CN102264382A - 抗生素协同作用 - Google Patents

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汉斯-亨里克.K.霍根豪格
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Abstract

本发明涉及包含防卫素和β-内酰胺类抗生素的药物组合物的抗生素协同作用。

Description

抗生素协同作用
对序列表的引用
本申请包含计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过提述并入本文。
发明背景
发明领域
本发明涉及防卫素类抗生素和β-内酰胺类抗生素之间的协同作用。
背景
抗微生物化合物的可用类型稀少限制了对细菌感染包括涉及抗生素抗性细菌的感染的单一和组合药物处理的范围。因此，抗细菌化疗研究着眼于发现新靶标以供开发新的抗细菌剂。发现新的抗细菌化合物的另一方法是发现抗生素增效剂。抗微生物疗法的协同作用是周知的，并用于描述组合使用抗生素的超加成(supra-additive)活性。举例而言，在处理细菌感染时，已显示组合如青霉素或氨苄西林和链霉素或庆大霉素针对肠球菌感染具有超加成作用。类似地，羧苄西林或替卡西林与氨基糖苷类如庆大霉素或妥布拉霉素在处理铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)感染时呈现协同作用。一同使用链霉素与四环素的组合疗法比单独使用任一药物更加有效地治疗布氏菌病，而氯霉素加上磺胺的混合物针对由流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)引起的脑膜炎更为有效。
本领域已知几种抗细菌防卫素多肽。实例包括菌丝霉素(Plectasin)(参见WO 03/044049)和菌丝霉素的变体(参见WO 2006/131504)。β-内酰胺类抗生素也是一组周知的抗细菌化合物。β-内酰胺是具有杂环结构的内酰胺，由三个碳原子和一个氮原子组成。β-内酰胺环是几种抗生素(如青霉素)的一部分，因此这些抗生素也称为β-内酰胺类抗生素。
之前并未公开防卫素类和β-内酰胺类抗生素的组合，及其治疗用途。
本发明的目的是提供使用防卫素类和β-内酰胺类抗生素的协同组合治疗。
发明内容
我们现已发现防卫素多肽和β-内酰胺类抗生素呈现协同的抗细菌活性。
相应地，本发明提供包含第一抗细菌化合物和第二抗细菌化合物的(协同性)药物组合物，所述第一抗细菌化合物为防卫素，且所述第二抗细菌化合物为β-内酰胺类抗生素或氨基糖苷。
在第二个方面，本发明提供了在人或动物中处理细菌感染的方法，包括以处理所述细菌感染的有效量向需要这种处理的人或动物施用第一抗细菌化合物和第二抗细菌化合物，所述第一抗细菌化合物为防卫素且所述第二抗细菌化合物为β-内酰胺类抗生素或氨基糖苷(a beta-lactam antibiotic or anaminoglyeoside)。
发明详述
定义
抗细菌活性：术语“抗细菌活性”于本文定义为一种能够杀死细菌细胞或抑制细菌细胞生长的活性。在本发明的上下文中，术语“抗细菌”旨在意指有杀细菌和/或抑制细菌的效果，其中所述术语“杀细菌”应理解为能够杀死细菌细胞；而其中所述术语“抑制细菌的”应理解为能够抑制细菌生长。当细菌细胞的生长受抑制时，细胞处于非生长状态，即其无法繁殖。
在优选的实施方案中，术语“抗细菌活性”定义为针对链球菌(Streptococci)(优选肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae))或葡萄球菌(Staphylococci)(优选金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的杀细菌和/或抑制细菌活性。
就本发明而言，抗细菌活性可根据由Lehrer等，Journal of ImmunologicalMethods，Vol.137(2)pp.167-174(1991)所述的方法测定。或者，抗细菌活性可根据来自CLSI(临床和实验室标准学会(Clinical and Laboratory StandardsInstitute)；之前称为国家临床与实验室标准委员会(National Committee ofClinical and Laboratory Standards))的NCCL S指南测定。
将具有抗细菌活性的化合物以浓度为500μg/mL；优选浓度为250μg/mL；更优选浓度为100μg/mL；甚至更优选浓度为50μg/mL；最优选浓度为25μg/mL；且特别是浓度为10μg/mL的所述具有抗微生物活性的多肽在相关微生物生长底物中于37℃温育24小时后(优选16小时后，更优选8小时后，最优选4小时后，且特别是2小时后)可具有将肺炎链球菌(ATCC 49619)的活细胞数减少至1/100的能力。
具有抗细菌活性的化合物当以500μg/mL的浓度加入；优选当以250μg/mL的浓度加入；更优选当以100μg/mL的浓度加入；甚至更优选当以50μg/mL的浓度加入；最优选当以10μg/mL的浓度加入；以及特别是当以5μg/mL的浓度加入时，在相关微生物生长底物中于37℃也可具有将肺炎链球菌(ATCC 49619)的长出(outgrowth)抑制8小时的能力。
本发明的化合物具有至少20％，优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，且甚至最优选至少100％的由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的多肽的抗细菌活性。
防卫素(Defensin)：术语“防卫素”用于本文意指本领域的技术人员识别为属于防卫素类抗微生物肽的多肽。为确定某多肽是否为本发明的防卫素，优选将其氨基酸序列通过使用可免费获得的HMMER软件包与PFAM数据库的隐蔽马尔科夫模型序型(hidden markov model profile)(HMM序型(HMMprofile))比较(参见实施例5)。
PFAM防卫素家族包括防卫素_1或“哺乳动物防卫素”(登录号PF00323)、防卫素_2或“节肢动物防卫素”(登录号PF01097)、防卫素_β或“β防卫素”(登录号PF00711)、防卫素_propep或“防卫素前肽”(登录号PF00879)与γ-硫素(gamma-thionin)或“γ-硫素家族”(登录号PF00304)。
防卫素可属于α-防卫素类、β-防卫素类、θ-防卫素类、昆虫或节肢动物防卫素类、或植物防卫素类。来自这些类中每一类的防卫素享有共同的结构特征，如半胱氨酸样式。但重要的是注意类的归属并不表明防卫素的来源。举例而言，来自真菌的防卫素可属于昆虫防卫素类。
如SEQ ID NO：1所示的防卫素是来源于菌丝霉素的合成防卫素(参见WO 03/044049)，其属于昆虫防卫素类。
在一个实施方案中，本发明的防卫素的氨基酸序列包含4、5、6、7或8个半胱氨酸残基，优选4、5或6个半胱氨酸残基，更优选4或6个半胱氨酸残基，且最优选6个半胱氨酸残基。
防卫素也可为享有任何防卫素类的特性特征的合成防卫素。
这样的防卫素的实例包括但不限于α-防卫素HNP-1(人嗜中性粒细胞肽)、HNP-2和HNP-3；β-防卫素-12、Drosomycin、Heliomicin、γ1-嘌呤硫素(γ1-purothionin)、昆虫防卫素A，和PCT申请WO 99/53053、WO 02/06324、WO 02/085934、WO 03/044049、WO 2006/131504、WO 2006/050737和WO2006/053565中所公开的防卫素。
分离的多肽：术语“分离的变体”或“分离的多肽”用于本文指自来源分离的变体或多肽。在一方面，该变体或多肽为至少1％纯的，优选至少5％纯的，更优选至少10％纯的，更优选至少20％纯的，更优选至少40％纯的，更优选至少60％纯的，甚至更优选至少80％纯的，且最优选至少90％纯的，如通过SDS-PAGE所测定的。
基本上纯的多肽：术语“基本上纯的多肽”于本文代表一种多肽制备物，其含有以重量计至多10％，优选至多8％，更优选至多6％，更优选至多5％，更优选至多4％，更优选至多3％，甚至更优选至多2％，最优选至多1％，且甚至最优选至多0.5％的与其天然或重组结合的其它多肽物质。因此，优选所述基本上纯的多肽按该制备物中存在的总多肽物质的重量计为至少92％纯的，优选至少94％纯的，更优选至少95％纯的，更优选至少96％纯的，更优选至少96％纯的，更优选至少97％纯的，更优选至少98％纯的，甚至更优选至少99％纯的，最优选至少99.5％纯的，且甚至最优选100％纯的。本发明的多肽优选处于基本上纯的形式。这可以通过以公知的重组方法或以经典的纯化方法制备该多肽来完成。
同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性通过参数“同一性”描述。
就本发明而言，两个氨基酸序列之间的同一性程度使用如于EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物开放软件组(The European Molecular BiologyOpen Software Suite)，Rice等，2000，Trends in Genetics 16：276-277；http://emboss.org)的Needle程序，优选3.0.0或更新的版本中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)来确定。所使用的任选参数为缺口产生罚分(gap open penalty)为10，缺口延伸罚分为0.5，和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。使用标记为“最长同一性”的Needle的输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性并如下计算：
(相同的残基×100)/(比对的长度-比对中缺口的总数)
就本发明而言，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的同一性程度使用如于EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物开放软件组，Rice等，2000，如上；http://emboss.org)的Needle程序，优选3.0.0或更晚版本中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，如上)测定。所使用的任选参数为缺口开放罚分10，缺口延伸罚分0.5，和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。使用标记为“最长同一性”的Needle的输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性并如下计算：
(相同的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对的长度-比对中缺口的总数)。
等位变体：术语“等位变体(allelic variant)”在本文中表示占据相同染色体基因座的基因的任何两种或两种以上可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。
修饰：术语“修饰”在本文的意思是，对由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的多肽的任何化学修饰，以及对编码所述多肽的DNA的遗传操作。所述修饰可以是一处或多处一个或多个(数个)氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及一处或多处一个或多个(数个)氨基酸侧链的置换；或在氨基酸序列中使用具有相似特征的非天然氨基酸。特别地，所述修饰可为酰胺化，例如C-端的酰胺化。
具有抗细菌活性的防卫素多肽
在第一方面，本发明涉及具有与SEQ ID NO：1(即，成熟多肽)有至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％，且特别地至少97％同一性程度的氨基酸序列的分离的多肽，其具有抗细菌活性(以下称“同源多肽”)。
在一个优选的方面，所述同源多肽具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列相差至多六个氨基酸，优选至多五个氨基酸，更优选至多四个氨基酸，甚至更优选至多三个氨基酸，最优选至多两个氨基酸，且特别地是一个氨基酸的氨基酸序列。
在另一个优选的方面，所述同源多肽具有与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相差至多六个氨基酸，优选至多五个氨基酸，更优选至多四个氨基酸，甚至更优选至多三个氨基酸，最优选至多两个氨基酸，且特别地是一个氨基酸的氨基酸序列。
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有三处氨基酸差异，其在位置9、13和14处。
本发明的多肽优选包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或其等位变体。在一个优选的方面，多肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。在另一个优选的方面，多肽由SEQ ID NO：1的氨基酸序列或其等位变体组成。在另一个优选的方面，多肽由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成。
优选地，氨基酸改变对性质是较不重要的(of a minor nature)，即不显著影响多肽的折叠和/或活性的保守的氨基酸取代或插入；单缺失；小的氨基-或羧基-末端延伸；多至大约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能来促进纯化的小延伸，如多组氨酸标签(poly-histidine tag)、抗原表位(antigenic epitope)或结合域(binding domain)。
保守取代的实例是在以下组之内：碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性(specific activity)的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如H.Neurath和R.L.Hill，1979，于The Proteins，Academic Press，New York中描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。
除了20个基本氨基酸，非基本氨基酸(如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸残基。“非天然氨基酸”在蛋白质合成后已经过修饰，和/或在它们的侧链具有不同于基本氨基酸的化学结构。非天然氨基酸能够以化学方法合成，并且优选是商业上能够获得的，包括六氢吡啶羧酸(pipecolic acid)、噻唑烷羧酸(thiazolidine carboxylic acid)、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸，和3，3-二甲基脯氨酸。
能够根据本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(Cunningham和Wells，1989，Science 244：1081-1085)来鉴定亲本多肽中的必需氨基酸。在后一技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且测试所得突变分子的生物活性(即，抗微生物活性)以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见Hilton等，1996，J.Biol.Chem.271：4699-4708。生物相互作用也能够通过对结构的物理分析而测定，如通过以下这些技术：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同推定的接触位点氨基酸的突变来测定。参见例如de Vos等，1992，Science 255：306-312；Smith等，1992，J.Mol.Biol.224：899-904；Wlodaver等，1992，FEBSLett.309：59-64。必需氨基酸的身份(identity)也能够根据分析与多肽的同一性来推断，所述多肽与根据本发明的多肽相关。
能够使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，然后是有关的筛选方法，例如那些由Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science 241：53-57；Bowie和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625公开的那些方法来进行并测试单个或多个氨基酸取代。能够使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等，1991，Biochem.30：10832-10837；美国专利No.5,223,409；WO 92/06204)和区域定向的诱变(Derbyshire等，1986，Gene 46：145；Ner等，1988，DNA 7：127)。
诱变/改组方法能够与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性。能够从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用本领域内标准方法快速测序。这些方法允许快速测定感兴趣的多肽中单个氨基酸残基的重要性，并且能够应用于未知结构的多肽。
N-端延伸
本发明的多肽的N-端延伸可适当地由1至50个氨基酸，优选2-20个氨基酸，尤其是3-15个氨基酸组成。在一个实施方案中，N-端肽延伸不包含Arg(R)。在另一个实施方案中，N-端延伸包含kex2或kex2-样切割位点，如在下文进一步定义的。在一个优选的实施方案中，N-端延伸为肽，其包含至少两个Glu(E)和/或Asp(D)氨基酸残基，如包含以下序列之一的N-端延伸：EAE、EE、DE和DD。
Kex2位点
Kex2位点(参见，例如，Methods in Enzymology Vol 185，D.Goeddel编，Academic Press Inc.(1990)，San Diego，CA，“Gene Expression Technology”)和kex2-样位点为在一些蛋白质的前肽编码区和成熟区之间存在的二元的(dibasic)识别位点(即，切割位点)。
插入kex2位点或kex2-样位点已在某些情况中显示改进了于前肽切割位点处的正确内肽酶加工，导致蛋白质分泌水平增加。
在本发明的上下文中，插入kex2或kex2-样位点导致在N-端延伸中某个位置处获得切割的可能性，造成抗微生物多肽与SEQ ID NO：1中所示的成熟多肽相比得到延长。
融合的多肽
本发明的多肽也包括融合的多肽或可切割的融合多肽，其中另一多肽融合于本发明的多肽或其片段的N-端或C-端。通过将编码另一多肽的核苷酸序列(或其部分)融合于本发明的核苷酸序列(或其部分)来产生融合的多肽。产生融合多肽的技术是本领域已知的，并包括连接编码多肽的编码序列以使它们在阅读框中，并且使融合的多肽的表达在相同启动子和终止子的控制下。
如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的防卫素的作用机理
已使用多种技术彻底地研究了如SEQ ID NO：1(后文称为“防卫素2114”)和SEQ ID NO：2(后文称作“菌丝霉素”)杀灭细菌细胞的机理。与多数其他抗微生物肽相反，防卫素2114和菌丝霉素并不最初或作为主要机理破坏细菌的膜。对于暴露于防卫素2114或菌丝霉素的细菌，未检测到K+的流出且其跨膜电势保持不变。
传统的掺入法研究显示对防卫素2114或菌丝霉素的暴露严重地影响了细胞壁前体但非蛋白质或核酸(RNA/DNA)的掺入。
在补充实验如DNA微阵列、生长动力学和细胞形态的变化中显示了防卫素2114暴露或菌丝霉素暴露的结果与暴露于其他细胞壁抑制剂特别是万古霉素的反应相仿。更具体而言，在体外显示了防卫素2114和菌丝霉素以10-6至10-7M-1范围的结合常数结合于LipidI和LipidII，其为用于合成细菌细胞壁的前体。在细菌细胞中掩蔽LipidII(和LipidI)抑制这些前体聚合为肽聚糖。LipidII聚合为肽聚糖是糖模块的初始转糖基作用继以其中通过LipidII的肽部分介导不同糖链交联的转肽酶反应的结果。两个反应原则上均可由防卫素2114或菌丝霉素所阻断。
也显示了其他抗生素或抗微生物剂结合并掩蔽LipidII，例如，作为糖肽的万古霉素和作为羊毛硫抗生素的尼生素(lantibiotic Nisin)。未在例如万古霉素抗性金黄色葡萄球菌(VRSA)和防卫素2114或菌丝霉素之间观察到交叉抗性，表明LipidII上不同的表位涉及对这两种抗生素的结合，或在此结合中起重要作用。
β-内酰胺类抗生素的作用机理
β-内酰胺环是几种抗生素家族结构的一部分，主要为青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类和单环内酰胺类，因此它们也称为β-内酰胺类抗生素。这些抗生素通过抑制细菌细胞壁合成起作用。
β-内酰胺类抗生素(如青霉素G)通过抑制细菌细胞壁中的肽聚糖交联而起作用。青霉素的β-内酰胺模块(官能团)结合于在细菌中连接肽聚糖分子的酶(DD-转肽酶)，其削弱细菌的细胞壁(换言之，该抗生素导致由于渗透压引起的细胞溶解或死亡)。此外，肽聚糖前体的蓄积引发细菌细胞壁水解酶和自溶素的激活，其进一步消化细菌现有的肽聚糖。
青霉素显示与氨基糖苷类(如庆大霉素)的协同作用，因为对肽聚糖合成的抑制允许氨基糖苷类更容易穿透细菌细胞壁，允许其在细胞内破坏细菌的蛋白质合成。这导致易感生物的MBC降低。
头孢菌素类化合物由意大利科学家Giuseppe Brotzu在1948年首先从来自阴沟的顶头孢霉(Cephalosporium acremonium)的培养物中分离。头孢菌素母核，7-氨基头孢菌烷酸(7-aminocephalosporanic acid)(7-ACA)衍生自头孢菌素C，并证实类似于青霉素母核6-氨基青霉烷酸。因此，头孢菌素类化合物属于β-内酰胺类抗生素。
头孢菌素类(如头孢曲松(Ceftriaxone)或头孢噻肟(Cefotaxime))为杀细菌剂，并与其他β-内酰胺类抗生素(如青霉素)具有相同的作用模式。头孢菌素类破坏细菌细胞壁肽聚糖层的合成。肽聚糖层对于细胞壁结构完整性是重要的。在肽聚糖合成中最终的转肽步骤由称作青霉素结合蛋白(PBP)的转肽酶促进。PBP在胞壁肽(肽聚糖前体)的末端结合于D-Ala-D-Ala以交联肽聚糖。β-内酰胺类抗生素模拟该位点，并竞争性抑制肽聚糖的PBP交联。
氨基糖苷类的作用机理
氨基糖苷类(如庆大霉素)通过结合于细菌30S核糖体亚单位(部分通过结合于50S亚单位起作用)，抑制肽酰-tRNA从A位点转位至P位点，还导致mRNA的错读，使得细菌无法合成对其生长极其重要的蛋白质而起作用。其通过结合于16S rRNA而抑制蛋白质合成和通过破坏细菌细胞膜完整性而杀灭细菌。
呈现协同抗细菌活性的组合物
本发明提供呈现协同抗细菌活性的药物组合物，包含：
-第一抗细菌化合物，其是防卫素，和
-第二抗细菌化合物，其是β-内酰胺类抗生素或氨基糖苷。
协同作用是通过二维或棋盘状(checkerboard)测试中分级抑制浓度(FIC)指数≤0.5来鉴定的。在杀灭曲线中，协同性是根据在24小时之后，该组合与最具活性的组分之间在CFU/mL方面≥2Log10的减少而鉴定的；而在该组合存在情况下存活的生物数必需低于起始接种物≥2Log10CFU/mL。至少一种药物必需以单独使用时不影响测试生物的生长曲线的浓度存在。拮抗是通过≥4的FIC指数鉴定的。亦参见实施例1和2。
在一个实施方案中，本发明的组合物使用选自下组的测试生物呈现FIC指数≤0.5：肺炎链球菌ATCC49619，金黄色葡萄球菌ATCC29213，金黄色葡萄球菌ATCC34400，金黄色葡萄球菌ATCC25923和表皮葡萄球菌ATCC49134。
在另一个实施方案中，本发明的组合物对革兰氏阳性细菌如链球菌和葡萄球菌呈现协同性抗细菌活性。
方法和用途
本发明组合物用于处理细菌感染。相应地，本发明的组合物可用作抗细菌的兽用或人用治疗剂或预防剂。本发明的组合物可用于制备用于处理细菌感染的兽用或人用治疗剂或预防剂。
本发明的组合物以足以处理细菌感染，即，足以杀灭或抑制导致细菌感染的细菌，例如杀灭或抑制链球菌属菌种如肺炎链球菌或葡萄球菌属菌种如金黄色葡萄球菌的生长的量使用。
将本发明组合物的配制物施用于患有细菌感染的宿主。施用可为局部的或全身的(systematic)。一般而言，本发明的组合物的剂量会足以使细菌群体减少至少1log，且可为2个或更多个log。本发明的组合物是以减少细菌群体同时最小化任何副作用的剂量施用。考虑的是获得组合物并在医师的指导下使用以用于体内用途。
本发明的组合物中使用的抗细菌化合物可同时施用，或以任何顺序先后施用。还可将所述抗细菌化合物彼此独立地通过不同途径施用。下述施用和配制的实例适用于本发明的组合物，以及用于组合物中的各个抗细菌化合物。
可采用多种施用方法。抗细菌化合物的配制物可口服给予，或可血管内、肌肉内、皮下、腹膜注射、通过气溶胶、眼部(opthalmically)、膀胱内、局部等方式。治疗性配制物的剂量变化会很大，取决于待施用的具体抗细菌化合物、施用的频率、施用的方式、药剂自宿主的清除等。初始剂量可以较大，然后为较小的维持剂量。在许多情况中，口服施用会需要比静脉内施用更高的剂量。防卫素的酰胺键，以及氨基与羧基端，可进行修饰以在口服施用时具有较大的稳定性。例如，羧端可经酰胺化。
配制物
在本发明的组合物中使用的抗细菌化合物可掺入多种配制物中用于治疗性施用。更具体地，所述抗细菌化合物可通过与适合的、药学上可接受的载体或稀释剂组合而配制成药物组合物，且可配制成固体、半固体、液体或气体形式的制备物，如片剂、胶囊、粉末、颗粒、软膏(ointment)、乳霜(cream)、泡沫、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶、微球、洗剂(lotion)和气雾剂。如此，抗细菌化合物的施用可以多种方式实现，其包括经口施用、含服施用、直肠施用、肠胃外施用、腹膜内施用、皮内施用、透皮施用、气管内施用等。本发明组合物的抗细菌化合物在施用后可为全身性或可为局部化的。
本发明的组合物可单独施用或可与其他已知化合物(例如，穿孔素(perforin)、抗炎剂、抗生素等)组合使用。在药物剂型中，组合物的抗细菌化合物可以其药学上可接受的盐的形式施用。以下方法与赋形剂仅为实例而非以任何方式限制。
对于口服制备物，抗细菌化合物可单独使用或与适合的添加剂组合以制造片剂、粉末、颗粒或胶囊，例如，与常规的添加剂，如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉组合；与粘合剂(binder)，如结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯树胶(acacia)、玉米淀粉或明胶组合；与崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠组合；与润滑剂，如滑石或硬脂酸镁组合；以及如果需要，与稀释剂、缓冲剂、湿润剂、防腐剂和调味剂结合。
抗细菌化合物可通过将其溶解、悬浮或乳化于水性或非水性溶剂(例如植物油或其它类似的油、合成的脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸的酯或丙二醇)中，以及如果需要，与常规的添加剂(例如增溶剂、等张剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂)一起，而配制成用于注射的制备物。
抗细菌化合物可用于气雾剂配制物中以经由吸入施用。在本发明的组合物中使用的抗细菌化合物可配制于加压的可接受推进剂如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等中。
此外，抗细菌化合物可通过与多种基底(base)(例如乳化基底或水溶性基底)混合而制成栓剂。所述抗细菌化合物可经由栓剂而直肠施用。栓剂可包括媒介物，例如可可脂、碳蜡(carbowax)和聚乙二醇，其在体温融化，但在室温固化。
可提供用于口服或直肠施用的单位剂型，如糖浆、酏剂和悬浮剂，其中每个剂量单位(例如茶匙量、汤匙量、片剂或栓剂)包含预定量的在本发明的组合物中使用的抗细菌化合物。类似的，用于注射或静脉内施用的单位剂型可包含抗细菌化合物，而所述剂型为无菌水、生理盐水或另一种药学上可接受的载体中的溶液。
用于持续释放配制物的移植物是本领域中公知的。移植物以生物可降解的或非生物可降解的聚合物配制成微球、厚片(slab)等。例如，乳酸和/或乙醇酸的聚合物形成可侵蚀性聚合物，其可良好地被宿主所容忍。将包含本发明组合物的移植物置于接近感染的位点，使得抗细菌化合物的局部浓度相对于身体的其余部分增加。
用于本文，术语“单位剂型”意指物理上离散的单位，其适合作为用于人和动物受试者的单位剂量，每个单位包含预定量的本发明的抗细菌化合物，该量经计算为足够产生期望效果的量，所述多肽与药学上可接受的稀释剂、载体或媒介物组合。本发明的单位剂型的规格取决于所采用的具体抗细菌化合物和待实现的效果、以及在宿主中与抗细菌化合物相关的药效动力学(pharmacodynamics)。
药学上可接受的赋形剂，如媒介物、佐剂、载体或稀释剂，是公众容易获得的。此外，药学上可接受的辅助物质，如pH调整和缓冲剂、张度调节剂(tonicity adjusting agent)、稳定剂、润湿剂等，是公众容易获得的。
用于全身性施用的典型剂量的范围为0.1pg至100毫克每公斤受试者重量每次施用。典型剂量可为每天服用二到六次每次一片，或每天服用一次每次一颗延时-释放的(time-release)胶囊或片剂，且包含成比例更高含量的活性成分。延时-释放效果可通过在不同pH值溶解的胶囊材料、通过由于渗透压缓慢释放的胶囊、或通过任何其它已知的控制释放方法而获得。
本领域的技术人员容易理解的是剂量水平可作为具体抗细菌化合物、症状的严重性和受试者对副作用的敏感性的函数而变化。一些特定抗细菌化合物比其他更为有效。用于给定抗细菌化合物的优选剂量可由本领域的技术人员通过多种手段容易地确定。一个优选的手段为测量给定抗细菌化合物的生理潜力(physiological potency)。
使用脂质体作为递送媒介物是一种所关注的方法。脂质体与目标位置的细胞融合并将内腔的内容物在细胞内递送。维持脂质体与细胞接触一段足够融合的时间，其使用多种方法以维持接触，如分离、结合剂等。在本发明的一个方面，脂质体经设计以气溶胶化用于肺部施用。脂质体可用介导膜融合的纯化蛋白质或肽(如，仙台病毒或流感病毒等)制备。脂质可为已知的脂质体形成性脂质的任何有用组合，包括阳离子脂质或两性离子脂质，如磷脂酰胆碱。剩下的脂质通常会为中性或酸性脂质，如胆固醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油等。
为了制备脂质体，可使用Kato等(1991)J.Biol.Chem.266：3361所描述的方法。简言之，将脂质和包含抗细菌化合物的内腔组合物在适合的水性介质(方便地为盐水介质)中组合，其中总固体在大约1-10重量百分比的范围内。在短时间(大约5-60秒)激烈地搅动后，将管子置于温水浴(大约25-40℃)并重复此循环大约5-10次。然后对所述组合物进行声处理一段方便的时间(一般大约1-10秒)并可进一步通过漩涡震荡而搅动。然后通过加入水性介质扩增体积，一般使体积增加大约1-2倍，然后摇动并冷却。此方法允许将高分子量分子并入内腔中。
具有其它活性剂的配制物
为了用于提述方法，在本发明的组合物中使用的抗细菌化合物可与其它药学活性剂(特别是其它抗微生物剂)一起配制。所关注的其它药剂包括广大范围的抗生素，如于技术领域中已知的。抗生素的类型包括青霉素类，例如青霉素G、青霉素V、甲氧西林(methicillin)、苯唑西林(oxacillin)、羧苄西林(carbenicillin)、萘夫西林(nafcillin)、氨苄西林等；青霉素类与β-内酰胺酶抑制剂，头胞菌素类的组合，例如头孢克洛(cefaclor)、头孢唑林(cefazolin)、头孢呋辛(cefuroxime)、拉氧头孢(moxalactam)等；碳青霉烯类(carbapenems)；单环内酰胺类(monobactams)；氨基糖苷类；四环素类；大环内酯类；林可霉素类；多粘菌素类；磺胺类；喹诺酮类(quinolones)；氯霉素(cloramphenical)；甲硝唑(metronidazole)；大观霉素；甲氧苄啶(trimethoprim)；万古霉素等。
抗霉菌剂(包括多烯类，例如两性霉素B(amphotericin B)、制霉菌素；5-flucosyn；以及唑类，例如咪康唑(miconazol)、酮康唑(ketoconazol)、伊曲康唑(itraconazol)与氟康唑(fluconazol))也是有用的。抗结核药物包括异烟肼(isoniazid)、乙胺丁醇(ethambutol)、链霉素和利福平(rifampin)。细胞因子(例如干扰素γ、肿瘤坏死因子α、白介素12等)也可包括于抗细菌化合物的配制物中。
体外合成
在本发明的组合物中使用的防卫素多肽可通过体外合成使用如本技术领域中已知的常规方法制备。多种商业合成设备(例如Applied BiosystemsInc.，Beckman的自动化合成仪等)是可获得的。通过使用合成仪，可以用非天然氨基酸(特别是D-异构体(或D-型)，例如D-丙氨酸和D-异亮氨酸、非对映异构体、具有不同长度或官能团的侧链等)取代天然存在的氨基酸。制备的特定顺序和方式可通过方便性、经济性、所需纯度等确定。
可将化学连接提供给多种肽或蛋白质，其包括方便的用于键合的官能团，如用于酰胺或取代的胺形成(例如还原性胺化)的氨基、用于硫醚或二硫键形成的硫醇基、用于酰胺形成的羧基等。
如果需要，可在合成过程中或在表达过程中将多个基团(其允许连接至其它分子或表面)导入至肽中。因此，可使用半胱氨酸以制造硫醚、使用组氨酸以连接至金属离子复合物、使用羧基以形成酰胺或酯、使用氨基以形成酰胺等。
所述多肽也可根据常规的重组合成方法分离和纯化。可制备表达宿主的裂解物，而该裂解物使用HPLC、排阻层析、凝胶电泳、亲和层析、或其它纯化技术纯化。一般来说，所使用的组合物会包含按重量计至少20％的期望产物，更通常按重量计至少大约75％，优选按重量计至少大约95％，以及为了治疗目的，通常按重量计至少大约99.5％，其系相对于与产物的制备及其纯化方法有关的污染物而言。通常，百分比会基于总蛋白质。
通过以下实施例进一步描述本发明，且所述实施例不应被理解为限制本发明的范围。
实施例
如SEQ ID NO：1所示的防卫素多肽在下文中称作“防卫素2114”。如SEQID NO：2所示的防卫素多肽在下文中称作“菌丝霉素”。
实施例1
抗生素协同作用I
使用时间-杀灭(Time-Kill)方法针对肺炎链球菌ATCC49619、金黄色葡萄球菌ATCC29213、金黄色葡萄球菌ATCC34400、金黄色葡萄球菌ATCC25923和表皮葡萄球菌ATCC49134调查防卫素2114与多种临床使用的抗生素之间的协同作用、相加作用和拮抗作用。
在此方法中，将1/2xMIC的各抗生素单独或以特定组合添加至107CFU/mL葡萄球菌或链球菌细胞，并在暴露2、3和5小时之后确定CFU。
协同作用定义为组合与最具活性的单一药物相比在CFU/ml方面≥2log10的减少。
相加作用定义为组合与单独的最具活性的单一抗微生物剂相比≥1log10的减少。
拮抗作用定义为在菌落计数方面≥2log10的增加。与防卫素2114组合测试的抗生素为：庆大霉素、青霉素G、头孢曲松、万古霉素、红霉素、环丙沙星(Ciprofloxacin)、四环素、多粘菌素B、立思丁(fucidin)、利奈唑胺(linezolid)、莫匹罗星(mupirocin)和氯霉素。
在防卫素2114和青霉素G，以及防卫素2114和头孢曲松之间鉴定出了协同作用。青霉素G和头孢曲松两者均为β-内酰胺类抗生素化合物，其抑制细菌肽聚糖合成中的转肽步骤。在一些但非所有时点，防卫素2114和庆大霉素显示了协同作用。
在防卫素2114和所有测试的化合物(庆大霉素、青霉素G、头孢曲松、万古霉素、红霉素、环丙沙星、四环素、多粘菌素B、立思丁、利奈唑胺、莫匹罗星和氯霉素)中未观察到拮抗作用。
实施例2
抗生素协同作用II
还使用棋盘滴定测定法调查了防卫素2114和多种临床上采用的抗生素之间针对金黄色葡萄球菌ATCC29213的协同作用、相加作用和拮抗作用。
该方法可基本上描述为两维上的MIC/MBC测定法。简言之，将一种抗生素沿微量滴定板的一个方向2倍系列稀释，而将第二抗生素沿微量滴定板的另一个方向稀释。此外，每个孔含有～5x104个细菌的悬液，并在37℃温育18-24小时之后读板。记录所得的生长或无生长，并将分级抑制浓度(FIC)指数根据下述公式计算为抑制微量滴定板上的生长的两种化合物的最小组合：
FIC指数＝(药物A浓度/药物A的MIC)+(药物B浓度/药物B的MIC)
以类似方式，但是基于MBC计算分级杀菌浓度(Fractional BactericidalConcentration，FB C)。
结果的解释(与文献一致)：
FBC/FIC指数≤0.5       ～协同作用
0.5＜FBC/FIC指数＜4    ～缺乏协同作用/拮抗作用
FBC/FIC指数≥4.0       ～拮抗作用
与防卫素2114组合测试的抗生素包括：红霉素、青霉素G、庆大霉素、头孢曲松、万古霉素、环丙沙星和利奈唑胺。
计算的FIC/FBC指数示于表1。
表1
  第一抗生素   第二抗生素   FIC指数   FBC指数
  防卫素2114   防卫素2114   1   -
  防卫素2114   红霉素   1.5   -
  防卫素2114   青霉素G   0.5   0.5
  防卫素2114   庆大霉素   1   -
  防卫素2114   头孢曲松   0.5   -
  防卫素2114   万古霉素   2   -
  防卫素2114   环丙沙星   1   -
  防卫素2114   利奈唑胺   2   -
如从实施例1中所述时间-杀灭方法观察到的，针对金黄色葡萄球菌发现了防卫素2114与青霉素G或头孢曲松之间的协同作用(FBC/FIC＝0.5)。
未在防卫素2114和红霉素、庆大霉素、万古霉素、环丙沙星和利奈唑胺之间发现FIC拮抗作用。
实施例3
抗生素协同作用III
还使用棋盘滴定测定法调查了防卫素2114与临床上采用的抗生素青霉素G和头孢曲松之间针对肠球菌属(Entorococci)、葡萄球菌属(Staphylococci)和链球菌属(Streptococci)的代表菌种的协同作用。该方法可基本上描述为两维上的MIC/MBC测定法。简言之，将一种抗生素沿微量滴定板的一个方向2倍系列稀释，而将第二抗生素沿另一方向稀释。此外，每个孔含有～5x104个细菌的悬液，并在37℃温育18小时之后读板。该分析导致两种抗生素系列稀释呈棋盘状。分级抑制浓度(FIC)指数通常计算为抑制微量滴定板上的生长的两种化合物的最小组合。该值计算为：
FIC指数＝(药物A浓度/药物A的MIC)+(药物B浓度/药物B的MIC)
结果的解释(与文献一致)
FBC/FIC指数≤0.5       ～协同作用
0.5＜FBC/FIC指数＜4    ～缺乏协同作用/拮抗作用
FBC/FIC指数≥4.0       ～拮抗作用
该结果得到的FIC指数表明下述抗生素组合的抗生素协同作用，如下述表2所述。
表2
Figure BDA0000070478560000171
表2中的结果表明防卫素2114与头孢曲松或青霉素之间针对肠球菌属、葡萄球菌属和链球菌属的代表菌株的协同作用。结果还显示防卫素2114与青霉素/头孢曲松之间针对甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌分离株的协同作用。
实施例4
抗生素协同作用IV
调查了菌丝霉素和多种临床上采用的抗生素之间针对金黄色葡萄球菌ATCC29213的协同作用，使用实施例2和3中描述的方法。
与菌丝霉素组合测试的抗生素为：红霉素、青霉素G、庆大霉素、万古霉素、环丙沙星和头孢噻肟。青霉素G和头孢噻肟是β-内酰胺抗生素。计算的FIC指数示于表3。
表3
  第一抗生素   第二抗生素   FIC指数
  菌丝霉素   红霉素   1.5
  菌丝霉素   青霉素G   0.5
  菌丝霉素   庆大霉素   1.5
  菌丝霉素   头孢噻肟   0.5
  菌丝霉素   万古霉素   2
  菌丝霉素   环丙沙星   0.75
发现菌丝霉素和青霉素G或头孢噻肟(FIC＝0.5)之间针对金黄色葡萄球菌的协同作用。
未在菌丝霉素与红霉素、庆大霉素、万古霉素或环丙沙星之间发现FIC拮抗作用。
实施例5
使用来自PFAM数据库的HMM文件鉴定防卫素
可在Internet上联线或在本地计算机上使用周知的可免费获得的HMMER软件包进行使用隐蔽马尔科夫模型序型(HMM序型)的序列分析。目前版本为自2003年10月起的HMMER 2.3.2。
HMM序型可从周知的PFAM数据库获得。目前版本是自2004年11月起的PFAM 16.0。对于所有计算机平台均可从例如Washington University in St.Louis(USA)，School of Medicine(http://pfam.wustl.edu andhttp://hmmer.wustl.edu)获得HMMER和PFAM。
如果调查的氨基酸序列或其片段属于下述五个PFAM家族之一，根据本发明该氨基酸序列为防卫素：
-防卫素_beta或“β防卫素”，登录号PF00711；
-防卫素_propep或“防卫素前肽”，登录号PF00879；
-防卫素_1或“哺乳动物防卫素”，登录号PF00323；
-防卫素_2或“节肢动物防卫素”，登录号PF01097；
-γ-硫素或“γ-硫素家族”，登录号PF00304。
根据本发明，如果氨基酸序列当联线使用PFAM数据库，或当本地使用hmmpfam程序(来自HMM R软件包)时，生成大于0.1的E值，和大于或等于零的得分，则其属于PFAM家族。
当在本地使用hmmpfam程序进行序列分析时，必需从PFAM数据库获得(下载)HMM序型。对于每个家族存在两个序型；用于全局检索的xxx_ls.hmm，和用于局部检索的xxx_fs.hmm(“xxx”为家族名称)。这样，对于上面提及的五个家族总共有十个序型。
这十个序型可单独使用，或加入(附加)至可命名为例如defensin.hmm的单序型(使用文本编辑器——这些序型是ASCII文件)中。然后可通过使用下述命令行评价调查的氨基酸序列：
hmmpfam-E 0.1defensin.hmm sequence_file
-其中“sequence_file”是具有任何HMMER软件包所识别的格式的调查的氨基酸序列的文件。
如果分值大于或等于零(0.0)，且E值大于0.1，调查的氨基酸序列为本发明的防卫素。
进一步在Bates等(2004)“The Pfam Protein Families Database”，NucleicAcids Research，Vol.32(Database Issue)pp.D138-D141中描述了PFAM数据库。
Figure IDA0000070478590000011

Claims (15)

1.一种药物组合物，包含：
-第一抗细菌化合物，其是防卫素，和
-第二抗细菌化合物，其是β-内酰胺类抗生素或氨基糖苷。
2.权利要求1的组合物，其中所述第一和第二抗细菌化合物呈现协同性抗细菌活性。
3.权利要求2的组合物，其中所述第一和第二抗细菌化合物使用选自下组的测试生物呈现FIC指数≤0.5：肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)ATCC49619，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC29213，金黄色葡萄球菌ATCC34400，金黄色葡萄球菌ATCC25923，和表皮葡萄球菌(Staphylococcus epiderm idis)ATCC49134。
4.权利要求1-3任一项的组合物，其中所述第一抗细菌化合物结合于细菌细胞壁前体Lipid I和/或Lipid II。
5.权利要求4的组合物，其中所述结合导致Lipid I和/或Lipid II的掩蔽。
6.权利要求4的组合物，其中所述结合的特征为约10-6M-1或更小的结合常数，优选约10-7M-1的结合常数。
7.权利要求1-6任一项的组合物，其中所述第一抗细菌化合物属于节肢动物防卫素类，或昆虫防卫素类。
8.权利要求1-7任一项的组合物，其中所述防卫素包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少80％同一性，优选至少85％同一性，更优选至少90％同一性，甚至更优选至少95％同一性，且最优选97％同一性的氨基酸序列。
9.权利要求1-8任一项的组合物，其中所述第二抗细菌化合物选自下组：青霉素类、头孢菌素类和氨基糖苷类。
10.权利要求1-9任一项的组合物，其中所述第二抗细菌化合物选自下组：青霉素G、头孢曲松和庆大霉素。
11.权利要求1-10任一项的药物组合物在制备用于治疗性处理细菌感染的药物中的用途。
12.权利要求11的用途，其中所述细菌感染由革兰氏阳性细菌引起。
13.权利要求12的用途，其中所述细菌感染由链球菌或葡萄球菌引起。
14.权利要求1-10任一项的药物组合物，其用于处理细菌感染。
15.权利要求14的用途，其中所述细菌感染由革兰氏阳性细菌，如链球菌或葡萄球菌引起。
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