762、导管734和返回泵746连接。返回袋740、空气探测器742、阀744与返回泵746一起形成了返回路径。泵746与返回阀748连接，返回阀748与空气探测器750连接。空气探测器750与返回压力传感器752连接，返回压力传感器752与导管754和返回结点756连接。

阀772与能够探测红血细胞的传感器788连接。导管774还与阀772连接，并且继而与白细胞(buffy)泵776连接。白细胞泵776与板778连接。板778的输出与导管797连接，导管797继而与阀798连接。阀798与返回泵746连接。HCT传感器788与平行配置的阀790和791连接。阀790与收集袋786连接。阀791与其中添加有富集用试剂的处理袋737连接。处理袋737与阀793连接，阀793继而与空气探测器794连接。空气探测器794与阀798连接。

选择缓冲袋795与阀796连接，阀796继而与空气探测器794连接。

细胞富集

图10示出了图9的设备900，并重新编号为设备1000。患者1040通过输入导管1050和输出导管1052以封闭回路方式连接到设备1000。在该实施例中，单核细胞群1010通过例如抗体包被的颗粒捕集(如磁颗粒捕集)进行富集1020。富集1020的输出为可返回到患者的富集的靶细胞1060。另外，通过设备1000可将来自富集1020的非靶细胞返回到患者1040。富集的细胞可用于特定的目的，其包括但不限于：

1.从血流中消除(例如白血病淋巴瘤、骨髓瘤细胞)；可选择这些细胞型作为将要从血液中消除并丢弃的细胞。

2.进行改性以返回到患者以获得积极的有益效果；一些实例包括：

a.通过白血病细胞或转移性癌细胞的富集和改性而诱导免疫响应；

b.进行改性以生成针对特定癌症的细胞毒素T淋巴细胞；以及

c.HSC/HPC的改性以包含用来影响疾病进程的基因，例如用来影响HIV/AIDS的抗HIV基因。

3.用于研究或测试等，其可包括可选的改性步骤。

靶细胞是在批量单核细胞收集后从外周血中富集的细胞。可从白细胞析离批量产物中富集的细胞型包括但不限于：B淋巴细胞、T淋巴细胞、CD4和CD8T淋巴细胞、树突状细胞、单核细胞、自然杀伤(NK)细胞、T调节细胞、T-辅助细胞、细胞毒素T淋巴细胞(CTL)、造血干细胞(HSC)、造血祖细胞、内皮细胞、上皮细胞、淋巴因子活化的杀伤细胞(LAK)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、间叶细胞干细胞上皮细胞-参见表1(FundamentalImmunology By William E.Paul 2003 Lippincott Williams & Wilkins ISBN0781735149；Essential Haematology，Hoffbrand，Pettit和Moss)。

表1

定向为用于丢弃的其它细胞型可以是本领域中已知的任一种，其包括但不限于来自血液或其它组织的癌症/白血病细胞、病毒或细菌感染的细胞、病毒或细菌或寄生生物、胎细胞或病原性效应细胞。通过使用合适的表面抗原可以富集这些细胞。这些后述的细胞还可被定向为按照上述#2的目的改性，即进行细胞改性并将改性的细胞返回以进行治疗免疫响应。

在富集步骤中，可富集多于一种的靶细胞型。所述系统可使用多种方法富集多种细胞型，例如可在设备(图9和图10的900和1000)的不同腔室中分别富集细胞型。不同的细胞型可一起处置(例如全部返回或丢弃或改性)，或者细胞型可以单独处置(例如一组返回、一组丢弃、一组改性或者全部组以不同方法进行改性)或前述的变型。

靶细胞的富集可以用来从外周血(如白血病细胞中)消除靶细胞，或用来富集至治疗用要求的百分比纯度，或用于研究/测试等。

可通过化学或物理方法来富集靶细胞，如捕集，所述的靶细胞被分离，即从批量血细胞群富集。富集过程可采用本领域中已知的一种或多种方法，其包括但不限于抗原捕集、微珠(bead)、磁、荧光活化细胞分选、微流体、固体载体、声、生物发光、抗体标记或酶底物。合适的固体载体包括颗粒，其包括但不限于铁磁体颗粒和密度改性颗粒。这些颗粒可从如MiltenyiBiotec和Dynal(Curr Opin Immunol.1991年4月，3(2)：238-241)获得。现有的；用于释放所捕集的细胞的方法包括：i)与过量的配体竞争；ii)酶消化；iii)pH改变，iv)离子强度改变，v)移除磁场，vi)物理搅拌。

对一个或多个靶细胞群有特异性的配体可以是本领域已知的任一种，优选为对细胞表面配体有特异性的抗体。所述细胞表面配体可以是簇标示(CD)抗原，其包括但不限于CD1a、CD4、CD8、CD14、CD25、CD34和CD133，他们通常使用特异性抗体来对靶细胞进行捕集/选择。所述细胞表面配体可为但不限于EpCAM(上皮细胞粘附分子)、选择蛋白、粘附分子受体、归巢受体、细胞因子受体、趋化因子受体和包括醛脱氢酶和其它细胞内酶在内的酶。表1中示出了多种表面标记物。

作为一个实例，一种富集细胞的方法是使用抗体或核酸配体。术语抗体是指能够与抗原上存在的表位结合的免疫球蛋白分子。本申请中使用的术语抗体是指细胞结合分子。该术语旨在包括完整的诸如单克隆抗体和多克隆抗体等免疫球蛋白分子，以及双特异性抗体、人源化抗体、嵌合抗体、抗特发性(抗ID)抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab′)片段、融合蛋白和包含所需要的特异性的配体辨认位点的前述抗体的变体。本申请使用的核酸配体是对靶具有所需作用的非天然存在的核酸或肽。所需作用包括但不限于，结合靶、以催化方式改变靶、以改性/改变靶或靶的功能活性的方式与靶反应、以在自杀性抑制剂中的方式与靶共价结合、促进靶与其它分子间的反应。

HSC/HPC可以通过多种方法富集，包括使用细胞表面标记物CD34或CD133或较高水平的醇脱氢酶(ALDH)。在本发明的一个实施例中，使CD34+HSC/HPC细胞富集，并随后通过引入抗HIV基因的步骤进行改性。可通过多种方法例如通过逆转录病毒转导来进行所述引入。

靶细胞可以返回到患者。在某些疾病中，出于诊断/监测目的而可丢弃或保存定向细胞群是有利的。例如，在通过Immunicon Inc.开发的称为CellSearch^TM的诊断程序中，可通过磁珠分离系统来测量血液中的稀有肿瘤细胞(参考文献)。该较大规模收集程序可以提高此类诊断方法的灵敏度。在自身免疫疾病中丢弃特异性靶肿瘤细胞或例如Th17细胞的病原性细胞可能是有益的(参考文献)。最终，淋巴细胞减少症诱导已经对出于如为细胞疗法提供空间的原因对某些疗法有较好的结果(Dudley，ME等，Science.2002年10月25日；298(5594)：850-4.Epub 2002年9月19日)。用于丢弃的细胞群可以是本领域中已知的任一种，包括但不限于来自血液或其它组织的恶性肿瘤细胞、病毒或细菌感染的细胞、病毒或细菌或寄生生物、胎细胞或诸如Th1、Th17、CTL等致病效应细胞等。进行该富集并实现治疗所需的百分比纯度。在某些情况下，需要特定百分比的富集(见下)。就移除病原性细胞(例如癌细胞或白血病细胞)而言，从血液中的清除效率比实际最终的百分比纯度更为重要。这些细胞还可定向以如上述目的#2进行改性。

细胞收集和富集这两个步骤在同一设备中以封闭回路方式进行；可在所述设备的相同或不同部分进行上述步骤。按照治疗上的需要，非靶细胞可以返回到患者或被丢弃，或者离线使用而用于研究/测试。就诸如HIV等免疫失能病症或淋巴细胞减少病症而言，例如非靶细胞可以在封闭回路系统中返回，以使必需的细胞返回，必需细胞的缺失可能会危害患者。在无需返回非靶细胞或不返回非靶细胞可带来益处的其它情况下，非靶细胞可以被丢弃或出于其他目的而进行离线使用。例如，由于使患者处于淋巴细胞减少能够提高某些细胞疗法的功效而带来了所述益处(Dudley，ME等，Science.2002年10月25日；298(5594)：850-4.Epub 2002年9月19日)。

细胞改性

图11示出了图9或图10的设备900或1000，并重新编号为设备1100。患者1140以封闭回路方式通过输入导管1150和输出导管1152连接到设备1100。在这个实施例中，提供了靶细胞以封闭回路且连接患者的方式的额外改性步骤。该步骤表示了细胞收集和富集的连接患者的封闭回路系统的延伸。靶细胞在连接患者的封闭回路系统中的改性可以作为收集和富集的连接患者的封闭回路系统的延伸。如图11所示，在容器1170中对富集的靶细胞1160进行改性以提供改性的靶细胞1180。可选的改性可以是电穿孔、脂转染、病毒转导、光(紫外A(UVA)、紫外B(UVB)等)、添加药物、细胞活化、加压、加热等中的一种或多种。

图8是图11中所示的血液处理设备的更详细的示意图。图8示出了将血液处理设备800与患者836连接。图7中示出的与图8的设备800相同的设备700的元件具有相同/相应的参考标号，不同的是第一位数字改变成相应的图号(7XX和8XX)，所以图7的收集结点702为图8的收集结点802。出于简洁目的，在图8的说明中不再重复相应特征的描述，因为图7中与图8中相同的那些元件具有相同的功能和构造。相反，下面仅对图7和图8间的不同之处进行描述。收集袋886与改性泵831连接，改性泵831继而与改性单元或模块833连接。改性模块833继而与改性细胞袋835连接。图8的设备800的构造在其它方面与图7的设备相同。

改性还可以非连续的离体细胞改性的方式进行以改变细胞显型、基因型或活性。这可以通过添加细胞因子、交联特异性受体、添加抗原、转染DNA、RNA或蛋白质、凋亡细胞诱导、包括病毒转导在内的基因结合来进行。在该实施例中，取出富集的靶细胞群1160来进行单独的非连续改性步骤，以改变细胞显型/基因型/活性。然后，改性细胞可用于研究或通过注回患者用于治疗。富集的程度为研究/测试用或治疗用所需的程度。

富集的靶细胞群可以通过本领域已知的任何方法进行改性，该方法包括但不限于活化、膨胀、诱导细胞凋亡、基因操作、诱导抗原特异性等。这可以通过例如添加细胞因子、交联特异性受体、添加抗原、引入DNA、RNA或蛋白质、病毒转导、电穿孔、脂转染、用多种波长的光处理、添加药物、捕集细胞或细胞成分、加压、加热等来实现。

可通过除光分离置换之外的全部情况中的多种手段对细胞进行改性(见下)，利用独立处理或设备在未连接患者的程序中实施。现存多种涉及离体细胞改性的未连接患者的过程的实例来改变细胞显型/基因型/活性；这可通过例如添加细胞因子、交联特异性受体、添加抗原、转染DNA或RNA、引入蛋白质、凋亡细胞诱导或通过例如病毒转导的基因结合来进行。用来进行该过程的方法包括但不限于电穿孔、脂转染、病毒转导、辐照、用药物温育、细胞捕集、细胞活化、加压、加热、交联细胞表面受体、用细胞因子、趋化因子、激素处理等。例如，电穿孔或电通透为用于通过由外加电场致使细胞膜的渗透性增加而将诸如遗传物质(DNA或RNA)等细胞外化合物引入细胞的方法。该技术现在通常用于研究目的，并已进行临床试验，其显示出在人类治疗中的潜在效用。

用于改性的细胞包括但不限于B淋巴细胞、T淋巴细胞、CD4和CD8T淋巴细胞、树突状细胞、单核细胞、自然杀伤(NK)细胞、T调节细胞、T辅助细胞、细胞毒素T淋巴细胞(CTL)、造血干细胞(HSC)、造血祖细胞、内皮细胞、上皮细胞、淋巴因子活化的杀伤细胞(LAK)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和上皮细胞-见表1(Fundamental Immunology by William E.Paul 2003Lippincott Williams & Wilkins ISBN 0781735149；Essential Haematology，Hoffbrand，Pettit和Moss)。

这些改性的细胞能用于治疗多种疾病或病症。例如、C.H.June.J.Clin.Invest.117，(2007)1466-1476描述了过继性T细胞疗法。在该实例中，自患者收集外周血淋巴细胞，在独立的步骤中进行富集并使用活化系统温育来提高抗肿瘤CTL活性。HSC已在骨髓移植中使用多年，并在诸如心血管治疗和创伤愈合等其它应用中得到日益增多的应用。

可使用本领域已知的任何方法来实现改性，该方法包括但不限于将遗传物质转染或转入靶细胞群的至少一部分中、交联特异性受体或用细胞因子处理。遗传物质的转染或转导可通过本领域已知的任何方法进行，该方法包括但不限于通过载体转导、电穿孔或脂转染。改性可以是本领域已知的任一种，其包括但不限于细胞毒素T淋巴细胞(CTL)活化、T调节细胞(Treg)活化、诱导细胞凋亡或用于免受人免疫缺陷病毒(HIV)的血细胞基因改性。

Amado等(2004)的国际(PCT)专利公开No.WO 03/006691中描述了用基因改性的造血祖/干细胞治疗HIV。在该系统中，自患者收集HSC/HPC作为通过白细胞析离的单核细胞部分，通过单独的Baxter设备富集并在注入患者前进行转导和温育(见图2)。在本发明的实施例中，患者进行较短时间的白细胞析离，细胞将在封闭回路中安全地进行富集，更为重要的是，可将非靶细胞返回到淋巴细胞减少的患者(见图4)。

有多种其它可通过所述设备进行富集并用于治疗的靶细胞，本申请给出一些实例。树突状细胞用于治疗癌症、传染病和免疫缺陷病(Nature.2007年9月27日；449(7161)：419-26.Review)。NK细胞用于治疗癌症。T调节细胞正在测试用于治疗移植物抗宿主病(GvHD)(Semin Immunol.2006年4月；18(2)：78-88)、免疫缺陷病、特应性皮炎合物和哮喘(Curr Opin AllergyClin Immunol.2006年2月；6(1)：12-6.Review)。CTL用于治疗癌症、传染病和过敏。内皮细胞用于膀胱、脉管系统等的细胞再生治疗。

在连接患者的封闭回路中结合了收集、富集和改性全部三个步骤的实施例中，富集和改性的程度由治疗用所需的值来确定。例如，在HIV基因疗法中，需要HSC/HPC富集至＞20％且更优选为＞80％，使得大量HSC/HPC能够使用抗HIV基因结构体来进行转导。需要优化转导，使得大量基因改性的HSC/HPC能够重新注入给患者。仅以举例的方式对前述内容进行描述。

在另一实例中，T调节细胞可以富集并且随后膨胀；纯度通常需要为＞75％且优选为＞90％，从而在改性/刺激步骤中限制效应T细胞的过度生长。因此，富集和改性参数因疾病和医学需求而不同。再次，仅以举例的方式对前述内容进行描述。

在另一实施例中，本发明中的实施例允许在步骤进行时监测步骤，即实时监测，如血细胞比容、细胞数目、细胞显型、细胞活化和细胞尺寸等的测量。例如，就HSC/HPC富集和改性而言，这允许在进行时确定处理的参数，如测量CD34+细胞的数目和转导的CD34+细胞的数目。

本申请引用的所有参考文献均以引证方式并入本申请。这些文献包括2007年5月1日授予Briggs等的美国专利号7211037(“Apparatus for thecontinuous separation of biological fluids into components and methods of usingsame”(将生物流体连续分离为成分的设备及其使用方法))和2007年3月6日授予Briggs等的美国专利号7186230(“Method and apparatus for thecontinuous separation of biological fluids into components”(将生物流体连续分离为成分的方法和设备))。以下实例用于说明但非限制本发明的实施例。

实例1.自外周血收集单核细胞和CD4+T淋巴细胞的富集

制备外周血袋来代表伪患者。在使用前1-2天将来自健康供体的4个单元的ABO匹配全血收集入ACD-A抗凝血剂中。所述多个单元的血液通过经Sepacell白血细胞减少过滤器的过滤来进行白血细胞排除，并且汇集至2L血袋中。加入leukopak白细胞层，使白细胞计数达到生理浓度，并将伪患者袋在室温保持在摇床(rocking platform)上，以确保一均质细胞悬液。从伪患者袋中取出10mL样品，并通过Beckman Coulter AcT计数器上的电子细胞计数和自动鉴别来确定基线细胞组成，并通过使用包括CD45-FITC，CD3-PECy7，CD4-APC，CD8-PECy5，CD14-PECy7，CD15-PE，CD20-APC，CD34-PE在内的单克隆抗体板(panel)的流式细胞计来评价免疫显型。

伪患者袋内的细胞组成的一个实例为：

血液处理系统

Therakos CellEx光分离置换系统作为血液处理系统的基础。如图9所示，系统900包含数个部件，包括离心室962、泵座964、光活化室和用户友好型软件驱动的操作接口960。在本实例中必要时添加额外的夹具和泵，并且对CellEx光分离置换过程特定的单次使用一次性用具进行改进而使用。在从外周血中收集单核细胞并富集CD4+细胞的本实例中，无需所述光活化室。CellEx光分离置换系统使用1-Ω2-Ω离心技术，与和三接口内腔腔驱动管连接的Latham杯一起，实现连续的全血处理。与其它白细胞析离设备相比，可由较低的体外体积来实现相似数目的单核细胞的收集。所述CellEx光分离置换系统可以按照单针头(成批返回)或双针头(连续返回)模式接入运行，这为患者提供了灵活性。在本实例中，双针头模式用于将血液以单程方式从伪患者袋送至伪患者返回袋。

在收集单核细胞前，Therakos CellEx光置换系统需要装载并灌注一次性过程试剂盒(procedural kit)。所述试剂盒是单次使用的一体的一次性用具，其由多个元件构成，所述元件包括Latham离心杯、泵管管理器和光活化模块。在该实例中，对所述过程试剂盒进行改使之包括额外的袋和夹具。按照Therakos CellEx光分离置换系统操作手册来安装并灌注改进的过程试剂盒。一旦装载了所述试剂盒，系统进行自动的7分钟灌注程序以确保正确的试剂盒装载，测试试剂盒完整性和器械完整性，并且用抗凝血剂灌注无菌的流体通道。本实例中使用的抗凝血剂为ACD-A。

在灌注后，系统准备好进行伪患者连接。将2L伪患者血袋连接到CellEx System一次性试剂盒的入口或“试剂盒收集接入”线路(line)处。将2L空血袋连接到出口或“试剂盒返回接入”线路处以代表伪患者的另一手臂，并称为“返回袋”。在连接上述两个供体接入线路后，CellEx系统被配置为在双针头模式下运行。其它系统参数在默认设定下使用。系统参数为：

1)处理1500mL全血，

2)血液收集速率50mL/分钟，和

3)抗凝血剂比率为10∶1。

通过按操作界面上的起动按钮来启动血液收集，系统自动地对体积为1500mL的全血进行处理。

当连续地将血液从伪患者抽出至Latham杯中时，红血细胞和血浆被连续移除，并通过本实例中由“返回袋”表示的第二静脉注射线返回。在单针头模式中，红细胞和血浆以成批方式通过同一线路返回。CellEx系统泵座驱动了多个泵，并在血液处理的整个过程中导向和转移血液成分。将单核细胞保留为所述杯中的红血细胞和血浆之间的白细胞层。使用激光束来监测“白细胞层”的位置。

当处理1500mL全血后，CellEx系统进入“白细胞层收集”模式。通过使控制血液流动至“返回袋”的泵停止来完成单核细胞的收集。这使得红血细胞进入杯中并向上转移“白细胞层”(尽管有一些白细胞层的扰动)，并经由所述杯顶部的血浆口通过开口阀移出。将血浆和“白细胞层”导入先前灌注有抗凝血剂的“处理袋”中。当系统血细胞比容光学传感器探测到血细胞比容为3％时，使收集泵暂时停止，并使所述杯旋转以使得白细胞带重新形成。然后收集入处理袋直至光学传感器探测到血细胞比容为24％。这触发阀门关闭并使流体从杯中转移至返回线路。“处理袋”此时含有收集的单核细胞制剂。“处理袋”主要由单核细胞组成，同时还含有血小板和低浓度的粒细胞和血细胞比容约为1-2％的红细胞。细胞“处理袋”经由改进的过程用具与额外的袋连接以进行富集。

自1570mL抗凝血的全血(伪患者)的单核细胞收集的实例为：

CD4+靶细胞从收集的单核细胞中的富集

在完成CellEx单核细胞收集后，用细胞富集缓冲液清洗单核细胞产物的一部分，并以一定的浓度经由“处理袋”的无针头接入口引入CD4+选择珠(Dynal)。使单核细胞和珠的混合物温育30分钟，同时通过CellEx一次性试剂盒的光活化模块的螺线型通道进行再循环。通过将细胞经由蠕动泵转移至置于磁性颗粒浓缩器中的袋中来终止温育。CD4+靶细胞保留在“富集细胞袋”中，并通过加入拆除珠(detechabead)来除去磁珠(Dynabeads)。将富集的靶CD4+和非靶细胞部分收集在分开的收集袋中。取样，使用Coulter细胞计数器和相关细胞表面标记的流式细胞计来确定细胞数、产率和纯度。

以下示出的数字来自收集的单核细胞的2mL小等分试样。

实例2.自外周血收集单核细胞并富集CD8+细胞

概述

图12示出了与图7的系统700有关的改进系统1200。出于简洁目的，图7与图12的系统1200中相同的特征保留了相同的标号(如，图7和图12中的抗凝血剂泵712)。另外，除非下面作明确描述，图12的系统1200中这些相同标号的特征也保留了相同的构造。图12的系统1200是一种血液处理设备，其涉及收集和富集(第2型)并包含3个新袋、6个新夹具和2个磁体。如图12所示，对标准CellEx过程试剂盒进行了改进。使用CLINIcell25袋1278来代替光活化室。患者1200在图12中表示为患者袋#1 1206和患者袋#2，所述患者袋#1与返回结点756连接，所述患者袋#2在图12中未示出但可替代袋1206并在处理的不同阶段与返回结点756连接，以实现收集和富集中的细胞计数。

对图12的系统作如下改进。将磁体1276设置为与板778相邻，并与板778接合或脱离。在图7中，HCT传感器788的输出与阀790和791(NEW1和NEW2)并行连接，阀790和791继而分别与收集袋786和处理袋737连接。在图12中保持了这种结构，但是对HCT传感器788的输出添加了额外的并行通道。阀(NEW6)1240与HCT传感器788的输出连接，并继而与废弃物袋1242连接。另一阀(NEW5)1250与HCT 788的输出连接，而且导管1252连接在阀1250和阀(NEW3)793以及空气探测器794之间。另外，阀(NEW4)796的输出在图12中连接在阀793和空气探测器794之间，而不是如图7所示连接在空气探测器794和阀798之间。最后，将第二磁体1254设置为与阀(NEW1)790和收集袋786之间的通道相邻。

结合4个全血单元以生成与收集结点702连接的“伪患者”1204，并取样用于coulter计数器和流式细胞计分析。将改进的试剂盒装载到CellEx设备上，并关闭阀NEW1 790、NEW4 796、NEW5 1250和NEW6 1240，打开阀NEW2 791和NEW3 794。作为初始状态，这提供了用于通过处理袋737的开放通路。使用标准CellEx软件来灌注试剂盒，使在笔记本计算机上运行的诊断软件与CellEx的IR口连接，以运行其他对泵、阀和离心机的用户配置的操作。

灌注

关闭阀NEW2 791并打开阀NEW1 790来形成至收集袋786的通道，这条线路通过使白细胞/再循环泵776顺时针循环来用缓冲液进行灌注。一旦线路进行了灌注，停止泵776，关闭阀NEW3 793，并打开阀NEW4796，以使选择缓冲区795能够被抽吸至试剂盒各处。逆时针开启白细胞/再循环泵776。在灌注至选择缓冲区795的线路后，停止泵776，关闭阀NEW1 790，并打开阀NEW6 1240。这将打开至废弃物袋1242的通道。通过以顺时针方向开启白细胞/再循环泵776，可以灌注至废弃物袋1242的线路。当至废弃物袋1242的线路已被灌注该时，停止泵776，关闭阀NEW61240和NEW4 796，并打开阀NEW5 1252以通过逆时针运行白细胞/再循环泵来灌注分流处理袋737的线路1252。一旦灌注了线路1252和1250，停止泵776，关闭阀NEW5 1250并打开阀NEW2 791和NEW3 793；完成灌注。

与“患者”的连接和收集

使“伪患者”1204与收集线路702和704连接，并使患者袋#1 1206与返回线路756和754连接。使用默认设置使标准CellEx双针头程序运行，以收集白细胞层(如上面实例1中所描述)。在白细胞层收集后，立即按压“停止”按钮，暂停自动运行的CellEx软件。然后由操作者并使用笔记本计算机上的诊断软件来控制CellEx泵、NEW阀和离心机。

靶细胞的富集

关闭系统1200中除阀(NEW2)791、(NEW4)796、(蓝-血浆底部)744，(粉-血浆顶部)784和(返回)748的全部阀门。这形成了用于将杯730和返回袋740中的剩余物质抽吸至患者袋#1 1206的开放通道。这通过使红血细胞泵732顺时针旋转并使返回泵746逆时针旋转来实现。从而，经由元件748、750、752、754和756并通过返回袋740形成了从离心杯通过泵732和746到达患者袋#1 1206的通道。停止泵732和746，关闭阀(蓝-血浆底部)744，并打开盐水阀764。为了清洗杯730，以逆时针方向运行红细胞泵732，并将盐水从盐水袋762抽吸至杯730中。当杯730约半满时，停止泵732并关闭盐水阀764。然后使离心机730进行脉冲，并通过红血细胞泵732顺时针旋转以及返回泵746逆时针旋转将血液抽吸至患者袋#1 1206。当杯730为空时，停止红血细胞泵732，并短暂提升返回泵746的速度以将剩余的血液从线路中冲至患者袋#1 1206中。停止泵746，并用患者袋#2(图12未示出)来代替患者袋#1 1206，所述患者袋#2与返回结点756连接。在coulter计数器上分析来自患者袋#1的样品，并通过流式细胞计得到细胞组成。处理了总共1800ml的血液，其总有核细胞计数为6.6×10⁶/mL。CD8细胞构成了初始物质的8.1％。在富集后，nbuffy为139mL，其总有核细胞计数为24.2×10⁶/mL，其中22.4％为CD8阳性。(回收率＝78％)

通过使白细胞/再循环泵776以100毫升/分钟顺时针运行数秒来将管道中剩余的细胞抽吸入处理袋737。然后停止泵776，关闭阀NEW4 796，并打开阀NEW3 793，并根据重量确定收集的白细胞层的体积。搅拌处理袋737来混合内容物，并收集样品来用于coulter计数和流式细胞术分析。

在本实例中，将处理袋791中的细胞数调节至1×10⁹，该数目为所记录的使用Dynabead的一个5mL小瓶能够捕集的数目。将Dynabead注入处理袋737中，并通过顺时针运行白细胞/再循环泵776来使珠/细胞混合物循环通过板778和处理袋737。在该模式中，关闭阀1240、1250、790、796、772和798。打开阀791和793。因此，循环经由元件793、794和780通过处理袋737到达板778。磁体1276与板778不配合。循环从板778通过白细胞泵776、HCT传感器788和阀791继续进行至处理袋737。因此，在该模式中，通过这条通道的循环是逆时针的。在该温育期间，表达出特异性细胞抗原(在该实例中为CD8)的细胞与抗体包被的Dynabead结合。该温育和循环持续至少30分钟，同时混合或搅拌处理袋737和板778。

在抗原/抗体循环步骤完成时，在磁体1276工作的情况下，将板778置于的Dynal ClinExVivo MPC(8k高斯磁体)1276中。白细胞/再循环泵776连续进行数分钟的抽吸以从板778和处理袋737的顶部间的管道中除去Dynabead。

一旦清空了板778和处理袋737间的线路，停止泵776，关闭阀(NEW2)791，打开阀(NEW6)1240，并且随后以顺时针方向运行白细胞/再循环泵776。通过关闭阀791来中断进入处理袋737的流体连通。在磁体1276工作的情况下，循环从处理袋经元件793、794和780流至板778。通过板778来抽吸处理袋737中的所有细胞。通过磁体1276来使Dynabead-细胞络合物(CD8阳性集部分)捕集在板778中。在阀(NEW6)1240打开时，循环从板778经白细胞泵776和HCT传感器788继续进行至废弃物袋1242。由此使剩余的细胞(阴性部分)流入废弃物袋1242中。

当处理袋737为空时，停止白细胞/再循环泵776，关闭阀(NEW3)793，打开阀(NEW4)796，并以同一方向再运行泵776，以允许来自袋795的选择缓冲液能够冲洗从处理袋737的底部通过板778并到达废弃物袋1242的线路，从而确保该线路中剩余的大部分细胞得到处理。

当已用缓冲液冲洗该线路数分钟时，停止白细胞/再循环泵776，关闭阀(NEW6)1240，打开阀(NEW2)791并将板778移出磁体1276。通过使白细胞/再循环泵776顺时针循环将来自袋795的缓冲液添加到板778和处理袋737中。在加入足够的缓冲液时，停止泵776，关闭阀(NEW4)796，打开阀(NEW3)793并使泵776随后重新启动。使细胞-珠混合物通过板778和处理袋737循环数分钟，以使Dynabead-细胞络合物再次悬浮。循环经由元件793、794和780通过处理袋737到达板778。循环从板778经白细胞泵776、HCT传感器788和阀791继续进行至处理袋737。因此，在该模式中，通过该通道的循环是逆时针的。该步骤可重复进行，并等同于清洗阳性部分以除去杂质。

在清洗后，将2ml Dynal的DETACHaBEAD注入处理袋737中，并通过顺时针运行白细胞/再循环泵776至少45分钟来用Dynabead-细胞络合物进行温育。温育后，将板778置于磁体1276中。使白细胞/再循环泵776顺时针旋转数分钟，从而从板778和处理袋737的顶部间的管道中清除Dynabead。一旦清除了Dynabead，停止泵776，关闭进入处理袋737的阀(NEW2)791，打开进入收集袋786的阀(NEW1)790，并以顺时针方向运行白细胞/再循环泵776。循环从处理袋737经由元件793、794和780到达板778。循环从板778经白细胞泵776、HCT传感器788和阀790继续进行至收集袋786。磁体1276保持与板778配合。

通过板778抽吸处理袋737中的流体和细胞，通过磁体1276来捕集Dynabead(现与细胞分离)，而细胞(阳性选择)则流入收集袋786中。在进入收集袋786之前，未被主磁体1276捕集的任何Dynabead应随后被次磁体1254捕集。当处理袋786为空时，停止白细胞/再循环泵776、关闭阀(NEW3)793，打开阀(NEW4)796，随后以同一方向再运行泵776。来自选择缓冲袋795的缓冲液冲洗从处理袋737的底部通过板778并到达收集袋786的线路，从而确保该线路中的大部分细胞得到处理。

当已用缓冲液冲洗该线路数分钟时，停止白细胞/再循环泵776。称量废弃物袋1240和收集袋786来确定收集体积，废弃物袋1240(不需要的部分)被采样以用于coulter计数、流式细胞计和pH分析。浓缩收集袋786中的富集部分，然后采样以用于coulter计数、流式细胞计和pH分析。CD8阳性细胞的产率为33％，纯度为92％。

非靶细胞的返回

废弃物袋1242中的细胞进行浓缩，以用于返回至由患者袋#2(图12中未示出但可替换袋1206)表示的患者。系统1200中除阀(NEW5)1250、(NEW6)1240、(绿-血沉棕黄底部)798、(粉-血浆顶部)784和(返回)748被打开外全部阀门均关闭，。这打开了将废弃物袋1242的内容物转移至杯730中的路径，并用返回袋740中收集溢流。因此，自废弃物袋1242的循环经阀140和1250、空气探测器794、阀798和泵732到达离心杯730。自杯730起，循环经由784进入返回袋740。这通过使红细胞泵732逆时针转动而实现。

一旦废弃物袋1240为空，停止泵732，并关闭全部阀，但是打开阀(蓝-血浆底部)744、(粉-血浆顶部)784和(返回)748。通过在逆时针方向运行红细胞泵732以20毫升/分钟排除杯730中的全部空气，同时开启离心机730至速度为600-1000RPM数秒，然后关闭离心机730。在红细胞泵732连续抽吸时打开和关闭离心机730的过程重复进行多次，直至观察到不再有空气泡留在杯730中。一旦完成，离心机730缓慢提升至全速同时泵732仍被运行，从而使杯730的内容物分离数分钟。

在进行分离后，停止红细胞泵732，打开阀(NEW2)791和(黄-白细胞顶部)772，并关闭阀(粉-血浆顶部)784。以20毫升/分钟恢复红细胞泵732的逆时针抽吸。循环从返回袋742经由空气探测器742、阀774和泵732到达离心杯730。自杯730起，循环经由阀772、HCT传感器788和阀791继续到达所述处理袋。该过程使得从杯730的顶部除去盐，而将血液产物中的大部分非靶细胞保留在杯730内。

当返回袋740为空时，停止离心机730，并使杯730的所有内容物通过红细胞泵732顺时针旋转和返回泵746逆时针旋转经阀748、空气探测器750、压力传感器752和返回结点756返回到患者袋#2(图12中未示出)。当清空杯730时，停止泵732和746，关闭阀(蓝-血浆底部)744，打开盐水阀764，以100毫升/分钟再运行返回泵746数秒，以将剩余的非靶血细胞冲至患者袋#2(图12中未示出)中。停止泵746，对患者袋#2进行称重以确定总体积，并进行取样以用于coulter计数和流式细胞计分析。非靶细胞仅含有2.7％的CD8细胞。

实例3.自外周血收集单核细胞并富集CD34+细胞

使用与CD34特异性结合的物质，可按照实施例1和2所述进行CD34+细胞的收集和富集。

自收集的单核细胞富集CD34+细胞

在本发明的一个实施例中，可使用粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员所述对象。在完成标准CellEx单核细胞收集后，用经由“收集袋”的无针头接入口引入的添加有HSA和CD34+选择珠(Miltenyi)的细胞富集缓冲液PBS/EDTA(Miltenyi)进行清洗。单核细胞和珠混合物进行温育30分钟，同时通过改进的CellEx一次性试剂盒的捕集模块进行再循环，并通过在大约制造商建议的流率下将细胞经由蠕动泵转移至Miltenyi CliniMACS磁系统来结束温育。CD34+靶细胞可自非靶细胞进行富集，并且可将靶细胞和非靶细胞部分收集在单独的收集袋中，并进一步进行改性或返回到患者。

结果

Therakos CellEx光分离置换系统能够收集较高产率的单核细胞并能够以单流体路径与用于靶细胞的额外富集的细胞富集系统连接。合并系统的收集和富集模块间的连接和接口的进一步改进可以提高靶细胞回收率和产率。

实例4.自外周血收集单核细胞、富集CD4+细胞和改性

实例1和2的细胞可以在图8所示的闭合流体路径中进行改性。

使用泵将富集的细胞转移至改性室中。引入诸如生长因子(如白介素-2)、肽和/或基因递送剂(如病毒载体)等试剂并将细胞保持在恒温下(培养)。这使得细胞能够改变显型和/基因型，并能够具有不同的物理性质和功能。改性细胞可以进一步进行培养并用作治疗剂。

硬件和软件需求说明

泵座保持与现有的CellEx基本相同，并具有要添加的额外泵头-泵座的左下角有空间。

如果从CellEx中除去用于光分离置换的球状物和板状物，则有充足的空间来添加收集乃至改性所需要的物件。可在器械的左侧添加额外的袋挂钩。

如前述方式，本申请公开了用于处理血细胞的多种方法、装置和系统。尽管只公开了少数实施例，但根据本发明的公开，对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的范围和精神的情况下，可做出多种改变和替换是显而易见的。

Claims

1.一种用于处理血液的装置，所述装置包含：

入口接口，所述入口接口用于连接患者以接收直接来自所述患者的血液循环的血液；

白细胞析离模块，所述白细胞析离模块与所述入口接口连接，用于从所述接收的血液中收集批量单核血细胞；

富集模块，所述富集模块与所述白细胞析离模块连接，用于同时使与所述批量单核血细胞中非靶细胞分离的靶细胞富集；

靶细胞改性模块，所述靶细胞改性模块适于提供选自细胞毒素T淋巴细胞(CTL)活化、T调节细胞(Treg)活化和保护血细胞免受人免疫缺陷病毒(HIV)影响的基因改性的改性，所述靶细胞改性模块与所述白细胞析离模块和所述富集模块中的至少一个连接，所述靶细胞改性模块使所述富集的靶细胞改性；

出口接口，所述出口接口与所述白细胞析离模块和所述富集模块中的至少一个连接，用于连接所述患者以至少将富集的靶细胞返回到所述患者的血液循环，使得所述装置和所述患者在连接在一起时形成封闭回路；和

控制器，所述控制器用于所述入口和出口接口、所述白细胞析离模块、所述富集模块和所述靶细胞改性模块的运行的自动控制。

2.如权利要求1所述的装置，其中所述控制器包含：

存储器，所述存储器用于存储用于自动控制所述入口和出口接口、所述白细胞析离模块、所述富集模块和所述靶细胞改性模块的运行的数据和指令；和

处理器，所述处理器与所述存储器连接并能够存取所述数据和所述指令，所述处理器适于执行用于自动控制所述入口和出口接口、所述白细胞析离模块、所述富集模块和所述靶细胞改性模块的运行的所述指令。

3.如权利要求1所述的装置，所述装置还包含用于将所述改性靶细胞返回到所述患者的装置。

4.如权利要求1所述的装置，所述装置还包含非靶细胞改性模块，所述非靶细胞改性模块与所述白细胞析离模块和所述富集模块中的至少一个连接，所述非靶细胞改性模块使所述非靶细胞改性。

5.如权利要求4所述的装置，所述装置还包含用于将所述改性非靶细胞返回到所述患者的装置。

6.如权利要求1所述的装置，所述装置还包含至少一个泵，所述泵用于使所述血液的至少一部分在所述装置中循环。

7.如权利要求6所述的装置，所述装置还包含与所述入口接口连接的第一泵和至少一个第一阀以用于将所述接收的血液的至少一部分提供给所述白细胞析离模块；和与所述出口接口连接的第二泵和至少一个第二阀以用于使所述血液的至少一部分从所述装置中返回。

8.如权利要求1所述的装置，其中所述白细胞析离模块包含离心杯，所述离心杯使用差速离心来收集所述单核血细胞。

9.如权利要求8所述的装置，其中，通过连续流动系统来进行所述差速离心。

10.一种用于处理血液的系统，所述系统包含：

用于自患者获取血液的装置；和

单一的血液处理设备，所述血液处理设备与所述获取装置和所述患者连接以在所述患者和所述血液处理设备间形成封闭回路，所述血液处理设备包含：

通过使用所述封闭回路中的所述血液处理设备实施的白细胞析离而用于从所述血液中收集批量单核血细胞的装置；

使用所述封闭回路中的所述血液处理设备而用于使与所述批量单核血细胞中的非靶细胞分离的靶细胞同时富集的装置；和

用于靶细胞改性的装置，所述用于靶细胞改性的装置适于提供选自细胞毒素T淋巴细胞(CTL)活化、T调节细胞(Treg)活化和保护血细胞免受人免疫缺陷病毒(HIV)影响的基因改性的改性，所述靶细胞改性装置与所述收集装置和所述富集装置中的至少一个连接，所述靶细胞改性装置使所述富集的靶细胞改性。

11.如权利要求10所述的系统，所述系统还包含用于丢弃所述非靶细胞的装置。

12.如权利要求10所述的系统，所述系统还包含分别用于同时监测所述收集装置和所述富集装置的收集和富集的装置。

13.如权利要求10所述的系统，其中所述收集装置使用差速离心来收集所述单核血细胞，所述富集装置使用配体捕集来使所述靶细胞富集。

14.如权利要求13所述的系统，其中所述配体为对细胞表面配体有特异性的抗体。

15.如权利要求14所述的系统，其中所述细胞表面配体选自上皮细胞粘附分子(EpCAM)、选择蛋白、粘附分子受体、归巢受体、细胞因子受体、趋化因子受体、酶和CD抗原。

16.如权利要求13所述的系统，其中通过连续流动系统来进行所述差速离心。

17.如权利要求15所述的系统，其中所述CD抗原选自：CD1a、CD4、CD8、CD14、CD25、CD34、CD133和CD143。

18.如权利要求10所述的系统，其中所述靶细胞选自：树突状细胞、单核细胞、中性粒细胞、造血干细胞(HSCs)、造血祖细胞、内皮细胞、上皮细胞、间质细胞和淋巴细胞。

19.如权利要求18所述的系统，其中对所述造血祖细胞和所述造血干细胞进行富集并且所述造血祖细胞和所述造血干细胞任选对CD34、CD133和CD143的至少一种是阳性的。

20.如权利要求10所述的系统，其中所述靶细胞选自：B细胞、T细胞、自然杀伤(NK)细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞(LAKs)和肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)。

21.如权利要求10所述的系统，其中所述靶细胞选自：T调节细胞、T辅助细胞和细胞毒素T淋巴细胞(CTL)。