TWI498336B - 用以抑菌之醫藥組合物及其用途 - Google Patents

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Wen Ling Shih
Hsiang Ju Hsiao
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Univ Nat Pingtung Sci & Tech
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用以抑菌之醫藥組合物及其用途
本發明係關於一種包含核糖體失活蛋白之醫藥組合物，該醫藥組合物係用以抑制病原菌之生長或複製。
早在十九世紀末期，有許多關於蓖麻毒素(Ricin)和相思子毒素(Abrin)的研究，並發現該等毒素係作用於昆蟲的核糖體28S rRNA，以抑制昆蟲的蛋白質合成。後期研究發現，許多植物組織中皆能夠以抑制核糖體活性的機制，防止他種生物侵害，因此，該等植物毒蛋白統稱作核糖體失活蛋白(Ribosome-Inactivating Proteins，簡稱RIPs)。
在二十世紀時發現，從植物分離出的RIPs，除了能夠使核糖體失活而抑制蛋白質合成之外，還具有抗病毒及抑制腫瘤增生的作用。舉例而言，由苦瓜所分離出二種RIPs，分別係α-苦瓜素(α-Momorcharin)及β-苦瓜素，目前已確認該苦瓜素具有抑制腫瘤細胞DNA、RNA或蛋白質合成，以及抗病毒之特性。
為了進一步研究植物RIPs的用途或開發該植物RIPs的新應用面，首要之務係提高該植物RIPs之產量，才能夠提供足夠量的植物RIPs以進行研究。如Yao等人於2009年Journal of Separation Science期刊中所發表「Immuno-affinity purification of α-momorcharin from bitter melon seeds(Momordica charantia )」研究報告，其係利用一帶有 Sepharose 4B之單株抗體與一親和性基質(affinity matrix)結合，藉由該單株抗體抓取一苦瓜粗蛋白液中的α-苦瓜素，達到約每100克苦瓜純化出196毫克之α-苦瓜素。
然而，以單株抗體抓取苦瓜粗蛋白液的苦瓜素，其產量仍不足以供應研究單位使用，更遑說將該α-苦瓜素進行量產以供醫藥學界的應用。藉由該單株抗體分離α-苦瓜素的製備成本高，例如，該親和性基質的管柱製作成本昂貴，該親和性基質的管柱經過一段使用時間後，將無法有效率的抓取α-苦瓜素。因此，該研究報告所揭示之純化α-苦瓜素的方法不適合用以大量生產α-苦瓜素。
有鑒於許多植物RIPs存在於植物組織中的含量過低，許多研究亦藉由構築包含該等植物RIPs基因的重組質體，再以一勝任細胞(E.coli )表現該等植物RIPs，以大量獲得該蛋白質。
然而，由於以原核細胞轉錄及轉譯真核細胞的基因時，其所獲得的蛋白質有失活(Inactivation)或形成蛋白質包涵體(Inclusion body)的問題，因此，仍無法藉由習知重組DNA的技術獲得足夠量的植物RIPs。
由上述可知，雖然植物RIPs係具有醫藥學上的應用價值，然而，目前尚未有適當的製備方法能夠適於研究單位或生產線進行量產。
本發明之主要目的係提供一種用以抑菌之醫藥組合物，係藉由該核糖體失活蛋白與習用抗生素之協同作用， 抑制病原菌之複製或生長者。
為達到前述發明目的，本發明所運用之技術手段包含有：一種用以抑菌之醫藥組合物，係包含：至少一抗生素，係用以破壞病原菌之外壁；及一如SEQ ID NO：3或4所示之核糖體失活蛋白，係用以抑制病原菌之蛋白質合成。
本發明用以抑菌之醫藥組合物中，該核糖體失活蛋白係編碼自如SEQ ID NO：1或2所示之核酸序列。
本發明用以抑菌之醫藥組合物中，每毫升醫藥組合物中，該核糖體失活蛋白與該抗生素之重量比例較佳為1：2至1：3。
本發明用以抑菌之醫藥組合物中，該抗生素可以選擇為氯黴素或四環黴素。
為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：本發明係提供一種核糖體失活蛋白，係自苦瓜種子中分離出一第一型核糖體失活蛋白或一第二型核糖體失活蛋白之去氧核糖核酸，並將該第一型核糖體失活蛋白及該第二型核糖體失活蛋白之去氧核醣核酸，分別構築於一表現載體中，藉由該表現載體表現該第一或二型核糖體失活蛋白；本發明之第一型核糖體失活蛋白(Type I ribosome-inactivating protein)簡稱RIP-I，係編碼自如SEQ ID NO：1所示之核酸序列，而獲得如SEQ ID NO：3所示之胺基酸序列，本發明之第二型核糖體失活蛋白(Type Ⅱ ribosome-inactivating protein)，簡稱RIP-Ⅱ，係編碼自如SEQ ID NO：2所示之核酸序列，而獲得如SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列。
本發明之核糖體失活蛋白係與至少一種抗生素組合成一醫藥組合物，以該RIP-I或RIP-Ⅱ與抗生素之協同作用，抑制革蘭氏陰性菌或革蘭氏陽性菌等病原菌之生長或複製；更詳言之，藉由該醫藥組合物中之抗生素較佳係具有破壞病原菌之外壁(細胞壁、莢膜或鞘膜等)之特性，使本發明之RIP-I或RIP-Ⅱ容易進入該病原菌之細胞質內，使該病原菌之核糖體失去活性而無法進行蛋白質合成作用，進而達到抑制該病原菌之生長或複製之功效；特別地是，本發明之醫藥組合物係能夠取代原本抗生素對病原菌的抑制有效量之九成以上，藉此降低抗生素的用量，不僅能夠避免病原菌因抗生素濫用而產生抗藥性，又能夠達到有效抑制病原菌的功效。本實施例之每毫升醫藥組合物中，該核糖體失活蛋白與該抗生素之重量比例較佳為1：2至1：3。
本發明之核糖體失活蛋白(RIP-I或RIP-Ⅱ)係以原核生物表現，而由原核生物表現之RIP-I或RIP-Ⅱ多以不可溶性之狀態呈現(即蛋白質包涵體)，然而，該蛋白質包涵體形成一團聚物而無法將其活性位置呈現出來，而使該RIP-I或RIP-Ⅱ失去活性。因此，本發明提供一種核糖體失活蛋白之製備方法，係能夠藉由原核生物大量表現該 RIP-I或RIP-Ⅱ，使該原核生物表現之RIP-I或RIP-Ⅱ具有抑菌活性。
請參照第1圖，係本發明之核糖體失活蛋白之製備方法的步驟方塊圖，其包含有一表現載體構築步驟S1、一增殖步驟S2、一純化步驟S3及一復性步驟S4。
該表現載體構築步驟S1，係將一核糖體失活蛋白之核酸片段構築於一表現載體上，並將該構築有核糖體失活蛋白核酸片段之表現載體送入一勝任細胞(competent cell)中，以表現一經重組之核糖體失活蛋白。該核糖體失活蛋白為本發明之RIP-I或RIP-Ⅱ，係如SEQ ID NO：3或4所示之胺基酸序列，該經重組之核糖體失活蛋白係可以選擇表現於該勝任細胞之細胞質內或細胞膜上，本實施例之表現載體係選擇為pMALTM -c5X表現載體，將經重組之RIP-I或RIP-Ⅱ表現於勝任細胞之細胞質內，以便後續將勝任細胞破碎後直接抽取蛋白質；該包含有RIP-I之表現載體係寄存於台灣新竹食品科學工業發展研究所，其寄存編號為BCRC 940645，該包含有RIP-Ⅱ之表現載體係寄存於台灣新竹食品科學工業發展研究所，其寄存編號為BCRC 940646。
本實施例所用之勝任細胞可以選擇為大腸桿菌BL21(DE3)pLysS、大腸桿菌Rosetta-gamiTM 2(DE3)pLysS或大腸桿菌NEB，較佳係選擇為pMALTM -c5X表現載體之使用手冊所建議之大腸桿菌NEB(E.coli NEB Express,New England Biolabs,Inc.)，以得到較佳之蛋白質表現效率，但不以此為限。
該pMALTM -c5X表現載體係以分子量大約為42.5KDa之MBP(maltose binding protein)作為標籤蛋白，該標籤蛋白可幫助純化外源基因所表現之蛋白，例如，以澱粉親和性色層分析(amylose affinity chromatography)抓取該標籤蛋白MBP，而獲得該RIP-I或RIP-Ⅱ之重組蛋白，但不以此為限；該pMALTM -c5X表現載體具lacZ’ 基因及氨比西林(ampicillin)抗藥基因，該lacZ’ 基因位於外源基因接合處，當外源基因成功構築入該外源基因接合處時，該lacZ’ 基因即被破壞而無法表現半乳糖苷酶(β-galactosidase)，使帶有成功構築外源基因之載體的勝任細胞因無法表現半乳糖苷酶而呈白色；是以藉由該pMALTM -c5X表現載體具有之lacZ’ 基因，篩選出攜帶有構集該核糖體失活蛋白基因成功之pMALTM -c5X表現載體的勝任細胞，並藉由ampicillin抗藥基因篩除未轉形成功之勝任細胞。
該增殖步驟S2，係誘導轉形成功之勝任細胞合成該核糖體失活蛋白。該轉形成功之勝任細胞係以含1.5mM葡萄糖之LB液態培養基(pH 7.2)，培養至吸光值OD600 為0.3~0.4時，再加入濃度為0.5毫莫耳濃度(mM)之IPTG誘導物誘導該勝任細胞表現該外源基因(即該RIP-I或RIP-Ⅱ之核酸片段)，自加入該IPTG誘導物培養10~20小時後，該勝任細胞合成該表現載體所含之外源基因，依照該外源基因係供該勝任細胞合成一分子量約為72.5KDa之重組蛋白(包含30KDa之RIP-I或RIP-Ⅱ及42.5KDa之標籤蛋白MBP)。
本實施例較佳係待完成誘導後，將培養液移除，以PBS 溶液(137mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀，10mM磷酸氫二鈉，2mM磷酸二氫鉀，pH 7.4)沖洗該勝任細胞，再以如第1表所示之破菌溶液將該勝任細胞懸浮、沖散，該破菌溶液係有助於降低該重組蛋白形成不水溶性蛋白質包涵體之比例，以超音波震盪將勝任細胞破碎，取得一粗蛋白。
該純化步驟S3，係以一親和性管柱，純化該核糖體失活蛋白。更詳言之，由於該核糖體失活蛋白係容易形成蛋白質包涵體，本實施例以如第2表所示之純化溶液回溶該粗蛋白並進行純化，則有助於降低該重組蛋白形成不水溶性蛋白質包涵體的比例；本實施例之沖提液係含有50mM麥芽糖之PBS溶液。該親和性管柱係包含與該標籤蛋白(MBP)具有親和性之樹脂，當該樹脂抓取該標籤蛋白後，再以一沖提液(elution buffer)將該經重組之核糖體失活蛋白自該親和性管柱上沖提出來，而獲得該經重組之核糖體失活蛋白。
第2表：純化溶液之配方(pH 7.4)
該復性步驟S4，係提供一高濃度透析溶液及一低濃度透析溶液，該二透析溶液之濃度差至少為高濃度者的50~80%，將該核糖體失活蛋白先置於高濃度透析溶液中進行透析，再以低濃度透析溶液進行透析，藉由該二透析溶液之濃度差異，使該核糖體失活蛋白之標籤蛋白移除，並使該核糖體失活蛋白復性，且不會形成蛋白質包涵體。更詳言之，由於在純化步驟後所獲得之重組蛋白中的標籤蛋白及RIP-I或RIP-Ⅱ會各自形成包涵體形態，且該標籤蛋白及該RIP-I或RIP-Ⅱ之間具有雙硫鍵，而不易溶於水中。相對於習用純化方式係以漸進式的透析方法(舉例而言，習知方法係以6M尿素作為起始透析溶液，漸進式地以5M、2M、1M尿素置換，最後以純水透析，獲得一復性蛋白)，藉由本發明復性步驟之非漸進式透析法，能夠降低該重組蛋白之包涵體形成的比例。
更詳言之，本實施例係以濃度為8M之尿素將該重組蛋白溶解，置於溫度為0~4℃環境中震盪反應1~2小時，再以濃度為2M之尿素進行透析0.5小時，將該重組蛋白所在環境中相對高濃度(8M)之尿素移除。由於本發明RIPs之重組蛋白的兩個包涵體(標籤蛋白及RIPs)對濃度 差異較大之環境的折疊速度不同，該二包涵體間的雙硫鍵受到拉扯而斷裂，並以酒精沉澱獲得本發明之RIP-I或RIP-Ⅱ。至此，即完成本發明RIP-I或RIP-Ⅱ的製備。
以本發明所揭示之方法能夠獲得不會形成蛋白質包涵體的RIP-I或RIP-Ⅱ，相較於習知蛋白質復性方法，本發明之蛋白質包涵體的復性方法，係能夠得到足夠量且具有活性之蛋白質，達到簡單且能夠進行量產之功效。
為證實本發明所揭示該RIP-I或RIP-Ⅱ之製備方法，確實相較於習知蛋白質復性方法具有增進之功效，分別以習知蛋白質復性方法及本發明之步驟，進行(A)不同純化條件之西方墨點法，比較習知蛋白質復性方法與本發明之差異；另外，為證實本發明RIP-I或RIP-Ⅱ確實能夠用以抑制病原菌的生長或複製，進行(B)本發明之苦瓜RIPs降解病原菌之RNA、(C)本發明RIP-I或RIP-Ⅱ之抑菌圈試驗及(D)本發明苦瓜RIPs與不同抗生素之協同作用試驗，證實本發明RIP-I或RIP-Ⅱ對於不同病原菌確實具有抑制效果，並且能降低該抗生素之使用劑量。
(A)不同純化條件之西方墨點法
為證實本發明之該RIP-I或RIP-Ⅱ之製備方法相較於習知蛋白質復性方法有增進效果，本實施例係參考購自New England Biolabs公司之E.coli NEB表現載體操作手冊進行蛋白質純化，取不同操作步驟下獲得之蛋白質，進行西方墨點法，比較該RIP-I或RIP-Ⅱ的純化及復性效果。
本實施例係取寄存編號為BCRC 940645之表現載體，轉形至大腸桿菌NEB之勝任細胞中，並以含1.5mM葡萄糖之LB液態培養基(pH 7.2)培養至OD600 為0.3，加入0.5mM之IPTG誘導物進行誘導12小時，將經誘導之大腸桿菌NEB培養液分成8組(各組之培養液體積為100ml)，使各組別之大腸桿菌NEB培養液中所合成蛋白質之量相同，再以如第3表所示之條件進行純化：第A1-1組(本發明之破菌步驟)，將100ml大腸桿菌 NEB培養液以10000rpm之轉速離心2分鐘，移除上清液後以PBS溶液清洗菌塊，再以如第1表所示之破菌溶液(5ml)將該菌塊沖散，均勻混合後於室溫、轉速為25rpm之條件震盪反應1小時，再移至-20℃使該含有大腸桿菌NEB之破菌溶液冷凍，重複上述步驟三次後，以超音波震盪2分鐘後，以13000rpm離心，並收取經破菌之大腸桿菌NEB培養液；第A1-2組係取如第A1-1組之破菌步驟後的大腸桿菌NEB培養液，以離心方式取得其粗蛋白(pellet)；第A1-3組係取第A1-2組之粗蛋白，以如第2表所示之純化溶液及一親和性管柱進行對該經破菌之粗蛋白純化，取未與親和性管柱之樹脂結合之蛋白質；第A1-4組則係以第A1-2組之粗蛋白，以如第2表所示之純化溶液及一親和性管柱進行純化，再以含有50mM麥芽糖之PBS溶液，將該重組蛋白自該親和性管柱之樹脂上沖提下來。
第A1-5組(習知破菌步驟)，將100ml之大腸桿菌NEB培養液以10000rpm之轉速離心2分鐘，移除上清液後以PBS溶液清洗菌塊，再以習用破菌溶液(為大腸桿菌NEB商用套組之破菌溶液：20mM Tris-HCl，200mM氯化鈉，1mM EDTA及10mM β-mercaptoethanol，pH 7.4，體積為5ml)將該菌塊沖散，均勻混合後於室溫、轉速為25rpm之條件震盪反應1小時，再移至-20℃使該含有大腸桿菌NEB之破菌溶液冷凍，重複上述步驟三次後，以超音波震盪2分鐘後，以13000rpm離心，並收取經破菌之大腸桿菌NEB培養液；第A1-6組係取如第A1-5組之習用破菌步驟後的大腸桿菌NEB培養液，以離心方式取得其粗蛋 白(pellet)；第A1-7組係取第A1-6組之粗蛋白，以習用純化溶液(為大腸桿菌NEB商用套組之純化溶液：20mM Tris-HCl，200mM氯化鈉，1mM EDTA及10mM β-mercaptoethanol，pH 7.4，體積為5ml)及一親和性管柱對經破菌之粗蛋白進行純化，取未與親和性管柱之樹脂結合之蛋白質；第A1-8組則係以第A1-6組之粗蛋白，以習用純化溶液及一親和性管柱進行純化，再以含有50mM麥芽糖之PBS溶液，將該重組蛋白自該親和性管柱之樹脂上沖提下來。
請參照第2圖所示，係以上述本發明之純化條件(第A1-1至A1-4組)及習用純化條件(第A1-5至A1-8組)之蛋白質電泳結果，由圖中可看出，以本發明之破菌溶液處理該經誘導之大腸桿菌NEB(第A1-1組)，與習用破菌溶液處理後之結果(第A1-5組)相較，能夠更有效率地打破該大腸桿菌NEB而取得較多之粗蛋白；以本發明之純化溶液回溶該粗蛋白，並將之通過該親和性管柱(第A1-3組)，由於該純化溶液較不易使該粗蛋白中的RIP-I重組蛋白形成蛋白質包涵體，因此可以通過該親和性管柱之蛋白質，較以習用純化溶液處理者(第A1-7組)為多，再請對照第A1-4及A1-8組，以本發明之製備方法處理後，該沖提液能夠將該親和性管柱之樹脂上的RIP-I重組蛋白(72.5KDa)沖提下來，相較於習知純化方式則無法得到RIP-I重組蛋白。
由此可知，習用破菌溶液及習用純化溶液容易使該RIP-I重組蛋白形成蛋白質包涵體，因此，RIP-I重組蛋 白不易通過該親和性管柱，也不容易被親和性管柱之樹脂抓取，而無法有效率地獲得該RIP-I重組蛋白。
據此，以本發明所揭示核糖體失活蛋白之製備方法，確實係能夠提高該RIP-I或RIP-Ⅱ重組蛋白之純化效率。
為了將該RIP-I重組蛋白中的標籤蛋白移除，本實施例取6組由第A1-4組之條件所獲得之RIP-I重組蛋白，以如第4表所示之條件，分別進行本發明之復性步驟及習用蛋白質復性步驟。
請參照第3圖所示，係根據第4表所示之條件，將該重組蛋白之標籤蛋白移除並復性後的蛋白質電泳結果： 第A2-1及2-4組係取本發明之RIP-I重組蛋白(分子量為72.5KDa)；第A2-2組係以商用套組之Factor Xa酵素處理該RIP-I重組蛋白，由於該RIP-I重組蛋白係形成蛋白質包涵體，該Factor Xa酵素無法有效率地進行剪切，因此該RIP-I之產生量不多，相較於本發明之復性步驟，係以8M尿素將該RIP-I重組蛋白溶解，置於冰上反應1.5小時後，以濃度為2M尿素進行透析0.5小時後，可將RIP-I重組蛋白之標籤蛋白移除，並獲得較多的RIP-I；將第A2-2及A2-5組之RIP-I以沉澱步驟處理後，確實可得到分子量為30KDa之RIP-I。
由此可知，藉由本發明RIP-I之製備方法，確實可以有效移除該標籤蛋白，又能獲得足夠量之RIP-I。
(B)本發明之苦瓜RIPs降解病原菌之RNA
為證實本發明之苦瓜RIPs確實能夠抑制病原菌，本實施例係抽取病原菌之總RNA，將本發明之苦瓜RIPs與病原菌之總RNA共培養後，以北方墨點法觀察經處理之總RNA是否受到本發明苦瓜RIPs的破壞。
本實施例以商用RNA抽取套組(Trizol® )取6組病原菌之總RNA，分別以如第5表之成份混合，並於溫度37℃下共培養1小時後，再移至60℃之溫度下25分鐘使反應停止。
由第4圖之RNA電泳結果可知，第B2、B4及B6組之RNA已被本發明之苦瓜RIPs抑制或分解，因此，本發明之苦瓜RIPs確實能夠將病原菌之RNA破壞，使病原菌無法合成蛋白質，而達到抑制病原菌之生長或複製之功效。
(C)本發明RIP-I或RIP-Ⅱ與不同抗生素之協同作用試驗
本實施例係以金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )、傷寒沙門氏菌(Samonella typhimurium )及腸炎沙門氏菌(Samonella enteritidis )為例，將本發明之RIPs及/或抗生素(如氯黴素或四環黴素)與上述之病原菌共培養後，測量各菌液之OD600 吸光值，以證實本發明之苦瓜RIPs係確實能夠抑制革蘭氏陰性菌或陽性菌之生長或複製。
請參照第6表之第C1-1至C1-4組及第5圖所示，未添加本發明苦瓜RIPs及氯黴素之第C1-1組，以及僅添加本發明苦瓜RIPs之第C1-2組，其金黃色葡萄球菌之OD600 隨培養時間而增加；第C1-3組係添加有效量(34μg)之氯黴素，能夠抑制金黃色葡萄球菌之生長，使其OD600 係小於0.05，而第C1-4組係降低氯黴素的使用量，亦能夠達到與第C1-3組相當程度的抑制效果，證明本發明苦瓜RIPs確實能夠與廣效性抗生素-氯黴素協同，以抑制革蘭氏陽性菌之生長，並達到減少抗生素用量之功效。
請參照第6表之第C2-1至C2-4組及第6圖所示，未添加本發明苦瓜RIPs及氯黴素之第C2-1組，以及僅添加 本發明苦瓜RIPs之第C2-2組，其傷寒沙門氏菌之OD600 隨培養時間而增加；而第C2-3組係添加有效量(34μg)之氯黴素，能夠抑制傷寒沙門氏菌之生長，使其OD600 係小於0.01，而第C2-4組係降低氯黴素的使用量，亦能夠達到與第C2-3組相當程度的抑制效果，證明本發明苦瓜RIPs確實能夠與廣效性抗生素-氯黴素協同，以抑制革蘭氏陰性菌之生長，並達到減少抗生素用量之功效。
請參照第6表之第C3-1至C3-4組及第7圖所示，未添加本發明苦瓜RIPs及氯黴素之第C3-1組，以及僅添加本發明苦瓜RIPs之第C3-2組，其腸炎沙門氏菌之OD600 隨培養時間而增加；第C3-3組係添加有效量(34μg)之氯黴素，能夠抑制腸炎沙門氏菌之生長，使其OD600 係小於0.01，而第C3-4組係降低氯黴素的使用量，亦能夠達到與第C3-3組相當程度的抑制效果。
此外，上述第5至7圖係如第6表所示之條件，以本發明RIP-I與氯黴素進行協同試驗，而第8至10圖則如第6表所示之條件，以本發明RIP-Ⅱ與氯黴素進行協同試驗，二者的抑制效果類似，皆能夠減少原本氯黴素的抑制有效用量的九成以上，證明本發明苦瓜RIPs確實能夠與廣效性抗生素-氯黴素協同，以抑制革蘭氏陰性菌之生長，並達到減少抗生素用量之功效。
請參照第7表之第C4-1至C4-4組及第11圖所示，未添加本發明苦瓜RIPs及四環黴素之第C4-1組，以及僅添加本發明苦瓜RIPs之第C4-2組，其金黃色葡萄球菌之OD600 隨培養時間而增加；第C4-3組係添加有效量(15μg)之四環黴素，能夠抑制金黃色葡萄球菌之生長，使其OD600 係小於0.01，而第C4-4組係降低四環黴素的使用量，亦能夠達到與第C4-3組相當程度的抑制效果，證明本發明苦瓜RIPs確實能夠與四環黴素協同，以抑制革蘭氏陽性菌之生長，並達到減少抗生素用量之功效。
請參照第7表之第C5-1至C5-4組及第12圖所示，未添加本發明苦瓜RIPs及四環黴素之第C5-1組，以及僅添加本發明苦瓜RIPs之第C5-2組，其傷寒沙門氏菌之 OD600 隨培養時間而增加；第C5-3組係添加有效量之四環黴素，能夠抑制傷寒沙門氏菌之生長，使其OD600 係小於0.01，而第C5-4組係降低四環黴素的使用量，亦能夠達到與第C5-3組相當程度的抑制效果，證明本發明苦瓜RIPs確實能夠與四環黴素協同，以抑制革蘭氏陰性菌之生長，並達到減少抗生素用量之功效。
請參照第7表之第C6-1至C6-4組及第13圖所示，未添加本發明苦瓜RIPs及四環黴素之第C6-1組，以及僅添加本發明苦瓜RIPs之第C6-2組，其腸炎沙門氏菌之OD600 隨培養時間而增加；第C6-3組係添加有效量之四環黴素，能夠抑制腸炎沙門氏菌之生長，使其OD600 係小於0.01，而第C6-4組係降低四環黴素的使用量，亦能夠達到與第C6-3組相當程度的抑制效果。
此外，上述第11至13圖係如第7表所示之條件，以本發明RIP-I與四環黴素進行協同試驗，而第14至16圖則如第7表所示之條件，以本發明RIP-Ⅱ與四環黴素進行協同試驗，二者的抑制效果類似，皆能夠減少原本四環黴素的抑制有效用量的七成以上，證明本發明苦瓜RIPs確實能夠與四環黴素協同，以抑制革蘭氏陰性菌之生長，並達到減少抗生素用量之功效。
由此可知，本發明之苦瓜RIP-I或RIP-Ⅱ係能夠有效抑制革蘭氏陰性菌或陽性菌之生長，並且減少抗生素用量，以避免抗生素的濫用情形，減少病原菌對抗生素產生抗藥性的情形。
(D)本發明RIP-I或RIP-Ⅱ之抑菌圈試驗
為證實本發明之苦瓜RIP-I或RIP-Ⅱ係能夠與至少一抗生素協同以抑制病原菌之生長，本實施例係以Kirby-Bauer法測試不同組別共培養物之抑制效果。
本實施例以金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )作為抑菌圈試驗之菌株，將含有如第8表所示成分的紙錠(直徑為6mm)，貼附於塗佈有金黃色葡萄球菌培養液(菌液濃度為0.5 McFarland standard)之平板培養基(Mueller-Hinton agar，pH值為7.2~7.4，培養基厚度較佳為4mm)上，並於37℃下培養16~18小時後，測量各組別之抑菌圈大小，該抑菌圈大小係包含該紙錠之直徑。
請參照第8表所示，第D1及D2組之紙錠分別係RIP-I及RIP-Ⅱ；第D3組之紙錠係含有170μg/ml廣效性抗生素(氯黴素)；第D4及D5組係將紙錠上的抗生素濃度降低為第D3組所用抗生素濃度的20%，並添加不同種類本發明之苦瓜RIPs後，將第D1至D5組於37℃下培養18小時後測量各組之抑菌圈大小。第D1及D2組之抑菌圈大小為0mm，表示僅以本發明之RIP-I或RIP-Ⅱ係無 法抑制病原菌；而第D3至D5組之抑菌圈皆能夠達到22mm，證實本發明之苦瓜RIPs確實能夠與抗生素產生協同作用，而能夠有效抑制病原菌生長。
本發明之苦瓜RIPs係可以與至少一抗生素組成一用以抑菌之醫藥組合物，藉由該苦瓜RIPs與該抗生素之協同作用，抑制革蘭氏陽性菌(如金黃色葡萄球菌)或革蘭氏陰性菌(傷寒沙門氏菌及腸炎沙門氏菌)之生長或複製，不僅可達到降低該習用抗生素之使用劑量(減少為原本抑制有效量的一至三成)之功效，以降低病原菌對習用抗生素產生抗藥性之風險，並藉由本發明苦瓜RIPs抑制病原菌之RNA，進而抑制病原菌的蛋白質合成，如此，便能達到抑制病原菌生長或複製之功效。
藉此，本發明用以抑菌之醫藥組合物，係藉由該核糖體失活蛋白與習用抗生素之協同作用，不僅能夠有效抑制病原菌之生長或複製，又具有降低病原菌產生抗藥性情形之功效。
雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
<110>　國立屏東科技大學
<120>　核糖體失活蛋白之製備方法及用以抑菌之醫藥組合物
<160>4
<210>1
<211>
<212>DNA
<213>Mormordica charantia
<223>Type Ⅰ RIPs
<400>SEQUENCE: 1
<210>2
<211>
<212>DNA
<213>Mormordica charantia
<223>Type Ⅱ RIPs
<400>SEQUENCE: 2
<210>3
<211>
<212>PRT
<213>Mormordica charantia
<223>Type Ⅰ RIPs
<400>SEQUENCE: 3
<210>4
<211>
<212>PRT
<213>Mormordica charantia
<223>Type Ⅱ RIPs
<400>SEQUENCE: 4
S1‧‧‧表現載體構築步驟
S2‧‧‧增殖步驟
S3‧‧‧純化步驟
S4‧‧‧復性步驟
第1圖：本發明核糖體失活蛋白之製備方法的步驟方塊圖。
第2圖：本實施例第A1-1至A1-8組之蛋白質電泳結果。
第3圖：本實施例第A2-1至A2-6組之蛋白質電泳結果。
第4圖：本實施例第B1至B6組之RNA電泳結果。
第5圖：本實施例RIP-I之第C1-1至C1-4組之金黃色葡萄球菌OD600 吸光值折線圖。
第6圖：本實施例RIP-I之第C2-1至C2-4組之傷寒沙門氏菌OD600 吸光值折線圖。
第7圖：本實施例RIP-I之第C3-1至C3-4組之腸炎沙門氏菌OD600 吸光值折線圖。
第8圖：本實施例RIP-Ⅱ之第C1-1至C1-4組之金黃色葡萄球菌OD600 吸光值折線圖。
第9圖：本實施例RIP-Ⅱ之第C2-1至C2-4組之傷寒沙門氏菌OD600 吸光值折線圖。
第10圖：本實施例RIP-Ⅱ之第C3-1至C3-4組之腸炎沙門氏菌OD600 吸光值折線圖。
第11圖：本實施例RIP-I之第C4-1至C4-4組之金黃色葡萄球菌OD600 吸光值長條圖。
第12圖：本實施例RIP-I之第C5-1至C5-4組之傷寒沙門氏菌OD600 吸光值長條圖。
第13圖：本實施例RIP-I之第C6-1至C6-4組之腸炎沙門氏菌OD600 吸光值長條圖。
第14圖：本實施例RIP-Ⅱ之第C4-1至C4-4組之金黃色葡萄球菌OD600 吸光值長條圖。
第15圖：本實施例RIP-Ⅱ之第C5-1至C5-4組之傷寒沙門氏菌OD600 吸光值長條圖。
第16圖：本實施例RIP-Ⅱ之第C6-1至C6-4組之腸炎沙門氏菌OD600 吸光值長條圖。

Claims (3)

  1. 一種用以抑菌之醫藥組合物，係包含：至少一抗生素，係用以破壞病原菌之外壁；及一如SEQ ID NO：3或4所示之核糖體失活蛋白，係用以抑制病原菌之蛋白質合成；其中，該核糖體失活蛋白係由包含以下步驟之方法製備獲得：將一構築有核糖體失活蛋白核酸片段之表現載體送入一勝任細胞中，該構築有核糖體失活蛋白核酸片段之表現載體，係寄存於台灣新竹食品科學工業發展研究所，其寄存編號為BCRC 940645或BCRC 940646；誘導該轉形成功之勝任細胞合成該核糖體失活蛋白；以一純化溶液回溶該勝任細胞中的蛋白質，該純化溶液包含137mM之氯化鈉、2.7mM之氯化鉀、10mM之磷酸氫二鈉及10mM之磷酸二氫鉀，續以一親和性管柱純化該核糖體失活蛋白；及提供一高濃度透析溶液及一低濃度透析溶液，該高濃度透析溶液為8M之尿素，該低濃度透析溶液為2M之尿素，將該核糖體失活蛋白先置於高濃度透析溶液中進行透析，再以低濃度透析溶液進行透析；其中，該至少一抗生素為氯黴素，每毫升醫藥組合物中，該核糖體失活蛋白為1.5μg，氯黴素為3.4μg；該至少一抗生素為四環黴素，每毫升醫藥組合物中，該核糖體失活蛋白為1.5μg，四環黴素為4.5μg。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之用以抑菌之醫藥組合物，其中該核糖體失活蛋白係編碼自如SEQ ID NO：1或2所示之核酸序列。
  3. 如申請專利範圍第1或2項所述之醫藥組合物的用途，係用以製備抗菌藥物，其中，係以該核糖體失活蛋白抑制病原菌之蛋白質合成，減少該抗生素之使用劑量。
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LIN Yu-quan.," Cloning , Expression and the Anti-tumor Activity of Recombinant MAP30 in Escherichia coli " China Biotechnology 2005, 25 (5), 60-66 摘要、第60頁左欄第1-5行、第61頁左欄第4-5段、第61頁右欄第3段、第63頁左欄第2段、圖示6 Ortigao M.," Momordin II, a ribosome inactivating protein from Momordica balsamina, is homologous to other plant proteins " Nucleic Acids Res. 1992, 20(17), 4662 圖示1 *

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