DE10127071A1

DE10127071A1 - Verfahren zum magnetischen Markieren von Zellen des peripheren Blutes und ihrer Abtrennung

Info

Publication number: DE10127071A1
Application number: DE10127071A
Authority: DE
Inventors: Thomas Kober; Michael K Bahr; Joachim Clement; Manuela Schwalbe; Ernst Madai; Kay-Oliver Kliche; Gerhard Ifland; Werner Weitschies
Original assignee: BIO MEDICAL APHERESE SYSTEME G
Current assignee: BIO MEDICAL APHERESE SYSTEME G
Priority date: 2001-05-23
Filing date: 2001-05-23
Publication date: 2002-11-28
Also published as: WO2002094350A2

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum magnetischen Markieren von Zellen des peripheren Blutes und ihrer Abtrennung. Dabei wird peripheres Blut mittels Aphereseverfahren in die zellulären und nicht-zellulären Bestandteile aufgetrennt. Nach Überführen der zellulären Fraktion in einen Arbeitspuffer werden Magnetteilchen zugesetzt. Der Zeitraum für die Reaktion der Magnetteilchen mit den Bestandteilen der zellulären Fraktion darf 30 Minuten nicht überschreiten. Die weitere Interaktion zwischen den Magnetteilchen und der zellulären Fraktion wird druch eine Stopplösung unterbunden. Freie Magnetteilchen werden aus der Lösung entfernt. Nach Passieren einer Vorbereitungseinheit werden die Bestandteile der zellulären Fraktion, die ein bestimmtes magnetisches Moment haben über einen Magnetfilter abgetrennt. Nach Passieren des Magnetfilters wird das Filtrat in einer Analyseneinheit kontrolliert. Schließlich erfolgt die Vorbereitung des Filtrats, d. h. der gereinigten zellulären Franktion für die Weiterverwendung.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum magnetischen Markieren von Zellen des peripheren Blutes und ihrer Abtrennung gemäß dem Oberbegriff des Anspruches 1.

Gegenwärtig werden große Anstrengungen unternommen in biologischen Flüssigkeiten, wie z. B. Blut, dort vorhandene Zellen, Biomakromoleküle oder gezielt eingebrachte pharmazeutische Zubereitungen magnetisch zielgerichtet zu markieren um dann aus therapeutischen oder diagnostischen Gründen diese magnetisch markierten Objekte aus dieser biologischen Dispersion zu entfernen. Hierbei wird die magnetisch markierte Objekte enthaltende biologische Flüssigkeit mit einem sogenannten Magnetfilter kontaktiert, um die magnetisch markierten Objekte mittels magnetischer Kraft aus der biologischen Dispersion zu entfernen. Diese Magnetfiltration kann sowohl kontinuierlich als auch diskontinuierlich erfolgen.

In bestimmten Behandlungsstadien, beispielsweise einer chronischen teukämie, existieren im Blutkreislauf des Patienten funktionsfähige Leukozyten neben geschädigten weißen Blutzellen. Therapeutisch wünschenswert wäre die Unterdrückung der geschädigten Leukozyten ohne gleichzeitig die funktionsfähigen Zellen zu zerstören.

Chemotherapeutische Behandlungsansätze führten bisher nicht zum gewünschten Erfolg, hingegen ist es möglich, die Gesamtheit der weißen Blutzellen mittels bekannter Zentrifugationstechniken extrakorporal abzutrennen. Diese als Leukapherese bezeichneten Techniken sind im Prinzip bekannt.

Nach Abtrennung der weißen Blutzellen werden die übrigen Blutbestandteile dem Patienten wieder zugeführt.

Bekannt ist weiterhin, dass dieses Verfahren bei chronischen lymphatischen Leukämien zur Senkung der Leukozytenzahlen bereits eingesetzt wird.

Aufgabe der Erfindung ist es, demgegenüber mittels eines weiteren Verfahrens aus der bereits abgetrennten Leukozytenfraktion gezielt geschädigte weiße Blutzellen abzutrennen und die ungeschädigten dem Patienten zurückzugeben.

Die Lösung der Aufgabe erfolgt mit dem kennzeichnenden Teil des Anspruches 1.

Das erfindungsgemäße Verfahren besteht darin, der Leukozytenfraktion magnetische Nanoteilchen zuzusetzen, die selektiv an geschädigte Zellen angelagert oder von den geschädigten Zellen aufgenommen werden. Dadurch wird es möglich, die geschädigten Zellen mittels eines Magnetfilters abzutrennen. Der Durchlauf des Magnetfilters besteht im Idealfall nur aus gesunden Leukozyten, die der Patient zurück erhält.

Erfindungsgemäß gelingt die Markierung mit magnetischen Nanoteilchen nur in einem Medium mit gegenüber Blutplasma verminderter Konzentration an Eiweißen. Die mittels der bekannten Leukapherese gewonnene Suspension von weißen Blutkörperchen muss deshalb gewaschen und in eine Pufferlösung überführt werden. Dort erfolgt dann die Markierung mit magnetischen Nanoteilchen, wobei zweckmäßigerweise mit einem Überschuß an Magnetteilchen gearbeitet werden sollte. Danach werden die geschädigten Zellen in einem Magnetfilter abgeschieden.

Möglich ist es, dass nach dem Durchgang durch den Magnetfilter unmarkierte Leukozyten und Nanoteilchen enthalten sind. Bevor die so gewonnenen Leukozyten in den Blutkreislauf des Patienten zurückgeführt werden, muss demnach ein weiterer Wasch- und Anreicherungsprozeß durchgeführt werden, durch den sowohl Lösungsmittel als auch magnetische Nanoteilchen entfernt werden. Eine Aufkonzentrierung der Leukozyten nach dem Magnetfilterdurchgang kann ebenfalls notwendig sein.

Um Schädigungen der Leukozyten zu vermeiden, sollte die Verarbeitung innerhalb weniger Stunden erfolgen. Die magnetische Markierung der Leukozyten soll dabei innerhalb eines begrenzten Zeitraums von maximal 30 Minuten abgeschlossen sein, das heißt Leukozyten und magnetische Nanoteilchen dürfen nur für einen begrenzten Zeitraum in einem weitgehend an Eiweißen reduzierten Medium in Kontakt sein.

Erfindungsgemäß ist die Reaktion zwischen Magnetteilchen und Leukozyten durch die Zugabe von eiweißhaltigen Lösungen (Stopplösung) zu beenden. Als Stopplösung sind insbesondere humanes Blutplasma, humanes Blutserum und Lösungen von Humanalbumin geeignet.

Wichtig für den Markierungs- und nachfolgenden Trennprozess ist es, dass die Gesamtmenge der zu verarbeitenden Leukozyten und der Anteil der geschädigten Leukozyten bekannt ist. Die Mengen und Mengenverhältnisse variieren jedoch naturgemäß zwischen Patienten und weichen in Abhängigkeit von den Behandlungsschritten voneinander ab. Von Patient zu Patient müssen deshalb sehr große Unterschiede in der Menge der abzuscheidenden Zellen erwartet werden, demzufolge sind die erfindungsgemäßen Verfahrensschritte individuell qualitativ und quantitativ zu modifizieren.

Das magnetische Markieren und Abtrennen der markierten Leukozyten zeigt eine gewisse Abhängigkeit von der Größe der Magnetteilchen.

Es hat sich gezeigt, dass vorteilhafterweise Magnetteilchen im Nanometerbereich eingesetzt werden sollten. Die Partikelgröße der magnetischen Kerne der Teilchen sollte im Bereich zwischen 2 und 100 nm liegen. Je nach Anzahl der geschädigten Leukozyten kann es vorteilhaft sein, monodisperse Teilchenverteilungen oder Gemische von Magnetteilchen unterschiedlicher Partikelgrößen einzusetzen. Die Oberfläche der Magnetteilchen sollte mit einer geeigneten biokompatiblen Schicht versehen sein. Geeignete Materialien zur Ausbildung biokompatibler Schichten auf den Partikeloberflächen sind Poly- und Oligosaccharide oder deren Derivate, Dextran, Carboxymethyl-Dextran, Carboxydextran, Stärke, sulfatierte Stärke, Dialdehyd-Stärke, Chitin, Alginate, Zellulose, Carboxymethyl-Zellulose, Proteine oder deren Derivate wie Albumine, Peptide, synthetische Polymere wie Polyethylenglykole, Polyvinylpyrolidon, Polyethylenimin, Polymetacrylate, bifunktionelle Carbonsäuren und deren Derivate wie die Merkaptobernsteinsäure oder Hydroxycarbonsäuren. Davon besonders geeignet sind Dextran, Carboxymethyl-Dextran und Carboxydextran.

Die Erfindung wird im Folgenden anhand von einem Ausführungsbeispiel und Fig. 1 näher erläutert.

Beispiel 1

Patienten wird peripheres Blut entnommen. Mittels Standardapherese-Prozeduren (wie zum Beispiel Cobe Spectra) werden aufkonzentrierte Leukozytenpräparate gewonnen, die in einem kleinen Volumen eine hohe Konzentration an Leukozyten bei einem geringen Anteil an Plasma enthalten (10). Dieses sterile Präparat wird mittels Adapter mit einem Schlauchset verbunden, das in die Separationsvorrichtung (siehe weitere Patentanmeldung "Vorrichtung und Verfahren zum Einbringen von Magnetteilchen in biologische Dispersionen") eingelegt ist. Das Präparat, im Weiteren als "zelluläre Fraktion" bezeichnet, wird in die Wascheinheit (20) gepumpt. Dort erfolgt eine Verdünnung mit dem Arbeitspuffer, der aus dem Vorratsgefäß (21) zugeführt wird. Dabei wird eine Zellkonzentration von 1 x107 Zellen/ml eingestellt. Die zelluläre Fraktion wird in die Mischeinheit (30) überführt. Dort wird aus dem Vorratsbehälter für Magnetteilchen (31) unter Druck ein 1/100stel (v/v) Magnetteilchen-Lösung zugegeben. Das Einschießen der Magnetteilchen führt zu einer Durchmischung der entstehenden Suspension aus zellulärer Fraktion und Magnetteilchen. Die Suspension aus zellulärer Fraktion und Magnetteilchen wird genau 30 Minuten vom Zeitpunkt der Magnetpartikelzugabe an gerechnet in der Mischeinheit (30) belassen. Nach Ablauf der Inkubationszeit wird aus dem Vorratsgefäß für Stopplösung (32) eine Lösung aus PEB mit 10% patienteneigenem Plasma in die Mischkammer zugegeben um eine weitere Interaktion der Magnetteilchen mit der zellulären Fraktion zu unterbinden. Nach erfolgter Zugabe wird die Suspension in eine weitere Wascheinheit (40) überführt und die Zellen von den freien Magnetteilchen abgetrennt. Diese gelangen in das Abfallgefäß (80). Aus dem Vorratsgefäß für Arbeitspuffer (41) wird das Ausgangsvolumen zur Wiederaufnahme der zellulären Fraktion in die Wascheinheit (40) zugeführt. Dies ist wichtig, um die zelluläre Fraktion in eine Konzentration zu bringen, die eine optimale Separation der magnetisch markierten Zellen im Magnetfilter (50) erlaubt. Die zelluläre Fraktion wird in gleichmäßigem Fluß durch den Magnetfilter gepresst und gelangt in den Konzentrator (60). Dort wird das Filtrat bestehend aus der gereinigten zellulären Fraktion von verbliebenen freien Magnetteilchen gereinigt, die in das Abfallgefäß (80) gelangen. Aus dem Vorratsgefäß für humanverträgliche Lösung (61) wird PBS mit EDTA zur Verdünnung des Filtrates eingesetzt. Schließlich wird die gereinigte zelluläre Fraktion in eine Meßeinrichtung (70) überführt. Dort wird die Zelldichte mittels optischer Verfahren bestimmt und eine Probe unter sterilen Bedingungen genommen. Die gereinigte Zellfraktion wird wieder der Fraktionierungseinheit (10) zugeführt und mit den zu Beginn abgetrennten Blutbestandteilen gemischt. Danach erfolgt die Rückführung des gereinigten Blutes.

Fig. 1

Prinzip (Verfahren zum magnetischen Markieren von Zellen des peripheren Blutes und ihrer Abtrennung)

10 Blut-Fraktioniereinheit
20 Wascheinheit
21 Arbeitspuffer-Vorratsbehälter
30 Mischeinheit
31 Magnetteilchen-Lösung-Vorratsbehälter
32 Stopplösung-Vorratsbehälter
40 Wascheinheit
41 Arbeitspuffer-Vorratsbehälter
50 Magnetfilter
60 Konzentrator
61 Vorratsbehälter für humanverträgliche Lösung
70 Meßeinrichtung
80 Abfall
90 Steuereinheit

Claims

1. Verfahren zum magnetischen Markieren von Zellen des peripheren Blutes und ihrer Abtrennung, gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrensschritte:

a) Fraktionieren des Blutes in die zellulären und nicht zellulären Bestandteile auf an sich bekannte Weise mittels Apherese,
b) Überführen der zellulären Fraktion in einen Arbeitspuffer,
c) Zusatz von Magnetteilchen und Inkubation mit der zellulären Fraktion in einem Zeitraum von maximal 30 Minuten,
d) Stoppen der Interaktion Magnetteilchen-zelluläre Fraktion durch die Zugabe einer Stopplösung
e) Abtrennung freier Magnetteilchen
f) Zellkonzentration in Vorbereitungseinheit einstellen,
g) Abtrennung der magnetischen Objekte mittels Magnetfiltration,
h) Analyse des Filtrates
i) Rückführung des Filtrates

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als zelluläre Fraktion zum Beispiel Leukozyten, Lymphozyten, Granulozyten, Makrophagen und disseminierte Tumorzellen eingesetzt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestandteile der zellulären Fraktion in vitaler Form eingesetzt werden.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die zelluläre Fraktion in kontinuierlichem Fluss oder in Portionen eingesetzt wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die zelluläre Fraktion in eine Suspension überführt wird, die isotonisch ist und einen freien Proteinanteil kleiner 1% (m/v) aufweist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Magnetteilchen Teilchen im Nanogrößenbereich zugesetzt werden, die eine Hülle aus einem biokompatiblen Substrat aufweisen.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass als Magnetteilchen Teilchen zugesetzt werden, deren magnetische Kernteilchen eine biokompatible Hülle aufweisen.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass als Kernteilchen Teilchen aus Magnetit, Maghemit, Ferriten der allgemeinen Formel MeO_xFe₂O₃, wobei Me ein zweiwertiges Metall, wie Cobalt, Mangan ist, oder aus Cobalt, Eisen, Nickel, Eisencarbid oder Eisennitrid eingesetzt werden.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass als Kernteilchen Teilchen mit einer Größe von 2-100 nm eingesetzt werden.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass als biokompatibles Substrat eine Verbindung wie Poly- bzw. Oligosaccharide oder deren Derivate, Dextran, Carboxy- Dextran, Carboxymethyl-Dextran, Stärke, sulfatierte Stärke, Dialdehyd-Stärke, Chitin, Alginate, Zellulose, Carboxymethyl-Zellulose, Proteine oder deren Derivate wie Albumine, Peptide, synthetische Polymere wie Polyethylenglykole, Polyvinylpyrolidon, Polyethylenimin, Polymetacrylate, bifunktionelle Carbonsäuren und deren Derivate wie die Merkaptobernsteinsäure oder Hydroxycarbonsäuren eingesetzt wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass Magnetteilchen mit einer Teilchengrößenverteilung von überwiegend sehr großen und sehr kleinen Teilchen eingesetzt werden.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die zelluläre Fraktion mit den Magnetteilchen maximal 30 Minuten kontaktiert wird.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubation der zellulären Fraktion mit den Magnetteilchen durch eine Stopplösung beendet wird, die einen Mindestanteil an Eiweiß von 2% hat.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass als Eiweiß Plasma, globuläre Proteine (z. B. Albumine), Polypeptide, Oligopeptide eingesetzt werden.

15. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass als Stopplösungsbestandteil ein Arbeitspuffer eingesetzt wird.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Trennung zelluläre Fraktion und freie Magnetteilchen durch Separation wie Zentrifugation, Filtration, Sedimentation, Dichtegradient erfolgt.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die zelluläre Fraktion in einen Arbeitspuffer aufgenommen wird.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die in einem Arbeitspuffer suspendierte oder gelöste zelluläre Fraktion durch einen Magnetfilter vorgereinigt wird.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Funktionstüchtigkeit des Magnetfilters und die Integrität und Viabilität des Filtrates durch physikalische, optische, chemische, biochemische oder molekularbiologische Verfahren analysiert wird.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die zelluläre Fraktion des Filtrats durch Separation wie Zentrifugation, Filtration, Sedimentation, Dichtegradient, Dialyse aufgereinigt wird.

21. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die aufgereinigte zelluläre Fraktion des Filtrates in eine human verträgliche Lösung wie PBS mit Plasma, PBS mit EDTA aufgenommen wird.