ES2606236T3

ES2606236T3 - Procesamiento de sangre

Info

Publication number: ES2606236T3
Application number: ES09810835.0T
Authority: ES
Inventors: Janet Lesley Macpherson; David Peritt; Kevin Henrichsen; Geoffrey Phillip Symonds; Susan Pond; Philip Wong
Original assignee: Therakos Inc
Current assignee: Therakos Inc
Priority date: 2008-12-23
Filing date: 2009-12-15
Publication date: 2017-03-23
Anticipated expiration: 2029-12-15
Also published as: US20210187181A1; MX2011006767A; US10926020B2; US10953149B2; CN102271729A; EP2392369B1; EP2367580A2; EP2367580B1; EP2392369A1; IL212898A0; ES2637618T3; WO2010075061A3; JP2015165916A; US20100210989A1; AU2009330352A1; KR101712569B1; JP2012513287A; HK1163569A1; AU2009330352B2; JP6673974B2

Abstract

Un aparato para procesar sangre, comprendiendo dicho aparato: una interfaz de entrada para acoplarse con un paciente a fin de recibir sangre directamente de la circulación de dicho paciente; un módulo de leucaféresis acoplado a dicha interfaz de entrada para recolectar células sanguíneas mononucleares a granel a partir de dicha sangre recibida; un módulo de enriquecimiento acoplado a dicho módulo de leucaféresis para enriquecer células diana concurrentemente separadas de las células que no son diana en dichas células sanguíneas mononucleares a granel; un módulo de modificación de las células diana adaptado para proporcionar una modificación seleccionada del grupo que consiste en activación de linfocitos T citotóxicos (CTL); activación de linfocitos T reguladores (Treg) y células sanguíneas modificadas genéticamente protegidas del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) unidas a al menos uno de dicho módulo de leucaféresis y dicho módulo de enriquecimiento, modificando dicho módulo de modificación dichas células diana enriquecidas; una interfaz de salida acoplada a al menos uno de dicho módulo de leucaféresis y dicho módulo de enriquecimiento para acoplar con dicho paciente para devolver células diana enriquecidas a la circulación de dicho paciente; formando dicho aparato y dicho paciente un circuito cerrado cuando se acoplan juntos; y un controlador para el control automático de la operación de dichas interfaces de entrada y salida, dicho módulo de leucaféresis y dicho módulo de enriquecimiento.

Description

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DESCRIPCION

Procesamiento de sangre

Referencia cruzada con solicitudes relacionadas

Esta solicitud reclama el beneficio de prioridad de la Solicitud Provisional de Estados Unidos N.° 61/140.196 presentada el 23 de Diciembre de 2008.

Campo tecnico

La presente invencion se refiere, generalmente, a metodos y aparatos para procesar sangre y, mas particularmente, a metodos y dispositivos para leucaferesis.

Antecedentes

Las celulas sangumeas se producen continuamente a lo largo de la vida de un individuo y proceden de la celula sangumea mas primitiva, la denominada celula madre hematopoyetica (HSC). Esta HSC es capaz de originar celulas progenitoras hematopoyeticas (HPC) y celulas sangumeas de los distintos tipos de celulas (por ejemplo, globulos rojos (RBC) y leucocitos o globulos blancos (WBC) y tiende a encontrarse en la medula osea. Los tipos de celulas sangumeas mas maduros se encuentran en la sangre y en el tejido linfatico. La hematopoyesis es la produccion continua de celulas sangumeas en el individuo a partir de HSC y HPC. Esto tiene como resultado que la sangre periferica tenga muchos tipos diferentes de celulas sangumeas de los distintos linajes mieloide y linfoide y de distintos grados de madurez. Estas celulas sangumeas son responsables de procesos fisiologicos tales como el transporte de oxfgeno por los globulos rojos, la funcion inmunitaria por las celulas dendnticas, los linfocitos B y T, y la respuesta inflamatoria por los granulocitos y macrofagos.

La aferesis es un procedimiento medico en el cual la sangre de un individuo se pasa a traves de un aparato, se recoge un constituyente predominante (por ejemplo, celulas mononucleares) y se devuelven los otros constituyentes a la circulacion. La aferesis es, generalmente, un proceso de tres etapas que comprende: (1) retirar sangre del individuo, (2) separar los componentes de la sangre (por ejemplo, en base a la densidad) y (3) devolver ciertos componentes de la sangre al individuo. La sangre se separa, normalmente, en tres fracciones: RBC (aproximadamente 45 % de la sangre total), capa leucocitaria (menos que 1 % de la sangre total) y plasma (aproximadamente 55 % de la sangre total). Pueden usarse varios tipos de procedimientos de aferesis dependiendo del componente de sangre que se retira. Por ejemplo, “plasmaferesis” se refiere, generalmente, a la separacion y recoleccion de plasma sangumeo y “trombocitaferesis” se refiere a la separacion y recoleccion de plaquetas, mientras que “leucaferesis” se refiere, habitualmente, a la separacion y recoleccion de leucocitos (WBC).

Con el avance de las ciencias medicas, la aferesis puede llevarse a cabo de una manera conectada al paciente, de flujo continuo y sistema cerrado. Los dispositivos usados para este proposito incluyen, por ejemplo, los siguientes sistemas de aferesis: sistemas COBE® Spectra, Trima, Spectra Optia (todos comercializados por Gambro BCT), y Amicus y CS-3000+ (comercializados por Fenwal/Baxter).

Recientemente, la leucaferesis tambien se esta usando para recolectar una cierta fraccion de celulas mononucleares sangumeas (MNC) para su uso en trasplantes de medula osea y otras areas de enfermedad. Por ejemplo, a los pacientes que han sido sujeto de ablacion para tratar un tumor maligno se les puede infundir una poblacion a granel de celulas mononucleares del donante que contienen HSC y HPC (aquellas presentes en la sangre periferica, tambien denominadas celulas progenitoras de sangre periferica o PBPC) para llevar a cabo la reconstitucion subsiguiente de su sistema hematopoyetico. En este caso, primero se recolecta la capa leucocitaria (que contiene la mayona de los WBC (granulocitos, linfocitos, monocitos), PBPC y algunas plaquetas) mientras que el resto de los componentes de la sangre (que incluyen plasma, RBC, plaquetas y algunos WBC) se devuelve al individuo. Las PBPC, despues, se enriquecen y se afslan, mientras que la fraccion restante de la capa leucocitaria (que constituye casi el 99 % de la capa leucocitaria) se desecha. Este proceso de enriquecimiento celular (es decir, aislamiento y purificacion de celulas) en la actualidad se lleva acabo de una manera desconectada del paciente, mediante el uso de dispositivos distintos de aquellos de las maquinas de aferesis. Los dispositivos usados para este proposito incluyen, por ejemplo, el Baxter Isolex 300j y el Miltenyi CliniMACS, los cuales enriquecen las PBPC en base a un ligando espedfico (CD34, ambos dispositivos y CD133 Miltenyi) sobre la superficie de las celulas. Otros dispositivos autonomos, tales como el procesador de celulas sangumeas COBE 2991 de Gambro o el sistema de lavado de celulas CytoMate™ de Baxter, se usan frecuentemente para lavar, concentrar o disponer las celulas en el medio de crecimiento o infusion adecuado.

En otra solicitud, la leucaferesis puede usarse para tratar los WBC de un individuo en un proceso denominado fotoferesis (Edelson et al., Yale J Biol Med., 1989, nov-dic; 62(6): 565-77). En este proceso, el individuo recibe, primero, una dosis de sustancia fotoactivable (por ejemplo, 8 metoxi-psoraleno). Despues, se lleva a cabo la aferesis, en la cual los WBC del individuo se irradian con luz Ultravioleta A (UVA), lo que tiene como resultado la activacion de una sustancia y la inhibicion de los procesos metabolicos de los WBC. Los dispositivos usados para

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este proposito incluyen, por ejemplo, el sistema de fotoferesis UVAR y UVAR® XTS™ (comercializado por Therakos).

Ademas del proceso de enriquecimiento descrito anteriormente, las PBPC recolectadas ademas podnan modificarse en otros procesos antes de volver a infundirlas en el individuo. Esto se lleva a cabo, generalmente, por el uso de una variedad de tecnicas en el cultivo celular. En ultima instancia, las celulas modificadas (por ejemplo, con actividad, fenotipo o genotipo alterado) podnan volver a introducirse en el paciente para obtener ciertos beneficios terapeuticos. Los ejemplos de procesos de modificacion incluyen la produccion de HSC/HPC que contienen un gen anti-VIH (R. G. Amado et al. Human Gene Therapy (2004), 251-262) y la produccion de linfocitos T citotoxicos “educados” para dirigirse a tumores espedficos y destruirlos.

La Figura 1 es un diagrama en bloque que ilustra los medios actuales por los cuales se saca sangre de un paciente, se procesa y se devuelve. Aqm, una disposicion 100 de dispositivos que puede usarse secuencialmente para la recoleccion de celulas mediante el empleo de tecnicas de leucaferesis y enriquecimiento celular, tal como el uso de lavado y purificacion celular. El diagrama enumera, ademas, modificaciones celulares opcionales. Los dispositivos ilustrativos que pueden usarse en este metodo incluyen el dispositivo Cobe Spectra. Un dispositivo asf, 110, para leucaferesis (recoleccion) se usa secuencialmente con un dispositivo para el lavado celular, tal como un dispositivo CytoMate de Baxter, 120, (enriquecimiento) el cual se usa, ademas, en conjunto con un dispositivo de purificacion celular (enriquecimiento) tal como un dispositivo Isolex 300i de Baxter, 130. Adicionalmente, pueden emplearse en este esquema dispositivos de manipulacion celular (modificacion), 140, que incluyen, pero no se limitan a: electroporacion, lipofeccion, transduccion viral, luz (UVA, UVB, etc.), adicion de farmacos, activacion celular, presion, funciones de calentamiento, etc. La bolsa 150 de celulas sangumeas procesadas producidas como resultado de los dispositivos 110, 120, 130 y 140 se proporciona al paciente 160 para el retorno de la sangre procesada.

La Figura 2 representa un ejemplo espedfico de un metodo 300 para la recoleccion, el enriquecimiento y la modificacion celular. El ejemplo es de un metodo usado para la introduccion de un gen anti-VIH en HSC/HPC CD34+ en el cual, durante un penodo de 5 dfas:

En la etapa 310, se recolectan celulas mononucleares, es decir, se cosechan por leucaferesis. En esta etapa

310, otros componentes de celulas sangumeas, concretamente globulos rojos, plaquetas, plasma y celulas

polimorfonucleares se devuelven al paciente.

En la etapa 320, la fraccion de celulas mononucleares se lavan mediante el uso de, por ejemplo, un CytoMate

(mencionado anteriormente) (dfa 2), se enriquecen celulas CD34+ diana mediante el uso de, por ejemplo, un

dispositivo Isolex 300i (dfa 2) y las celulas que no son CD34+ se desechan.

En la etapa 330, las celulas CD34+ se cultivan en presencia de citocinas (dfa 2) y el gen anti-VIH (una ribozima

contra una region conservada del gen tat/vpr) se introduce mediante el uso de un retrovirus murino (dfa 4).

Despues de la etapa 330, se lleva a cabo la prueba de liberacion del producto (dfa 5) y las celulas se infunden al mismo individuo que originalmente se habfa sometido a leucaferesis.

Sin embargo, la aferesis tiene inconvenientes y limitaciones inherentes. Por ejemplo, la aferesis solo es un procedimiento de recoleccion de constituyentes lfquidos. A pesar de los avances tecnologicos, las etapas compuestas de recoleccion, enriquecimiento y modificacion (opcional) de celulas sangumeas diana se realizan mediante el uso de dispositivos continuos y discontinuos individuales, como se menciono anteriormente. De estas etapas, solo la recoleccion y, en un caso, la recoleccion y la modificacion (fotoferesis) actualmente se llevan a cabo conectadas al paciente. Estos procesos discontinuos actuales demandan mucho tiempo y los materiales, el trabajo y los costes son ineficaces (J. Gryn et al., Journal of Hematotherapy & Stem Cell Research 11 (2002), 719-730; K.R. Meehan et al., Journal of Hematotherapy & Stem Cell Research 9 (2000), 767-771). Estos procesos introducen, ademas, problemas graves tales como (i) la seguridad debido a la potencial contaminacion microbiana y (ii) la cadena de custodia (es decir, asegurar que se devuelven al paciente las celulas correctas y mantener la integridad de las celulas) debido a la logfstica de seleccion y modificacion celular. Por ejemplo, la hemolisis es una complicacion rara debido al enredo de las lmeas de los kits de recoleccion de aferesis (R. Reddy, Transfusion and Apheresis Science 32 (2005) 63-72).

Para ilustrar aun mas, la trombocitopenia (reduccion de plaquetas) es un resultado indeseado conocido de la leucaferesis y el efecto secundario mas frecuentemente notificado de leucaferesis en ninos (J. Sevilla et al., Transfusion and Apheresis Science 31 (2004) 221-231; E. Yamaguchi et al., Journal of Hematotherapy & Stem Cell Research 9 (2000) 565-572). La trombocitopenia es importante porque los pacientes son frecuentemente trombocitopenicos debido a sus enfermedades subyacentes y hay una perdida adicional de plaquetas durante la leucaferesis. Idealmente, en individuos con una deficiencia en el numero de plaquetas debido a ciertos estados patologicos, las plaquetas a las que se les realizo aferesis dentro de la capa leucocitaria debenan separarse y devolverse al individuo. Sin embargo, en la realidad, las plaquetas a las que se les realizo aferesis simplemente se desechan como residuo. Aparte de esto, la reduccion de plaquetas en la capa leucocitaria tiene, ademas, el beneficio adicional de aumentar la eficacia de seleccion de inmunoafinidad de celulas progenitoras CD34+ (un tipo de PBPC) en un promedio de 1,8 veces (R. Moog, Transfusion and Apheresis Science 31 (2004) 207-220).

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Otro inconveniente del proceso de leucaferesis es la perdida de linfocitos valiosos para algunos pacientes. Como se ha comentado anteriormente, las HSC y HPC (en particular las celulas progenitoras CD34+) se seleccionan, frecuentemente, para usarse en la reconstitucion del sistema hematopoyetico de un individuo. Para individuos infectados con el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), la seleccion de celulas progenitoras CD34+ mediante el uso de leucaferesis elimina del cuerpo linfocitos valiosos (tales como celulas CD3+ y CD4+), los cuales, frecuentemente, ya se encuentran en numero bajo. Las celulas progenitoras CD34+ (aproximadamente 1,3% despues de la movilizacion) se encuentran entre las fracciones de celulas mas pequenas recolectadas durante la leucaferesis de PBPC, mientras que los linfocitos y monocitos representan hasta el 70 % de los productos de aferesis (V. Witt et al., Journal of Clinical Apheresis l6(2001) 161-168).

Existe la necesidad de un dispositivo que pueda superar o al menos mejorar una o mas desventajas de los sistemas existentes, que incluyen aquellos mencionados anteriormente.

Sumario

De acuerdo con un aspecto de la invencion, se proporciona un aparato para procesar sangre tal como se define en la reivindicacion 1.

En relacion con la invencion, se proporciona un metodo de procesamiento de sangre. El metodo comprende las etapas de: obtener sangre de un paciente acoplado a un solo dispositivo de procesamiento de sangre para formar un circuito cerrado entre el paciente y el dispositivo de procesamiento de sangre; recolectar celulas sangumeas mononucleares a granel de la sangre por leucaferesis implementada mediante el uso del dispositivo de procesamiento de sangre en el circuito cerrado; y enriquecer concurrentemente las celulas diana separadas de las celulas que no son diana en las celulas sangumeas mononucleares a granel mediante el uso del dispositivo de procesamiento de sangre en el circuito cerrado.

En relacion con la invencion, se proporciona un sistema de procesamiento de sangre. El sistema comprende: un mecanismo para obtener sangre de un paciente y comprende un solo dispositivo de procesamiento de sangre acoplado a los medios de obtencion y al paciente para formar un circuito cerrado entre el paciente y el dispositivo de procesamiento de sangre. El dispositivo de procesamiento de sangre comprende: un modulo para recolectar celulas sangumeas mononucleares a granel a partir de la sangre por leucaferesis implementada mediante el uso del dispositivo de procesamiento de sangre en el circuito cerrado; y un modulo para enriquecer concurrentemente celulas diana separadas de celulas que no son diana en las celulas sangumeas mononucleares a granel mediante el uso del dispositivo de procesamiento de sangre en el circuito cerrado.

Estos y otros aspectos de la invencion se exponen con mayor detalle de aqrn en adelante.

Breve descripcion de los dibujos

Las realizaciones de la invencion se describen de aqrn en adelante con referencia a las figuras, en las cuales:

La Figura 1 es un diagrama en bloque de dispositivos para la recoleccion de celulas por leucaferesis y enriquecimiento mediante el uso de purificacion y lavado de celulas;

La Figura 2 es un diagrama esquematico que describe un ejemplo espedfico de un metodo actual para la recoleccion, el enriquecimiento y la modificacion celular;

La Figura 3 es un diagrama de flujo de un metodo de procesamiento de celulas sangumeas de acuerdo con una realizacion de la invencion;

La Figura 4 es un diagrama esquematico que describe la recoleccion de celulas, el enriquecimiento de celulas diana y el retorno de celulas que no son diana concurrentes;

La Figura 5 es un diagrama esquematico que describe la recoleccion de celulas, el enriquecimiento de celulas diana y el retorno de celulas diana concurrentes;

La Figura 6 es un diagrama esquematico que describe un metodo de recoleccion de celulas de un paciente, el enriquecimiento de celulas diana, la modificacion de celulas diana y el retorno de las celulas diana modificadas al paciente concurrentes;

La Figura 7 es un diagrama esquematico de un dispositivo que lleva a cabo la recoleccion y el enriquecimiento de acuerdo con una realizacion de la presente invencion. Los simbolos representan los siguientes componentes:

bolsa de solucion salina,

bomba peristaltica

prensa,

detector de aire,

calibre de presion,

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prensa,

La Figura 8 es un diagrama esquematico de un dispositivo que lleva a cabo la recoleccion, el enriquecimiento y la modificacion de acuerdo con otra realizacion de la presente invencion. Los simbolos representan los siguientes

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componentes: bolsa de solucion salina,

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bomba peristaltica, o ; prensa, A i detector de aire, calibre

de presion,

's prensa,,

La Figura 9 es una vista en perspectiva de elementos del dispositivo de procesamiento de sangre que comprende las unidades o modulos de recoleccion, enriquecimiento y modificacion (opcional);

La Figura 10 es una vista en perspectiva de elementos del dispositivo de procesamiento de sangre, segun el dispositivo de la Figura 9, donde se resalta el modulo/proceso de enriquecimiento celular;

La Figura 11 es una vista en perspectiva de elementos del dispositivo de procesamiento de sangre, segun el dispositivo de la Figura 9 o 10, donde se resalta la etapa opcional de modificacion de celulas dentro del dispositivo; y

La Figura 12 es un diagrama esquematico de un dispositivo que lleva a cabo la recoleccion y el enriquecimiento de acuerdo con otra realizacion de la presente invencion. Los simbolos representan los siguientes componentes:

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prensa Descripcion detallada

A continuacion se describen metodos, aparatos y sistemas para el procesamiento de celulas sangumeas. En particular, se describen metodos, aparatos y sistemas para leucaferesis que permiten la recoleccion y el enriquecimiento concurrentes de celulas diana espedficas a partir de la sangre periferica de un individuo, y el resto de los componentes de la sangre se devuelven al individuo. Adicionalmente, las celulas diana recolectadas podnan modificarse y devolverse al individuo durante el proceso de aferesis o podnan devolverse al individuo mas tarde. Las realizaciones de la invencion se relacionan con un dispositivo de circuito cerrado que permite la recoleccion y el enriquecimiento concurrentes de celulas diana espedficas a partir de sangre periferica de un individuo, y el retorno de las celulas que no son diana al individuo. Las celulas diana podnan modificarse para alterar su fenotipo, genotipo o actividad, y en una extension del circuito cerrado devolverse al individuo. Las realizaciones de la invencion llevan a cabo eficazmente el proceso de aferesis de una manera conectada al paciente, de flujo continuo y circuito cerrado, por la cual solo se enriquecen componentes diana de la sangre (por ejemplo, celulas progenitoras CD34+) mientras que todos los demas componentes restantes se devuelven al paciente. Adicionalmente, ciertas otras funciones podnan llevarse a cabo sobre las celulas diana (por ejemplo, la modificacion del fenotipo) con la opcion de devolver las celulas modificadas al paciente. La provision de un dispositivo asf puede reducir significativamente los costos de funcionamiento (sin necesidad de multiples aparatos y artfculos de consumo) y asegurar la consistencia del producto. Permitir que el procedimiento de aferesis suceda en un solo lugar en un solo dispositivo ademas reduce el riesgo de dano o perdida del producto. Sin embargo, a partir de esta descripcion, resultara evidente para aquellos con experiencia en la tecnica que podnan realizarse modificaciones y/o sustituciones sin apartarse del alcance y el espmtu de la invencion.

Definiciones

Termino

Celula

mononuclear

granel

Definicion

La poblacion de celulas mononucleares a granel recolectada por leucaferesis. Tambien a denominada poblacion de celulas mononucleares a granel.

Captura

Procesamiento de celulas

El aislamiento de un tipo o tipos espedficos de celulas a partir de una mezcla de celulas, mediante una interaccion especifica (por ejemplo, ffsica o qmmica) (por ejemplo, interacciones anticuerpo-antfgeno u otras interacciones como se describen en la presente memoria). Esto podna realizarse mediante un sistema de captura de celulas.

Todas las etapas (algunas de las cuales podnan ser opcionales) que implican la recoleccion, el enriquecimiento, la modificacion y el almacenamiento de celulas. Las celulas podnan usarse fuera del cuerpo para investigar, controlar o desechar o podnan infundirse posteriormente a un individuo(s).

Termino Definicion

Circuito cerrado: Al menos una sucesion de celulas se mantiene en un sistema que es un continuo, de manera que las celulas se obtienen del paciente y pueden devolverse al paciente sin moverse fuera de lmea.

Designacion de grupo (CD): Sistema de clasificacion para anticuerpos monoclonales generados por laboratorios en todo el mundo contra moleculas superficiales de celulas, inicialmente, en leucocitos, ahora tambien antfgenos de otros tipos de celulas.

Concurrente: Parte del mismo proceso en tiempo real, que sucede en tiempo real; puede ser secuencial o simultaneo.

Continuo: Parte de un circuito cerrado.

Flujo continuo: El flujo de sangre desde el paciente al dispositivo y de vuelta al paciente, en el cual las celulas que no son diana, generalmente se devuelven al paciente, mientras que las celulas diana podnan recolectarse, podnan fluir por un sistema de enriquecimiento en el dispositivo, podnan modificarse a traves de un sistema de modificacion en el dispositivo y, despues, volver al paciente; todo de una forma conectada al paciente, de circuito cerrado y en tiempo real.

Sistema de flujo continuo: El paso fluido y los controles tecnicos que permiten el flujo continuo.

Centrifugacion diferencial: La centrifugacion para separar una poblacion de celulas a granel en funcion del tamano y la densidad.

Discontinuo: Que no es parte de un circuito cerrado.

Enriquecer: La concentracion del tipo de celula diana por un medio ffsico o qmmico; esto podna abarcar lavado, aislamiento o purificacion.

Integral: Una parte importante de/un requisito.

Aislar: El proceso de extraer (por ejemplo, por captura) un tipo de celula espedfico o mas a partir de una mezcla de celulas.

Leucaferesis: Un proceso de flujo continuo donde se obtiene la sangre de un donante, se recoleta una poblacion de celulas mononucleares y se reinfunden los componentes restantes de la sangre (plasma, plaquetas, globulos rojos y celulas polimorfonucleares) al donante.

Ligando: Cualquier molecula (por ejemplo, un anticuerpo) que se une a otra (por ejemplo, un receptor).

Control: La determinacion de parametros del proceso (por ejemplo, en tiempo real o retrospectivo), por ejemplo, medicion del numero de un tipo de celula espedfico (por ejemplo, CD34) que se esta capturando.

Celulas que no son diana: Estas son las celulas que quedan despues del enriquecimiento de celulas diana de la recoleccion de celulas mononucleares a granel, las cuales se recolectaron por leucaferesis.

Modificacion: La alteracion del fenotipo, el genotipo o la actividad celular, tambien denominada, en algunos casos, manipulacion.

Conectado al paciente: Esto se refiere a cuando el dispositivo se encuentra conectado al paciente. El paciente podna estar conectado al dispositivo durante todo el periodo de recoleccion y enriquecimiento de celulas sangumeas y, potencialmente, modificacion celular. El flujo de sangre desde un paciente al dispositivo y de regreso al paciente, en el cual las celulas que no son diana se devuelven generalmente al paciente, mientras que las celulas diana podnan recolectarse, podnan fluir por un sistema de enriquecimiento en el dispositivo, podnan modificarse a traves de un sistema de modificacion en el dispositivo y, despues volver al paciente; todo en una forma de circuito cerrado.

Desconectado del paciente: Las etapas de procesamiento celular que suceden cuando el paciente esta desconectado del dispositivo.

Pureza: El porcentaje de un tipo espedfico de celula en la poblacion celular.

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Termino

En tiempo real Tal como sucede.

Definicion

Control en tiempo La determinacion de parametros del proceso tal como esta sucediendo, por ejemplo, medicion real del numero de un tipo de celula espedfico (por ejemplo, CD34) que se esta capturando.

Liberacion

El proceso de separacion (por ejemplo, ffsico o qmmico) de la celula desde el sistema de captura.

Mismo dispositivo Un dispositivo en el cual se pueden llevar a cabo multiples funciones.

Celula diana El tipo o los tipos de celulas enriquecidas de la poblacion de celulas mononucleares a granel

recolectadas por leucaferesis. El tipo (o los tipos) de celula diana se enriquece para luego desecharse o usarse, lo cual podna incluir la modificacion y reinfusion en el individuo. Se entiende que el tipo de celula sangumea diana que se enriquece puede abarcar un tipo de celula o mas. Tambien denominada, en la presente invencion, tipo de celula diana o poblacion de celula diana.

Los dispositivos multifuncionales y sus metodos de uso, es decir, de circuito cerrado, pueden estar conectados al paciente y comprenden los siguientes aspectos:

a) recoleccion: realizar la recoleccion por leucaferesis de una poblacion de celulas sangumeas mononucleares a granel que contiene la poblacion de celulas diana de interes; y, concurrentemente,

b) enriquecimiento: enriquecer una poblacion celular diana desde la poblacion de celulas sangumeas mononucleares a granel.

La poblacion celular enriquecida se devuelve al paciente o se retira para el uso subsiguiente fuera de lmea, que incluye modificaciones que podnan implicar la posterior infusion de las celulas modificadas al paciente. El uso fuera de lmea de la poblacion celular diana podna incluir el uso para investigacion o control. La poblacion celular que no es diana podna devolverse, concurrentemente, al paciente, podna separarse fuera de lmea para usarse u, opcionalmente, desecharse. El metodo, adicionalmente, puede modificar, en una extension del proceso de circuito cerrado, la poblacion de celulas sangumeas diana antes de devolver la poblacion de celulas sangumeas diana modificadas al paciente.

La Figura 3 describe a grandes rasgos un metodo 300 para procesar sangre que comprende las etapas 310-316 y 330 (indicadas por cuadros con lmeas continuas). Si bien no se describen en la Figura 3, las etapas 312-316 podnan llevarse a cabo reiteradamente. El metodo 300 podna comprender, opcionalmente, una o mas de las etapas 320-326 (indicadas por cuadros con lmeas discontinuas en la Figura 3). Del mismo modo, una o mas de estas etapas 320326 podnan llevarse a cabo reiteradamente (no mostrado en la Figura 3). Si bien las etapas del metodo 300 se describen como llevadas a cabo secuencialmente y en un orden particular, el metodo 300 no esta limitado a la secuencia particular, el procesamiento secuencial o todas las etapas, algunas de las cuales son opcionales, que se estan llevando a cabo. Aquellos con experiencia en la tecnica entenderan que a la luz de esta divulgacion, el ordenamiento de las etapas podna cambiarse. Ademas, podnan llevarse a cabo una o mas etapas en paralelo. Por ejemplo, las etapas 312 a 316 podnan llevarse a cabo en paralelo. Ademas, la etapa 326 podna llevarse a cabo en paralelo con las etapas 314 y 316. De aqrn en adelante se describe el metodo 300 para procesar sangre con mayor detalle.

El procesamiento comienza en la etapa 310. En la etapa 312 se obtiene sangre de un paciente acoplado a un solo dispositivo de procesamiento de sangre para formar un circuito cerrado entre el paciente y el dispositivo de procesamiento de sangre.

En la etapa 314 las celulas sangumeas mononucleares a granel se recolectan de la sangre por leucaferesis implementada mediante el uso del dispositivo de procesamiento de sangre en el circuito cerrado. La etapa de recoleccion 314 podna comprender el uso de centrifugacion diferencial para recolectar las celulas sangumeas mononucleares. La centrifugacion diferencial podna conducirse mediante un sistema de flujo continuo.

En la etapa 316 las celulas diana separadas de celulas que no son diana en las celulas sangumeas mononucleares a granel se enriquecen, concurrentemente, mediante el uso del dispositivo de procesamiento de sangre en el circuito cerrado. Las celulas diana podnan ser linfocitos B, linfocitos T, celulas dendnticas, monocitos, neutrofilos, linfocitos citolfticos naturales (NK), linfocitos T reguladores T, linfocitos T cooperadores, linfocitos T citotoxicos (CTL), celulas madre hematopoyeticas (HSC), celulas progenitoras hematopoyeticas, celulas endoteliales, celulas epiteliales, celulas mesenquimales, linfocitos, linfocitos citolfticos activados por linfocina (LAK) o linfocitos infiltrantes de tumor (TIL). Los linfocitos T podnan enriquecerse. Los linfocitos T podnan ser CD8+ o CD4+. Las celulas progenitoras hematopoyeticas y las celulas madre hematopoyeticas podnan enriquecerse. Las celulas madre hematopoyeticas y las celulas progenitoras hematopoyeticas podnan ser positivas para uno o mas de CD34, CD133 y CD143. Opcionalmente, las celulas diana podnan ser al menos una de celulas malignas de la sangre, celulas malignas del

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tejido, celulas infectadas por virus, celulas infectadas por bacterias, al menos un virus, al menos una bacteria, un parasito, celulas fetales y celulas efectoras patogenicas.

La etapa de enriquecimiento 316 podna comprender la captura de ligandos para enriquecer las celulas diana. El ligando podna ser un anticuerpo espedfico para un ligando de superficie celular. El ligando de superficie celular podna ser una molecula de adhesion de celulas epiteliales (EpCAM), una selectina, un receptor de molecula de adhesion, un receptor de localizacion, un receptor de citocina, un receptor de quimiocina o una enzima. El ligando de superficie celular podna ser un antigeno de designacion de grupo (CD). El antigeno CD podna ser CD1a, CD4, CD8, cDl4, CD25, CD34, CD133 o CD143. El enriquecimiento de celulas diana en la etapa 316 podna llevarse a cabo por al menos uno de los metodos siguientes: magnetico, clasificacion de celulas activada por fluorescencia, microflmdica, soporte solido, acustico, bioluminiscencia, etiquetado de anticuerpos y sustrato enzimatico. El soporte solido podna comprender una partfcula. La partfcula podna ser al menos una de una partfcula magnetica y una partfcuia de densidad modificada.

Las etapas de recoleccion y enriquecimiento 314, 316 podnan llevarse a cabo en distintas secciones del dispositivo de procesamiento de sangre.

En la etapa 320, las celulas diana enriquecidas podnan modificarse. La etapa de modificacion 320 podna incluir una modificacion que comprende una o mas de activacion, expansion, induccion de apoptosis, modificacion genetica e induccion de especificidad de antfgenos. La etapa de modificacion 320 podna implicar una modificacion que se lleva a cabo por al menos uno de reticulacion de receptores de superficie celular, irradiacion, y tratamiento con al menos uno de citocinas, quimiocinas, estimulacion de antfgenos, hormonas, farmacos, presion, y calentamiento. La irradiacion podna ser al menos una de radiacion gamma, beta, alfa y lummica. La radiacion lummica podna ser al menos una de ultravioleta A (UVA), ultravioleta B (UVB) y luz visible. Opcionalmente, la etapa de modificacion 320 podna implicar una modificacion genetica que se lleva a cabo por una de transfeccion y transduccion de material genetico en al menos una porcion de las celulas diana. La transfeccion de material genetico podna ser una de electroporacion y lipofeccion. La transduccion de material genetico podna ser por transduccion de vectores virales. En otra alternativa, la etapa de modificacion 320 podna implicar una modificacion que comprenda al menos una de activacion de linfocitos T citotoxicos (CTL), activacion de celulas reguladoras T (Treg) y celulas sangumeas modificadas geneticamente protegidas del virus de inmunodeficiencia humana (VIH).

En la etapa 322, las celulas que no son diana podnan modificarse. Ademas, en la etapa 324, las celulas que no son diana podnan devolverse al paciente. Las celulas que no son diana podnan devolverse al paciente conectado al circuito cerrado o desconectado del circuito cerrado. Ademas, las celulas que no son diana podnan desecharse.

En la etapa 326, las etapas de recoleccion y enriquecimiento podnan controlarse, concurrentemente, para determinar el numero de celulas. Esto permitina que se complete la recoleccion tan pronto como se recolecten y enriquezcan suficientes celulas, lo cual permite que la recoleccion se personalice al paciente.

El metodo podna comprender mantener una conexion continua del paciente en el circuito cerrado durante el procesamiento de celulas diana o desconectar al paciente del circuito cerrado por un intervalo de tiempo durante el procesamiento de las celulas diana. El procesamiento finaliza (Final) en la etapa 330. A continuacion se describen estos y otros aspectos con mas detalle.

Recoleccion de celulas y enriquecimiento concurrente de celulas diana para usarse fuera de lrnea, que incluye la modificacion y su eliminacion

La Figura 4 describe, a grandes rasgos, un metodo 400 de recoleccion de celulas 410 del paciente 450, enriquecimiento de celulas diana 420 y retorno de celulas que no son diana 452 concurrentes (todo descrito dentro del drculo 402). Las celulas diana enriquecidas 430 podnan usarse fuera de lrnea para investigacion/prueba 462, 470 o podnan desecharse 482. Opcionalmente, las celulas diana enriquecidas 430, 462 se modifican para infundirlas 464, mas tarde, en el paciente 450. Este aspecto abarca la recoleccion de celulas 410, el enriquecimiento de celulas diana 420 y el retorno 452 concurrentes de celulas que no son diana al paciente 450 en un circuito cerrado. La etapa de recoleccion por leucaferesis 410 brinda una poblacion de celulas mononucleares. Se lleva a cabo una etapa de enriquecimiento en lrnea 420 de celulas diana. Las celulas que no son diana se devuelven 452 al paciente 450. Las celulas diana enriquecidas 430 podnan usarse fuera de lrnea y, opcionalmente, podnan modificarse para la investigacion, prueba, etc. 470 o para la posterior infusion 464 de celulas diana en el paciente 450. Las celulas diana 462 podnan usarse con o sin modificacion. Las celulas ademas podnan desecharse 482. En la situacion donde las celulas diana se modifican y devuelven 464 al paciente, las celulas que no son diana 452 no se devuelven necesariamente al paciente 450. El proceso 400 de recoleccion de celulas 410, enriquecimiento de celulas diana 420 y modificacion de celulas fuera de lrnea concurrentes podna repetirse tantas veces como sea necesario, por ejemplo, para alcanzar un cierto numero de celulas diana. El enriquecimiento de celulas diana 420 podna ser para uno o varios tipos de celulas. La modificacion de celulas diana podna ser para uno o varios tipos de celulas. El circuito cerrado se conecta al paciente 450 en los momentos de recoleccion de celulas 410 y retorno de celulas 452.

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Recoleccion de celulas y enriquecimiento de celulas diana concurrente para devolver con celulas que no son diana usadas fuera de lrnea o desechadas

La Figura 5 describe, a grandes rasgos, un metodo 500 de recoleccion de celulas 510 de un paciente 550, enriquecimiento de celulas diana 520 y retorno concurrentes de celulas diana 552 al paciente 550. Las celulas que no son diana enriquecidas 530, se usan despues, fuera de lrnea con o sin modificacion para investigacion/prueba 562, 570, o se desechan 582. Nuevamente, la etapa de recoleccion por leucaferesis 510 brinda una poblacion de celulas mononucleares. Se lleva a cabo la etapa de enriquecimiento en lrnea 520 de celulas diana. Las celulas diana 552 se devuelven al paciente 550. Este aspecto abarca recoleccion de celulas 510, enriquecimiento 520 de celulas diana y retorno 552 de celulas diana al paciente 550 concurrentes. Las celulas que no son diana 562 podnan usarse fuera de lrnea para investigacion, prueba, etc. 570 (tanto con o sin una etapa de modificacion) o se desechan 582. El circuito cerrado se conecta al paciente 550 en los momentos de recoleccion de celulas 510 y retorno de celulas 552.

Recoleccion de celulas, enriquecimiento y modificacion de celulas diana concurrente

La Figura 6 describe a grandes rasgos un metodo 600 de recoleccion de celulas 610 de un paciente 650, enriquecimiento 620 de celulas diana, modificacion 660 de celulas diana 630 y retorno concurrentes de celulas diana modificadas 670 al paciente 650. Las celulas que no son diana 652 podnan, ademas, devolverse al paciente 650. Este aspecto abarca recoleccion de celulas 610, enriquecimiento 620 de celulas diana, modificacion 660 de celulas diana y retorno concurrentes de celulas diana 670 modificadas al paciente 650, en un procedimiento de circuito cerrado. Las celulas que no son diana 652 podnan devolverse, opcionalmente, al paciente. El circuito cerrado se conecta al paciente 650 en los momentos de recoleccion de celulas 610 y retorno de celulas 652, 670.

Recoleccion de celulas

Una realizacion de la invencion comprende recoleccion de celulas y enriquecimiento de celulas concurrente. La recoleccion es la recoleccion por leucaferesis de las celulas sangumeas mononucleares a granel, las celulas a partir de las cuales las celulas sangumeas diana se enriquecen. Esta etapa podna emplear cualquier metodo conocido en la tecnica para obtener celulas mononucleares a partir de un paciente que incluye, sin limitacion, el uso de centrifugacion diferencial. Los dispositivos para este fin incluyen los sistemas COBE® Spectra, Trima Spectra Optia (todos comercializados por Gambro BCT) y el Amicus o CS-300 (comercializados por Fenwal/Baxter) Gambro Cobe Spectra u Optia, Fenwal Amicus o CS-3000. Preferentemente, la centrifugacion diferencial se realiza mediante un sistema de flujo continuo. En una realizacion preferida, esta recoleccion de celulas sangumeas a granel usa la tecnologfa Therakos CellEx debido a su eficacia de recoleccion superior y su volumen extracorporeo bajo en comparacion con otros dispositivos, los cuales incluyen los dispositivos enumerados anteriormente. Durante la leucaferesis, la poblacion de celulas que no son mononucleares se vuelve a infundir en el individuo.

La Figura 9 ilustra el dispositivo de procesamiento de sangre de acuerdo con una realizacion de la invencion. El paciente 940 se acopla al dispositivo 900 en un circuito cerrado con un cateter de entrada 950 acoplado al paciente 950 para proporcionar sangre como entrada al dispositivo 900 y un cateter de salida 952 como un trayecto de retorno desde el dispositivo 900 al paciente. El dispositivo 900 tiene una interfaz de entrada para recibir sangre directamente desde la circulacion del paciente. El dispositivo 900 tiene, ademas, una interfaz de salida para devolver celulas diana y/o celulas que no son diana enriquecidas a la circulacion del paciente. El dispositivo 900 y el paciente forman un circuito cerrado cuando se acoplan juntos. El dispositivo 900 incluye una unidad de recoleccion por leucaferesis 910 y una unidad de enriquecimiento 920. La unidad o el modulo de recoleccion (leucaferesis) 910 recolecta celulas mononucleares a granel de la sangre recibida. La unidad o el modulo de enriquecimiento 920 enriquece concurrentemente celulas diana separadas de celulas que no son diana en las celulas sangumeas mononucleares a granel. El dispositivo 900 tiene una interfaz de operador 960 para recibir entradas y proporcionar salidas a un operador (no mostrado). El dispositivo 900 comprende, ademas, una plataforma de bomba/valvula 964. El dispositivo 900 podna comprender, ademas, una unidad de modificacion opcional 930. El dispositivo 900 comprende una centnfuga 962 para procesar celulas sangumeas como se explica a continuacion. Se acopla un controlador (no mostrado) a la interfaz de operador 960 y los otros modulos para el control automatico de la operacion del dispositivo 900.

En el sistema Therakos CellEx, un bol de centrifugacion, tal como, por ejemplo, un bol de Latham, como se muestra en la patente de los Estados Unidos N.° 4.303.193 otorgada a Latham, Jr el 1 de diciembre de 1981 y titulada “Apparatus for separating blood into components thereof”, la cual se incorpora a la presente invencion, en su totalidad, como referencia, separa sangre en globulos rojos y capa leucocitaria. El bol de Latham es un separador de componentes sangumeos que se ha usado durante algun tiempo en el mercado medico de la leucaferesis asf como en tratamientos medicos tales como fotoferesis extracorporea (ECP). La patente de los Estados Unidos N.° 5984887 “Photopheresis treatment of leukocyte” proporciona descripciones de fotoferesis extracorporea y su metodo de separacion y centrifugacion celular.

La Figura 7 es un diagrama esquematico mas detallado del dispositivo de procesamiento sangumeo descrito en la Figura 9 (asf como el sistema de la Figura 10 descrito a continuacion). El dispositivo de procesamiento de sangre 700 se muestra acoplado al paciente 736 en la Figura 7. Un nodo de recoleccion 702 y un nodo de retorno 756 se

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encuentran conectados al paciente de la manera mostrada en la Figura 9. El nodo de recoleccion 702 es parte de una interfaz de entrada que incluye un cateter 704, el cual, a su vez, se conecta a un sensor de presion (“recoleccion”) 720. En secuencia, el sensor de presion de recoleccion 720 se acopla a un detector de aire 722, el cual se acopla a una valvula de recoleccion 724. La valvula de recoleccion 724 se acopla a una bomba peristaltica de “recoleccion” 726, la cual, a su vez, se acopla al sensor de presion del bol 728. El sensor de presion 720 afecta a la operacion de la bomba de recoleccion 726. El sensor de presion del bol 728 se acopla al bol de centrifugacion 730. Una salida del bol de centrifugacion 730 se acopla a una bomba de globulos rojos (RBC) 732 y al cateter 734, el cual, a su vez, se acopla a un trayecto de retorno descrito con mas detalle de aqu en adelante.

Una bolsa de anticoagulante (AC) 710 se acopla a una bomba peristaltica de anticoagulante 712 y un cateter adecuado. La bomba 712, a su vez, se acopla a una valvula 714, la cual, a su vez, se acopla a un detector de aire 716. El detector de aire 716 se acopla mediante un cateter adecuado al cateter de entrada 704 y el sensor de presion de recoleccion 720. Esta disposicion permite aplicar el anticoagulante a la entrada de sangre al dispositivo 700 desde el paciente 736.

Otro cateter 770 proporciona una salida desde el bol de la centnfuga 730 y se acopla a una valvula 772. Tambien se encuentra acoplado al cateter 770 un cateter 782 acoplado a una valvula 784. A su vez, la valvula 784 se acopla a una bolsa de retorno 740. La bolsa de retorno 740 se acopla a un detector de aire 742 que, a su vez, se acopla a una valvula 744. La valvula 744, a su vez, se acopla a una valvula 798, a una valvula de solucion salina 760 que, a su vez, se acopla a una bolsa de solucion salina 762, un cateter 734 y una bomba de retorno 746. La bolsa de retorno 740, el detector de aire 742 y la valvula 744 forman un trayecto de retorno con la bomba de retorno 746. La bomba 746 se acopla a la valvula de retorno 748, que se acopla a un detector de aire 750. El detector de aire 750 se acopla al sensor de presion de retorno 752, el cual se acopla al cateter 754 y al nodo de retorno 756.

La valvula 772 se acopla a un sensor 788 capaz de detectar globulos rojos. Un cateter 774 tambien se acopla a la valvula 772 y, a su vez, se conecta a una bomba leucocitaria 776. La bomba leucocitaria 776 se acopla a una placa 778. La salida de la placa 778 se acopla a un cateter 797, el cual, a su vez, se acopla a la valvula 798. La valvula 798 se acopla a una bomba de retorno 746. El sensor de HCT 788 se acopla a las valvulas configuradas en paralelo 790 y 791. La valvula 790 se acopla a una bolsa de recoleccion 786. La valvula 791 se acopla a una bolsa de tratamiento 737, en donde se adicionan agentes para el enriquecimiento. La bolsa de tratamiento 737 se acopla a la valvula 793, la cual, a su vez, se acopla al detector de aire 794. El detector de aire 794 se acopla a la valvula 798.

Una bolsa de tampon de seleccion 795 se acopla a una valvula 796, la cual, a su vez, se acopla al detector de aire 794.

Enriquecimiento de celulas

La Figura 10 muestra el dispositivo 900 de la Figura 9 renumerado como dispositivo 1000. El paciente 1040 se acopla con el dispositivo 1000 en un circuito cerrado con el cateter de entrada 1050 y el cateter de salida 1052. En esta realizacion, la poblacion de celulas mononucleares 1010 se somete a enriquecimiento 1020, por ejemplo, por captura de partfculas recubiertas de anticuerpo, tal como captura de partfculas magneticas. El enriquecimiento 1020 da como resultado celulas diana enriquecidas 1060, las cuales pueden devolverse al paciente. Ademas, las celulas que no son diana que quedan del enriquecimiento 1020 podnan devolverse al paciente 1040 a traves del dispositivo 1000. Las celulas se enriquecen para fines espedficos, los cuales incluyen, pero no se limitan a:

1. Eliminacion del torrente sangumeo (por ejemplo, celulas de mieloma, linfoma leucemico); estos tipos de

celulas se eleginan como celulas a eliminarse de la sangre y desecharse.

2. Modificacion para devolver al paciente y obtener un beneficio; algunos ejemplos incluyen:

a. provocar una respuesta inmunitaria mediante el enriquecimiento y la modificacion de celulas leucemicas o celulas de cancer metastasico;

b. modificacion para generar linfocitos T citotoxicos destinados a un cancer espedfico; y

c. modificacion de HSC/HPC para que contengan un gen que impacte sobre un proceso de enfermedad; por ejemplo, un gen anti VIH para impactar sobre el VIH/SIDA.

3. Uso para investigacion, prueba, etc., el cual podna incluir una etapa de modificacion opcional.

Las celulas diana son celulas que se enriquecen a partir de la sangre periferica despues de la recoleccion de celulas mononucleares a granel. Los tipos de celulas que pueden enriquecerse a partir del producto a granel de la leucaferesis incluyen, pero no se limitan a, linfocitos B, linfocitos T, linfocitos T CD4 y CD8, celulas dendrfticas, monocitos, linfocitos citolfticos naturales (NK), linfocitos T reguladores, linfocitos T cooperadores, linfocitos T citotoxicos (CTL), celulas madre hematopoyeticas (HSC), celulas progenitoras hematopoyeticas, celulas endoteliales, celulas epiteliales, linfocitos citolfticos activados por linfocina (LAK), linfocitos infiltrantes de tumor (TIL), celulas madre mesenquimales y celulas epiteliales, vease la Tabla 1 (Fundamental Immunology por William E. Paul 2003 Lippincott Williams & Wilkins ISBN 0781735149; Essential Haematology, Hoffbrand, Pettit y Moss).

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________________________________________TABLA 1_________________________________________

Tipos de celulas que pueden aislarse de la sangre periferica (con marcadores superficiales conocidos)

■ Celulas madre hematopoyeticas (CD34+, CD135+)

■ Celulas progenitoras endoteliales (CD34+, Flk-1 +, VEGRF-3+, CD133+)

■ Celulas estromales de la medula osea

■ Celulas progenitoras del musculo esqueletico

■ Celulas progenitoras del musculo cardiaco

■ Celulas progenitoras hepaticas (C1qRp+ o CD34+, CD38", CD45+)

■ Celulas madre mesenquimales (cd29+, CD44+, SH2+, SH3+ y SH4+)

■ Eritrocitos (CD44, Glicoforina A)

■ Celulas dendnticas (CD11c+, CD123+)

■ Linfocitos T (CD3+, CD4+, CD8+, CD28+)

■ Linfocitos NK (CD16+, CD57+, CD94+, CD96+, CD122+)

■ Linfocitos B (CD19+, CD22+, CD40+, CD72+, CD79+)

■ Neutrofilos (CD15+, CD128+)

■ Eosinofilos (CD116+, CD125+)

■ Basofilos (CD125+)

■ Monocitos - Macrofagos (CD14+, CD64+, CD68+, CD98+, CD115+, CD163+, Flt-1+)

■ Megacariocitos/Plaquetas (CD41+, CD42+, CD61+, CD109+)

■ Mastocitos (FceRIa+)

■ Progenitores osteoblasticos*

■ Osteoclastos

* Aislados de la sangre periferica, pero sin ningun marcador superficial de celulas identificado hasta la fecha

Otros tipos de celulas destinados a desecharse pueden ser cualquiera conocido en la tecnica, que incluyen, sin limitarse a, celulas de cancer/leucemia de la sangre u otros tejidos, celulas infectadas por virus o bacterias, virus o bacterias o parasitos, celulas fetales o celulas efectoras patogenicas. Estas celulas pueden enriquecerse mediante el uso de antfgenos de superficie adecuados. Estas ultimas celulas ademas pueden destinarse a la modificacion de acuerdo con el proposito N.° 2 anterior, es decir, la modificacion de celulas y la devolucion de las celulas modificadas para causar una respuesta inmunitaria terapeutica.

Durante la etapa de enriquecimiento, puede enriquecerse mas de un tipo de celula diana. El sistema podna enriquecer, de varias formas, multiples tipos de celulas, por ejemplo, los tipos de celulas podnan enriquecerse de forma separada en distintas camaras del dispositivo (900, 1000 de las Figuras 9 y 10). Los distintos tipos de celulas podnan manejarse juntos (por ejemplo, devolverse, desecharse o modificarse todos) o los tipos de celulas podnan manejarse de forma separada (por ejemplo, un grupo devolverse, un grupo desecharse, un grupo modificarse o todos los grupos modificarse pero de distintas formas) o variaciones de lo anterior.

El enriquecimiento de la(s) celula(s) diana podna ser eliminar las celulas diana de la sangre periferica (como en las celulas de leucemia) o enriquecerlas a un porcentaje de pureza requerido para la aplicacion terapeutica o para investigacion/prueba, etc.

El enriquecimiento de la celula diana podna lograrse por medios ffsicos o qmmicos, por ejemplo, captura, y se dice que las celulas diana, por ejemplo, estan aisladas, es decir enriquecidas a partir de la poblacion de celulas sangumeas a granel. El procedimiento de enriquecimiento podna emplear uno o mas metodos conocidos en la tecnica que incluyen, pero no se limitan a, captura de antfgenos, perlas, materiales magneticos, clasificacion de celulas activada por fluorescencia, microflmdica, soporte solido, acustico, bioluminiscencia, etiquetado de anticuerpos o sustrato enzimatico. Los soportes solidos adecuados incluyen partfculas que incluyen, sin limitarse a, partfculas ferromagneticas y de densidad modificada. Estos pueden obtenerse, por ejemplo, de Miltenyi Biotec and Dynal (Curr Opin Immunol. Abr 1991; 3(2):238-241). Existen metodos que pueden usarse para la liberacion de las celulas capturadas que incluyen: i) competencia con un exceso de ligando, ii) digestion enzimatica, iii) cambio de pH, iv) cambio de la fuerza ionica, v) eliminacion del campo magnetico, vi) agitacion ffsica.

El o los ligandos espedficos para la poblacion o las poblaciones de celulas diana pueden ser cualquiera conocido en la tecnica y, preferentemente, es un anticuerpo espedfico para un ligando de superficie celular. El ligando de superficie celular puede ser un antfgeno de designacion de grupo (CD) que incluye, sin limitarse a, CD1a, CD4, CD8, cD14, CD25, cD34 y CD133, el cual, habitualmente, usa un anticuerpo espedfico para capturar/seleccionar la celula diana. El ligando de superficie celular puede ser, sin limitarse a, EpCAM (molecula de adhesion de celulas epiteliales), selectinas, receptor de molecula de adhesion, receptores de localizacion, receptores de citocina, receptores de quimiocina y enzimas que incluyen aldehfdo deshidrogenasa y otras enzimas intracelulares. En la Tabla 1 se indican varios marcadores de superficie.

A modo de ejemplo, una forma de enriquecer celulas es el uso de anticuerpos o aptomeros. El termino anticuerpo se refiere a una molecula de inmunoglobulina capaz de unirse un epttopo presente en un antfgeno. Como se usa en la presente memoria, el termino anticuerpo se refiere a moleculas que unen celulas. El termino pretende abarcar

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moleculas de inmunoglobulina intactas tales como anticuerpos monoclonales y policlonales, pero tambien, anticuerpos biespedficos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quimericos, anticuerpos antiidiopaticos (anti ID), anticuerpos de cadena sencilla, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), protemas de fusion y cualquier modificacion de los anteriores que comprenda un sitio de reconocimiento de ligandos de la especificidad requerida. Como se usa en la presente memoria, un aptomero es un peptido o acido nucleico que no es de origen natural y que tiene una accion deseada en una diana. Una accion deseada incluye, pero no se limita a, unirse a la diana, cambiar cataltticamente la diana, reaccionar con la diana de una forma que modifique/altere la diana o la actividad funcional de la diana, adherirse covalentemente a la diana como en un inhibidor suicida, facilitar la reaccion entre la diana y otra molecula.

Las HSC/HPC pueden enriquecerse mediante una variedad de metodos que incluyen el uso de marcadores de la superficie celular CD34 o CD133, o niveles elevados de alcohol deshidrogenasa (ALDH). En una realizacion de la presente invencion, las celulas HSC/HPC CD34+ se enriquecen y, despues, se modifican en la etapa de introduccion de un gen anti VIH. La introduccion podna llevarse a cabo mediante una variedad de medios, por ejemplo, la transduccion retroviral.

Las celulas diana podnan devolverse al paciente. En ciertas afecciones medicas podna resultar ventajoso desechar o retener las poblaciones de celulas diana para fines de diagnostico/control. Por ejemplo, en el procedimiento de diagnostico desarrollado por Immunicon Inc. denominado CellSearch™ se determinan celulas de tumores raros en la sangre mediante un sistema separador de perlas magneticas (referencia). Este procedimiento de recoleccion a escala mas grande podna aumentar la sensibilidad de tal metodo de diagnostico. Desechar celulas tumorales diana espedficas o celulas patogenicas, tales como celulas Th17 en enfermedades autoinmunitarias podna resultar beneficioso (referencia). Finalmente, la induccion de linfopenia se ha asociado con mejores resultados para ciertos tratamientos por razones tales como dejar espacio para la terapia celular (Dudley, ME et.al. Science. 2002 Oct 25;298(5594):850-4. Epub 2002 Sep 19). Las poblaciones de celulas destinadas a desecharse pueden ser cualquiera conocida en la tecnica, que incluyen, pero no se limitan a, celulas malignas de la sangre u otros tejidos, celulas infectadas con virus o bacterias, virus, bacterias o parasitos, celulas fetales o celulas efectoras patogenicas tales como Th1, Th17, CTL, etc. Se realiza este enriquecimiento y se logra el porcentaje de pureza requerido para la aplicacion terapeutica. En ciertos casos, se requiere un porcentaje de enriquecimiento espedfico (vease abajo). En el caso de eliminar celulas patogenicas, por ejemplo, celulas de cancer/leucemia, la eficacia del aclaramiento desde la sangre es mas importante que el porcentaje de pureza final real. Estas celulas ademas pueden destinarse para la modificacion de acuerdo con el proposito N.° 2 anterior.

Las dos etapas de recoleccion y enriquecimiento de celulas se realizan en una forma de circuito cerrado en un unico dispositivo; las etapas pueden llevarse a cabo en las mismas secciones o en secciones distintas del dispositivo. Las celulas que no son diana podnan devolverse al paciente o desecharse, como se requiera terapeuticamente, o usarse fuera de lmea para investigacion/prueba. En el caso de afecciones inmunocomprometidas o linfopenicas tal como la infeccion por VIH, por ejemplo, las celulas que no son diana pueden devolverse en el sistema de circuito cerrado, lo que permite el retorno de celulas esenciales, la perdida de las cuales podna comprometer al paciente. En otros casos en donde no se requiere el retorno de las celulas diana o en donde el no retorno ofrecena un beneficio, las celulas que no son diana pueden desecharse o usarse fuera de lmea para otros fines. Tal beneficio podna surgir como resultado, por ejemplo, de convertir al paciente en linfopenico, lo que puede aumentar la eficacia de ciertos tratamientos celulares. (Dudley, ME et.al. Science. 2002 Oct 25;298(5594):850-4. Epub 2002 Sep 19).

Modificacion de celulas

La Figura 11 muestra el dispositivo 900 o 1000 de la Figura 9 o 10 renumerado como dispositivo 1100. El paciente 1140 se acopla con el dispositivo 1100 en un circuito cerrado con el cateter de entrada 1150 y el cateter de salida 1152. En esta realizacion, se proporciona una etapa de modificacion adicional de las celulas diana en una forma conectada al paciente y de circuito cerrado. Esta etapa representa una extension del sistema de circuito cerrado conectado al paciente de recoleccion y enriquecimiento celular. La modificacion de celulas diana en un sistema de circuito cerrado conectado al paciente puede llevarse a cabo como una extension del sistema conectado al paciente de circuito cerrado de recoleccion y enriquecimiento. Como se muestra en la Figura 11, las celulas diana enriquecidas 1160 se modifican en un recipiente 1170 para proporcionar celulas diana modificadas 1180. La modificacion opcional puede ser una o mas de electroporacion, lipofeccion, transduccion viral, luz (ultravioleta A (UVA), ultravioleta B (UVB), etc.), adicion de farmacos, activacion celular, presion, calentamiento, etc.

La Figura 8 es un diagrama esquematico mas detallado del dispositivo de procesamiento de sangre descrito en la Figura 11. El dispositivo de procesamiento de sangre 800 se muestra acoplado a un paciente 836 en la Figura 8. Los elementos del dispositivo 700 mostrado en la Figura 7 que son los mismos que en el dispositivo 800 de la Figura 8 tienen el numero de referencia correspondiente, excepto que el primer dfgito es distinto para que se corresponda con el numero de la Figura (7XX y 8XX), entonces el nodo de recoleccion 702 de la Figura 7 es el nodo de recoleccion 802 de la Figura 8. Para mayor brevedad, la descripcion de las caractensticas correspondientes no se repetira en la descripcion de la Figura 8 ya que aquellos elementos de la Figura 7 que son iguales en la Figura 8 tienen la misma funcion y configuracion. En cambio, de aqrn en adelante solo se describen las diferencias entre las Figuras 7 y 8. La bolsa de recoleccion 886 se acopla a una bomba de modificacion 831, la cual a su vez se acopla a una unidad o un modulo de modificacion 833. El modulo de modificacion 833 a su vez se acopla a una bolsa de

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celulas modificadas 835. La configuracion del dispositivo 800 de la Figura 8 es, de cualquier otra forma, igual al de la Figura 7.

La modificacion ademas podna llevarse a cabo como una modificacion celular ex vivo discontinua para alterar el fenotipo, el genotipo o la actividad de las celulas. Esto puede ser mediante la adicion de citocinas, reticulacion de receptores espedficos, adicion de antigenos, transfeccion de ADN, ARN o protemas, induccion de celula apoptotica, incorporacion genica que incluye transduccion viral. En esta realizacion la poblacion de celulas diana enriquecidas 1160 se retira para una etapa de modificacion discontinua individual para alterar el fenotipo/el genotipo/la actividad de las celulas. Despues, las celulas modificadas pueden usarse para investigacion o para la aplicacion terapeutica mediante la infusion a un paciente. El grado de enriquecimiento es el que se requiere para fines de investigacion/prueba o para la aplicacion terapeutica.

La poblacion de celulas diana enriquecidas puede modificarse mediante cualquier metodo conocido en la tecnica que incluye, sin limitarse a, activacion, expansion, induccion de apoptosis, manipulacion genetica, induccion de especificidad de antfgeno, etc. Esto puede lograrse, por ejemplo, mediante adicion de citocinas, reticulacion de receptores espedficos, adicion de antfgenos, introduccion de ADN, ARN o protemas, transduccion viral, electroporacion, lipofeccion, tratamiento con luz de varias longitudes de onda, adicion de farmacos, captura de celulas o componentes celulares, presion, calentamiento, etc.

Las celulas pueden modificarse mediante una variedad de medios que, en todos los casos menos en el de la fotoferesis (vease abajo), se realizan en un proceso desconectado del paciente mediante un proceso o dispositivo autonomo. Existen muchos ejemplos de procedimientos desconectados del paciente que incluyen modificacion de celulas ex vivo para alterar el fenotipo/genotipo/actividad de las celulas; esto puede realizarse, por ejemplo, mediante la adicion de citocinas, reticulacion de receptores espedficos, adicion de antfgenos, transfeccion de ADN o ARN, introduccion de protemas, induccion de celulas apoptoticas o incorporacion de genes mediante, por ejemplo, transduccion viral. Los medios para hacerlo incluyen, pero no se limitan a, electroporacion, lipofeccion, transduccion viral, irradiacion, incubacion con farmacos, captura de celulas, activacion de celulas, presion, calentamiento, reticulacion de receptores de superficie celular, tratamiento con citocinas, quimiocinas, hormonas, etc. Por ejemplo, la electroporacion o electropermeabilizacion es un metodo usado para introducir compuestos extracelulares tales como material genetico (ADN o ARN) en una celula aumentando la permeabilidad de la membrana celular causada por un campo electrico aplicado externamente. Esta tecnica se usa, actualmente, rutinariamente para fines de investigacion y se han llevado a cabo ensayos clmicos que muestran su utilidad potencial en un tratamiento para un ser humano.

Las celulas destinadas a modificacion incluyen, pero no se limitan a, linfocitos B, linfocitos T, linfocitos T CD4 y CD8, celulas dendnticas, monocitos, linfocitos citoltticos naturales (NK), linfocitos T reguladores, linfocitos T cooperadores, linfocitos T citotoxicos (CTL), celulas madre hematopoyeticas (HSC), celulas progenitoras hematopoyeticas, celulas endoteliales, celulas epiteliales, linfocitos citoltticos activados por linfocina (LAK), linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) y celulas epiteliales, vease la Tabla 1. (Fundamental Immunology por William E. Paul 2003 Lippincott Williams & Wilkins ISBN 0781735149; Essential Haematology, Hoffbrand, Pettit y Moss).

Estas celulas modificadas son utiles para el tratamiento de una variedad de enfermedades y afecciones. Por ejemplo, la terapia adoptiva de linfocitos T se describe en C.H. June. J. Clin. Invest. 117, (2007) 1466-1476. En este ejemplo, los linfocitos de la sangre periferica se recolectan del paciente, se enriquecen en una etapa individual y se incuban con sistemas de activacion para aumentar la actividad antitumoral de los CTL. Las HSC se han usado en trasplantes de medula osea durante muchos anos y se usan cada vez mas en otras aplicaciones tales como tratamiento cardiovascular y cicatrizacion de heridas.

Las modificaciones pueden llevarse a cabo mediante el uso de cualquier metodo conocido en la tecnica que incluye, pero no se limitan a, transfeccion o transduccion de material genetico en al menos una porcion de la poblacion de celulas diana, reticulacion de receptores espedficos o tratamiento con citocinas. La transfeccion o transduccion de material genetico puede hacerse mediante cualquier metodo conocido en la tecnica que incluye, sin limitarse a, transduccion de vectores, electroporacion o lipofeccion. La modificacion puede ser cualquiera conocida en la tecnica que incluye, pero no se limita a, activacion de linfocitos T citotoxicos (CTL), activacion de linfocitos T reguladores (Treg), induccion de apoptosis o modificacion genica de celulas sangumeas para la proteccion contra el virus de inmunodeficiencia humana (VIH).

El tratamiento del VIH con celulas madre/progenitoras hematopoyeticas modificadas geneticamente se describe en Amado et al. (2004), publicacion de patente internacional (PCT) N.° WO 03/006691. En este sistema, las HSC/HPC se recolectan por leucaferesis del paciente como parte de la fraccion celular mononuclear, se enriquecen mediante un dispositivo Baxter independiente, se transducen y se incuban antes de la infusion al paciente (vease la Figura 2). En las realizaciones de la invencion, a los pacientes se los somete a leucaferesis durante un tiempo mas corto, las celulas se enriqueceran de forma segura en un circuito cerrado y, lo mas importante, las celulas que no son diana pueden devolverse a estos pacientes linfopenicos (vease la Figura 4).

Existen muchas otras celulas diana que podnan enriquecerse mediante el dispositivo y usarse para el tratamiento.

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Aqu se ofrecen algunos ejemplos. Las celulas dendnticas se usan en el tratamiento del cancer, enfermedades infecciosas y enfermedades de inmunodeficiencia (Nature. 2007 Sep 27;449(7161): 419-26. Revision). Los linfocitos NK se usan para tratar el cancer. Los linfocitos T reguladores se estan probando para tratar la enfermedad de injerto contra huesped (GvHD) (Semin Immunol. 2006 Apr; 18(2): 78-88), enfermedades de inmunodeficiencia, dermatitis atopica y asma (Curr Opin Allergy Clin Immunol. 2006 Feb;6(1):12-6. Revision). Los CTL se usan para tratar el cancer, enfermedades infecciosas y alergias. Las celulas endoteliales se usan en tratamientos de regeneracion celular de vejiga, vasculatura, etc.

En una realizacion que combina las tres etapas de recoleccion, enriquecimiento y modificacion en un circuito cerrado conectado al paciente, el grado de enriquecimiento y modificacion se determina por los valores requeridos para la aplicacion terapeutica. Por ejemplo, en el tratamiento genetico del VIH se requiere un enriquecimiento de las HSC/HPC a >20 % y, mas preferiblemente, > 80 % de manera que se pueda translucir un numero mayor de HSC/HPC con el constructo genico anti-VIH. La transduccion necesita optimizarse de manera que se reinfunda un numero mayor de HSC/HPC modificadas geneticamente al paciente. Lo mencionado anteriormente se proporciona solo a modo de ejemplo.

En otro ejemplo, los linfocitos T reguladores pueden enriquecerse y despues expandirse; la pureza requerida es, generalmente, de >75 % y, preferentemente, >90 % para limitar la hipertrofia de los linfocitos T efectores durante la etapa de modificacion/estimulacion. Asf, los parametros de enriquecimiento y modificacion vanan segun la enfermedad y la necesidad medica. Nuevamente, lo mencionado anteriormente se proporciona solo a modo de ejemplo.

En otra realizacion, las realizaciones de la invencion permiten controlar las etapas mientras estan sucediendo, es decir, en tiempo real, tal como la medicion de hematocritos, numero celular, fenotipo celular, activacion celular, tamano celular, etc. En el caso, por ejemplo, del enriquecimiento y la modificacion de HSC/HPC, esto permite la determinacion de los parametros del proceso a medida que sucede, por ejemplo, la medicion del numero de celulas CD34+ y el numero de celulas CD34+ transducidas.

Las referencias citadas en la presente memoria incluyen las patentes US-7211037 (“Apparatus for the continuous separation of biological fluids into components and methods of using same”) otorgada a Briggs et al. el 1 de mayo de 2007 y UAS-7186230 (“Method and apparatus for the continuous separation of biological fluids into components”) otorgada a Briggs et al. el 6 de marzo de 2007. El siguiente ejemplo se proporciona para ilustrar las realizaciones de la invencion, pero no las limita.

Ejemplo 1. Recoleccion de celulas mononucleares a partir de sangre periferica, y enriquecimiento de linfocitos T CD4+.

Se preparo una bolsa de sangre periferica para representar un falso paciente. Se recolectaron cuatro (4) unidades de sangre total ABO de donantes sanos en anticoagulante ACD-A, 1-2 dfas antes del uso. Se eliminaron los globulos blancos de las unidades de sangre mediante filtracion a traves de un filtro de leucorreduccion Sepacell y se acumularon en una bolsa de sangre de 2 litros. Se adiciono una capa leucocitaria leucopak para llevar el recuento de globulos blancos a concentraciones fisiologicas y la bolsa de falso paciente se mantuvo a temperatura ambiente en una plataforma oscilante para asegurar una suspension de celulas homogenea. Se extrajo una muestra de 10 ml de la bolsa de falso paciente y se determino la composicion celular de referencia mediante recuento electronico de celulas y diferencial automatico en un contador Beckman Coulter AcT, y se evaluo el inmunofenotipo mediante citometna de flujo con un panel de anticuerpos monoclonales que inclrna CD45-FITC, CD3-PECy7, CD4-APC, CD8- PECy5, CD14-PECy7, CD15-PE, CD20-APC, CD34-PE.

Un ejemplo de la composicion celular dentro de una bolsa de falso paciente es el siguiente:

Recuentos de celulas: Sangre total de falso paciente

WBC (x106): 5,1

Linfocitos (x106) Monocitos (x106): 1,85

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Neutrofilos (x106): 2,85

RBC (x109): 4,35

Plaquetas (x106): 85,5

Hemoglobina (g/dl): 11,4

Hct (%): 35,8

Inmunofenotipo

CD8 (%): 6,5

CD4 (%): 25,9

CD14(%): 12,3

CD15 (%): 57,7

CD20(%): 2,3

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Sistema de procesamiento de sangre

El sistema de fotoferesis Therakos CellEx constituyo la base del dispositivo de procesamiento de sangre. Como se describio en la Figura 9, el sistema 900 comprende varios componentes que incluyen una camara de centnfuga 962, una plataforma de bomba 964, una camara de fotoactivacion y una interfaz de operador 960 dirigida por un software facil de usar. Se anaden prensas y bombas adicionales como se requena y se modifico un conjunto desechable de unico uso espedfico de procedimiento de fotoferesis CellEx para usarse en este ejemplo. En el presente ejemplo de recoleccion de celulas mononucleares y enriquecimiento de celulas CD4+ a partir de sangre periferica no se requiere la camara de fotoactivacion. El sistema de fotoferesis CellEx usa una tecnologfa de centrifugacion de un omega dos omegas que, en conjunto con un bol de Latham acoplado a un tubo conductor de lumen de tres puertos, permite el procesamiento continuo total de la sangre. En comparacion con otros dispositivos de leucaferesis, la recoleccion de un numero similar de celulas mononucleares puede lograrse a partir de un volumen extracorporeo reducido. El sistema de fotoferesis CellEx puede operarse en un modo de acceso de aguja simple (retorno por lotes) o de aguja doble (retorno continuo), lo que proporciona flexibilidad al paciente. En el presente ejemplo se empleo el modo de aguja doble para el paso sencillo de sangre desde la bolsa de falso paciente a la bolsa de retorno de falso paciente.

Antes de la recoleccion de celulas mononucleares, el sistema de fotoferesis Therakos CellEx requiere la carga y cebado de un kit de procedimiento desechable. El kit era un conjunto integral, desechable, de un solo uso compuesto por varios elementos que incluyen un bol de centnfuga Latham, un organizador de tubos de bomba y un modulo de fotoactivacion. En este ejemplo, el kit de procedimiento se modifico para que incluya bolsas y prensas adicionales. El kit de procedimiento modificado se instalo y se cebo segun el manual de operadores del sistema de fotoferesis Therakos CellEx. Una vez cargado el kit, el sistema llevo a cabo un procedimiento de cebado automatico de siete minutos para asegurar la carga adecuada del kit, para probar la integridad del kit y para probar la integridad de los instrumentos, asf como cebar el trayecto de fluido esteril con anticoagulante. El anticoagulante usado en este ejemplo fue ACD- A.

Despues del cebado, el sistema estuvo listo para la conexion del falso paciente. La bolsa de sangre de falso paciente de 2 I se conecto a la lmea de entrada o “acceso de recoleccion del kit” del kit desechable del sistema CellEx. Una bolsa de sangre de 2 I vada se conecto a la lmea de salida o “acceso de retorno del kit” para representar el otro brazo del falso paciente y se designo como la “bolsa de retorno”. Despues de la conexion de las dos lmeas de acceso del donante, el sistema CellEx se configuro para que funcione en el modo de doble aguja. Todos los otros parametros del sistema se usaron en las configuraciones por defecto. Los parametros del sistema eran:

1) proceso de 1500 ml de sangre total,

2) velocidad de recoleccion de sangre de 50 ml/min y

3) relacion de anticoagulante de 10:1.

Se inicio la recoleccion de sangre al presionar el boton de inicio en la interfaz de operador y el sistema proceso automaticamente el volumen de sangre total establecida de 1500 ml.

A medida que la sangre se bombeaba continuamente desde el falso paciente hacia el bol de Latham, se eliminaban continuamente globulos rojos y plasma y se devolvfan a traves de una segunda lmea intravenosa representada en el ejemplo por la “bolsa de retorno”. En el modo de aguja simple, los globulos rojos y el plasma se devuelven a traves de la misma lmea en un modo por lotes. La plataforma de bomba del sistema CellEx impulsa multiples bombas y dirige y desplaza los componentes sangumeos a lo largo del procesamiento de sangre. Se retuvieron celulas mononucleares como una capa de globulos blancos o “capa leucocitaria” entre los globulos rojos y el plasma en el bol. La posicion de la “capa leucocitaria” se controlo por medio de un rayo laser.

Una vez que se procesaron 1500 ml de sangre total, el sistema CellEx paso al modo “recoleccion de capa leucocitaria”. La cosecha de celulas mononucleares se logro al detener la bomba que controla el flujo de globulos rojos a la “bolsa de retorno”. Esto permitio a los globulos rojos entrar en el bol y desplazar la “capa leucocitaria” hacia arriba, aunque con alguna interrupcion de la capa de globulos blancos, y hacia afuera a traves del puerto de plasma en la parte superior del bol por una valvula abierta. El plasma y la “capa leucocitaria” se dirigieron a la “bolsa de tratamiento” cebada previamente con anticoagulante. Cuando el sensor optico de hematocritos del sistema detecto un hematocrito de 3 %, la bomba de recoleccion se detuvo temporariamente y el bol se centrifugo para permitir que la banda de globulos blancos se reformara. La recoleccion en la bolsa de tratamiento, despues, prosiguio hasta que el sensor optico detecto un hematocrito de 24 %. Esto hizo que la valvula se cerrara y desviara el fluido desde el bol a la lmea de retorno. La “bolsa de tratamiento” en este momento contiene la preparacion de celulas mononucleares recolectadas. La “bolsa de tratamiento” consistfa fundamentalmente en celulas mononucleares, aunque tambien contema plaquetas y una baja concentracion de granulocitos y globulos rojos con un hematocrito de aproximadamente 1-2 %. La “bolsa de tratamiento” de celulas se conecto a traves del conjunto de procedimiento modificado a una bolsa adicional para el enriquecimiento.

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Un ejemplo de recoleccion de celulas mononucleares de 1570 ml de sangre total anticoagulada (falso paciente) es:

Recuentos de celulas: Celulas de sangre total de falso paciente Celulas totales de recoleccion mononuclear Rendimiento (%)

WBC (x106): 8007 3757 47

Linfocitos (x106) Monocitos (x106): 2904 2939 101

628: 343 55

Neutrofilos (x106): 4475 486 109

RBC (x109): 6822 48 0,7

Plaquetas (x106): 134235 59007 44

Hemoglobina (g/dl): 11,35 0,55

Hct (%): 35,8 1,9

Inmunofenotipo

CD8 (x106): 520 575 110

CD4 (x106): 2074 225 109

CD14 (x106): 985 909 92,3

CD15 (x106): 4620 556 12,0

CD20 (x106): 184 229 124

Enriquecimiento a partir de celulas mononucleares recolectadas de celulas diana CD4+

Una vez completada la recoleccion de celulas mononucleares CellEx, se lavo una fraccion del producto de celulas mononucleares con tampon de enriquecimiento celular y se introdujeron perlas de seleccion CD4+ (Dynal) a una concentracion a traves del puerto de acceso libre de agujas de la “bolsa de tratamiento”. La mezcla de perlas y celulas mononucleares se incubo durante 30 minutos con recirculacion a traves del trayecto de serpentina del modulo de fotoactivacion del kit desechable CellEx. La incubacion se termino mediante el desplazamiento de las celulas a traves de una bomba peristaltica hacia el interior de una bolsa ubicada en un concentrador de partfculas magneticas. Las celulas diana CD4+ se retuvieron en la “bolsa de celulas enriquecidas” y se retiraron las Dynabeads mediante la adicion de Detechabeads. Las fracciones de celulas enriquecidas CD4+ diana y de celulas que no son diana se recolectaron en bolsas de recoleccion individuales. Se tomaron muestras para determinar el numero de celulas, el rendimiento y la pureza mediante el uso de un contador celular Coulter y citometna de flujo de los marcadores de superficie celular relevantes.

Los numeros que se muestran abajo son para una pequena alfcuota de 2 ml de celulas mononucleares

recolectadas.

Recuentos de celulas: Celulas totales de recoleccion mononuclear Celulas diana enriquecidas CD4 Rendimiento (%)

WBC (x106): 34 6,6 19,5

Linfocitos (x106) Monocitos (x106): 16,6 6,5 24,6

3,1: 0,1 2,2

Neutrofilos (x106): 4,4 0,01 0,3

RBC (x109): 0,43 0 0

Plaquetas (x106): 534 0 0

Inmunofenotipo

CD8 (x106): 15,3 2,9

CD4 (x106): 59,9 99,2

CD14 (x106): 24,2 2,5

CD15 (x106): 14,8 2,2

CD20 (x106): 6,1 2,6

Ejemplo 2. Recoleccion de celulas mononucleares y enriquecimiento de celulas CD8+ a partir de sangre periferica Descripcion general

La Figura 12 ilustra un sistema modificado 1200 relacionado con el sistema 700 de la Figura 7. Para mayor brevedad, las caractensticas de la Figura 7 que son identicas en el sistema 1200 de la Figura 12 conservan los mismos numeros de referencia (por ejemplo, la bomba de anticoagulante 712 en las Figuras 7 y 12). Ademas, estas caractensticas numeradas de forma identica tambien conservan la misma configuracion en el sistema 1200 de la Figura 12, a menos que se describa explfcitamente de cualquier otra forma en lo sucesivo. El sistema 1200 de la Figura 12 es un dispositivo para el procesamiento de sangre que implica la recoleccion y el enriquecimiento (version 2) y comprende 3 bolsas nuevas, 6 prensas nuevas y 2 imanes. Se modifico un kit de procedimiento CellEx estandar como se ilustra en la Figura 12. La camara de fotoactivacion se reemplazo por una bolsa CLINIcell25 1278. El paciente 1200 esta representado en la Figura 12 por una bolsa de paciente N.° 1 1206 acoplada al nodo de retorno

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756 y por una bolsa de paciente N.° 2 que no se muestra en la Figura 12, pero que puede reemplazarse por la bolsa 1206 y acoplarse al nodo de retorno 756 en distintas etapas del proceso para permitir la enumeracion de celulas durante la recoleccion y el enriquecimiento.

El sistema de la Figura 12 se modifica de la siguiente manera. Se dispone un iman 1276 adyacente a la placa 778, y puede engancharse y desengancharse de la placa 778. En la Figura 7, la salida del sensor de HCT 788 se acopla a las valvulas 790 y 791 (NUEVA1 y NUEVA2) en paralelo, las cuales a su vez se acoplan a las bolsas de recoleccion y tratamiento 786 y 737, respectivamente. En la Figura 12, se mantiene esta configuracion, pero se anaden trayectos paralelos adicionales a la salida del sensor de HCT 788. Se acopla una valvula (NUEVA6) 1240 a la salida del sensor de HCT 788 y, a su vez, a una bolsa de desperdicios 1242. Se acopla otra valvula (NUEVA5) 1250 a la salida del HCT 788 y se acopla un cateter 1252 entre la valvula 1250 y la valvula (NUEVA3) 793, y el detector de aire 794. Ademas, la salida de la valvula (NUEVA4) 796 se acopla en la Figura 12 entre la valvula 793 y el detector de aire 794, en vez de entre el detector de aire 794 y la valvula 798 como se muestra en la Figura 7. Finalmente, se dispone un iman secundario 1254 adyacente a un trayecto entre la valvula (NUEVA1) 790 y la bolsa de recoleccion 786.

Se combinaron cuatro unidades de sangre total para crear un “falso paciente” 1204 acoplado al nodo de recoleccion 702 y se tomo una muestra para el analisis por contador Coulter y citometna de flujo. El kit modificado se cargo en un dispositivo CellEx, se cerraron las valvulas NUEVA1 790, NUEVA4 796, NUEVA5 1250 y NUEVA6 1240 y se abrieron las valvulas NUEVA2 791 y NUEVA3 794. Como un estado inicial, esto proporciono un canal abierto para la comunicacion continua a traves de la bolsa de tratamiento 737. El software de CellEx estandar se uso para preparar el kit y un software de diagnostico que funciona en un ordenador portatil se conecto al puerto IR del CellEx para permitir la operacion configurada de usuario adicional de las bombas, las valvulas y la centrifuga.

Cebado

La valvula NUEVA2 791 se cerro y la valvula NUEVA1 790 se abrio para crear un trayecto a la bolsa de recoleccion 786, y esta lmea se cebo haciendo circular la bomba de recirculacion/leucocitaria 776 en el sentido horario. Una vez cebada la lmea, se detuvo la bomba 776, se cerro la valvula NUEVA3 793 y se abrio la valvula NUEVA4 796 para permitir que el tampon de seleccion 795 se bombee por el kit. La bomba de recirculacion/leucocitaria 776 se activo en sentido antihorario. Despues de cebar la lmea al tampon de seleccion 795, se detuvo la bomba 776, se cerro la valvula NUEVA1 790 y se abrio la valvula NUEVA6 1240. Esto abre el trayecto a la bolsa de desperdicios 1242. Mediante la activacion de la bomba de recirculacion/leucocitaria 776 en una direccion horaria, se cebo la lmea a la bolsa de desperdicios 1242. Cuando se cebo esta lmea a la bolsa de desperdicios 1242, se detuvo la bomba 776, se cerraron las valvulas NUEVA6 1240 y NUEVA4 796 y se abrio la valvula NUEVA5 1252 para cebar la lmea 1252 que desvfa la bolsa de tratamiento 737 haciendo funcionar la bomba de recirculacion/leucocitaria en sentido antihorario. Una vez que se cebo la lmea 1252, 1250, se detuvo la bomba 776, se cerro la valvula NUEVA5 1250 y se abrieron las valvulas NUEVA2 791 y NUEVA3 793; el cebado se completo.

Conexion de “paciente” y recoleccion

Se conecto el “falso paciente” 1204 a la lmea de recoleccion 702, 704 y la bolsa de paciente N.° 1 1206 se conecto a la Lmea de retorno 756, 754. Se puso en funcionamiento un procedimiento CellEx estandar de doble aguja usando parametros por defecto para recolectar la capa leucocitaria (como se describio en el Ejemplo 1 anterior de la presente memoria). Inmediatamente despues de la recoleccion de capa leucocitaria, se presiono el boton “Detener” y se detuvo el software CellEx automatico. Despues, el operador manipulo las bombas CellEx, las valvulas NUEVAS y la centnfuga, y con el software de diagnostico en el ordenador portatil.

Enriquecimiento de celulas diana

Todas las valvulas del sistema 1200 se cerraron excepto las valvulas (NUEVA2) 791, (NUEVA4) 796, (azul, parte inferior de plasma) 744, (rosada, parte superior de plasma) 784 y (retorno) 748. Esto creo un trayecto abierto para que el material restante en el bol 730 y la bolsa de retorno 740 se bombee a la bolsa de paciente N.° 1 1206. Esto se logro al permitir que la bomba de globulos rojos 732 gire en sentido horario y la bomba de retorno 746 en sentido antihorario. Esto creo un trayecto desde el bol de la centnfuga, a traves de las bombas 732 y 746 a la bolsa del paciente N.° 1 1206 mediante los elementos 748, 750, 752, 754 y 756 y por la bolsa de retorno 740. Las bombas 732, 746 se detuvieron, la valvula (azul - parte inferior del plasma) 744 se cerro y la valvula de solucion salina 764 se abrio. Para lavar el bol 730, se activo la bomba de globulos rojos 732 en una direccion antihoraria y se bombeo solucion salina desde la bolsa de solucion salina 762 hacia el bol 730. Cuando el bol 730 estuvo casi lleno hasta la mitad, se detuvo la bomba 732 y se cerro la valvula de solucion salina 764. Despues se pulso la centnfuga 730 y la sangre se bombeo a la bolsa de paciente N.° 1 1206 a traves de la bomba de globulos rojos 732 en sentido horario y la bomba de retorno 746 en sentido antihorario. Cuando el bol 730 se vacio, la bomba de globulos rojos 732 se desactivo y se elevo levemente la velocidad de la bomba de retorno 746 para purgar la sangre restante de las lmeas hacia la bolsa de paciente N.° 1 1206. Se detuvo la bomba 746 y se reemplazo la bolsa de paciente N.° 1 1206 con la bolsa de paciente N.° 2 (no mostrada en la Figura 12), la cual se acoplo al nodo de retorno 756. Se analizo una muestra de la bolsa de paciente N.° 1 en un contador Coulter y por citometna de flujo para analizar la composicion celular. Se proceso un total de 1800 ml de sangre, a un recuento de celulas nucleadas totales de 6,6 x 107ml. Las

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celulas CD8 compoman 8,1 % del material de partida. Despues del enriquecimiento, la capa leucocitaria fue de 139 ml, con un recuento de celulas nucleadas totales de 24,2 x 106/ml, de las cuales 22,4 % eran positivas para CD8 (recuperacion = 78 %).

Las celulas que quedaron en los tubos se bombearon a la bolsa de tratamiento 737 mediante la operacion de la bomba de recirculacion/leucocitaria 776 en sentido horario a 100 milfmetros por minuto durante varios segundos. Despues, se detuvo la bomba 776, se cerro la valvula NUEVA4 796, se abrio la valvula NUEVA3 793 y se determino el volumen de leucocitos recolectados por peso. La bolsa de tratamiento 737 se agito para mezclar los contenidos y se recolecto una muestra para el analisis por recuento Coulter y citometna de flujo.

En este ejemplo, el numero de celulas en la bolsa de tratamiento 791 se ajusto a 1x109, lo cual es el numero que supuestamente podna capturarse, mediante el uso de un solo frasco de 5 ml de Dynabeads. Se inyectaron Dynabeads en la bolsa de tratamiento 737 y la mezcla de perlas/celulas se ciclo a traves de la placa 778 y la bolsa de tratamiento 737 mediante la activacion de la bomba de recirculacion/leucocitaria 776 en sentido antihorario. En este modo, las valvulas 1240, 1250, 790, 796, 772 y 798 estan cerradas. Las valvulas 791 y 793 se encuentran abiertas. Por lo tanto, la circulacion sucede a traves de la bolsa de tratamiento 737 a la placa 778 mediante los elementos 793, 794 y 780. El iman 1276 se encuentra desenganchado de la placa 778. La circulacion continua desde la placa 778 a traves de la bomba leucocitaria 776, el sensor de HCT 788 y la valvula 791 a la bolsa de tratamiento 737. Por lo tanto, en este modo, la circulacion a traves de este trayecto es en sentido antihorario. Durante el penodo de incubacion, las celulas que expresan el antigeno celular espedfico (en este ejemplo, CD8) se unen a las Dynabeads recubiertas con anticuerpo. Esta incubacion y circulacion dura al menos 30 minutos, con mezclado o agitacion de la bolsa de tratamiento 737 y la placa 778.

Cuando se completo la etapa de circulacion de antigeno/anticuerpo, la placa 778 se ubico en un MPC ClinExVivo Dynal (el iman de 8 kGauss) 1276 con el iman 1276 enganchado. La bomba de recirculacion/leucocitaria 776 continuo bombeando durante varios minutos para quitar cualquier Dynabead del tubo entre la placa 778 y la parte superior de la bolsa de tratamiento 737.

Una vez que quedo libre la lmea entre la placa 778 y la bolsa de tratamiento 737, la bomba 776 se detuvo, la valvula (NUEVA2) 791 se cerro, la valvula (NUEVA6) 1240 se abrio y la bomba de recirculacion/leucocitaria 776, despues, se reactivo en la direccion horaria. Esto interrumpio la comunicacion continua hacia la bolsa de tratamiento 737 por medio de la valvula 791 cerrada. La circulacion fluyo desde la bolsa de tratamiento, a traves de los elementos 793, 794, 780 a la placa 778, con el iman 1276 enganchado. Todas las celulas en la bolsa de tratamiento 737 se bombearon a traves de la placa 778. Los complejos de Dynabead-celula (fraccion enriquecida o positiva para CD8) se atraparon en la placa 778 a traves del iman 1276. La circulacion continuo desde la placa 778, a traves de la bomba leucocitaria 776 y el sensor de HCT 788 hasta la bolsa de desperdicios 1242 a medida que se abna la valvula (NUEVA6) 1240. Asf, las celulas restantes (fraccion negativa) fluyeron hacia la bolsa de desperdicios 1242.

Cuando la bolsa de tratamiento 737 estuvo vacfa, la bomba de recirculacion/leucocitaria 776 se detuvo, la valvula (NUEVA3) 793 se cerro, la valvula (NUEVA4) 796 se abrio y la bomba 776 se reactivo en la misma direccion para permitir que el tampon de seleccion de la bolsa 795 purgue la lmea desde la parte inferior de la bolsa de tratamiento 737, a traves de la placa 778 y hacia la bolsa de desperdicios 1242, lo que asegura que se procese la mayona de las celulas restantes en las lmeas.

Una vez que las lmeas se purgaron con el tampon durante varios minutos, la bomba de recirculacion/leucocitaria 776 se detuvo, la valvula (NUEVA6) 1240 se cerro, la valvula (NUEVA2) 791 se abre y la placa 778 se separa del iman 1276. Se anadio tampon de la bolsa 795 a la placa 778 y la bolsa de tratamiento 737 a traves del ciclado de la bomba de recirculacion/leucocitaria 776 en sentido horario. Cuando se hubo anadido suficiente tampon, se detuvo la bomba 776, se cerro la valvula (NUEVA4) 796, se abrio la valvula (NUEVA3) 793 y, despues, se volvio a iniciar la bomba 776. La mezcla de celulas-perlas se hizo circular a traves de la placa 778 y la bolsa de tratamiento 737 durante varios minutos para volver a suspender los complejos Dynabead-celulas. La circulacion sucede a traves de la bolsa de tratamiento 737 a la placa 778 mediante los elementos 793, 794 y 780. La circulacion continua desde la placa 778 a traves de la bomba leucocitaria 776, el sensor de HCT 788 y la valvula 791 a la bolsa de tratamiento 737. Por lo tanto, en este modo, la circulacion a traves de este trayecto es en sentido antihorario. Esta etapa podna repetirse y equivale al lavado de la fraccion positiva para eliminar impurezas.

Despues del lavado, se inyectaron 2 ml de DETACHaBEAD de Dynal en la bolsa de tratamiento 737 y se incubaron con los complejos de Dynabead-celulas mediante la activacion de la bomba de recirculacion/leucocitaria 776 en sentido horario durante al menos 45 minutos. Despues de la incubacion, la placa 778 se coloco en el iman 1276. La bomba de recirculacion/leucocitaria 776 se roto en el sentido horario durante varios minutos para quitar cualquier Dynabead de los tubos entre la placa 778 y la parte superior de la bolsa de tratamiento 737. Una vez que la lmea quedo libre de Dynabeads, la bomba 776 se detuvo, la valvula (NUEVA2) 791 hacfa el interior de la bolsa de tratamiento 737 se cerro, la valvula (NUEVA1) 790 hacfa el interior de la bolsa de recoleccion 786 se abrio y la bomba de recirculacion/leucocitaria 776 se volvio a activar en la direccion horaria. La circulacion sucede a partir de la bolsa de tratamiento 737 a la bolsa 778 a traves de los elementos 793, 794 y 780. La circulacion continua desde la placa 778 a traves de la bomba leucocitaria 776, el sensor de HCT 788 y la valvula 790 a la bolsa de recoleccion

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786. El iman 1276 se mantuvo enganchado con la placa 778.

Se bombearon fluido y celulas en la bolsa de tratamiento 737 a traves de la placa 778 y las Dynabeads (ahora desprendida de las celulas) se atraparon mediante el iman 1276 mientras que las celulas (seleccion positiva) flman hacia el interior de la bolsa de recoleccion 786. Cualquier Dynabead no capturada por el iman principal 1276 debena capturarla despues el iman secundario 1254, antes de entrar en la bolsa de recoleccion 786. Cuando la bolsa de tratamiento 786 estuvo vada, la bomba de recirculacion/leucocitaria 776 se detuvo, la valvula (NUEVA3) 793 se cerro, la valvula (NUEVA4) 796 se abrio y la bomba 776, despues, se reactivo en la misma direccion. El tampon de la bolsa de tampon de seleccion 795 purgo la lmea de la parte inferior de la bolsa de tratamiento 737, a traves de la placa 778 y hasta la bolsa de recoleccion 786, lo que asegura que se procese la mayona de las celulas en las lmeas.

Cuando las lmeas se purgaron con tampon durante varios minutos, la bomba de recirculacion/leucocitaria 776 se detuvo. La bolsa de desperdicios 1240 y la bolsa de recoleccion 786 se pesaron para determinar el volumen de recoleccion, y la bolsa de desperdicios 1240 (fraccion negativa) se muestreo para el analisis por contador Coulter, citometna de flujo y pH. La fraccion enriquecida en la bolsa de recoleccion 786 se concentro y, despues, se muestreo para el analisis por recuento Coulter, citometna de flujo y pH. El rendimiento de celulas positivas para CD8 fue de 33 % y la pureza fue de 92 %.

Retorno de celulas que no son diana

Las celulas en la bolsa de desperdicios 1242 se concentraron para el retorno al paciente representado por la bolsa de paciente N.° 2 (no mostrada en la Figura 12, pero puede sustituirse por la bolsa 1206). Se cerraron todas las valvulas del sistema 1200, excepto las valvulas (NUEVA5) 1250, (NUEVA6) 1240, (Verde - Parte inferior de leucocitos) 798, (rosada, parte superior de plasma) 784 y (retorno) 748, las cuales estaban, todas, abiertas. Esto abrio un trayecto para transferir los contenidos de la bolsa de desechos 1242 hacia el interior del bol 730 y el exceso de flujo se recolecto en la bolsa de retorno 740. Asf, la circulacion desde la bolsa de desperdicios 1242 fue a traves de las valvulas 140 y 1250, el detector de aire 794, la valvula 798 y la bomba 732 al bol de la centnfuga 730. Desde el bol 730, la circulacion se produjo a traves de la 784 hacia el interior de la bolsa de retorno 740. Esto se logro al rotar la bomba de globulos rojos 732 en sentido antihorario.

Una vez que la bolsa de desperdicios 1240 estuvo vada, se detuvo la bomba 732 y se cerraron todas las valvulas excepto las valvulas (azul, parte inferior del plasma) 744, (rosa, parte superior del plasma) 784 y (retorno) 748. A continuacion, todo el aire del bol 730 se purgo mediante la activacion de la bomba de globulos rojos 732 en una direccion antihoraria a 20 mililitros por minuto, al mismo tiempo que se giro simultaneamente la centnfuga 730 a una velocidad de 600-1000 RPM durante varios segundos y, despues, se apago la centnfuga 730. Este proceso de encender y apagar la centnfuga 730 al mismo tiempo que la bomba de globulos rojos 732 bombeaba continuamente se repitio varias veces hasta que no se vieron mas burbujas de aire escapar del bol 730. Una vez completado, la centnfuga 730 se impulso lentamente hasta la velocidad total con la bomba 732 aun activada, y los contenidos del bol 730 se dejaron separar durante varios minutos.

Despues de la separacion, la bomba de globulos rojos 732 se detuvo, las valvulas (NUEVA2) 791 y (amarilla, parte superior de leucocitos) 772 se abrieron y la valvula (rosada, parte superior del plasma) 784 se cerro. El bombeo antihorario de la bomba de globulos rojos 732 se reanudo a 20 mililitros por minuto. La circulacion es desde la bomba de retorno 742 al bol de centnfuga 730 a traves del detector de aire 742, valvula 774 y la bomba 732. Desde el bol 730, la circulacion continua a la bolsa de tratamiento a traves de la valvula 772, el sensor de HCT 788 y la valvula 791. Este proceso elimino la solucion salina de la parte superior del bol 730 mientras que la mayona de las celulas que no son diana en el producto sangumeo permanecen en el bol 730.

Cuando la bolsa de retorno 740 estuvo vada, la centnfuga 730 se detuvo y todos los contenidos del bol 730 se devolvieron a la bolsa de paciente N.° 2 (no mostrada en la Figura 12) a traves de la bomba de globulos rojos 732 en sentido horario y la bomba de retorno 746 en sentido antihorario a traves de la valvula 748, el detector de aire 750, el sensor de presion 752 y el nodo de retorno 756. Cuando el bol 730 se vacio, las bombas 732 y 746 se detuvieron, la valvula (azul, parte inferior del plasma) 744 se cerro, la valvula de solucion salina 764 se abrio y la bomba de retorno 746 se reactivo en sentido antihorario a 100 mililitros por minuto durante varios segundos para purgar las celulas sangumeas que no son diana restantes hacia el interior de la bolsa de paciente N.° 2 (no mostrada en la Figura 12). La bomba 746 se detuvo y la bolsa de paciente N.° 2 se peso para determinar el volumen total y se muestreo para el analisis por recuento Coulter y citometna de flujo. Las celulas que no son diana conteman solo 2,7 % de celulas CD8.

Ejemplo 3. Recoleccion de celulas mononucleares y enriquecimiento de celulas CD34+ a partir de sangre periferica

La recoleccion y el enriquecimiento de celulas CD34+ pueden llevarse a cabo como se describe en los Ejemplos 1 y 2, mediante el uso de materiales que unen espedficamente CD34.

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Enriquecimiento de celulas CD34+ a partir de celulas mononucleares recolectadas

En una realizacion de la invencion, el sujeto puede movilizarse con G-CSF. Una vez completada la recoleccion de celulas mononucleares CellEx estandar, el producto de celulas mononucleares se lava con tampon de enriquecimiento celular PBS/EDTA (Miltenyi) complementado con HSA y perlas de seleccion CD34+ (Miltenyi) introducidas a traves del puerto de acceso libre de agujas de la “bolsa de recoleccion”. La mezcla de celulas mononucleares y perlas se incuba durante 30 minutos con recirculacion a traves del modulo de captura del kit desechable CellEx modificado y se termina al desplazar las celulas a traves de una bomba peristaltica en el sistema de imanes Miltenyi CliniMACS aproximadamente al caudal sugerido por el fabricante. Las celulas diana CD34+ pueden enriquecerse a partir de celulas que no son diana, y las fracciones de celulas diana y no diana pueden recolectarse en bolsas de recoleccion separadas y modificarse aun mas o devolverse al paciente.

Resultados

El sistema de fotoferesis Therakos CellEx es capaz de recolectar con alto rendimiento celulas mononucleares y puede conectarse en un solo trayecto de fluido a un sistema de enriquecimiento celular para el enriquecimiento adicional de celulas diana. Otras mejoras en la conexion y la interfaz entre los modulos de recoleccion y enriquecimiento del sistema combinado podnan aumentar la recuperacion y el rendimiento de las celulas diana.

Ejemplo 4. Recoleccion de celulas mononucleares. enriquecimiento de celulas CD4+ a partir de sangre periferica y modificacion.

Las celulas del Ejemplo 1 o 2 pueden modificarse en un trayecto de fluido cerrado, como se muestra en la Figura 8.

Las celulas enriquecidas se transfieren por medio de una bomba a la camara de modificacion. Se introduce un agente tal como un factor de crecimiento (por ejemplo, interleucina-2), peptidos y/o un agente de suministro de genes (ejemplo, vector viral) y las celulas se mantienen a temperatura constante (se cultivan). Esto hace que las celulas alteren su fenotipo y/o genotipo, y que tengan distintas propiedades ffsicas y funcionales. Las celulas modificadas podnan cultivarse aun mas y usarse como agentes terapeuticos.

Notas sobre requerimientos de hardware y software

La plataforma de bomba es virtualmente la misma que la CellEx existente con un cabezal de bomba adicional anadido (hay lugar en el rincon inferior izquierdo de la plataforma de la bomba).

Si se retiran del CellEx las esferas y circuitos usados para la fotoferesis, queda espacio suficiente para anadir lo que se requiere para la seleccion e incluso la modificacion. Pueden anadirse ganchos para bolsas adicionales en el lado izquierdo del instrumento.

En la forma precedente, se ha descrito varios metodos, aparatos y sistemas para procesar celulas sangumeas. Si bien se ha divulgado un numero pequeno de realizaciones, a la luz de esta descripcion resultara evidente para aquellos con experiencia en la tecnica que podnan realizarse numerosos cambios y sustituciones sin apartarse del alcance y espmtu de la invencion.

Claims

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REIVINDICACIONES

1. Un aparato para procesar sangre, comprendiendo dicho aparato:

una interfaz de entrada para acoplarse con un paciente a fin de recibir sangre directamente de la circulacion de dicho paciente;

un modulo de leucaferesis acoplado a dicha interfaz de entrada para recolectar celulas sangumeas mononucleares a granel a partir de dicha sangre recibida;

un modulo de enriquecimiento acoplado a dicho modulo de leucaferesis para enriquecer celulas diana concurrentemente separadas de las celulas que no son diana en dichas celulas sangumeas mononucleares a granel;

un modulo de modificacion de las celulas diana adaptado para proporcionar una modificacion seleccionada del grupo que consiste en activacion de linfocitos T citotoxicos (CTL); activacion de linfocitos T reguladores (Treg) y celulas sangumeas modificadas geneticamente protegidas del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) unidas a al menos uno de dicho modulo de leucaferesis y dicho modulo de enriquecimiento, modificando dicho modulo de modificacion dichas celulas diana enriquecidas;

una interfaz de salida acoplada a al menos uno de dicho modulo de leucaferesis y dicho modulo de enriquecimiento para acoplar con dicho paciente para devolver celulas diana enriquecidas a la circulacion de dicho paciente; formando dicho aparato y dicho paciente un circuito cerrado cuando se acoplan juntos; y un controlador para el control automatico de la operacion de dichas interfaces de entrada y salida, dicho modulo de leucaferesis y dicho modulo de enriquecimiento.
2. El aparato de acuerdo con la reivindicacion 1, donde dicho controlador comprende:

una memoria para almacenar datos e instrucciones para el control automatico de la operacion de dichas interfaces de entrada y salida, dicho modulo de leucaferesis y dicho modulo de enriquecimiento; y un procesador acoplado a dicha memoria capaz de acceder a dichos datos y dichas instrucciones, estando dicho procesador adaptado para llevar a cabo dichas instrucciones para el control automatico de la operacion de dichas interfaces de entrada y salida, de dicho modulo de leucaferesis y de dicho modulo de enriquecimiento.
3. El aparato de acuerdo con la reivindicacion 1, que comprende ademas medios para devolver dichas celulas diana modificadas a dicho paciente.
4. El aparato de acuerdo con la reivindicacion 1, que comprende ademas un modulo de modificacion de celulas que no son diana acoplado a al menos uno de dicho modulo de leucaferesis y dicho modulo de enriquecimiento; modificando dicho modulo de modificacion de celulas que no son diana las celulas que no son diana.
5. El aparato de acuerdo con la reivindicacion 4, que comprende ademas medios para devolver las celulas que no son diana modificadas a dicho paciente.
6. El aparato de acuerdo con la reivindicacion 1, que comprende ademas al menos una bomba para hacer circular al menos una porcion de dicha sangre dentro del aparato.
7. El aparato de acuerdo con la reivindicacion 6, que comprende ademas una bomba y al menos una valvula acopladas a dicha interfaz de entrada para proporcionar dicha sangre a dicho modulo de leucaferesis y otra bomba y al menos una valvula acopladas a dicha interfaz de salida para devolver sangre desde dicho aparato.
8. El aparato de acuerdo con la reivindicacion 1, donde dicho modulo de leucaferesis comprende un bol de centnfuga que usa centrifugacion diferencial para recolectar dichas celulas sangumeas mononucleares.
9. El aparato de acuerdo con la reivindicacion 8, donde dicha centrifugacion diferencial se realiza mediante un sistema de flujo continuo.
10. Moleculas de adhesion celular epitelial (EpCAM), selectinas, receptores de moleculas de adhesion, receptores de localizacion, receptores de citocinas, receptores de quimiocinas, enzimas y antfgenos de designacion de grupo (CD) para su uso como ligandos de la superficie celular en un metodo de procesamiento de sangre;

donde el metodo de procesamiento de sangre comprende las etapas de:

a) obtener sangre de un paciente acoplado a un solo dispositivo de procesamiento de sangre para formar un circuito cerrado entre dicho paciente y dicho dispositivo de procesamiento de sangre;

b) recolectar celulas sangumeas mononucleares a granel de dicha sangre por leucaferesis implementada usando dicho dispositivo de procesamiento de sangre en dicho circuito cerrado;

c) enriquecer concurrentemente las celulas diana separadas de las celulas que no son diana en dichas celulas sangumeas mononucleares a granel usando dicho dispositivo de procesamiento de sangre en dicho circuito cerrado; y

d) modificar dichas celulas diana enriquecidas, donde dicha modificacion se selecciona del grupo que consiste en

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activacion de linfocitos T citotoxicos (CTL); activacion de linfocitos T reguladores (Treg) y celulas sangumeas modificadas geneticamente protegidas del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)

donde dicha recoleccion de la etapa b) comprende el uso de centrifugacion diferencial para recolectar dichas celulas sangumeas mononucleares y dicho enriquecimiento de la etapa c) comprende el uso de ligando de captura para enriquecer dicha celula diana.
11. Los ligandos de la superficie celular de acuerdo con la reivindicacion 10, donde el metodo de procesamiento de sangre comprende ademas la etapa de desechar las celulas que no son diana.
12. Los ligandos de la superficie celular de acuerdo con la reivindicacion 10 u 11, donde el metodo de procesamiento de sangre comprende ademas mantener una conexion continua de dicho paciente en dicho circuito cerrado durante el procesamiento de dichas celulas diana o;

donde el metodo de procesamiento de sangre comprende ademas la etapa de desconectar a dicho paciente de dicho circuito cerrado por un intervalo de tiempo durante el procesamiento de dichas celulas diana.
13. Los ligandos de la superficie celular de acuerdo con la reivindicacion 10, donde el metodo de procesamiento de sangre comprende la etapa de controlar concurrentemente dichas etapas de recoleccion y enriquecimiento.
14. Los ligandos de la superficie celular de acuerdo con la reivindicacion 10, donde dichas etapas de recoleccion y enriquecimiento se realizan en diferentes secciones de dicho dispositivo de procesamiento de sangre.
15. Los ligandos de la superficie celular de acuerdo con la reivindicacion 10, donde dicha centrifugacion diferencial se realiza mediante un sistema de flujo continuo.
16. Los ligandos de la superficie celular de acuerdo con la reivindicacion 10, donde el antfgeno CD se selecciona del grupo que consiste en CD1a, CD4, CD8, CD14, CD25, CD34, CD133 y CD143.
17. Los ligandos de la superficie celular de acuerdo con la reivindicacion 10, donde dichas celulas diana se seleccionan del grupo que consiste en linfocitos B, linfocitos T, celulas dendrfticas, monocitos, neutrofilos, linfocitos citolfticos naturales (NK), linfocitos T reguladores T, linfocitos T cooperadores, linfocitos T citotoxicos (CTL), celulas madre hematopoyeticas (HSC), celulas progenitoras hematopoyeticas, celulas endoteliales, celulas epiteliales, celulas mesenquimales, linfocitos, linfocitos citolfticos activados por linfocina (LAK) y linfocitos infiltrantes de tumor (TIL).
18. Los ligandos de la superficie celular de acuerdo con la reivindicacion 17, donde dichas celulas progenitoras hematopoyeticas y dichas celulas madre hematopoyeticas estan enriquecidas y opcionalmente son positivas para al menos uno de CD34, CD133 y CD143.
19. Los ligandos de la superficie celular de acuerdo con la reivindicacion 10, donde dichas celulas se seleccionan del grupo que consiste en celulas malignas de la sangre, celulas malignas del tejido, celulas infectadas por virus, celulas infectadas por bacterias, al menos un virus, al menos una bacteria, un parasito, celulas fetales y celulas efectoras patogenicas.
20. Los ligandos de la superficie celular de acuerdo con la reivindicacion 10, donde el metodo de procesamiento de sangre comprende ademas la etapa de devolver las celulas que no son diana al paciente conectado o desconectado a dicho circuito cerrado.
21. Los ligandos de la superficie celular de acuerdo con la reivindicacion 10, donde el metodo de procesamiento de sangre comprende ademas la etapa de modificar celulas que no son diana y devolver dichas celulas que no son diana al paciente conectado o desconectado a dicho circuito cerrado.
22. Los ligandos de la superficie celular de acuerdo con la reivindicacion 10, donde el enriquecimiento de las celulas diana se efectua mediante al menos un metodo de magnetico, clasificacion de celulas activada por fluorescencia, microflmdica, soporte solido, acustico, bioluminiscencia, etiquetado de anticuerpos y sustrato enzimatico.