CN102269739A - 一种同时检测利莫那班和西布曲明的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同时检测利莫那班和西布曲明的方法：将待测品进行样品前处理后进行高效液相色谱法检测即可；所述的高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以甲醇或乙腈为流动相等度洗脱，检测波长为220～225nm。本发明的检测方法操作简单、分析速度快、结果可靠灵敏，可以通过对利莫那班和西布曲明的同时检测与监控，实现对产品的质量控制。
Description
技术领域
本发明涉及一种同时检测利莫那班和西布曲明的方法。
背景技术
随着我国人们生活水平的不断提高引起的膳食结构不合理，导致肥胖者人数逐年上升，随之而来的是糖尿病、高血压和心血管疾病发病潜在人数的不断增加，因此具有减肥功效的功能食品成为人们关注的焦点。然而，一些不法厂家为增强“速效”、“强效”的减肥效果，在功能食品中非法添加西药成分，其添加量往往随机而定，存在危害消费者的健康的可能。其中利莫那班和西布曲明是两种常用的精神抑制类添加药物：利莫那班(式1所示)最早是由Barth等人提出的(U.S.Patent No.5624941与EP 0656354)，是一种大麻素受体-1阻滞剂，具有胰岛素增敏和改善脂代谢紊乱的作用，有助于降低体重(Stanislas Grassin Delyle et al，Determination of rimonabantin human plasma and hair by liquid，Chromatograp-hy mass spectrometryChromatography[J]，Chromatography B，2008，872：115-120)。西布曲明(式2所示)是一种去甲肾上腺素和5-羟色胺重摄取抑制剂，具有兴奋、抑制食欲等作用(曹玲等；减肥保健食品中非法添加盐酸西布曲明的检测；[J]；食品科学；2008年02期)。
尽管这两种药物的减肥效果明显，但带来的不良反应也不容忽视。过量服用利莫那班的患者中易出现癫痫发作、攻击性和自杀倾向等严重的副作用(de Mattos，Viana B，Prais H A，et al，Melancholic features related torimonabant，Gen Hosp Psychiatry[J]，2009，31(6)：583-585)；过量服用西布曲明易出现了肢体痉挛、思维异常，且具有导致心血管疾病风险(deSimone G，D′Addeo G，Sibutramine，balancing weight loss benefit andpossible cardiovascular risk，Nutr Metab Cardiovasc Dis[J]，2008.，18(5)：337-341)；(裴振峨，蔡皓东；西布曲明的不良反应及其防治；[J]；药品不良反应；2006年04期)，已经被美国FDA和我国国家食品药品监管局明确禁止使用。
中国专利200810028617.9公开了一种中草药减肥产品中掺杂西布曲明的快速筛查方法，利用硫氰酸铬铵与西布曲明生成粉红色沉淀的反应初步判断样品中是否含有西布曲明。但是，该方法中所用的硫氰酸铬铵溶液稳定性差，需要现配现用，并且水溶性较差，不利于工作人员在药店、药厂的现场检测。
2009年理化分析报道了马薇等人的研究成果(理化分析-化学分册，2009，Vol.45，No.10)，他们利用加速溶剂萃取技术进行提取样品，同时采用固相萃取净化技术，用高效液相色谱-串联质谱测定减肥食品中利莫那班的含量，方法灵敏度高，兼具定性和定量功能。
中国专利申请201020019201.8公开了杨文红等人的研究：他们制备了抗西布曲明及其衍生物的单克隆抗体的胶体金标记物和金标结合垫，从而成功制备了快速检测西布曲明及其衍生物的胶体金层析试纸条，特异性强，简便快速。
但至今，尚未见到可同时检测利莫那班和西布曲明的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有针对利莫那班和西布曲明的检测方法单一、繁杂、不利于现场检测等缺陷，提出了一种同时检测利莫那班和西布曲明的高效液相色谱方法。本发明的检测方法操作简单、分析速度快、结果可靠灵敏，可以通过对利莫那班和西布曲明的同时检测与监控，实现对产品的质量控制。
本发明同时检测利莫那班和西布曲明的方法包括如下步骤：将待测品进行样品前处理后进行高效液相色谱法检测即可；所述的高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以甲醇或乙腈为流动相等度洗脱，检测波长为220～225nm。
其中，所述的待测品可为各种需测试的样品，例如具有减肥效果的天然产物功能食品。
其中，所述的样品前处理的方法可按常规的色谱待测溶液的样品前处理方法进行操作。具体的，可将待测品溶解于溶剂中，有机微孔滤膜过滤，即可。所述的溶剂为能溶解利莫那班和西布曲明的溶剂，经实验筛选优选甲醇或甲醇水溶液。对于胶囊剂型的待测品而言，较佳的采用甲醇作为溶解胶囊内容物的溶剂，较佳的采用体积比30％-80％、更佳的为50％的甲醇水溶液作为溶解胶囊壳的溶剂。为促进待测品的充分溶解，可采用超声处理的方式。超声处理的较佳条件：功率为600W、频率为40KHZ、超声为10～40min，优选20min。所述的有机微孔滤膜的孔径可按常规条件选择，一般为0.22～0.80μm，优选0.22μm。
其中，所述的色谱柱为可为现有的各种型号和规格的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，如4.6mm×250mm、4.6mm×150mm等径长规格均可适用，最优选4.6mm×150mm。本发明特别优选Waters公司的Atlantic T3(4.6mm×150mm)。
其中，所述流动相采用甲醇或者乙腈，优选为甲醇。
其中，本发明方法中，流速对实验效果影响不大，可按本领域常规方法选择，一般流速为0.5～2.0mL·min-1，优选为0.5～1.0mL·min-1，更优选为0.6mL·min-1。
其中，本发明方法中，柱温对实验效果影响不大，可采用常规的色谱柱可以允许使用的温度范围，一般为20～40℃，优选为20℃。
其中，检测波长优选为223nm。
本发明中，所述的高效液相色谱法检测的进样量根据色谱检测领域常规知识选择，一般为2～100μL，优选的为5～20μL，更优选的进样体积10μL。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明首次建立了对利莫那班和西布曲明的同时进行检测的高效液相色谱方法。本发明的检测方法操作简单、分析速度快、结果可靠灵敏，可以通过对利莫那班和西布曲明的同时检测与监控，实现对产品的质量控制。
附图说明
图1是实施例1中10μg/mL利莫那班和10μg/mL西布曲明混合工作标准溶液的HPLC图。
图2是实施例2具有减肥效果功能食品2的HPLC图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述实施例中，所用设备和试剂：
LC100高效液相色谱仪(Agilent 1100)，KQ-600B超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，MS2型漩涡振荡器(德国IKA公司)，Milli-Q超纯水制备系统(Millipore，美国)，微量进样器(上海高鸽工贸有限公司)。
对照品利莫那班(纯度＞98％，TIC)、西布曲明(中国药品生物制品检定所提供)，甲醇为色谱纯，具有减肥效果功能食品为市售。
实施例1 标准曲线
1、样品制备
标准储备液：精密称取利莫那班与西布曲明对照品各0.0200g于两个10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为2mg/mL的对照品储备液，保存在-20℃冰箱中，有效期为一年。
混合标准工作溶液：精密量取各标准储备液适量，用甲醇稀释制成浓度0.01、0.05、0.1、1、2、5、10、20μg/mL系列混合标准工作溶液，保存在4℃冰箱中，有效期为六个月。
2、色谱方法
将系列混合标准工作溶液分别以10μL进样量注入色谱系统，柱温为20℃，以甲醇为流动相，流速为0.6mL·min-1，在Atlantic T3(4.6mm×150mm)色谱柱上分离，紫外检测器波长为223nm。
3、实验结果
利莫那班和西布曲明的标准曲线方程及相关系数如表1所示：
表1 标准曲线方程及相关系数
| 化合物 | 线性回归方程 | 相关系数 |
| 利莫那班 | A＝6116.4C+418.1 | r＝0.9999 |
| 西布曲明 | A＝3246.1C+181.2 | r＝0.9999 |
A-色谱峰面积；C-样品浓度
10μg/mL利莫那班和10μg/mL西布曲明混合工作标准溶液色谱图如图1所示。其中，色谱峰1为利莫那班(tR＝4.689min)，色谱峰2为西布曲明(tR＝6.883min)。
由上述实验可见，利莫那班和西布曲明分别在0.01～20μg mL-1和0.01～20μg mL-1线性范围内线性关系良好。
实施例2 精密度实验
将实施例1中制备的10μg/mL混合标准工作溶液摇匀，每次进样10μL，重复进样6次，按实施例1中HPLC条件分析。测定各次的峰面积A，RSD分别为1.47％，1.25％(n＝6)，表明精密度良好。相关数据见表2。
表2 精密度实验数据(n＝6)
| 化合物 | A1 | A2 | A3 | A4 | A5 | A6 | RSD |
| 利莫那班 | 60971.3 | 61587.5 | 62382.7 | 63636.3 | 61540.8 | 61103.5 | 1.47％ |
| 西布曲明 | 32209.2 | 32550.4 | 32769.7 | 33551.1 | 32986.9 | 32897.9 | 1.25％ |
实施例3 稳定性实验
取同一浓度为5μg/mL的混合标准工作溶液，室温放置0、1、2、4、6、8、12、24h后依次进样测定，分别测定利莫那班和西布曲明的峰面积，外标法定量，计算其浓度，RSD分别为2.62％、2.13％，表明利莫那班和西布曲明溶液在室温下24h内稳定性良好。相关数据见表3。
表3 稳定性实验数据
| 时间(h) | 0 | 2 | 4 | 6 | 8 | 12 | 24 | RSD |
| 利莫那班(μg/mL) | 5.53 | 5.45 | 5.56 | 5.55 | 5.63 | 5.60 | 5.17 | 2.62％ |
| 西布曲明(μg/mL) | 5.44 | 5.34 | 5.40 | 5.43 | 5.46 | 5.48 | 5.12 | 2.13％ |
实施例4 具有减肥效果功能食品2的检测
1、试验方法
具有减肥效果功能食品2的预处理方法：取5粒胶囊内容物混匀，精密称取0.10g，置250mL容量瓶中，加甲醇200mL，超声波发生器上超声提取20min，冷却至室温，甲醇定容至刻度，摇匀，经0.22μm有机微孔滤膜过滤，供HPLC测定。HPLC条件同实施例1。
2、实验结果
以具有减肥效果功能食品1为样品，进行高效液相色谱所得色谱图如图2所示。按照外标法定量，具有减肥效果功能食品2中含有41.71mg/g的西布曲明。
实施例5 检出限
将实施例1中制备的混合标准溶液摇匀，进样10μL，按实施例1中HPLC条件分析。信噪比S/N＝3时，利莫那班的检出限为1ng·mL-1，西布曲明的检出限为3ng·mL-1；信噪比S/N＝10时，利莫那班的定量限为3.3ng·mL-1，西布曲明的检出限为10.0ng·mL-1。
实施例6 加样回收率实验
以本底无利莫那班和西布曲明的具有减肥效果功能食品1，本底无利莫那班含有西布曲明的具有减肥效果功能食品2分别为样品，加入一定量的利莫那班和西布曲明对照品，按实施例4方法进行样品前处理。按照实施例1中HPLC条件分析，计算方法的回收率，得到结果如下表4：
表4 加样回收率实验结果(n＝3)
由表4可见，对利莫那班和西布曲明，本发明的检测方法具有良好的加样回收率。
实施例7 具有减肥效果功能食品胶囊壳检测
1、试验方法
将具有减肥效果功能食品胶囊壳的预处理：任取胶囊5粒，倾出内容物粉末，用棉花擦拭干净胶囊壳。小心地剪成碎片，置于50mL容量瓶中，加40mL体积比50％甲醇水溶液，超声波发生器上超声提取20min，冷却至室温，加体积比50％甲醇水溶液定容至刻度，摇匀，经0.22μm有机微孔滤膜过滤，供HPLC测定。按照实施例1中HPLC条件分析。
2、实验结果
应用本方法分别对市场上4种具有减肥效果功能食品的胶囊壳进行分析测定，都未检出利莫那班和西布曲明，结果见表5。
表5 具有减肥效果功能食品胶囊壳测定结果(N.D.表示未测出)
| 样品名 | 利莫那班(mg/g) | 西布曲明(mg/g) |
| 具有减肥效果功能食品1 | N.D. | N.D. |
| 具有减肥效果功能食品2 | N.D. | N.D. |
| 具有减肥效果功能食品3 | N.D. | N.D. |
| 具有减肥效果功能食品4 | N.D. | N.D. |
从上述结果可知本发明建立的高效液相色谱法同时检测检利莫那班和西布曲明的方法，不需要梯度洗脱，10min内即可将两种目标物完全分离，有效地提高了分析效率和灵敏度，操作简单、分析速度快、结果可靠灵敏，可以通过对利莫那班和西布曲明的同时检测与监控，实现对产品的质量控制。
Claims (9)
1.一种同时检测利莫那班和西布曲明的方法，其特征在于包括如下步骤：将待测品进行样品前处理后进行高效液相色谱法检测即可；所述的高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以甲醇或乙腈为流动相等度洗脱，检测波长为220～225nm。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的将待测品进行样品前处理的步骤为：将待测品溶解于溶剂中，超声处理，冷却，之后用有机微孔滤膜过滤，即可；所述的溶剂为甲醇或甲醇水溶液。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的色谱柱选用AtlanticT3。
4.如权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于：所述的色谱柱的径长规格为4.6mm×250mm或4.6mm×150mm。
5.如权利要求1或3所述的方法，其特征在于：所述的流动相的流速为0.5～2.0mL·min-1。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的流速为0.5～1.0mL·min-1。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述的流速为0.6mL·min-1。
8.如权利要求1、3、5～7任一项所述的方法，其特征在于：所述的色谱柱的柱温为20～40℃。
9.如权利要求1、3、5～8任一项所述的方法，其特征在于：所述的检测波长为223nm。
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