CN102251051A - 一种检测边鸡mstn基因型的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及家禽育种领域，具体涉及一种检测边鸡MSTN基因型的试剂盒。该试剂盒由特异性引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg²⁺、10×PCR缓冲液、BbvI酶、10×bufferBbvI和超纯水组成，其中所述的特异性引物的序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示。用本发明的试剂盒选择的检测方法简单快捷，可直接根据基因型选留个体，且不受外界环境的影响，可以用于边鸡体重选择的分子遗传标记，进行标记辅助选择。

Description

一种检测边鸡MSTN基因型的试剂盒

技术领域

本发明涉及家禽育种领域，具体涉及一种用DNA分子标记筛选边鸡体重增长程度的方法中所使用到的检测边鸡MSTN基因型的试剂盒。

背景技术

传统的数量遗传学对数量性状遗传机制的理解建立在抽象的微效多基因假设基础上，将影响一个数量性状的所有基因当作一个整体来处理，而不考虑其中的各个基因是如何作用的。这一假说在多年的动植物育种中发挥了重要作用，推动了动植物育种工作的进展，在当时的理论和技术条件下不失为一个很好的基础。但这一假说不了解数量性状的遗传背景，不了解控制数量性状的基因在染色体上的位置及其传递规律，无法对其效应作出准确的估计，更不能从分子水平分离和定位该类基因。随着现代分子生物学技术的飞速发展，遗传学家和育种学家认识到控制数量性状的基因并非在基因组中随机分布，且存在影响数量性状的主效基因。

目前，在育种中对鸡体重增长程度的筛选方法主要是通过数量遗传学方法，而数量遗传学方法进展缓慢，寻找到合适的DNA标记用于辅助选择能增强选择的准确性、缩短世代间隔，加快遗传进展。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种检测边鸡MSTN基因型的试剂盒，根据该试剂盒的检测图谱可对边鸡体重进行标记辅助选择，不受环境影响。

本发明的原理是：DNA池测序发现边鸡MSTN基因外显子1的234bp处存在一个G→A突变，DNAMAN 5.22软件分析表明该位点为BbvI识别位点。针对该酶切位点设计特异性引物扩增边鸡基因组DNA，引物的扩增产物经BbvI酶切产生3种基因型（GG、GA 和AA）。无论是一世代还是二世代的边鸡，在6到18周龄时，AA和GA基因型边鸡的体重都显著或极显著高于GG型（P<0.05或P<0.01）。该单核苷酸突变能稳定遗传，选择的检测方法简单快捷，且不受外界环境的影响，可以用于边鸡体重选择的分子遗传标记，进行标记辅助选择。

一种用分子标记筛选边鸡体重增长程度的方法是：提取待测样本的鸡基因组DNA，经特异性引物扩增得到162bp的目的片段，目的片段经限制性内切酶BbvI酶切，酶切产物凝胶电泳后用银染显色，得到DNA的酶切图谱，根据图谱中条带的数量和大小对待测样本的MSTN基因型进行判断。

所述根据图谱中条带的数量和大小对待测样本基因型进行判断的方法是：仅有162bp条带的为体重增长快的纯合型样本，仅有127bp条带的为体重增长慢的纯合型样本；同时含有162bp和127bp条带的为体重增长快的杂合型样本，。

本发明还提供了边鸡MSTN基因在边鸡育种筛选中作为体重选择的分子遗传标记的应用。

所述分子遗传标记在应用于育种筛选时，选择MSTN基因中不含BbvI酶切位点的个体，即体重增长快的纯合型样本（AA型）。

本发明还公开了用于上述方法的试剂盒，该试剂盒由特异性引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、10×PCR缓冲液、BbvI酶、10×buffer BbvI和超纯水组成，其中所述的特异性引物的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

提取待测样本的鸡基因组DNA后，利用该试剂盒进行PCR扩增和酶切，酶切产物经凝胶电泳后用银染显色，得到DNA的酶切图谱与图2比对，可直接判定基因型。

附图说明

图1是PCR产物图，Marker为GM331。

图2是BbvI酶切产物图，Marker为GM331。

具体实施方式

实施例1

1. 待测基因组DNA的提取

1.1 采血

一世代（137只）和二世代（117只）的边鸡母鸡采自山西省农科院畜牧兽医研究所，翅静脉采集血样0.5 mL左右，肝素钠抗凝，置冰盒带回实验室，-20℃保存。

1.2消化蛋白质和RNA

取抗凝血30 μL，放入1.5 mL离心管中，加入0.3 mL TE，0.3ml裂解液，10 μL RnaseA酶（2.5 mg/mL），8 μL蛋白酶K（20 mg/mL），颠倒混匀，55℃过夜，充分消化蛋白质和RNA。

有机溶剂提取DNA

加入0.6 mL Tris饱和酚，颠倒混匀20 min，12000 rpm离心10 min；吸取上清液至另一干净的1.5 mL的离心管中，加入0.6 mL酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），颠倒混匀20 min，12000 rpm离心10 min；吸取上清液放入另一干净的1.5 mL的离心管中，加入0.6 mL氯仿/异戊醇（24：1）溶液，颠倒混匀20 min，12000 rpm离心10 min；吸取上清液放入另一干净的1.5 mL的离心管中，加入1 mL的冰无水乙醇，颠倒混合，可见絮状漂浮物。12000 rpm离心10 min，倒掉乙醇；加入0.5 mL70％冰乙醇洗涤2次；倒掉乙醇，37℃过夜干燥DNA样品。加300 μL 超纯水过夜溶解DNA。

1.4 DNA浓度和纯度的测定

用核酸测定仪测定DNA的OD260、OD280和浓度，把基因组DNA稀释成100 ng/μl，4 ℃贮存，备用。

2. 引物设计和PCR扩增

2.1 酶切引物的设计

根据GenBank中鸡MSTN基因序列（GenBank登录号为AF346599）针对外显子1的BbvI位点设计1对引物，扩增产物大小为162 bp。引物序列如下： 

P1：F: 5’-GCATTAGCAGGGACGTTAT-3’;（SEQ ID NO：1）

  R:5’-ACTCCGTAGGCATTGTGAT-3’ （SEQ ID NO：2）。

2．2试剂盒的组成

序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的特异性引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、10×PCR缓冲液、BbvI酶、10×buffer BbvI和超纯水。各组分的份量如下：

SEQ ID NO：1：100 μL

SEQ ID NO：2：100 μL

dNTPs：300 μL

Taq DNA聚合酶：20 μL

Mg²⁺：200 μL

10×PCR缓冲液：300 μL

BbvI酶：50 μL

10×buffer BbvI：300 μL

超纯水：5 mL 。

 2.2 PCR扩增

PCR扩增反应为25 μL体系，包括：上、下游引物（10 μmol/L）2 μL；dNTPs（2 mmol/L）2.5 μL；Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.2 μL；DNA模板（50 ng/μL）2 μL；Mg²⁺（25 mmol/L）1.5 μL；10×PCR缓冲液2.5 μL；超纯水14.3 μL。PCR扩增反应程序：94℃变性6 min；94℃变性30 s，56℃复性30 s，72℃延伸30 s，进行30个循环；最后72℃延伸10 min；10℃保存。

PCR反应完成后，用交联度为（Acr:Bis）39:1的10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增结果如图1（图1中1-8泳道为8个不同边鸡个体的PCR产物，其它个体的扩增结果与图1相同，省略），硝酸银染色，UV凝胶成像系统进行凝胶成像。

2.3 PCR-RFLP检测

PCR产物用BbvI酶切，以检测多态性。酶切反应总体积为20 μL，超纯水 16.5 μL，BbvI酶(10 u/μL) 0.5 μL，10×buffer 2 μL，37°C酶切2 h，酶切产物用交联度为（Acr:Bis）29:1的10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶检测，200V电泳5 h，硝酸银染色。酶切图谱如图2所示，显示3种基因型，仅有162bp目的片段的样本不含BbvI酶切位点，命名为AA型；仅有127bp的为含有BbvI酶切位点的纯合型，命名为GG型；同时含有162bp和127bp的为含有BbvI酶切位点的杂合型样本，命名为GA型。GG和AA相比在外显子1编码区的234 bp（C.234 bp）处有一个G→A的突变。当C.234 bp处为G时，BbvI酶切产生127 bp和35 bp的片段；当C.234 bp处为A时，无BbvI酶切位点。在凝胶检测时，有酶切位点的样本产生的35bp的片段由于长度太小，跑出了凝胶，所以在凝胶中未显示出条带。根据酶切图谱中条带的数量和大小辨别引物的扩增产物中是否有BbvI酶切位点。

2．4 MSTN基因BbvI位点不同基因型与边鸡生长性状的关联分析

各样本的生长性状与PCR-RFLP检测结果分析如表1和表2，由此可见，无论是一世代还是二世代的边鸡，在6到18周龄时，AA和GA基因型边鸡的体重都显著或极显著高于GG型（P<0.05或P<0.01）。在育种筛选中只选择AA型（即不含BbvI酶切位点的MSTN基因）可以在群体中固定该基因型。所以PCR产物能否被BbvI酶切开可作为筛选边鸡体重增长程度的方法。

注: 同行数据肩标不同小写字母表示差异显著( P<0.05) , 肩标不同大写字母表示极显著（P<0.01 )。

注: 同行数据肩标不同小写字母表示差异显著( P<0.05) , 肩标不同大写字母表示极显著（P<0.01 )。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  扬州大学

 

<120>  一种检测边鸡MSTN基因型的试剂盒

 

<130> 

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

gcattagcag ggacgttat                                                  19

 

 

<210>  2

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

actccgtagg cattgtgat                                                  19

 

 

Claims (1)

1.一种检测边鸡MSTN基因型的试剂盒，其特征在于，由特异性引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、10×PCR缓冲液、BbvI酶、10×buffer BbvI和超纯水组成，其中所述的特异性引物的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

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